專利名稱：：Vla-1的單克隆封閉抗體及其在炎性病癥的治療中的應用的制作方法VLA-1的單克隆封閉抗體及其在炎性病癥的治療中的應用此案是申請日為2000年06月01日、中國申請?zhí)枮?0808428.9、發(fā)明名稱為"VLA-1的單克隆封閉抗體及其在炎性病癥的治療中的應用"的發(fā)明申請的分案申請。
背景技術：
：整合素是細胞表面蛋白復合物，它們構成一大類能介導細胞彼此間以及與它們的周圍環(huán)境之間的粘附的細胞表面分子。細胞在多種發(fā)育和生理過程中需要彼此粘附并與它們的周圍環(huán)境中的其它分子粘附。實例包括組織和器官的產生以及它們的完整性的維持。這些生理過程中就包括炎性病癥。炎性過程中的關鍵步驟之一涉及細胞滲出血管，進入組織，和向感染部位移動。粘附分子在該過程中的作用常常被分割為一種三步驟模式，首先為白細胞在發(fā)炎的內皮上"滾動"，然后牢牢附著，使白細胞穿過內皮移動至發(fā)炎的組織(Hynes，R.O.，1992細胞69:11-25;Springer,T.A.，1992細胞76:301-314)。炎性連鎖反應中的另一關^T定步驟，以及尚未得到深入探索的一個步驟，發(fā)生在外周組織中，在這里，浸潤細胞以及固有細胞需要移動至感染部位，識別外來抗原，然后進行細胞活化以便實施它們的效應功能。為了直接評估間質粘附作用在炎癥中的重要性，并與粘附作用在白細胞補充(recruitment)中的作用相區(qū)別，我們主要關注整合素家族的粘附分子和它們的片段的重要性，以及它們在炎癥的動物模型，尤其關節(jié)炎模型中的作用。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了治療受試者的炎性病癥的方法。具體地，本發(fā)明提供了治療關節(jié)炎的方法。更具體地，本發(fā)明提供了治療受試者中炎性病癥的方法，該方法包括給與所述受試者一種藥用組合物，其包含有效量的aipi功能封閉抗體或該抗體的片段，其中所述alpl功能封閉抗體或片段能與VLA-1上包含氨基酸殘基91-96，即Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg的表位結合?？拐纤乜贵w可選自人類抗體、嵌合抗體、人源化抗體和它們的片段?？拐纤乜贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明還提供治療人或動物受試者的炎性病癥的方法。本發(fā)明還提供一種治療關節(jié)炎的藥用組合物，其包括有效量的功能封閉性抗體或該抗體的片段以及可藥用栽體，其中(1)所述功能封閉性抗體或該抗體的片段能與極遲抗原-1(VLA-1)的一種表位結合；(2)該表位包含SEQIDNO:8的氨基酸殘基91-96;和(3)所述抗體的片段為Fab,Fab，，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)(v)，重鏈單體或二聚體，輕鏈單體或二聚體，或由一條重鏈和一條輕鏈組成的二聚體。本發(fā)明還提供功能封閉性抗體或該抗體的片段在制備用于治療關節(jié)炎患者的關節(jié)炎的藥用組合物中的應用，其中(l)所述功能封閉性抗體或該抗體的片段能與極遲抗原-1(VLA-1)的一種表位結合；(2)該表位包含SEQIDNO:8的氨基酸殘基91-96;和(3)所述抗體的片段為Fab,Fab，，F(xiàn)(ab，)2,F(v),重鏈單體或二聚體，輕鏈單體或二聚體，或由一條重鏈和一條輕鏈組成的二聚體。以上部分所引用的所有文獻，以及后文公開的引用文獻，均在此引入作為參考。圖1.活/A的冷勿應J:的魔^蛋冷潛合^整合,a/^和a2yW。(A)對IL-2活化型脾細胞(第11天)上al和a2J31整合素表達的流式細胞儀分析。細胞用抗almAb，抗ot2mAb，或非結合型對照mAb標記(灰線)，然后用FITC-抗倉鼠免疫球蛋白標記。(B)抗al和抗a2mAb對白細胞與膠原蛋白的粘附的影響。將1()S個IL-2活化的脾細胞用所述mAb處理15分鐘，然后鋪板至IV型或I型膠原蛋白包被孔中，37。Cl小時。如實施例1所述計算粘附，表示為相對于對照mAb所處理細胞的粘附百分比。粘附試驗一式3份，至少進行3個獨立的實驗。圖中顯示了一個代表實驗。圖2.戎整合,wy^對il^型超敏AJ效j癆的參詢。SRBC致敏的小鼠腹膜內(i.p.)注射所述mAb,1小時后進行SRBC攻擊?？