專利名稱：：廣玉蘭葉揮發(fā)油在制藥上的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及廣玉蘭葉揮發(fā)油的用途，尤其涉及其在制備抗菌、鎮(zhèn)痛藥物上的應用。
背景技術：
：玉蘭為木蘭科(^^^"0//""^)植物中重要的分類群之一，是一類速生林、特用經(jīng)濟林、水土保持林和城鄉(xiāng)風景生態(tài)林的優(yōu)良種，很有發(fā)展和開發(fā)利用前景。木蘭禾斗植物望春花(M3g"o"a6!'o"必尸amp.)、玉蘭(她gno,/ac/e做(i3teofesr.)或武當玉蘭(M^o/Za^re"ger/尸flw/.)的干燥花蕾為中藥辛夷的藥用部位，臨床上用來治療風寒頭痛、鼻塞等感冒癥狀。文獻(趙利琴.望春玉蘭萜類成分及其生物活性研究進展.時珍國醫(yī)國藥[J].2005.16(4):298-230)記載，玉蘭中富含萜類成分，主要為單萜和倍半萜及其含氧衍生物。陳興榮等(陳興榮，等.荷花玉蘭化學成分研究.中藥材[J].2000,13(3):159-160)等對荷花玉蘭進行化學成分研究，從中分離鑒別了三個倍半萜內酯類化合物，分別為丁香樹脂醇、閉鞘姜酯和小白菊內酯。文獻(TwonewgermacranolidesfromM3g"o//agra順ora.J.AsianNatProdRes.2001，3(2):95-102)報道了從廣玉蘭中分離的倍半萜內酯類化合物，其中包括2-a-羥基-二氫小白菊內酯、小白菊內酯、木香內酯等內酯類化合物。
發(fā)明內容對玉蘭葉揮發(fā)性成分的研究，目前尚少，尤其是其在制藥、食品添加劑、香料中的應用。本發(fā)明的目的之一是提供玉蘭葉揮發(fā)性活性成分在制藥上的應用，尤其是在抗菌、鎮(zhèn)痛藥物中的應用。本發(fā)明以玉蘭葉揮發(fā)油為原料，可將其作為活性成分與制藥上可接受的載體或藥用輔料開發(fā)成相宜的抗菌、鎮(zhèn)痛制劑，如注射劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、片劑、顆粒劑、散劑、口服液、乳濁液、脂質體等。本發(fā)明玉蘭葉揮發(fā)油原料即可單獨使用，也可與其它原料混合使用制成所需劑型。廣玉蘭葉中含有多種植物性香料，如水芹烯、莰烯、蛇床烯、(3-新丁子烯等，它們都廣泛用于香料工業(yè)、化妝品和食品中，在香精中的價值日臻重要。因此，廣玉蘭葉除可用于制備抗菌、鎮(zhèn)痛藥物中外，還可用于食品添加劑、化妝品、香料中。本發(fā)明中，廣玉蘭葉揮發(fā)油采用常用的水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法或超臨界萃取法等適于工業(yè)化生產(chǎn)的方法進行制備。得到的廣玉蘭葉揮發(fā)油呈淡黃色，主要含有大根香葉烯-D(Gemacrene-D)、檀紫三烯(Santolinatriene)、石竹烯(Caryophyllene)、3，7-二甲基誦1,3，7三烯(1，3，7-Octatriene誦3,7醫(yī)dimehtyl-)、莰烯(Camphene)、蔽烯(Pinene)、水開烯(Phellandrene)、D-檸檬烯(D-Limonene)、a'陽松油醇(a-terpineol)、羅漢柏烯(Thujopesene)、蛇床烯、a-金合歡烯(a-Farnesene)、橙花醇等，占總油的90%以上，廣玉蘭葉的含油量為.25%-0.40%,即每100g生藥含揮發(fā)油0.35-0.5mL。上述水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的方案主要是通過油水分離器分離揮發(fā)油，其步驟為按重量份計算，取廣玉蘭葉l-20份，加水5-200份，先浸泡至透，水蒸氣蒸餾3-8小時，溫度控制在85-105'C，起始時溫度可設置高些，待沸騰后，適當調低溫度，以保持水為微沸，進行油水分離，得到含水廣玉蘭葉揮發(fā)油,j《揮發(fā)油以乙醚萃取，乙醚萃取部分加無水硫酸鈉干燥(24小時以上)、過濾，去除水相，蒸去乙醚，即可得到廣玉蘭葉揮發(fā)油。