專利名稱：一種α-葡萄糖苷酶抑制劑——夏枯草提取物及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物，具體地說是涉及夏枯草提取物作為a -葡萄糖 苷酶抑制劑，及其該提取物的提取方法。
技術(shù)背景根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟報告，目前全球糖尿病人數(shù)已逾l億，預(yù)測2025年將 突破3億，主體為2型糖尿病 (Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group. Type 2 diabetes practical targets and treatments 2005， fourth edition 6-7;25)。我國糖尿病患病率逐年增高，從1979年的0. 67%上升到1997年的3. 6%， 估計現(xiàn)已有糖尿病患者2000萬以上，居世界第2位(丁學(xué)屏主編.《中西醫(yī)結(jié) 合糖尿病學(xué)》人民衛(wèi)生出版社.2004.3第l版，1, 52)，其中2型糖尿病亦占 到90%。因此，預(yù)防和治療糖尿病極為緊迫。糖尿病前期即葡萄糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation, IGR)，其包 括空腹血糖受損(i即aired fasting glucose, IFG)和葡萄糖耐量缺損(i即aired glucose tolerance IGT)。而發(fā)展成糖尿病，幾乎都要經(jīng)過IGT階段(Alice Y.Y. Cheng, George Fantus. Oral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetes mellitus CMAJ. 2005; 172(2): 213-226.)。我國有近IGT 3000萬人，(衛(wèi)生部疾 病控制司，中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.中國慢性病預(yù)防與控制2004; 12 (6): 283.)他們是最重要的2型糖尿病高危人群，每年約有8%~11%進展為2型糖尿 病，其轉(zhuǎn)化的危險性居世界前列。對于IGT和2型糖尿病早期患者，均表現(xiàn)為餐后高血糖，而餐后高血糖對機 體的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過空腹高血糖，(衛(wèi)生部疾病控制司，中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會. 中國慢性病預(yù)防與控制2004; 12 (6): 283.)餐后高血糖的糖毒作用，不僅極 易誘發(fā)大血管、微血管、周圍神經(jīng)等多組織的病變，引起各種并發(fā)癥，(Bell DS, Importance of postprandial glucose control. Southern med J 2001:94(8) :804-809.)還與冠心病和糖尿病的總死亡率之間相關(guān)性大于空腹高 血糖，所以降低餐后血糖是預(yù)防2型糖尿病的發(fā)生，減少其并發(fā)癥和降低死亡率 的重要措施之一。因此，a -葡萄糖苷酶抑制劑，被亞太地區(qū)2型糖尿病政策組， 制訂的2005年第四版《2型糖尿病實用目標(biāo)與治療》 一書中，仍然推薦為降餐 后血糖的一線藥物(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group. Type 2 diabetes practical targets and treatments 2005， fourth edition 6—7;25)。a -葡萄糖苷酶抑制劑是通過抑制小腸上皮細(xì)胞表面a -葡萄糖苷酶的活性， 延遲和減少單糖在其上部的吸收，明顯降低餐后高血糖(Coutinho M，Gerstein HC，Wang Y, etal.The relationship between glucose and incident cardiovascular events. A metaregression analysis of published data from 20 studies of 95,783 individuals followed forl2. 4 years. Diabetes Care 1999 ;22 (2) :223-240.)，來治療葡萄糖耐量降低和2型糖尿病的(DECODE Studty Group. The European Diabetes Epidemiology Group. Glucose tolerance and cardiovascular mortality:comparison of fastiog and 2-hour diagnostic criteria. Arch Intern Med. 2001,161(3):397-405.)