乖舻?0小時后測量足墊厚度，結果表示為如實施例2所述的。/。足墊厚度增加值士SEM。這些數(shù)據(jù)代表總共8個試驗，其中n-79(PBS)，68(對照倉鼠Ig)，68(抗-al),29(抗-a2)，18(抗-al+抗-012)，45(抗-a4)，18(抗-a5)，20(抗-a6)，和10(抗-pl)。所用mAb為Ha4/8(對照倉鼠的第二組免疫球蛋白)，Ha31/8(抗-al)，Hal/29(抗-a2),PS/2(抗-a4)，5H10-27(抗畫a5)，GoH3(抗-a6)，和HM卩1-1(抗-pl)。圖3.戎整合,m^6^凝J^/4超敏A^放^歡的參^。FITC致敏的小鼠腹膜內注射所述mAb，4小時后進行FITC攻擊。在起點和24小時后測量耳的厚度，結果表示為如實施例3所述的。/。耳厚度增加值士SEM。這些數(shù)據(jù)代表總共9個試驗，其中n-74(PBS),60(對照倉鼠Ig),26(抗-ICAM-l)，44(抗誦al)，44(抗-a2)，38(抗-al+抗-a2)，36(抗畫a4),16(抗-a5),26(抗-a4+抗《5)，24(抗-a6),和22(抗-pi)。所用倉鼠mAb為Ha4/8(對照倉鼠的第二組免疫5求蛋白)，Ha31/8(抗-al)，Hal/29(抗-a2),HM(31-1(抗-卩l(xiāng))，3E2(抗-ICAM-l);所用大鼠mAb為R35-95和R35-38(分別為對照大鼠IgG2a和大鼠IgG2b)，PS/2(抗-a4)，5H10-27(抗-a5)，GoH3(抗-a6)。圖4.缺/^型V、l與野蘭型V、it檸禊廢^超敏A^U吝邦化較。FITC致敏的小鼠腹膜內注射所述mAb,4小時后進行FITC攻擊。在起點和24小時后測量耳的厚度，結果表示為如實施例4所述的％耳厚度增加值士SEM。每種情況中用到4-5只小鼠，所有實驗都至少實施3次。顯示其中一次代表性的實驗。圖5.在a7和戎《2^46對￡衛(wèi)油謬#的##并#^癥的教詢。小鼠腹膜內注射所述mAb,4小時后在耳部涂抹巴豆油。在起點和24小時后測量耳的厚度，結果表示為如實施例5所述的。/。耳厚度增加值土SEM。每種情況中用到4-5只小鼠，所有實驗都至少實施3次。顯示其中一次代表性的實驗。圖6.戎cc/和戎a2m屜對厥j蛋冷w屈謬導的^，義的彩詢。小鼠在第0天時腹膜內注射抗膠原蛋白mAb，第3天注射LPS。小鼠從第0天開始每3天腹膜內注射目標mAb—次。關節(jié)炎的臨床癥狀在注射LPS后的2-3天時出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)周。每隔3天，如實施例6所述分別給各肢按0-4級評分，結果表示為所有各肢在第9天至第15天之間的平均關節(jié)炎評分(士SEM)。這些數(shù)據(jù)代表4次實驗的總結，其中每一實驗由每種情況下的3-4只小鼠纟且成。圖7.給與抗al或抗a2mAb抑制了DTH應答期間白細胞向足墊中的浸潤。實驗如圖2所述進行?？乖舻?0小時后，切下足墊，組織切片用蘇木精和伊紅染色。組織切片來自未受攻擊的小鼠(A)或用SRBC攻擊后的SRBC-致敏小鼠(B-H)。小鼠在接受攻擊的1小時前用PBS(B)、對照倉鼠的Ig(C,G)、抗-al(D)、抗-a2(E)或抗-al與抗-a2mAb的組合(F，H)處理。放大倍數(shù)xioo(A-F)，x400(G-H)。圖8.在DTH應答期間，al|31在足墊中的浸潤白細胞上表達?？乖舻?0小時后，對未接受處理但已發(fā)炎的足墊中浸潤的白細胞進行免疫組化染色。(A)直接用Alexa488偶聯(lián)的對照mAb和抗almAb染色的系列切片。(B)用Alexa488偶聯(lián)的抗almAb和藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的細胞譜系特異性mAb進行的雙免疫熒光染色。所用PE偶聯(lián)的mAb特異性針對粒細胞/單核細胞(抗CDllb)、中性粒細胞(抗Ly6G/Gr-l)、和T淋巴細胞(抗CD3)。放大倍數(shù)x400。圖9.抗al和a2mAb對膠原蛋白mAb誘導型關節(jié)炎的影響。(A)小鼠用抗al或抗a2mAb進行預防性處理降低了關節(jié)炎評分。小鼠在第O天用抗膠原蛋白mAb處理，然后在第3天用LPS處理。第6天出現(xiàn)關節(jié)炎并持續(xù)數(shù)周。