專利名稱：：用于神經(jīng)再生的層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管及其制造和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及哺乳動物神經(jīng)再生的領(lǐng)域。尤其涉及一種用于促進跨越神經(jīng)斷裂兩端間的間隙的神經(jīng)再生的中空導(dǎo)管。本發(fā)明亦揭示制造及使用該導(dǎo)管的方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)再生是一種復(fù)雜的生物現(xiàn)象。成熟的神經(jīng)不再復(fù)制，也就是不再進行細胞分裂。神經(jīng)系統(tǒng)一旦受損即十分難以復(fù)元，且身體其它部分可能衰竭。在外圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中，若損傷較小，神經(jīng)可自行再生。雖然成人PNS在受傷后可再生，其并非均能造成功能復(fù)元。這主要是由于再生軸突誤導(dǎo)向不當(dāng)之標(biāo)的。當(dāng)神經(jīng)被大于l公分長度之間隙分隔時，缺乏特定導(dǎo)引的軸突可能會向后生長至近端的神經(jīng)殘根，進入不當(dāng)?shù)纳窠?jīng)內(nèi)衣或形成神經(jīng)瘤。在所有上述情況下，受損軸突的再生可能費時數(shù)月。為了增加軸突再生及功能復(fù)元的可能性，曾使用諸多策略。這些策略包括植入自體移植物、同種異體移植物、異種移植物、及填充有許旺細胞(SC)的管狀物。自體移植可能產(chǎn)生一些問題，包括供應(yīng)處發(fā)病、供應(yīng)處遠程的除神經(jīng)、神經(jīng)瘤形成、以及適合收取神經(jīng)之處有限的事實。這些缺點導(dǎo)致了人工神經(jīng)移植物的開發(fā)。研究集中于創(chuàng)造管狀物，或神經(jīng)導(dǎo)引物，以在CNS(中樞神經(jīng)系統(tǒng))及PNS中橋接截斷神經(jīng)間的間隙。在發(fā)表至今的諸多管接再生術(shù)(entubulation)研究中，已在PNS中達到某些最佳結(jié)果(S.E.MackinnonandA.L.Dellon,戶/osricieco"Wrac"ve5Wg，85:419-24(19卯)；M.F.Meeketal.,M/cmsw取oU9:247-53(1999);S.T.Lietal.，C7/"M"fe《9:195-200(1992))。除了生物可降解性及生物可兼容性的問題外，亦確立了導(dǎo)管的各種物理特性，如導(dǎo)管的直徑及長度、管腔表面的微幾何學(xué)、及管壁的多孔性及可通透性的影響性。將培養(yǎng)的SC導(dǎo)入合成神經(jīng)移植物的管腔中促進了外圍神經(jīng)的再生(V.Guenardetal.，J7Vewmsc/,12:3310-20(1992))。為了使SC在移植物中存活，必須使其附著，因為附著是SC存活及增生的先決要件。層黏蛋白(laminin)是一種細胞外基質(zhì)蛋白，在神經(jīng)再生中使SC附著的可用蛋白質(zhì)。層黏蛋白可與SC表面的整合素(integrin)交互作用而支持SC附著及增生。Madison等人揭示使用一種生物可吸收性神經(jīng)導(dǎo)引物以加速小鼠中的軸突再生，該導(dǎo)引物以含層黏蛋白的凝膠充填(Madisonetal.,五x/en'me"to/A^wro/ogv,88:767-772(1985))。然而，制造以這些促進劑充填的管狀物相當(dāng)昂貴且過程冗長。Rangappa等人揭示使用一種以平行排列的層黏蛋白包覆聚(l-乳酸辨維絲充填的神經(jīng)導(dǎo)引物，以誘發(fā)健全的神經(jīng)突生長并提供方位導(dǎo)向(N.Rangappaetal.，JAom^/Materies，51:625-34(2000))。然而，這些纖維絲在導(dǎo)引信道內(nèi)的排列不規(guī)則且難以復(fù)制。美國第4,963,146及5,019,087號專利揭示一種用于在活體內(nèi)促進斷裂的哺乳動物神經(jīng)再生的中空導(dǎo)管，其管壁包括I型膠原蛋白及含層黏蛋白的材料，以及制備這些導(dǎo)管的方法。這些方法包括下列步驟形成包含I型膠原蛋白及含層黏蛋白材料的分散液；添加沉淀劑至該分散液；及以旋轉(zhuǎn)軸接觸沉淀物以形成管狀的膠原蛋白薄膜。研究顯示生物環(huán)境與人工材料間的交互作用最可能取決于材料的「表面特性」。因此，對已有的生物材料作表面改質(zhì)以增進材料的生物可兼容性，近年來已成為生物材料研究的主要焦點。不同實驗室已嘗試數(shù)種合成方法，例如接枝長垸基鏈或生物活性分子。這些合成方法時常導(dǎo)致原始材料物理特性的改變。反之，已知氣體表面改質(zhì)方法可以改質(zhì)生物材料的表面特性而不影響其主體物理特性。此外，可使用廣泛種類的化學(xué)物質(zhì)(包括無法藉由傳統(tǒng)合成方法予以高分子化者)以將特定官能基并入基材中。氣體離子體處理廣泛用于聚(乳酸)(PLA)或聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)的化學(xué)改質(zhì)。非高分子化氣體離子體可在聚合物表面創(chuàng)造反應(yīng)位點，如過氧化物及磺酸基。離子體法曾被用于增加PLA的親水性及增進其細胞附著性(J.Yangetal.，尸o(ym^Wvrec/^o/，13:220-6(2002))。另一個方法是結(jié)合離子體處理及膠原蛋白固定，亦可顯著增進PLA之細胞親和性(J.Yangetal.，Aomatehafe,23:2607-14(2002))。這些結(jié)果指出經(jīng)離子體處理后聚合物的表面組成及表面上的官能基對該聚合物的細胞親和性有很大的影響。雖然已經(jīng)由使用包含細胞附著性分子(如層黏蛋白)的神經(jīng)導(dǎo)引物/導(dǎo)管獲得改善的結(jié)果，仍有進一步大幅改善的空間。此外，仍希望能提供一種手段，從而再生更多有髓鞘的軸突、達到更快速的神經(jīng)生長、并跨越更長的神經(jīng)間隙。仍需要滿足這些需求并降低或消除已有技術(shù)試圖修復(fù)神經(jīng)曾遭遇的問題，例如血管再生、過度纖維生成、神經(jīng)纖維重新導(dǎo)向及最終的末梢器官功能復(fù)元不佳。