上述的溶劑提取法，其步驟為取廣玉蘭葉l-20份，加入有機溶劑正己烷或環(huán)己烷6-120重量份，進行回流提取，溫度控制在50-70°C，回流2-3小時，待回流液溫度降至室溫時，放出回流液，回收有機溶劑，即可得到揮發(fā)油粗品；在粗品中加入無水乙醇0.01-0.1重量份，與揮發(fā)油粗品從分混合，放置-2(TC冰箱中，24h以上，將混濁液過濾除去，繼續(xù)放置冰箱中重復此步驟，直到液體澄清為止，將含有揮發(fā)油的乙醇溶液濃縮，即可得到廣玉蘭葉揮發(fā)油。上述所述的超臨界萃取法，其步驟為取廣玉蘭葉，粉碎成粒徑為0.5-lmm的碎粉，萃取斧的壓力為10-30Mpa，溫度為20-5(TC，進行超臨界002萃取，萃取時間為30-90分鐘，從萃取斧出來的C02進入分離系統(tǒng)，一級分離溫度為35-50°C，壓力為15-25Mpa;二級分離溫度為20-30°C,壓力為4-8Mpa，得到廣玉蘭葉揮發(fā)油，<:02流速為10-20L/h，分離出來的C02再經(jīng)過濾和制冷系統(tǒng)加壓后循環(huán)利用。為了更好的理解本發(fā)明的實質，以下從廣玉蘭葉揮發(fā)油的抑菌和鎮(zhèn)痛實驗來說明本發(fā)明在制備抗菌和鎮(zhèn)痛藥物中的應用。一、體外抑菌實驗1、菌種產(chǎn)酸克雷伯菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌。2、培養(yǎng)基M-H肉湯培養(yǎng)基加0.3%的瓊脂，制成半固體培養(yǎng)基。3、MIC的測定采用微量瓊脂稀釋法測定MIC(徐淑云.藥理學實驗方法學[M].北京人民衛(wèi)生出版社.1985,1066-1070)。將2%廣玉蘭油水溶液(乳濁液)做1:2-128倍比稀釋，取20u1加入培養(yǎng)孔中，再分別加入用肉湯瓊脂稀釋的各菌液(約107/ml)200lU，混勻，于37。C培養(yǎng)24h，重復實驗1次，結果見表l。表l廣玉蘭葉揮發(fā)油的最低抑菌濃度實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"一"表示無細菌生長，"+"表示有細菌生長。體外抑菌實驗表明，2%的廣玉蘭葉揮發(fā)油做1/4倍稀釋后，對產(chǎn)酸克雷伯菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌均有顯著的抑菌作用，做l/8倍稀釋后，對痢疾志賀氏菌、表皮葡萄球菌仍有顯著抗菌作用，且比1%的黃連素強。說明廣玉蘭葉揮發(fā)油的最低抑菌濃度為2%的廣玉蘭溶液做l/4倍稀釋，即0.5%濃度的溶液(V/V)。二、體內抗菌實驗1.實驗前接種細菌于10ml營養(yǎng)肉湯中，孵育24h為菌原液，繼續(xù)用5%高活性干酵母制成所需濃度，以預實驗是選定的使小鼠死亡率達80%-100%的菌液(大腸桿菌的稀釋度為10—1,金黃色葡萄球菌的稀釋度為10_2)作為感染菌量，小鼠隨機分組，每組10只，雌雄各半，各組小鼠腹腔注射各菌液0.5ml感染；給予不同劑量的廣玉蘭葉揮發(fā)油液(揮發(fā)油濃度為2%(V/V))，腹腔注射0.03ml/kg和0.015ml/kg，灌胃O.lml/kg和0.05ml/kg，空白對照組給生理鹽水，對照組腹腔注射40U/kg慶大霉素，給藥第二天，第七天統(tǒng)計各組小鼠死亡數(shù)量，結果見表2。表2廣玉蘭葉揮發(fā)油的體內抑菌實驗(n-10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.急性毒性實驗取小鼠隨機分組，分別腹腔注射和灌胃給予廣玉蘭葉揮發(fā)油，結果腹腔注射LD5G為0.75mL/kg，灌胃LD5G為4.86mL/kg。三、對小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響配藥所得廣玉蘭揮發(fā)油以5%的吐溫-80配成所需濃度。小鼠熱板、法健康昆明種小鼠，雌性，18~22g，于實驗前l(fā)天放入(55±0.5)'C水浴燒杯中，記錄從放入到出現(xiàn)舔后足的時間，即痛閾值，取痛閾值為5~30s的合格小鼠40只，隨機分為4組，每組10只。實驗前禁食16h，不禁水。給藥前再測一次痛閾值，作為正常痛閾值。陽性對照組腹腔注射阿司匹林10mg/kg，陰性對照組腹腔注射等體積(0.2mL/20g)的5%吐溫-80溶液，藥物實驗組給藥揮發(fā)油0.15、0.3ml/kg，測15、30、60、90min痛閾值，比較給藥前后痛閾值大小。