小鼠從第0天開始每3天用目標mAb處理一次。每隔3天分別給各肢按0-4級評分。結果表示為所有各肢在第9天至第15天之間(最大評分為16)的平均關節(jié)炎評分(士SEM)。每種情況下，每組使用4只小鼠；顯示了12項試驗的均值。(B)al缺陷型小鼠與抗almAb處理的野生型小鼠相比，關節(jié)炎評分降低。實驗細節(jié)和評分如上概述。每種情況下，每組使用4只小鼠；顯示了2項試驗的均值。圖10.抗almAb處理對患有關節(jié)炎的關節(jié)的免疫病理的影響?？筧lmAb處理減少了白細胞的浸潤，細胞向關節(jié)表面的粘附，和以蛋白聚糖丟失為表現(xiàn)的軟骨損傷。正常小鼠(A-D)或接受對照倉鼠Ig(E-H)或抗almAb處理(I-L)的關節(jié)炎小鼠(第8天)的后肢。對所述后肢拍照(A，E,I)并切下，組織切片用蘇木精/伊紅(B-C,F-QJ-K)或曱苯胺藍染色以檢測蛋白聚糖(D,H，L)?！肺拇蟊稊?shù)x16(B,F，J);x160(C，GK);x200(D，H，L)。圖11.關節(jié)炎的進展因淋巴細胞的缺乏而延遲，抗ctlmAb對關節(jié)炎的抑制作用因淋巴細胞的缺乏而發(fā)生。野生型B6，129或RAG-l-缺陷型B6，129小鼠在第0天用抗膠原蛋白mAb處理，然后在第3天用LPS處理。第6天出現(xiàn)關節(jié)炎并持續(xù)數(shù)周。小鼠從第0天開始每3天用目標mAb處理。每隔3天分別給各肢按0-4級評分。結果表示為每一肢的平均關節(jié)炎評分(最大評分為4)。每種情況下，每組使用4只小鼠。圖12.抗almAb對關節(jié)炎的抑制作用的劑量應答。野生型Balb/c小鼠在第0天用抗膠原蛋白mAb處理，然后在第3天用LPS處理。第6天出現(xiàn)關節(jié)炎并持續(xù)數(shù)周。小鼠從第0天開始每3天腹膜內注射目標劑量的Ha4/8(同種型對照)或Ha31/8(抗al)mAb。每隔3天分別給各肢按0-4級評分。結果表示為每一肢的平均關節(jié)炎評分(最大評分為4)。每種情況下，每組使用4只小鼠。圖13.用抗almAb進行治療性處理降低了關節(jié)炎評分。野生型Balb/c小鼠在第O天用抗膠原蛋白mAb處理，然后在第3天用LPS處理。第6天出現(xiàn)關節(jié)炎并持續(xù)數(shù)周。小鼠從第4天開始每3天腹膜內注射mAb(250嗎)或Ig融合蛋白(200嗎)。小鼠接受mAb(Ha4/8同種型對照或Ha31/8抗al)，或Ig融合蛋白(同種型對照Ig或TNF-R55-Ig)，或二者的組合(250昭Ha31/8和200嗎TNF-R55-Ig)。每隔3天分別給各肢按0-4級評分。結果表示為每一肢的平均關節(jié)炎評分(最大評分為4)。每種情況下，每組使用4只小鼠。圖14.定位戎a//潛一々試封游'/i""6的《位。A.大鼠(上)和人(下)的al-I結構域的氨基酸序列。含有MIDAS(金屬離子依賴性粘附位點)基元的殘基用粗體表示。取代了相應大鼠殘基的人類氨基酸(RAH)表示在方框區(qū)內大鼠序列的下面。為表示清楚，文本部分的殘基編號與該圖一致。B.濃度不斷增加的mAbAJH10(ATCC保藏號PTA3580)與包被了30ng/ml人類(圓形)，大鼠(三角)或RAH(方形)的al-I結構域的平板結合。所示數(shù)據(jù)為三次實驗的代表。圖15.圖15描述人類al-I整合素多肽序列的氨基酸序列?？?al-I結構域阻斷性mAbs(SEQIDN0:8)所識別表位的氨基酸序列顯示在框中。圖16.(^-/潛游誠的封分7性/6的姿定。A.濃度不斷增加的mAbAEF3(三角)或AJH10(ATCC保藏號PTA3580)(圓形)與包被了30ng/mlal-I結構域的平板結合。B.al-I結構域用濃度不斷增加的mAbAJH10(ATCC保藏號PTA3580)(鉆石型)或mAbBGC5(方形)處理，并結合至IV型膠原蛋白(2嗎/ml)包被的平板。C.K562-al細胞用濃度不斷增加的mAbAEF3(三角)或AJH10(ATCC保藏號PTA3580)(圓形)處理，并結合至IV型膠原蛋白(5嗎/ml)包被的平板。每孔中所加細胞的45-50%與IV型膠原蛋白粘附。數(shù)據(jù)為三項獨立實驗的代表。圖l7.封游'/iw^6的錄神Jt義A乂'^。A.