。上個世紀(jì)七十年代先后從微生物發(fā)酵產(chǎn)生的三種a -葡萄糖苷酶抑制劑，即 阿卡波糖(拜唐蘋)、伏格列波糖(倍欣)和米格列醇己被廣泛應(yīng)用于臨床。 STOP-NIDDM(2003年公布有9個國家40個研究中心參加，用拜唐蘋lOOmg， tid， 干預(yù)人群平均3.6年))研究已證實(Chiasson JI， Josse RG， Gom is R， etal. Acarbose treatment and the risk of cardiovascular disease and hypertension in patients with impaired glucose tolerance the STOP-NIDDM trial JAMA， 2003, 290(4): 486-494.)，阿卡波糖可使IGT轉(zhuǎn)化為2型糖尿病 的危險下降36%，還可明顯減少其心血管疾病發(fā)生的危險性。(Van de Laar FA, UicassenPL， etal. Alpha-glucosidase inhibitors for type 2 diabetes mellitus. ACPJClub.2005;143(3):66.)阿卡波糖明顯降低糖化血紅蛋白；空腹和 負(fù)荷后血糖以及負(fù)荷后胰島素水平；并使體重指數(shù)降低。但是，上述這類抑制劑 市場價格都比較貴，要滿足低收入患者長期用其干預(yù)IGT、 2型糖尿病早期的餐后高血糖，延緩2型糖尿病的發(fā)生或減輕胰島e細(xì)胞功能的衰竭，是件不容易堅持的事。從天然產(chǎn)物、中藥中篩選更多、更便宜的a-葡萄糖苷酶抑制劑，近年來有 不少報道，有多糖、黃酮類、鞣質(zhì)、皂甙、生物堿或提取物等種類。葡萄糖耐量缺損、2型糖尿病早期的餐后高血糖毒性作用，極易誘發(fā)血管、 周圍神經(jīng)等多組織病變，引起各種并發(fā)癥，增加糖尿病的總死亡率。用抑制a-葡萄糖苷酶的方法，延緩單糖吸收，降低餐后高血糖，對防止糖毒作用十分關(guān)鍵。 而夏枯草提取物對a -葡萄糖苷酶是否有抑制作用，尚未見報導(dǎo)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種a -葡萄糖苷酶抑制劑——夏枯草提取物及其提 取方法。本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種a -葡萄糖苷酶抑制劑——夏枯草提取物，其特征在于該提取物為夏枯 草水提物和流浸膏。一種提取上述夏枯草提取物的方法，其提取方法如下(1) 夏枯草水提物的制備稱取夏枯草10g加純凈水冷浸，常溫下過夜， 在沸水浴上隔水煎煮，過濾，藥渣重復(fù)隔水煎煮2次，合并三次濾液，抽濾后得 到棕色的澄清濾液，再置于坩堝內(nèi)，在水浴中蒸發(fā)濃縮至相當(dāng)生藥濃度為 0. 5g/ml;(2) 夏枯草流浸膏的制備取上述(1)的夏枯草水提物，加入乙醇，混勻靜置過夜，經(jīng)離心，棄沉淀，得到上清液置于坩堝內(nèi)，在水浴中揮盡乙醇，蒸 發(fā)濃縮至流浸膏。上述步驟(1)水提物中，夏枯草加10倍純凈水浸泡，水浴煎煮時間2小時， 四層紗布過濾，合并三次濾液，4'C下靜置過夜，抽濾后的濾液放入坩堝內(nèi)，于 水溫75t:蒸發(fā)濃縮。上述步驟(2)流浸膏提取中，在夏枯草水提物中加入95%乙醇，使其濃度 達50%，混勻，4。C下靜置過夜，用3000r/min的離心機離心10min，得到上清 液置于坩堝中，在75。C水浴中揮盡乙醇。上述的夏枯草提取物在制備a -葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用。有益效果經(jīng)實驗研究結(jié)果表明夏枯草水提物按31. 25 mg/ml、 62. 5 mg/ml、 125 mg/ml、 250 mg/ral、 500 mg/ml相當(dāng)生藥的五個不同濃度的水提物，以及5 g/ml拜唐蘋 加入測定體系，結(jié)果拜唐蘋的抑制率為73.9%,而夏枯草水提物的抑制率達 84.6-96.2%，明顯高于拜唐蘋(見表l)。夏枯草流浸膏的抑制率，按12.5mg/ml、 25mg/ral、 50 mg/ml、 100 mg/ml、 200 mg/ml五種不同濃度的流浸膏，以及5 mg/ml拜唐蘋加入測定體系，結(jié)果拜 唐蘋的抑制率為71. 4% ，流浸膏抑制率達93. 5 98. 4% 。
具體實施方式