發(fā)明內(nèi)容通過本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)一種新穎的神經(jīng)再生用導(dǎo)管，其消除或?qū)嵸|(zhì)上減少許多已有技術(shù)試圖再生神經(jīng)的相關(guān)缺點或問題。因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接其斷裂兩端間的間隙的中空導(dǎo)管，包含由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的管壁，該管壁的管腔表面共價鍵結(jié)有層黏蛋白，其中該層黏蛋白的鍵結(jié)通過氣體離子體處理而達成。在另一方面，本發(fā)明提供一種制造層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管的方法，該導(dǎo)管用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接其斷裂兩端間的間隙，該方法包含下列步驟(a)以適當(dāng)功率密度及適當(dāng)壓力的氣體離子體，將由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的中空導(dǎo)管處理充分時間，以活化高分子表面以與層黏蛋白鍵結(jié)；及(b)以層黏蛋白接觸該導(dǎo)管的管腔表面充分時間，以使層黏蛋白與高分子表面間形成共價鍵。在又一方面，本發(fā)明提供一種促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接其斷裂兩端間的間隙的方法，包含使該斷裂神經(jīng)的兩端分別接觸中空導(dǎo)管的兩端，該導(dǎo)管包含由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的管壁，該管壁的管腔表面共價鍵結(jié)有層黏蛋白，其中該層黏蛋白的鍵結(jié)通過氣體離子體處理而達成。上述
發(fā)明內(nèi)容及實施方式與附圖一并閱讀將更增了解。為供闡明本發(fā)明的目的，附圖中所示具體實施例為目前較佳者。然而，應(yīng)了解本發(fā)明并不限于所示的確切設(shè)置及手段。在附圖中-圖1顯示由氧離子體處理所制備的層黏蛋白改質(zhì)薄膜的FTIR吸收圖譜(a)未處理的PLGA薄膜；(b)層黏蛋白-PLGA薄膜；(c)未處理的殼聚糖薄膜；及(d)層黏蛋白-殼聚糖薄膜。圖2顯示由化學(xué)方法或氧離子體處理所制備的層黏蛋白改質(zhì)薄膜的XPS圖譜(a)由化學(xué)方法所制備的層黏蛋白-PLGA薄膜的XPSCls核心水平圖譜，其中左半部為未處理的PLGA薄膜而右半部為層黏蛋白-PLGA薄膜；(b)由化學(xué)方法所制備的層黏蛋白-PLGA薄膜之XPSNls核心水平圖譜，其中左半部為未處理的PLGA薄膜而右半部為層黏蛋白-PLGA薄膜；及(c)由氧離子體處理所制備的層黏蛋白-殼聚糖薄膜之XPSCls核心水平圖譜，其中左半部為未處理的殼聚糖薄膜而右半部為層黏蛋白-殼聚糖薄膜。圖3顯示許旺細胞(SC)的顯微鏡照片(a)培養(yǎng)于培養(yǎng)皿上的SC的外觀形態(tài)；及接種后1及3天時附著于改質(zhì)薄膜上的SC的外觀形態(tài)一(b)經(jīng)及(c)未經(jīng)氧離子體處理的層黏蛋白-殼聚糖薄膜。圖4包含圖4A及4B，顯示附著于改質(zhì)薄膜上的SC的定量結(jié)果。圖4A是接種后10天時附著于不同薄膜上的SC的MTS試驗結(jié)果。接種細胞的數(shù)量約為lxl()S個細胞/L。將三種改質(zhì)薄膜互相比較。圖4B顯示三種薄膜上細胞存活度的相對比例。吸收波長為490nm?！笟ぞ厶?離子體+層黏蛋白」經(jīng)氧離子體處理之層黏蛋白-殼聚糖薄膜。「殼聚糖+離子體」未經(jīng)氧離子體處理的層黏蛋白-殼聚糖薄膜?！笟ぞ厶恰怪挥袣ぞ厶潜∧ぁD5顯示具有不同DDA的殼聚糖在70°C下之400MHz&NMR圖譜(a)經(jīng)堿水解的殼聚糖(DDA=96.4±0.72%);及(b)市面可購得的殼聚糖(DDA=82.5±1.15%)。圖6包含圖6A及6B。圖6A顯示并入若丹明-BSA的神經(jīng)導(dǎo)管，以熒光顯微鏡偵測(氧離子體處理5分鐘)。圖6B顯示并入若丹明的神經(jīng)導(dǎo)管的橫截切片，其中(a)及(b)為熒光影像，(c)及(d)為相反差影像。導(dǎo)管系經(jīng)氧離子體處理5分鐘(a、c)或10分鐘(b、d)。圖7包含圖7A及7B，顯示行為分析的結(jié)果。圖7A顯示兩個實驗組之(a)BBB及(b)CBS分數(shù)，其中紅線代表使用層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管的組別，而藍線則代表使用未改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管的組別(所顯示的數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，n二3)。圖7B顯示接受未改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管的動物的跑步機分析結(jié)果，(a)脊髓損傷(SCI)剛發(fā)生及(b)受傷后兩個月時。圖8包含圖8A至8E，顯示免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果。圖8A顯示損傷中心點處的層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管切片，以(a-c)微管蛋白pill(—種細胞骨架標(biāo)記物)及(d-f)ED-l(—種巨噬細胞標(biāo)記物)作免疫染色，其中(a)及(d)的切片位于T5及T6，(b)及(e)的切片位于受傷區(qū)域，(c)及(f)的切片位于TIO。圖8B顯示對GAP-43的蛋白印跡抗體反應(yīng)性，其中以星號標(biāo)記的層黏蛋白改質(zhì)組的相關(guān)光學(xué)密度顯著地較高(Student'st檢定)。圖8C顯示未改質(zhì)組在受傷后60天時的微管蛋白染色，其中(a)為橫截切片及(b)為縱向切片。圖8D顯示未改質(zhì)組在受傷后60天時的GAP-43染色，其中(a)為橫截切片及(b)為縱向切片。圖8E顯示未改質(zhì)組在受傷后60天時的其它兩種標(biāo)記物免疫染色，其中(a)為以C0X-2染色的縱向切片及(b)為以凋亡蛋白-3染色的橫截切片。具體實施例方式本發(fā)明提供一種用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接其斷裂兩端間的間隙的中空導(dǎo)管，包含由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的管壁，該管壁的管腔表面共價鍵結(jié)有層黏蛋白，其中該層黏蛋白之鍵結(jié)通過氣體離子體處理而達成。依據(jù)本發(fā)明，該生物可降解性高分子材料指傳統(tǒng)上用于制造神經(jīng)導(dǎo)管者，包括但不限于膠原蛋白、聚(乳酸)(PLA)、聚(甘醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)、聚己內(nèi)酯、聚(己內(nèi)酯-共-乳酸)(PCLA)、殼聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸、明膠及纖維蛋白。在本發(fā)明一較佳具體實施例中，該生物可降解性高分子材料為PLGA或殼聚糖。層黏蛋白是所有基底膜的一種主要成分?；啄榉指舯砥づc基質(zhì)，及圍繞神經(jīng)、肌肉纖維、平滑肌細胞及脂肪細胞的連續(xù)薄片。除其它物質(zhì)外，基底膜尚包含IV型膠原蛋白、層黏蛋白、巢蛋白(nidogen)、硫酸肝素蛋白多醣、及其它醣蛋白及蛋白多醣。