(l)綿羊血管平滑肌、(2)人類白血病K562-al細胞或(3)純化的RAHGST-I結構域；(4)大鼠GST-alI結構域；以及(5)人類GST-alI結構域的去污劑裂解物用10-20%SDS-PAGE在非還原條件下分離，然后用功能封閉性mAbAJH10(ATCC保藏號PTA3580)進行免疫印跡。分子量標志示于左側；非還原性a1(31整合素遷移至-180kDa;GST-I結構域遷移至~45kDa。B.大鼠血管平滑肌細胞與mAbAJH10(ATCC保藏號PTA3580)(下)或鼠IgG對照(上)一起保溫，然后用熒光活化細胞分揀儀(FACS)進行分析。圖18.(^-/潛游械與發(fā)^蛋^潛合。A.濃度增加的人類al-I結構域與已包被了1(ig/mlI型膠原蛋白(方形)或IV型膠原蛋白(圓形)的平板結合。所示值已用與BSA結合的本底校正。B.2pg/ml人類al-I結構域與濃度增加的抗人al整合素抗體5E8D9(方形)或抗人a:2整合素抗體A2I正10(圓形)混合，然后結合至已用l|ag/mlIV型膠原蛋白包被的平板上。C.平板用l昭/mlIV型膠原蛋白或3。/。BSA包被。al-I結構域(2pg/ml)隨后在有1mMMn2+,1mMMg2+,或5mMEDTA存在的情況下，與已包被的平板結合。所示數(shù)據(jù)為三項獨立實驗的代表。發(fā)明詳述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，整合素抗體及其片段，尤其al整合素亞單位，能封閉前炎性白細胞與細胞外基質成分，包括但不限于膠原蛋白、層粘連蛋白、和纖連蛋白的相互作用。雖然并非將本發(fā)明限制在任何單一的作用機制上，但已提出，整合素及其片段與外周基質之間相互作用的中斷可:能減少了前炎性細胞因子的表達。還提出，整合素抗體及其片段可能通過作用于抗原特異性T細胞的水平而調節(jié)炎性應答的效應期。此外，已提出整合素抗體及其片段可能通過破壞細胞在組織中的遷移和/或對組織中的細胞引發(fā)和活化產生影響而發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)闡述了整合素家族的粘附分子，尤其aipi，在與炎癥相關的情況中在組織外環(huán)境中的重要性。它還通過強調富含基質的組織外環(huán)境對免疫應答的重要性，而將整合素家族以及它們的片段在炎癥中的作用擴展至白細胞粘附和在內皮界面的外滲以外，它還揭示了外周組織可作為基于粘附的治療的一個新介入點。本發(fā)明的方法包括對整合素抗體的使用，其中所述整合素包括下述分子，它々]含有與a鏈(包才^f旦不卩艮于al,a2,a3,a4，a5,a6，a7，a8，a9，a10，aV,aL，aM，aX,aD，aE，allb)非共價結合的卩鏈(包括但不限于(31，(32，|33，卩4,|35,卩6，卩7，卩8)。本發(fā)明所用各種整合素的實例包括，但不限于aipi,a2pi，a3pi，a4pl，a5pi,a601,a7pl，a印l，娜1,a10pl,avpi,aLpl，aMpi,aX卩l(xiāng),aDpl,allbpl,卿l;aip2,a2P2，a3P2，a4p2，柳2,鄉(xiāng)2,a7P2，鄉(xiāng)2,a鄧2,a10卩2,avp2,aLp2,aMP2,aXp2，aDp2,allbP2'aEP2;aip3,a2P3,a3p3,a4p3，a5p3,a6p3,a7p3，娜3，a9p3,alO卩3,aVP3,aLp3,aMp3,aXp3,aDP3，al郵3,鄉(xiāng)3;al(34,a2P4，a334,a4P4，a5p4，a6&4,a7p4,a8(34,a9p4，a10P4,aV(54,aLP4,aMP4,aX(34aD^4,alIbP4,aEP4;alp5,a2P5,a3p5,a4卩5，cc5p5,a6p5,cc7P5,a印5,a9P5，a10卩5,aVP5.aLP5,崎5,aXps,aDP5,allb卩5,鄉(xiāng)5;aip6,a2p6，a3p6,a4(36,a5|36,a6P6,a7p6,a8p6,a9p6,a10p6,aVp6,aLp6,aM(36，aXP6.aDp6,al寧，卿6:alp7.a2p7，a3p7'a化7，a5p7,a6P7,a7卩7,a8(37,a鄧7,a10(37,aVp7.aLP7,aMp7，aX卩7，aDp,a卿7,卿7;a戰(zhàn)a2P8'a308,a4p8，a5p8,鄉(xiāng)8,a7(38,a8(38，a9P8，a10沐aV(58,aLp8,aM(38,aXP8,aDP8,allbp8,鄉(xiāng)8;本發(fā)明的方法還包括針對整合素片段的抗體的應用，所述片段包括如單獨的卩鏈(其包括但不限于卩l(xiāng),卩2，卩3，卩4,(35，卩6,卩7,卩8),以及單獨的a鏈(其包4舌i旦不限于al,a2，a3，a4,a5，a6,a7，a8,a9，a10,aV，aL，aM,aX,aD,aE，allb)。