結果見表3。表3廣玉蘭葉揮發(fā)油對小鼠痛閾反應的影響^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與陰性對照組比較，*P<0.01，**P<0.05實驗結果表明，廣玉蘭揮發(fā)油對小鼠有明顯的鎮(zhèn)痛作用，與陰性對照組相比，差異顯著(P<O.Ol)。具體實施例方式下述實施例用以進一步說明本發(fā)明，但并不由此限制本發(fā)明范圍。實施例1取廣玉蘭新鮮葉500g，加10倍量水，水蒸氣蒸餾5小時，用油水分離器分離含水揮發(fā)油，含水揮發(fā)油以乙醚少量多次萃取后，用無水硫酸鈉脫水干燥過夜，過濾濃縮得到廣玉蘭揮發(fā)油。揮發(fā)油成淡黃色透明狀液體，有特殊香味，得油率為0.39%(ml/100g)，即得廣玉蘭揮發(fā)油1.95mL。揮發(fā)油少量氯仿溶解后進行GC-MS分析，結果見表4。色譜條件石英毛細管柱HP-5MS(30mX0.25mmX0.25um)，載氣為氦氣，柱流量lml/min升溫至260°C;質譜條件EI電離源，電離能量70eV，離子源溫度230°C，掃描范圍30-500amu，進樣量1.0uL，分流比10:1。表4廣玉蘭葉揮發(fā)油成分分析結果(水蒸氣蒸餾法)^il化合物名稱分子量相對含量/%相似度/%1a-旅烯a-Pinene1362卩-水芹烯e-Phellandlrene1363e-羅烯日-Pinene13642-蒈烯2-Carene1365D-檸檬烯D-Limonene1366P-月桂烯e-Myrcene1367a-松油醇a-terpineol1548古巴烯Copaene2049P-新丁子香烯P-Neclovene20410莰烯Camphene13611石竹烯Caryohpyllene20412綠葉烯Patchoulene20413a-金合歡稀a-Famesene20414a-石竹烯a"Caryophyllene20415馬兜鈴烯Aristolene20416大根香葉烯-DGemacrene-D20417擅紫三烯Santolinatriene13618羅漢柏烯-13Thulopene20419a-蓽澄莂烯a-Cubebene20420S-開子烯S-Selinene204213，7-二甲基-1，3，7辛三烯I,3，7-OCtatriene,3，7-dimethyl-13622e-蛇床烯e-Humulene20423(-)-藍桉醇(-)-Globulol22224喇叭醇Ledol22225愈創(chuàng)醇Guaiol22226新異長葉烯Neoisolongifolene222273-環(huán)己烯甲酸乙酯Ethyl3-Cyclohexenechrboxylate154614740962297400968955060584299999989999889899008998999991479226026P5160;^M64014180057實施例2取廣玉蘭葉1000g，粉碎成粒徑約為0.5-1.0mm的粗粉，投入到萃取斧中，萃取斧壓力為35Mpa，溫度為35"C;—級分離溫度為為40°C，壓力為15Mpa，二級分離溫度為20°C，壓力為6Mpa。超臨界流體靜態(tài)浸泡原料lh，設備穩(wěn)定后進行動態(tài)萃取，由接收器收集產(chǎn)品。最后得廣玉蘭葉揮發(fā)油4.2mL，揮發(fā)油成淡黃色透明液體，有特殊香味，得油率為0.42°/。(ml/100g)。揮發(fā)油加少量氯仿溶解后進行GC-MS分析，結果類似水蒸氣蒸餾相似。權利要求1、廣玉蘭葉揮發(fā)油在制備抗菌、鎮(zhèn)痛藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及廣玉蘭葉揮發(fā)油在制藥上的用途。廣玉蘭葉先采用常規(guī)的揮發(fā)油提取分離方法提取后，可得到玉蘭揮發(fā)油。藥理研究表明，廣玉蘭葉揮發(fā)油具有良好的抗菌抑菌作用，還具有較強的鎮(zhèn)痛作用，可用于制備抗菌、鎮(zhèn)痛藥物。文檔編號A61K36/185GK101406521SQ20071017565公開日2009年4月15日申請日期2007年10月10日優(yōu)先權日2007年10月10日發(fā)明者張樹祥,熊國裕申請人:北京星昊醫(yī)藥股份有限公司