人類胎盤含有大量的層黏蛋白，是不錯的層黏蛋白來源。層黏蛋白可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的方法，由例如基底膜及人類胎盤等材料萃取。這些萃取技術(shù)及有關(guān)層黏蛋白更詳細的討論述于RupertTimple等人的「層黏蛋白」一文("Laminin,"Md/zocfe。/五"^y附o/ogy畫5^wc^/ra/Cowfraca/e尸"WX.五jc^v2ce〃w/orA/^/r/x，Vol.82.Chap.47,pp.831-838,AcademicPress,(1982))及HyndaK.Kleinman等人的「層黏蛋白之生物活性」一文("BiologicalActivitiesofLaminin，"Jowtw/0/Ce〃w/ar所0c/^m&",Vol.27,pp.317-325(1985));兩者的內(nèi)容皆以如同全文揭示的參考方式并入本文。一般而言，本發(fā)明導(dǎo)管的內(nèi)直徑位于約100pm至約2000的范圍內(nèi)。較佳者，本發(fā)明導(dǎo)管的內(nèi)直徑為約570pm。導(dǎo)管的管壁厚度代表所需可通透性及壓縮強度間的平衡，以避免崩陷。較佳為將導(dǎo)管制作為盡可能地薄，但在活體內(nèi)使用時仍能禁得起縫合及崩陷。導(dǎo)管的適當(dāng)管壁厚度位于約0.5mm至約1.5mm的范圍內(nèi)。較佳者，本發(fā)明導(dǎo)管的管壁厚度介于約1mm至約1.2mm之間。導(dǎo)管的長度依欲橋接的神經(jīng)間隙長度而有所不同。本發(fā)明亦提供一種制造層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管的方法，該導(dǎo)管用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接其斷裂兩端間的間隙，該方法包含下列步驟(a)以適當(dāng)功率密度及適當(dāng)壓力的氣體離子體，將由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的中空導(dǎo)管處理充分時間，以活化高分子表面以與層黏蛋白鍵結(jié)；及(b)以層黏蛋白接觸該導(dǎo)管的管腔表面充分時間，以使層黏蛋白與高分子表面間形成共價鍵。依據(jù)本發(fā)明，用于制造本發(fā)明層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管的中空導(dǎo)管可為任何市面上可購得，由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的導(dǎo)管?；蛘撸梢曅枰匀魏我阎椒ㄖ圃煸撝锌諏?dǎo)管，例如Flynn等人述于歷om^enV^24:4265-4272(2003)中的纖維模板壓制法，以及Sundback等人述于所om^m'^24:819-830(2003)中的低壓注射模塑法；兩者的內(nèi)容皆以如同全文揭示的參考方式并入本文。在本發(fā)明一較佳具體實施例中，該中空導(dǎo)管依Huang等人述于/5/owe<iMa&r7&sPaW^cp/ZedMflteWa/s74:659-664(2005)(內(nèi)容以如同全文揭示的參考方式并入本文)中的凍干及金屬絲加熱法制造。簡言之，將基質(zhì)(如殼聚糖)溶液注入包含金屬(如Ni-Cr)絲作為軸心的模具中；將該包含基質(zhì)溶液的模具置入液態(tài)氮中；冷凍后，將該模具由液態(tài)氮中移出，并對該金屬絲施加電壓以加熱之；一旦包圍該金屬絲之基質(zhì)略為融化，將該金屬絲抽離基質(zhì)以在基質(zhì)中創(chuàng)造縱向的通道；可通過凍干法移除溶劑，以形成具縱向通道的導(dǎo)管。較佳者，用于制造本發(fā)明層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管的中空導(dǎo)管以殼聚糖或PLGA制成。離子體可概略定義為包含帶電及中性物種的氣體，包含下列中的某些電子、正離子、負離子、游離基、原子及分子。離子體處理改質(zhì)聚合物表面的常用方法?？墒┘舆@些表面改質(zhì)以達成各種目的，例如在表面產(chǎn)生特別的官能基，以與其它官能基進行特定交互作用。有關(guān)離子體技術(shù)的詳盡討論提供于C,M.Chan等人之5W/acei印o他24:1-54(1996)(內(nèi)容以如同全文揭示的參考方式并入本文)一文中。依據(jù)本發(fā)明，欲達成高分子對象的離子體處理，使該對象與欲用于處理的氣體接觸，并施加足以將該氣體離子化至離子體狀態(tài)的某一射頻(較佳為約13.56MHz)的高能量輻射。雖不欲受限于任何特定理論或作用機制，相信離子體可解離聚合物鏈中的共價鍵以形成與彼此或與離子體氣體本身中的自由基反應(yīng)的自由基，從而活化與離子體接觸的聚合物鏈。不同種類的氣體，例如氬、氧、氮、氟、二氧化碳及水，可產(chǎn)生各種應(yīng)用所需的獨特表面特性。依據(jù)本發(fā)明，用于處理中空導(dǎo)管的氣體離子體較佳為02或含02的氣體離子體。已知氧離子體可與范圍廣泛的聚合物反應(yīng)而在表面產(chǎn)生各種氧官能基，例如C-O、C=0、0-CK)及C03。相信聚合物表面上由氧離子體所產(chǎn)生的氧官能基與層黏蛋白的-NH2基反應(yīng)，造成層黏蛋白結(jié)合于導(dǎo)管的管腔表面。本發(fā)明離子體處理的效果不僅取決于用于產(chǎn)生離子體的氣體種類，亦取決于操作條件，例如功率密度、暴露時間、工作壓力、氣體流速、溫度、電極間距、氣室容積、基材偏置電壓、或這些條件的組合。依據(jù)本發(fā)明，使用由約2至約100W/cm2范圍的功率密度(以欲處理表面每單位面積之瓦特數(shù)表示)可獲得最佳結(jié)果。在本發(fā)明一較佳具體實施例中，所用功率密度為約50W/cm2。本發(fā)明中所用的離子體較佳為低壓離子體，亦即氣壓范圍由數(shù)微托耳(mTorr)至數(shù)百托耳。依據(jù)本發(fā)明，使用由約0mTorr至約80mTorr范圍的壓力可獲得最佳結(jié)果。在本發(fā)明一較佳具體實施例中，所用壓力為約36mTorr。暴露時間可選自約5至約10分鐘之間，只要離子體處理足以活化聚合物表面而不致于摧毀高分子材料的顯微結(jié)構(gòu)即可。在本發(fā)明一較佳具體實施例中，暴露時間為約5分鐘。其它處理條件(例如溫度及氣體流素)為可變因素，對本發(fā)明的新穎性及實用性并非關(guān)鍵。依據(jù)本發(fā)明，可通過任何適當(dāng)方法達成經(jīng)離子體處理的導(dǎo)管管腔表面與層黏蛋白的接觸。例如，可將含適當(dāng)濃度層黏蛋白的溶液添加至導(dǎo)管。該層黏蛋白溶液的量應(yīng)足以浸沒該導(dǎo)管。層黏蛋白及高分子表面間形成共價鍵的反應(yīng)條件(例如時間及溫度)取決于聚合物種類，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員鑒于本發(fā)明揭示，無須過度實驗即可決定之。在本發(fā)明一具體實施例中，于4°C下將導(dǎo)管浸泡于200^的100pg/ml層黏蛋白溶液中3小時。