此外，本發(fā)明還包括針對整合素片^R的抗體的應用，如針對a鏈的I結構域，包括但不限于alpl(Bresewitz等，1993,生物學化學雜志268:2989);a2pi(Takada和Hemler，1989,細胞生物學雜志109:397);aL卩2(Larson等，1989,細胞生物學雜志108:703);aM卩2(Corbi等，1988，生物學化學雜志263:12403);aX卩2(Crobi等，1989，EMBOJ6:4023);aD卩2(Grayson等，1988,實驗醫(yī)學雜志188:2187);aE卩7(Shaw等，1994，生物學化學雜志269:6016)的I結構域的抗體。在一優(yōu)選實施方案中，al-I結構域抗原決定簇包含至少6個連續(xù)氨基酸的序列，其中所述連續(xù)序列可在圖15的序列中找到。而且，在一優(yōu)選實施方案中，該連續(xù)序列為Val陽Gln-Arg-Gly-Gly-Arg。產生本發(fā)明所用整合素的方法為本領域技術人員已知(參見如Springer等，19卯，自然346:425-434)。本發(fā)明的實施方案還包括抗整合素多克隆和單克隆抗體。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括一種單克隆抗體，如抗al單克隆抗體。本文中al|31功能封閉抗體指與al-I結構域，具體是圖15的氨基酸91-96所確定的表位結合，并阻斷a1(31功能的抗體。所述阻斷可通過它們抑制k562-al依賴性粘附至IV型膠原蛋白的能力來檢測(見實施例15)。用于治療，尤其人類治療的優(yōu)選抗體和同系物包括人類抗體同系物、人源化抗體同系物、嵌合抗體同系物、Fab、Fab，、F(ab，)2和F(v)抗體片段，以及抗體重鏈或輕鏈的單體或二聚體或其混合物。因此，針對整合素分子及其片段的單克隆抗體是本發(fā)明方法中的優(yōu)選結合劑。本文中術語"抗體同系物"包括由免疫球蛋白重鏈和輕鏈經二^5克鍵連接而成的完整抗體。術語"抗體同系物"還包括含有選自下組的一或多種多肽的蛋白質，所述組包括免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈及其能結合一或多種抗原(即含al、a2、a6或a-I結構域的整合素亞單位)的抗原結合片段。由一種以上多肽組成的抗體同系物中的多肽組分可任選經二減/建連接或經其它方式共價交聯(lián)。相應地，"抗體同系物"包括完整的IgA,IgGIgE，IgD，IgM型免疫球蛋白(以及它們的亞型)，其中免疫球蛋白的輕鏈可以為K型或人型。"抗體同系物"還包括完整抗體中保留了抗原結合特異性的部分，如Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2片段、F(v)片段、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一條重鏈和一條輕鏈組成的二聚體、等。因此，衍生自上述抗體的抗原結合片段以及全長二聚體或三聚體多肽本身均有效。本文中"人源化抗體同系物"是通過重組DNA技術產生的抗體同系物，其中人類免疫球蛋白輕鏈或重鏈中非抗原結合所必需的部分或全部氨基酸被非人類哺乳動物免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應氨基酸取代。本文中"嵌合抗體同系物"是通過重組DNA技術產生的抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈的鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)的全部或部分已被另一種免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的相應區(qū)取代。