實施例1一種a -葡萄糖苷酶抑制劑——夏枯草提取物的提取方法如下 (1)夏枯草水提物的制備稱取夏枯草10g加10倍純凈水冷浸，常溫下 過夜，沸水浴上蒸煮2小時，四層紗布過濾，藥渣重復(fù)蒸煮2次，合并三次濾液， 4'C下靜置過夜，抽濾后得到棕色的澄清抽濾液，再置于坩堝內(nèi)，75。C水浴上濃 縮至相當(dāng)生藥濃度為0. 5g/ml。(2)夏枯草流浸膏的制備取上述(1)的夏枯草水提物，95%加入乙醇 達到50%濃度，混勻，4。C下靜置過夜，經(jīng)離心3000r/min, 10min，棄沉淀，將 上清液部分置于坩堝內(nèi)，在水浴中揮盡乙醇，蒸發(fā)水溫75。C濃縮至流浸膏。 實施例2夏枯草提取物對a -葡萄糖苷酶的抑制作用(一) 材料1、 試劑 a-葡萄糖苷酶，購于Sigma公司；對硝基苯酚-a -吡喃葡萄糖苷 (pNPG)，購于德國Merck公司；還原型谷胱甘肽，K服進口分裝；氫氧化鈉、碘化鉀、碘、氨水、a-萘酚、95%乙醇、無水乙醇、硫酸、丙酮，為上?；瘜W(xué)試 劑有限公司出品；硫酸銅，上海振欣試劑廠生產(chǎn)；無水碳酸鈉，為上海虹光化工 廠產(chǎn)品；乙醚，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀， 購于廣東汕頭西隴化工廠，以上均分析純試劑。2、 儀器 UV7500可見光分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司； FA2004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；低速自動平衡離心機，北京醫(yī) 用離心機廠；電熱三用水箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠；WH-1微型旋轉(zhuǎn)混合儀，上海滬 西分析儀器有限公司；pHs-25雷磁數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)設(shè)備公司；KQ-500B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；松下BCD-251WD冰箱，無錫松下冷 機公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥機，上海精密實驗設(shè)備有限公司；巨輪牌植物 粉碎機，河北黃驊齊家科學(xué)儀器廠；3650A紫外分析儀，上?？扑嚬鈱W(xué)儀皿廠； SH2-D (III)循環(huán)水式真空泵，鞏義市英山路予華儀器廠。3、 藥物與藥材拜唐蘋，拜耳醫(yī)藥保健有限公司(批號109291，日期 06.11.29)成分阿卡波糖，每片含50毫克阿卡波糖；夏枯草購于南京中醫(yī)藥 大學(xué)門診部國醫(yī)堂。(二) 方法l.夏枯草提取物成分鑒定方法l.l三氯化鐵反應(yīng)將提取液滴至瓷反應(yīng)板上，加數(shù)滴1%三氯化鐵試劑， 觀察顏色反應(yīng)。1.2氨水反應(yīng)將提取物滴至濾紙上，經(jīng)濃氨水上熏數(shù)分鐘，立即放到紫 外燈下觀察是否有黃色熒光反應(yīng)。1.3雙縮脲反應(yīng)取提取物lml加入數(shù)滴雙縮脲試劑，混勻，觀察顏色反應(yīng)。1.4 a -萘酚反應(yīng)取lml提取液加入1 2滴a -萘酚，再延管壁加入數(shù)滴 濃硫酸，觀察顏色反應(yīng)。1. 5碘反應(yīng)取lml提取液加入1滴碘液試劑觀察顏色反應(yīng)。2. a -葡萄糖苷酶活性測定(寇彤,孟曉敏，常建濤，等.何首烏對a -葡萄 糖苷酶活性的抑制作用[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2006, 25(4):239-241.) 反應(yīng)系統(tǒng)為67 mmo1/ L磷酸鉀緩沖液(37。C， pH 6.8 )2.0ml， 3咖ol/L谷胱甘 肽溶液50ul， 3.84u/ml a-葡萄糖苷酶溶液50ul，混勻，37。C水浴保溫10min 后，加入20mmol/L pNPG溶液30 ul，再置原水浴中繼續(xù)保溫10 min后，經(jīng)80 。C水浴中滅活，再加入0. 01 mo1/ L Na2C03溶液10 ml冷卻后，于波長400nm處 測定在酶的作用下釋放出對硝基酚(pNP)的吸光度(O.D)。其中酶活力單位定 義J37°C、 pH6. 8條件下，反應(yīng)體系中pNP在400 nm處每分鐘吸光值變化0. 001 規(guī)定為一個酶活力單位?？瞻讓φ展軆?nèi)不加a-葡萄糖苷酶和pNPG，加入等量的 蒸餾水補足體積。3. 夏枯草提取物抑制活性的測定反應(yīng)系統(tǒng)為67 ramo1/ L磷酸鉀緩沖液 (37°C, pH6.8)2.0ml， 3咖ol / L谷胱甘肽溶液50 ul， 3. 84 u/ml a -葡萄糖昔 酶溶液50ul，夏枯草取物200ul (陽性藥對照管，拜唐蘋5mg/ml)混勻，其他 操作同上。夏枯草提取物空白對照管內(nèi)除不加a-葡萄糖苷酶和pNPG外，加入不 同濃度的夏枯草提取物200ul和等量的蒸餾水補足體積。