本發(fā)明進一走提供一種促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接其斷裂兩端間的間隙的方法，包含使該斷裂神經(jīng)的兩端分別接觸中空導(dǎo)管的兩端，該導(dǎo)管包含由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的管壁，該管壁的管腔表面共價鍵結(jié)有層黏蛋白，其中該層黏蛋白的鍵結(jié)通過氣體離子體處理而達成。本發(fā)明的層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管適于在PNS及CNS中橋接斷裂神經(jīng)并促進神經(jīng)再生及功能復(fù)元。使用時，使斷裂神經(jīng)的兩端分別接觸本發(fā)明導(dǎo)管(其略長于欲橋接的間隙)的兩端，但不在斷裂神經(jīng)上施加任何張力。將遠程及近端的神經(jīng)殘根部分地插入導(dǎo)管中。由于該導(dǎo)管具有彈性，其不需縫合即可維持于間隙中。然而，亦可視需要將斷裂端的神經(jīng)束膜與導(dǎo)管縫合。實施例l層黏蛋白改質(zhì)高分子薄膜的制備與定性1.1高分子薄膜的制備制備兩種高分子薄膜。有關(guān)PLGA(聚(乳酸-共-甘醇酸))薄膜，以溫和攪拌將購自Sigma化學(xué)公司(SigmaChemcialCo.，USA)的PLGA(50:50;Mw:40，000~75,000)溶解于二惡烷中，制成5%(wt/vol)的溶液。然后，將250(!l的該溶液添加于96孔培養(yǎng)盤中，浸泡其底部。于室溫下使溶劑蒸發(fā)而得到干燥PLGA薄膜。有關(guān)殼聚糖薄膜，則使用殼聚糖/醋酸溶液(2%w/v)取代之。去乙?；潭?gt;85%之殼聚糖(分子量645,000)由Sigma化學(xué)公司供應(yīng)。醋酸(98%)購自和光純藥工業(yè)株式會社。其后的方法與PLGA薄膜相同。使用MilliporeMilli-RO10Plus過濾系統(tǒng)，在18MQ的電阻下將水蒸餾及去離子化。1.2高分子薄膜的層黏蛋白改質(zhì)為使PLGA薄膜具有親水性及化學(xué)活性，首先將PLGA薄膜以氬離子體處理。該離子體處理在一輝光放電石英反應(yīng)器(型號SP100PlasmaSystem;制造商AnatechCo.Ltd.,USA)中的兩個平行電極板間進行。將離子體電源供應(yīng)器設(shè)于50W及13.56MHz的頻率。將基材面朝上地置于接地電極上，暴露于36微托耳氬氣壓的輝光放電下IO分鐘，以供隨后的層黏蛋白(L-2020;Sigma,St.Louis,MO)偶合反應(yīng)。然后，將200|xl的層黏蛋白溶液(100pg/ml)添加至96孔培養(yǎng)盤中經(jīng)離子體預(yù)先處理過的PLGA薄膜上，置于4。C下3小時。偶合反應(yīng)后，以PBS緩沖液將層黏蛋白-PLGA薄膜清洗數(shù)次。使用BCA蛋白質(zhì)分析套組(Pierce,Rockford,IL)計算固定于PLGA表面上的層黏蛋白量。首先以1:1之0.1MNaOH-MeOH及1:1之MeOH-水清洗殼聚糖薄膜以中和酸性，然后風(fēng)干之。其后的方法與PLGA薄膜相同。除了氬離子體外，本實驗中亦使用氧離子體。為供比較，亦通過下列化學(xué)方法進行層黏蛋白改質(zhì)。首先將200pl的100mMl-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二酰亞胺氫氯酸鹽(WSC，39391，Sigma)添加至PLGA薄膜經(jīng)1小時以活化其羧基。以PBS清洗后，令該薄膜與200|il的層黏蛋白溶液(100|ig/ml)于4。C下反應(yīng)3小時，隨后以PBS緩沖液清洗數(shù)次。使用BCA蛋白質(zhì)分析套組計算反應(yīng)及PBS清洗后的層黏蛋白量。為制備化學(xué)改質(zhì)的層黏蛋白-殼聚糖薄膜，首先需將羧基導(dǎo)入殼聚糖中。在室溫下依序添加20wt。/。NaOH(約50]il)及10wt。/。單氯乙酸溶液(約200)xl)，直到pH為7.4士0.2。之后以PBS將薄膜清洗數(shù)次。其后的方法與層黏蛋白-PLGA薄膜相同。將層黏蛋白改質(zhì)聚合物薄膜分為五組(1)薄膜于4。C下的100tig/ml層黏蛋白中浸泡3小時，然后以PBS清洗三次(物理性地吸附于薄膜上的層黏蛋白Lphys);(2)薄膜在添加WSC活化羧基后，在4°C下的100pg/ml層黏蛋白中浸泡3小時，然后以PBS清洗三次(通過物理吸附及化學(xué)鍵結(jié)而固定于薄膜上的層黏蛋白Lt。t);(3)薄膜經(jīng)02或Ar離子體處理后浸泡于IOO嗎/ml層黏蛋白中(Lo2及Lat);(4)空白薄膜；及(5)作為對照組的培養(yǎng)皿。固定于薄膜上的層黏蛋白百分比使用下式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中A層點蛋自為固定有層黏蛋白的薄膜的吸收度，而Ao為100pg/ml層黏蛋白的吸收度。為確認是否已成功地將層黏蛋白接枝于PLGA及殼聚糖表面，采用BCA蛋白質(zhì)分析計算層黏蛋白的量。依據(jù)表1，固定于PLGA上的層黏蛋白百分比高于殼聚糖上的。此外，這些結(jié)果亦顯示大多數(shù)層黏蛋白通過物理吸附固定于薄膜上。至于離子體處理，在兩種材料上02離子體的效能皆顯著高于Ar離子體。通過化學(xué)方法固定于PLGA上的層黏蛋白百分比幾乎等同于使用02離子體處理。PLGA薄膜上的層黏蛋白量為41.3嗎/cm2，但就層黏蛋白-殼聚糖薄膜而言，02離子體處理的效能更高。殼聚糖薄膜上的層黏蛋白量為30.6pg/cm2。由于其低機械強度，殼聚糖薄膜在水溶液中會膨脹，這使得通過化學(xué)方法的層黏蛋白改質(zhì)難以控制。綜上所述，與傳統(tǒng)上使用的化學(xué)方法相比較，02離子體是較佳的表面改質(zhì)方法。表1以BCA分析測定的固定于兩種薄膜上的層黏蛋白百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.3改質(zhì)表面的定性使用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜儀(FTIR)進一步定性所有薄膜的表面改質(zhì)。所有圖譜于4/cm的分辨率及16次掃描下收集，并以內(nèi)建的標(biāo)準(zhǔn)軟件包(Perkin-ElmerSpectrumOne,Perkin-ElmerCo.，Norwalk,CT,USA)分析。圖1顯示薄膜的FTIR吸收圖譜。有關(guān)層黏蛋白-PLGA薄膜，吸收圖譜上位于1458cm"的峰由于酰胺基(-CO-NH-R)而顯著增加。另一位于1134cm'1的峰則是由于酰胺基(CO-NH2)及胺基(-CH2NH2)。由于烷基的存在，在PLGA薄膜上有這些峰的吸收值。有關(guān)殼聚糖及層黏蛋白-殼聚糖薄膜，位于1564cm"至1649cm"的峰比例顯示出顯著的增加。位于1649cm'1的吸收峰指出酰胺基及胺基的存在，但只有酰胺基可在1564cm"吸收。兩個峰的百分比改變指出酰胺基的形成以及胺基的破壞。換言之，層黏蛋白已成功地固定于PLGA及殼聚糖薄膜上。