在另一方面，本發(fā)明的特征是一種嵌合分子變體，其包括(l)整合素靶向部分；(2)任選地，第二肽，如增加整合素靶向部分的可溶性或體內壽命的肽，如免疫球蛋白超家族成員或其片段或部分，如IgG的部分或片段，如人類IgGl重鏈恒定區(qū)，如CH2和CH3鉸鏈區(qū)；以及毒素部分。嵌合分子可用于治療對與上皮細胞如毛嚢等增生相關的疾病易感的受試者，如人類。本文中"人類抗體同系物"是通過重組DNA技術產生的抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈或重鏈的所有氨基酸都來自人類。本文中"炎性病癥"包括，但不限于皮膚相關疾病，如牛皮癬、濕滲、支氣管炎、痛經、腱炎、滑嚢炎的治療，對疼痛和頭痛的治療，或作為退熱劑用于治療發(fā)燒。本發(fā)明的方法還可用于治療胃腸道疾病如炎性腸疾病、Crohn's病、胃炎、過敏性腸綜合征及潰瘍性結腸炎，還可用于預防結直腸癌。本發(fā)明的方法可用于治療下述疾病中的炎癥，所述病癥如脈管疾病、偏頭痛、結節(jié)性動脈炎、曱狀腺炎、再生障礙性貧血、Hodgkm，s病、風濕熱、I型糖尿病、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、結節(jié)病、腎綜合征、Behcet's綜合征、多肌炎、牙齦炎、超敏反應、結膜炎、傷后腫脹、心肌缺血等。本發(fā)明的方法還可用于治療過敏性鼻炎、呼吸窘迫綜合征、內毒素休克綜合征、以及動脈粥樣硬化。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療關節(jié)炎，包括例如類風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎。"有效量，，是足以實現(xiàn)有利或所需臨床結果的量。有效量可一次或分多次給與。就治療炎性病癥而言，抗整合素抗體的"有效量"是足以減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉、減緩或延遲一種炎癥相關癥狀的進展，并達到針對所治病癥或針對美容目標的臨床可接受水平的量。對效力的指標的檢測可用多種現(xiàn)有診斷方式進行，所述方式包括但不限于生理檢查如驗血、肺功能檢查、和X光胸透；CT掃描；支氣管鏡檢；支氣管肺泡灌洗；肺活檢和CT掃描。產生單克隆抗體，包括如抗整合素單克隆抗體的技術是已知的。如參見Mendrick等，1995，/騰".72:367-375(鼠抗aipi和抗a2卩l(xiāng)mAb);So認nberg等，1987，生物學化學雜志262:10376-10383(鼠抗a6卩l(xiāng)mAb);Yao等，1996，細胞科學雜志109:3139-50(鼠抗a7卩l(xiāng)mAb);Hemler等，1984，免疫學雜志132:3011-8(人al卩l(xiāng)mAb);Pischel等,1987,免疫學雜志138:226-33(人a2pimAb);Wayner等,1988，細胞生物學雜志107:1881-91(人a3131mAb);Hemler等,1987，生物學化學雜志262:11478-85(人ct4卩l(xiāng)mAb);Wayner等,1988,細胞生物學雜志107:1881-91(人a5卩l(xiāng)mAb);Sonnenberg等，1987,生物學化學雜志262:10376-10383(人a6(31mAb);AWang等，1996,Am./7^;zViCW/Afo/.5!'o/.15:664-672(人a9|31mAb);Davies等，1989，細胞生物學雜志109:1817-26(人aV卩l(xiāng)mAb);SanchezMadrid等，1982，美國國家科學院學報79:7489-93(人aL卩2mAb);Diamond等，1993，細胞生物學雜志120:1031-43(人aMj32mAb);Stacker等，1991,免疫學雜志146:648-55(人aX卩2mAb);VanderVieren等，1995,免疫(/mm朋/(v)3:683-卯(人aD卩2mAb);Bennett等，1983,美國國家科學院學報80:2417-21(人allbp3mAb);Hessle等，1984，分化(^^w""a"o")26:49-54(人a鄰4mAb);Weinacker等，1994，生物學化學雜志269:6940-8(人aV卩5mAb);Weinacker等，1994，生物學化學雜志269:6940-8(人aV(36mAb);Cerf-Bensussan等，1992,歐洲免疫學雜志22:273-7(人aE卩7mAb);Nishimura等，1994，生物學化學雜志269:28708-15(人aV卩8mAb);Bossy等，1991，五M5O/10:2375-85(人a8卩l(xiāng)多克隆抗血清)；Camper等，1998，生物學化學雜志273:20383-20389(人al0pi多克隆抗血清)。