一個抑制劑活力單位定義37°C、 p服.8條件下，相同時間內(nèi)降低l個酶活 力單位的吸光值。抑制百分率=(抑制劑活力/酶活力)X100%=[酶活力-酶活力(加入藥物)]/ 酶活力X10(m，計算公式簡化為抑制百分率-[l-(中藥提取物0.D-中藥提取 物空白管O.D) /酶活O.D]X10(m 。 (三)、結(jié)果1,夏枯草提取物抑制活性1.1夏枯草水提物抑制率不同濃度的夏枯草水提物，拜唐蘋——作陽性 對照藥抑制率見表l。結(jié)果表明，其水提物對該酶的抑制作用均有濃度梯度的量 效抑制關(guān)系。表l夏枯草水提物對a -葡萄糖苷酶的抑制率_夏枯草水提物相當(dāng)生藥mg /ml31,25 62.5125250 50084.6%96.2% 91.6% 86.9% — -，無法測定(O.D值溢出)1.2夏枯草流浸膏抑制率不同濃度流浸膏的抑制率見表2。結(jié)果表明， 其流浸膏對該酶的抑制作用均有濃度梯度的量效抑制關(guān)系。_表2夏枯草流浸膏對a -葡萄糖苷酶的抑制率_m,仏 拜唐蘋 _夏枯草流浸膏mg /ml_抑制物 ， -5mg/ml12.525 50100 200抑制率(1%) 71.4% 95.8% 93.5% 98.4% - --，無法測定(O.D值溢出) 1. 3夏枯草提取物成分初步鑒定取夏枯草兩種提取物，經(jīng)氨水、三氯化 鐵、a-萘酚中均顯陽性反應(yīng)，碘反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)中呈陰性，結(jié)果見表3。結(jié) 果表明，夏枯草提取物的抑制成分可能為含有羥基類黃酮苷的物質(zhì)。表3夏枯草提取物成分鑒定中藥名提取物氨水反 應(yīng)三氯化鐵 反應(yīng)雙縮脲 反應(yīng)a:碘反應(yīng)夏枯草水提物 流浸膏黃色 黃色褐色 褐色一紫紅色 -紫紅色 -(四)、結(jié)論體外實驗結(jié)果表明，夏枯草水提物和流浸膏對a -葡萄糖苷酶均有抑制作用， 且呈量效關(guān)系。其對a -葡萄糖苷酶抑制作用的成分可能與含羥基類黃酮苷化合 物有關(guān)。拜唐蘋抑制物5mg/ml抑制率(1%) 73.9%
權(quán)利要求
1.一種α-葡萄糖苷酶抑制劑——夏枯草提取物，其特征在于該提取物為夏枯草水提物和流浸膏。
2. —種提取權(quán)利要求1所述的夏枯草提取物的方法，其提取方法如下(1) 夏枯草水提物的制備稱取夏枯草10g加純凈水冷浸，常溫下過夜， 在沸水浴上隔水煎煮，過濾，藥渣重復(fù)隔水煎煮2次，合并三次濾液，抽濾后得 到棕色的澄清濾液，再置于坩堝內(nèi)，在水浴中蒸發(fā)濃縮至相當(dāng)生藥濃度為 0. 5g/ml;(2) 夏枯草流浸膏的制備取上述(1)的夏枯草水提物，加入乙醇，混 勾靜置過夜，經(jīng)離心，棄沉淀，得到上清液置于坩堝內(nèi)，在水浴中揮盡乙醇，蒸 發(fā)濃縮至流浸膏。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于步驟(1)水提物中，夏枯 草加10倍純凈水浸泡，水浴煎煮時間2小時，四層紗布過濾，合并三次濾液，4 'C下靜置過夜，抽濾后的濾液放入坩堝內(nèi)，于水溫75'C蒸發(fā)濃縮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于步驟(2)流浸膏提取中， 在夏枯草水提物中加入95%乙醇，使其濃度達50%，混勻，4'C下靜置過夜， 用3000r/min的離心機離心10min，得到上清液置于坩堝中，在75。C水浴中揮盡 乙醇。
5. 如權(quán)利要求1所述的夏枯草提取物在制備ci-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
一種α-葡萄糖苷酶抑制劑——夏枯草提取物，該提取物為水提物及流浸膏。其提取方法是將夏枯草冷浸、熱提得到水提物；取部分水提物經(jīng)醇沉后，濃縮上清液得到其流浸膏。實驗表明夏枯草水提物按31.25mg/ml、62.5mg/ml、125mg/ml、250mg/ml、500mg/ml相當(dāng)生藥的五個不同濃度，以及5mg/ml拜唐蘋作陽性藥對照，分別加入測定體系，結(jié)果表明，拜唐蘋對α-葡萄糖苷酶的抑制率為73.9％，水提物的抑制率達84.6～96.2％；流浸膏按12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml五種不同濃度加入測定體系，其抑制率達93.5～98.4％。其提取物成分經(jīng)鑒定，含羥基黃酮苷類化合物，可能與抑制α-葡萄糖苷酶活性有關(guān)。
文檔編號A61P3/10GK101129460SQ20071013147
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者吳慧平, 宇 朱 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)