此外，通過高解析X光光電分光鏡(XPS,VGMICROTECH,MT-500,U.K.)調(diào)查PLGA及殼聚糖薄膜的表面化學(xué)組成。圖譜以單色Mg-Ka輻射源(1253.6eV)于400W的功率下得自VGEscalab220i-xl分光鏡。使用配備有9頻道偵測器的CLAM4MCD電子分析器。以20eV的穿越能記錄Cls峰區(qū)(275—295eV)及Nls峰區(qū)(390-415eV)的高解析精密掃描。由相應(yīng)峰區(qū)計算各種Cls及Nls峰的濃度。采用高解析XPS測量研究薄膜在層黏蛋白改質(zhì)前后的表面化學(xué)變化。有及沒有層黏蛋白的PLGA薄膜的Cls區(qū)顯示出三個峰(圖2(a))。第一個峰(284.5eV)歸因于脂族碳鍵(-C-C-)或碳-氫鍵(-CH)的Cls。第二個峰(287.5eV)歸因于醚鍵(-C-O-)及-C-N鍵的Cls，而第三個峰(289.6eV)則歸因于類羰基種類(亦即-COO-、〉CO或-COOH)的Cls。然而，三種Cls的相對組成在層黏蛋白附著后即有所改變(如表2所示)?？捎^察到兩種不同的特征。第一，-CO及-CN鍵的比例增加至13.7%。第二，脂族碳鍵或碳-氫鍵的比例增加至80.3%。第三，醚鍵的比例減少。-COO-鍵及-COOH鍵的減少以及-CN鍵的增加可能是緣于酯鍵的切割以及酰胺鍵或胺鍵的形成。NlsXPS圖譜上-N-H鍵及-N-C-鍵的增加亦支持此推論(表2及圖2(b))。這顯示層黏蛋白與PLGA薄膜間形成了共價鍵。有及沒有層黏蛋白的殼聚糖薄膜的ClsXPS圖譜示于圖2(c)。-C-N-鍵及羰鍵顯著增加，而-C-H鍵及-C-C-鍵則減少(表2)。這些結(jié)果可能緣于脂族碳鍵或碳-氫鍵的破壞以及酰胺鍵的形成。如同F(xiàn)TIR吸收圖譜所示，XPS圖譜顯示層黏蛋白為共價鍵結(jié)于殼聚糖薄膜上。由于殼聚糖及層黏蛋白-殼聚糖薄膜中皆存在有-N-H鍵及-N-C-鍵，NlsXPS圖譜在此未示出。表2樣本在層黏蛋白固定化前后的高解析ClsXPS及NlsXPS峰的碳官能基比例<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1.4許旺細胞在改質(zhì)表面之附著及增生以許旺細胞(SC)培養(yǎng)確認層黏蛋白改質(zhì)薄膜的細胞親和性。使用J.P.Brockes等人于Sra/"Aaye^r/z.165:105-118(1979)中提議的方法單離并培養(yǎng)來自雌性Wistar大鼠的許旺細胞。簡言之，以過量麻醉將成年雌性Wistar大鼠犧牲。切除左及右坐股神經(jīng)，以磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)清洗之，并切成1mm長的小塊。于3mlDMEM(Dulbecco，smodifiedEaglemedium)中以0.03%膠原蛋白酶/0.25%胰蛋白酶對這些片段作酵素消化處理，并置于37。C下的5。/。CO2中30分鐘。靜置后，于2000rpm下離心這些片段并移除上清液。以針機械性地分離神經(jīng)束膜。將初代細胞懸浮液平板培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中含10%熱去活化胎牛血清(FBS)及1%抗生素(盤尼西林-鏈霉素溶液及兩性霉素B)的DMEM中。每周兩次替換培養(yǎng)基，且每周一次將個別神經(jīng)片段轉(zhuǎn)植于新培養(yǎng)皿中，以提高細胞懸浮液的細胞濃度。然后，將懸浮后的2xl(^細胞/ml的許旺細胞接種于含2mlDMEM培養(yǎng)基(含10y。FBS)的96孔組織培養(yǎng)盤中，以測試各種PLGA及殼聚糖薄膜在許旺細胞生長上的效果。使用掃描式電子顯微鏡(SEM)及光學(xué)顯微鏡(Olympus1X70)進行許旺細胞的外觀形態(tài)評估。有關(guān)SEM觀察，需以下列方法將所有樣本固定及脫水。首先，將PLGA及殼聚糖薄膜浸泡于2%戊二醛(于PBS中)中1小時以固定之。然后，使用始于50%的一系列濃度上升乙醇溶液將薄膜脫水。然后以臨界點干燥機(CPD)將樣本干燥。所有樣本以金包覆后以SEM檢視。SEM所得結(jié)果在此未示出。通過前述方法純化造成了高度純化的SC培養(yǎng)物(圖3(a))。大多數(shù)細胞向外延伸并轉(zhuǎn)型為紡錘形狀，雖然亦有一些細胞顯示出部分折迭的外型，表示這些細胞尚未完全附著。在接種后第1天時，附著至改質(zhì)薄膜的大多數(shù)SC顯示出小的片狀偽足(lamellipodial)延伸物(圖3(b)及(c)，左半部)。在第3天時，經(jīng)02離子體處理的層黏蛋白-殼聚糖薄膜上的大多數(shù)細胞向外伸展或轉(zhuǎn)型為紡錘形狀(圖3(b)及(c)，右半部)。在未經(jīng)離子體處理的層黏蛋白-殼聚糖薄膜上，即使經(jīng)過一段長時間后許多細胞仍未完全伸展。歷史上，SC曾被描述為紡錘形狀。然而，之后發(fā)現(xiàn)雖然許多經(jīng)培養(yǎng)的SC具有此特征的紡錘形外觀形態(tài)，某些卻具有較扁平(類似纖維母細胞)的外觀形態(tài)。使用MTS分析(CellTiter96Aqueous,Promega)定量細胞活性。在各時間點，將40plMTS試劑及600iil培養(yǎng)基添加至各孔中。將培養(yǎng)盤置于37。C、5%(302下4小時。以UV/VIS光譜儀(Lambda20,PerkinElmer)測量波長490nm的吸收度，并取讀值的平均值。由數(shù)據(jù)減去培養(yǎng)基的吸收度指數(shù)以校正背景吸收度。改質(zhì)薄膜的附著細胞量各有不同(圖4)。在接種后第10天時，附著于經(jīng)02離子體處理之層黏蛋白-殼聚糖薄膜的細胞數(shù)量顯著高于其它薄膜。此外，由計算改質(zhì)薄膜上細胞存活度的圖表亦獲得相同結(jié)果。1.5結(jié)論本研究顯示使用氧離子體作表面改質(zhì)較易控制、更為簡易且更加有效。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比較，通過離子體處理而并入殼聚糖薄膜上的層黏蛋白百分比顯著較高。大多數(shù)層黏蛋白通過物理吸附而吸附于薄膜上。使用FTIR及XPS，顯示層黏蛋白固定于兩種薄膜的表面。XPS圖譜的結(jié)果指出層黏蛋白與表面間形成了共價鍵。殼聚糖及/或PLGA表面上的層黏蛋白對于許旺細胞的附著及親和性有很大效果。這些成功的結(jié)果被認為對導(dǎo)引外圍神經(jīng)再生十分重要。實施例2由層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管媒介的外傷性脊髓損傷(SCI)后功能復(fù)元2.1材料具有約645,000的平均分子量的殼聚糖系由Sigma化學(xué)公司供應(yīng)。由!H-NMR光譜決定去乙酰化程度(DDA)為82.5±1.15%。氧化氖(D20，L-4501)及氯化氖(DC1，35wt。/。于D20中)購自Sigma-Aldrich(USA)。醋酸(98%，和光純藥工業(yè)株式會社)及Ni-Cr絲(570um)依常規(guī)使用。除非另外記載，所有其它化學(xué)品及溶劑均購自Sigma-Aldrich(Oakville，Canada)并依常規(guī)使用。