通常，將永生化細胞系(常為骨髓瘤細胞)與已用表達指定抗原如整合素的全細胞免疫的哺乳動物的淋巴細胞(常為脾細胞)融合，篩選所得雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清中針對所述抗原的抗體。主要參見Kohler等，1975,自然265:295-497，"能分泌具有預定特異性的抗體的融合細胞的連續(xù)培養(yǎng)"。免疫可用標準方法完成。單位劑量和免疫方案取決于所免疫的哺乳動物的種類、其免疫狀態(tài)、該哺乳動物的體重等。通常，給免疫動物放血，用相應篩選試驗分析每份血樣之血清中的特定抗體。例如，抗整合素抗體可通過對整合素表達細胞的1251-標記的細胞裂解物進行免疫沉淀來鑒定?？贵w，包括如抗整合素抗體，還可通過流式細胞儀鑒定，如通過測量抗體表達細胞與被認為能識別整合素分子的抗體一起保溫后的萸光染色來鑒定。用于產生雜交瘤細胞的淋巴細胞通常分離自已免疫且已用這類篩選試驗證實其血清含有整合素抗體的哺乳動物。通常，所述永生化細胞系(如骨髓瘤細胞系)來自與淋巴細胞相同的哺乳動物物種。優(yōu)選的永生化細胞系為敏感于含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基("HAT"培養(yǎng)基)的小鼠骨髓瘤細胞系。通常，將HAT敏感型小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞用分子量1500的聚乙二醇(PEG1500)融合。然后用HAT培養(yǎng)基篩選該融合所得雜交瘤細胞，在所述培養(yǎng)基中，未融合和生長特性不相符的骨髓瘤細胞被殺死(未融合的脾細胞7天后由于不能轉化而死亡)。能產生所需抗體的雜交瘤通過篩選雜交瘤培養(yǎng)上清來檢測。例如，為產生抗整合素抗體而制備的雜交瘤，可通過檢驗雜交瘤培養(yǎng)上清中分泌抗體的結合重組整合素表達細胞系的能力來進行篩選。為了產生完整免疫球蛋白形式的抗體同系物，包括如抗整合素抗體同系物，可將上述篩選中檢驗為陽性的雜交瘤細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中于適當條件下培養(yǎng)足夠長的時間，以使所述雜交瘤細胞將單克隆抗體分泌至培養(yǎng)基中。適用于雜交瘤細胞的組織培養(yǎng)技術和培養(yǎng)基是已知的。可收集經調整的雜交瘤培養(yǎng)上清，并可任選用已知方法進一步純化抗整合素抗體?；蛘?，可通過將雜交瘤細胞注射至未免疫小鼠的腹腔中來產生所需抗體。雜交瘤細胞在腹腔中增殖，分泌抗體并積累在腹水中?？捎米⑸淦鲝母骨恢谐槿「顾?，從而收獲抗體。針對例如整合素的純人類單克隆抗體同系物是本發(fā)明方法中另一種可阻斷抗原的優(yōu)選結合劑。在它們的完整形式中，它們可用體外引發(fā)的人類脾細胞制備，如Boemer等，1991,免疫學雜志147:86-95，"由體外引發(fā)的人類脾細胞產生抗原特異性人類單克隆抗體"所述?；蛘?，它們可通過如Persson等，1991，美國國家科學院學報88:2432-2436,"通過對所有組成成分的克隆產生各種高親和力人類單克隆抗體，，，以及Huang和Stollar,1991,免疫學方法雜志141:227-236,"不經體外刺激而從人類外周血淋巴細胞構建代表性的免疫球蛋白可變區(qū)cDNA文庫"所述的對所有組成成分的克隆來制備。美國專利5,798,230(1998年8月25日，"制備人類單克隆抗體的方法及其應用")描述了從人類B細胞制備人類單克隆抗體。根據(jù)該方法，能產生抗體的人類B細胞通過Epstein-Barr病毒或其能表達Epstein-Barr病毒核抗原2(EBNA2)的衍生物感染而永生化。EBNA2功能(是永生化所必需的)隨后關閉，導致抗體產生的增加。