水使用MilliporeMilli-RO10Plus過濾系統(tǒng)，在18MQ的電阻下予以蒸餾及去離子化。2.2去乙酰化程度(DDA)的分析DDA為96.4±0.72%之殼聚糖之合成，將市面可購得的82.5±1.15%去乙酰化殼聚糖片浸泡于110°C下的40%氫氧化鈉水溶液中2小時。使用iH-NMR光譜(BmkerAV400MHz)，依據(jù)經(jīng)修改的公開方法(見L.Vachoudetal.,Ca^o/^^Am1997;302:169—177;及M.Lavertuetal.，《/尸/zwm2003;32:1149-1158)決定殼聚糖樣本的DDA。簡言之，樣本的制備在室溫下攪拌由1.96mlD20及0.04mlDC1組成的溶液中的10mg殼聚糖，等待約半小時以確保該聚合物完全溶解。在所有情況下，聚合物在溶液中的濃度均為約0.5%(w/v)。DDA的計算系如前所述般，比較HI或H2-H6的信號組與甲基的信號的積分面積。圖5顯示70°C下不同DDA的殼聚糖之400MHz'HNMR圖譜。藉由堿水解成功地調(diào)整了殼聚糖的DDA。對于修復(fù)較長的神經(jīng)缺陷而言，支架的吸收率亦十分關(guān)鍵?？刂茪ぞ厶堑娜ヒ阴；潭瓤烧{(diào)節(jié)吸收率及機械強度。FreierT.等人顯示去乙?；潭容^高的殼聚糖具有較低的降解率、較高的機械強度及細胞存活度(FreierT.etal.，B/owwfen'a/s26:46244632(2005);及FreierT.etal.,5z.omWe"^s26:5872—5878(2006))。2.3層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管的制備及定性祌經(jīng)導(dǎo)管以凍干及金屬絲加熱法(Y.C.Huangetai.，2005，同上)制造。簡言之，使用Ni-Cr絲(570um)作為軸心材料。將殼聚糖/醋酸溶液(2%w/v)注入裝滿軸心的模具中。然后將該具軸心架構(gòu)的模具置入液態(tài)氮中。一旦冷凍后，增加電源供應(yīng)器(TaiYeeShing,Taiwan)的電壓以加熱該Ni-Cr絲。當(dāng)電源被開啟時，盡速(通常少于一分鐘)將金屬絲由冷凍的支架抽出。以鉗子直接抽取即可輕易將金屬絲個別移除。然后，使用溫度控制凍干機(VirTis，NY,USA)使醋酸升華。凍干后，首先以1:10.1MNaOH-MeOH及1:1MeOH-水清洗神經(jīng)導(dǎo)管以中和酸性，然后再次以凍干機干燥之。最后，將神經(jīng)導(dǎo)管貯藏于干燥環(huán)境下直到使用時。使用銳利的手術(shù)刀片將導(dǎo)管切割為所需長度。為使這些神經(jīng)導(dǎo)管具親水性及化學(xué)活性，首先以氧離子體處理之。離子體處理是在輝光放電石英反應(yīng)器(型號SP100PlasmaSystem;制造商AnatechCo.Ltd.,USA)中的兩個平行電極板間進行。將離子體電源供應(yīng)器設(shè)于50W及13.56MHz的頻率。將基材面朝上地置于接地電極上，暴露在36微托耳氧氣壓的輝光放電下5及10分鐘，以供隨后的層黏蛋白(L-2020;Sigma,St,Louis,MO)偶合反應(yīng)。然后，將200pl的層黏蛋白溶液(100pg/ml)添加至經(jīng)離子體預(yù)先處理過的導(dǎo)管上，置于4。C下3小時。偶合反應(yīng)后，以PBS緩沖液將層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管清洗數(shù)次。以光學(xué)顯微鏡(Olympus1X70，Japan)定性這些層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管的外觀形態(tài)。使用蘇木精/伊紅(H&E)染色法以更清晰地描繪支架。為顯現(xiàn)以離子體技術(shù)制備的神經(jīng)導(dǎo)管中的蛋白質(zhì)分布，依據(jù)上述方法制備導(dǎo)管的代表性樣本，但使用若丹明-BSA(紅色熒光)取代層黏蛋白。制備后，以PBS緩沖液沖洗通道，并使用共軛焦顯微鏡(TCSSP2,Leica，MajorInstrumentsCo.，LTD)于熒光模式下觀察之(圖6A)。如圖6A所示，蛋白質(zhì)主要局部化于神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部。此外，連續(xù)照片亦顯示蛋白質(zhì)似乎分布于整個信道壁(數(shù)據(jù)未出示)。層黏蛋白局部化于通道壁的內(nèi)部應(yīng)可幫助神經(jīng)再生，因為層黏蛋白可幫助許旺細胞附著并導(dǎo)引神經(jīng)突生長。在活體內(nèi)，這可能導(dǎo)致軸突再生于通道中并增進再生能力。為觀察神經(jīng)導(dǎo)管經(jīng)氧離子體處理后顯微結(jié)構(gòu)的改變，熒光及相反差影像示于圖6B。結(jié)構(gòu)被破壞得愈嚴(yán)重表示離子體處理時間愈長。此外，以離子體處理10分鐘，蛋白質(zhì)就穿透了整個支架。這些結(jié)果顯示處理時間不當(dāng)延長會導(dǎo)致支架失去其顯微構(gòu)造。這可能使軸突再生的導(dǎo)引失去方向性。2.4外科手術(shù)程序及動物護理下列研究中使用成年250g雌性Sprague-Dawley大鼠。所有涉及動物的程序經(jīng)臺北榮民總醫(yī)院動物委員會許可。將大鼠的脊髓于T8處完全切斷并移除5mm的脊髓組織。將殼聚糖導(dǎo)管植入該斷裂脊髓的5mm間隙中。在指定的受傷后時間(1或2個月)，給予大鼠過量的麻醉劑戊巴比妥鈉。有關(guān)組織切片染色，收集傷處頭側(cè)1公分長的節(jié)脊髓樣本。對大鼠依序灌輸生理鹽水及4%緩沖多聚甲醛(PFA)，并使固定(PFA中1小時)后的脊髓通過蔗糖梯度。將脊髓包埋于OCTTissueTek封片媒介中并在冷凍切片機中切割之。制作10mm連續(xù)冠狀冷凍切片并貯藏于-20。C下。2.5行為分析為確保所有實驗動物均受到相似程度的傷害及監(jiān)測復(fù)元率，依據(jù)Basso、Beattie及Bresnehan移動試驗(BBB)及合并行為分數(shù)(CBS)測試大鼠的功能缺失(D.M.Bassoetal.,JA^/ra/raww"12:1—21(1995))。BBB為測試開放空間移動時的姿勢、重量支撐及協(xié)調(diào)性。CBS包含一套反射試驗，包括針對伸展、壓力及疼痛所反應(yīng)的腳趾張開、置放及回抽；被放置于熱燙表面時舔其腳掌的反射動作；以及運動功能的協(xié)調(diào)，包括開放空間移動、游泳及在傾斜平面上維持位置的能力。圖7A顯示兩個實驗組的BBB及CBS開放空間行走的平均分數(shù)。依據(jù)紀(jì)錄代表動物的開放空間移動的影片，以層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管及未改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管介入的受傷后肢均具有復(fù)元潛力。兩組的BBB分數(shù)并未顯示顯著的功能復(fù)元，但CBS分數(shù)達到了約80的穩(wěn)定平均值，這指出行為改善的開始。與使用未改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管組別相比較，使用層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管的實驗組得到較佳的結(jié)果。以跑步機分析進一步測試大鼠的功能復(fù)元。在本研究中使用Robomedica，Inc.所售的自動機式大鼠踏走機(RodentRobot)。該自動機可抽樣體重支撐(BWS)水平及大鼠的小腿位置，并將這些測量值以100Hz的數(shù)字形式儲存于機器控制計算機的儲存碟中。大鼠的小腿位置由高度精確制造的自動機關(guān)節(jié)角度、轉(zhuǎn)輪及光學(xué)編碼器的測量值計算，準(zhǔn)確性小于l.Omm。在導(dǎo)管移植后14、28、35及70天時，對SCI大鼠進行大鼠踏步能力的詳細評估。紀(jì)錄時，令未裝置自動機的大鼠在75MBWS下于跑步機上踏步30秒。然后令后肢裝置有自動機的大鼠在四種固定水平的BWS(75、50、25及0%)下踏步30秒。在所有訓(xùn)練及測試期間，錄像記錄矢狀面的后肢運動。使用兩種結(jié)果測量值評估大鼠在測試日的踏步能力。首先，使用腳步偵測算法計數(shù)各大鼠在各BWS水平下所表現(xiàn)的腳步數(shù)。該算法可辨識水平速率方向的改變而指出腳趾離地及腳趾著地事件。設(shè)定最小及最大走長、踏步時間及速率的限制。包含至少一項超出這些限制的參數(shù)的腳步即被認為代表短暫反射或大回抽動作而不是腳步，因此由分析中刪除之。第二種用于評估踏步能力的測量為，對測試期間收集之錄像數(shù)據(jù)作踏歩質(zhì)量評估。每次分析評估SCI大鼠的腳掌置放、重量承受及運動能力。評估者不知道大鼠的訓(xùn)練組別(亦即固定的BWS、漸減的BWS或未訓(xùn)練)。除了評估踏步能力外，亦調(diào)査對漸減的BWS所反應(yīng)出的踏步空間及時間特征。以腳步偵測算法將自動機軌道截切為個別腳步，然后予以分析以決定步長、步高及臺腳趾姿勢，以及作為BWS函數(shù)的踏步周期、搖擺及站立時間(J.A.Nessleretal.,7hmsTVewra/ie/za&7五"g13(4):497-506(2005))。如圖7B所示，受傷后兩個月時的跑步機分析可指出腳底踏步的改善。因此，發(fā)明人推測兩種導(dǎo)管均使動物功能有所復(fù)元。然而，由跑步機分析證明的踏步改善可能是由于難以分辨的肌肉或神經(jīng)功能。因此，得自BBB、CBS及跑步機分析的結(jié)果可暗指行為改善的傾向。這就是為何在以下實驗中進行免疫組織化學(xué)及組織學(xué)分析的原因。2.6免疫組織化學(xué)分析對所有脊髓進行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)分析以幫助厘清功能復(fù)元。對動物灌輸4%多聚甲醛(于磷酸鹽緩沖液中)。收集脊髓，浸泡于4%多聚甲醛(于磷酸鹽緩沖液中)中隔夜，然后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液中。將脊髓的水平或橫截冷凍切片(20pm厚度)置于以聚-L-離胺酸涂覆之載玻片上以供免疫染色。以目標(biāo)抗體處理切片，以PBS清洗之，然后以與熒光團共軛的二級抗體、或依次與生物素及與鏈霉親和素共軛的熒光團偶合的二級抗體(為增加敏感度)處理之?；蛘?，在初級抗體處理后，可以ABC混合物(Vectorlab)處理切片，隨后以DAB溶液處理使過氧化酶顯影，以使過氧化酶標(biāo)記物顯現(xiàn)；或使用Vectorlab的套組使想要的發(fā)色團顯影。圖8A中所示T5至T10的脊髓影像代表受傷后30天的層黏蛋白改質(zhì)組，得自CBS分數(shù)接近各組平均值的動物。受傷區(qū)域中的大量微管蛋白pin陽性細胞指出找到許多細胞。此外，ED-1陽性染色顯示巨噬細胞滲透傷處并移除了抑制性殘骸。巨噬細胞亦可產(chǎn)生細胞激素以增進軸突重新生長。為取得軸突再生的直接證據(jù)，使用GAP-43—一種在再生軸突的生長椎內(nèi)受到向上調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。使用抗-GAP-43作為初級抗體，以蛋白印跡分析確認GAP-43的存在。有關(guān)蛋白印跡分析，由大鼠的脊髓移除10個切片。在室溫下以lmL之50mMNH4C1將這些切片處理10分鐘，然后以IXPBS清洗之并在室溫下以lmL的50mMTris-HCl(pH7.4)處理10分鐘，，然后再以1XPBS清洗之。將脊髓切片浸泡于"/。NP-40水解緩沖液中以萃取蛋白質(zhì)樣本，使用Bradford蛋白質(zhì)分析偵測之。將等量的蛋白質(zhì)裝填于3.5-12.5%梯度的SDS-PAGE凝膠上。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進行電泳并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以抗-GAP-43作為初級抗體處理該膜。然后以HRP-共軛二級抗體處理該膜，與SuperSignalChemiluminescent受質(zhì)(Pierce,Rockford，IL)反應(yīng)，最后將訊號捕捉于膠巻上。使用imageJ(NIH)定量GAP-43陽性條帶的相關(guān)光學(xué)密度。圖8B中所示的GAP-43陽性條帶相關(guān)光學(xué)密度提示可能存在有再生發(fā)生輪廓的組成分。與未改質(zhì)組相比較，層黏蛋白改質(zhì)組偵測到大量的GAP-43。這表示層黏蛋白改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管對神經(jīng)再生具有較佳的效能。雖然在外傷性SCI后神經(jīng)導(dǎo)管媒介了神經(jīng)再生，可通過可能的再生途徑予以補強。由T5至T10取得橫截切片，沿著脊髓中線通過損傷中心點地切割縱向切片(圖8C)。圖8C(a)中紅色框內(nèi)的兩幅影像為受傷區(qū)域。遍布于通道及支架的大量微管蛋白陽性元素進一步提示細胞生長的可能機制。除了導(dǎo)管的通道外，多孔性的殼聚糖支架亦對細胞附著具有良好親和性。圖8D中以GAP-43作免疫染色的影像取自與圖8C相同的脊髓區(qū)域。GAP-43陽性的結(jié)果顯示受傷后60天時大部分GAP-43分布于通道周圍。發(fā)明人提議神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)表面可能是軸突再生的最佳區(qū)域。未改質(zhì)神經(jīng)導(dǎo)管對于抗C0X-2或凋亡酵素-3抗體皆展現(xiàn)免疫陰性染色(分別為圖8E(a)及(b))。在圖8E中，免疫陰性染色的區(qū)域位于初次受傷的空間內(nèi)，表示新形成的組織并未產(chǎn)生發(fā)炎反應(yīng)。圖8E(b)中的橫截切面切自脊髓的T5至T10，神經(jīng)導(dǎo)管位于T8。以凋亡酵素-3作免疫組織學(xué)分析以辨識細胞凋亡。令人振奮的是，陰性結(jié)果顯示在神經(jīng)再生期間并未發(fā)生細胞凋亡。2.7結(jié)論使用氧離子體，發(fā)明人己成功地將層黏蛋白并入神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)表面上。不當(dāng)?shù)难娱L離子體處理時間會摧毀多孔性殼聚糖支架的顯微結(jié)構(gòu)。就動物模式實驗而言，得自接受神經(jīng)導(dǎo)管移植后BBB、CBS及跑步機分析的結(jié)果暗示行為改善的傾向。ED-1、微管蛋白pIII及GAP-43的免疫陽性染色指出神經(jīng)導(dǎo)管可引導(dǎo)受損軸突延伸通過受傷區(qū)域。COX-2及凋亡酵素-3的免疫陰性染色指出神經(jīng)導(dǎo)管不會誘發(fā)多余的術(shù)后發(fā)炎反應(yīng)及細胞凋亡。通過蛋白印跡分析，層黏蛋白改質(zhì)組的GAP-43光學(xué)密度較未改質(zhì)組為佳。層黏蛋白確實增加了軸突生長效率。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解可針對上述具體實施例加以改變而不背離其廣泛的發(fā)明概念。因此，應(yīng)了解本發(fā)明并不限于所揭示的特定具體實施例，而是意欲涵蓋本發(fā)明(其以權(quán)利要求界定)精神及范圍內(nèi)的改進。權(quán)利要求1.一種用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接該神經(jīng)斷裂兩端間的間隙的中空導(dǎo)管，其特征在于該導(dǎo)管包含由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的管壁，形成由該管壁的管腔表面所界定的管腔，且該管壁的管腔表面共價鍵結(jié)有層黏蛋白，其中該層黏蛋白與管腔表面的共價鍵結(jié)通過氣體離子體處理而達成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中空導(dǎo)管，其特征在于該生物可降解性高分子材料選自由下列組成之群膠原蛋白、聚(乳酸)、聚(甘醇酸)、聚(乳酸-共-甘醇酸)、聚己內(nèi)酯、聚(己內(nèi)酯-共-乳酸)、殼聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸、明膠及纖維蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中空導(dǎo)管，其特征在于該生物可降解性高分子材料包含聚(乳酸-共-甘醇酸)。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中空導(dǎo)管，其特征在于該生物可降解性高分子材料包含殼聚糖。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中空導(dǎo)管，其特征在于該氣體離子體包含02或含02的氣體離子體。6.—種制造層黏蛋白改質(zhì)導(dǎo)管的方法，該導(dǎo)管用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接該神經(jīng)斷裂兩端間的間隙，其特征在于該方法包含下列步驟(a)以功率密度及壓力的氣體離子體，將由生物可降解性高分子材料所構(gòu)成的中空導(dǎo)管處理充分時間，以活化該高分子材料的管腔表面以與層黏蛋白鍵結(jié)；及(b)以層黏蛋白接觸經(jīng)活化的管腔表面充分時間，以使層黏蛋白與經(jīng)活化的管腔表面間形成共價鍵。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于該氣體離子體包含02或含02的氣體離子體。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(a)中操作的功率密度位于約2至約100W/cm2的范圍內(nèi)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟(a)中操作的功率密度為約50W/cm2。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(a)中操作的壓力位于約0至約80微托耳的范圍內(nèi)。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于步驟(a)中操作的壓力為約36微托耳。12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(a)中的處理時間位于約5至10分鐘的范圍內(nèi)。13.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于步驟(a)中的處理時間為約5分鐘。14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(b)包含將含層黏蛋白的溶液添加至該導(dǎo)管，以使經(jīng)活化的管腔表面與層黏蛋白直接接觸。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于該層黏蛋白溶液具有約100嗎/ml的濃度。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于該導(dǎo)管在約4°C下在該層黏蛋白溶液中處理約3小時。17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于該生物可降解性高分子材料選自聚(乳酸-共-甘醇酸)及殼聚糖。18.—種用于促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接該神經(jīng)斷裂兩端間的間隙的中空導(dǎo)管，其特征在于該導(dǎo)管由根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法所制造。19.一種促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接該神經(jīng)斷裂兩端間的間隙的方法，其特征在于該方法包含使該神經(jīng)的斷裂兩端分別接觸根據(jù)權(quán)利要求1所述的中空導(dǎo)管的兩端。20.—種促進斷裂哺乳動物神經(jīng)的活體內(nèi)再生以便橋接該神經(jīng)斷裂兩端間的間隙的方法，其特征在于該方法包含使該神經(jīng)的斷裂兩端分別接觸根據(jù)權(quán)利要求18所述的中空導(dǎo)管的兩端。全文摘要本發(fā)明提供一種經(jīng)層黏蛋白改質(zhì)的高分子中空導(dǎo)管，用于促進跨越神經(jīng)斷裂兩端間的間隙的神經(jīng)再生。該導(dǎo)管的制造方法包含氣體離子體處理。已經(jīng)利用該層黏蛋白(laminin)改質(zhì)導(dǎo)管在哺乳動物中達成斷裂脊髓的功能復(fù)元。文檔編號A61L29/06GK101164627SQ200710097629公開日2008年4月23日申請日期2007年4月24日優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日發(fā)明者張佩德,鄭宏志,黃義侑,黃意真申請人:鄭宏志