在另一產生純人類抗體的方法中，美國專利5,789,650(1998年8月4曰，"產生異源抗體的非人類轉基因動物")描述了能產生異源抗體的非人類轉基因動物和具有滅活的內源性免疫球蛋白基因的非人類轉基因動物。內源性免疫球蛋白基因通過反義多核苷酸和/或通過針對內源性免疫球蛋白的抗血清來抑制。異源抗體由該種非人類動物的基因組中通常不具有的免疫球蛋白基因編碼。將含有非重排型異源人類免疫球蛋白重鏈序列的一或多種轉基因導入非人類動物，從而產生轉基因動物，該動物能功能性重排轉基因免疫球蛋白序列，并產生由人類免疫球蛋白基因編碼的各種同種型抗體的所有組成成分。這些異源人類抗體在B細胞中產生，然后B細胞通過與永生化細胞系如骨髓瘤融合而永生化，或通過用其它技術操作這些B細胞而制備一種能產生單克隆異源性純人類抗體同系物的永生化細胞系。另一種能在本發(fā)明方法中封閉整合素抗原或其片段的優(yōu)選結合劑是能與整合素蛋白或其片段結合的人源化抗體同系物。在制備嵌合抗體的早期方法之后，EP0239400(Winter等)描述了一種新方法，其中通過將一種抗體的互補決定區(qū)(CDR)用另一種的相應區(qū)代替而改變抗體。該方法可用于，例如將人類重鏈和輕鏈Ig可變區(qū)結構域的CDR用來自鼠的可變區(qū)結構域的另一種CDR取代。隨后使這些已改變的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)組合，產生除取代的鼠CDR以外，完全由人的成分組成的抗體。預計這些CDR-取代型抗體相對于嵌合抗體較不易于激發(fā)人類的免疫應答，因為CDR-取代型抗體只含有4艮少量的非人類成分。經由CDR"移植"而產生人源化單克隆抗體的方法被稱為"整形(reshaping)"(Riechmann等，1988，自然332:323-327，"對人類抗體進行整形以用于治療，，；Verhoeyen等，1988，科學239:1534-1536，"應用單克隆抗體中的CDR移植使人類抗體整形")。通常，將鼠的抗體的互補決定區(qū)(CDR)移植在人類抗體中相應區(qū)上，因為所述CDR(抗體重鏈上3個，輕鏈上3個)是小鼠抗體上的特異性抗原結合區(qū)?？赏ㄟ^基因工程移植CDR,其中CDRDNA序列通過克隆鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)(V區(qū))基因片段來測定，然后通過定點誘變轉移至相應人的恒定區(qū)。在該方法的最后階段，添加具有所需同種型的人類恒定區(qū)基因片段(通常為CH的yI型和CL的K型)，使人源化重鏈和輕鏈基因在哺乳動物細胞中共表達，以產生可溶性人源化抗體。向人的抗體轉移這些CDR使該抗體具備了來源鼠抗體的抗原結合特性。鼠抗體上的6個CDR安裝在V區(qū)的"框架區(qū)"上。CDR+移植成功的原因是，小鼠與人的抗體框架區(qū)可能具有非常相似的三維結構，且具有相似的CDR附著點，使得CDR可以互相交換。這類人源化抗體同系物可通過如Jones等，1986，自然321:522-525,"用小鼠抗體的互補決定區(qū)替代人類抗體中的相應區(qū)"；Riechmann,1988，自然332:323-327，"對人類抗體進行整形以用于治療，，；Queen等,1989，美國國家科學院學報86:10029,"與白細胞介素2受體結合的人源化抗體"和Orlandi等，1989，美國國家科學院學報86:3833,"通過聚合酶鏈反應克隆免疫球蛋白可變區(qū)以便表達"等所述制備。盡管如此，框架區(qū)中某些氨基酸被認為可與CDR反應并影響整個抗原結合親和力。直接從鼠抗體轉移CDR來產生人源化抗體，而不對人的V區(qū)框架作任何修飾，常常導致結合親和力的部分或完全喪失。在多個例子中，改變受體抗體的框架區(qū)中的殘基對獲得結合活性似乎是關鍵的。Queen等,1989，美國國家科學院學報86:10029-10033,"與白細胞介素2受體結合的人源化抗體，，和WO90/07861(ProteinDesignLabsInc.)已描述，通過使鼠mAb(抗-Tac)的CDR與人的免疫球蛋白框架區(qū)及恒定區(qū)組合可制備在受體抗體的框架區(qū)中包含修飾的殘基的人源化抗體。他們已證實了不修飾人的V區(qū)框架殘基而直接轉移CDR常導致的親和力丟失問題的一種解決方法；其包括兩個關鍵步驟。第一，用計算機分析與來源鼠抗體(此例中為抗-TacMAb)V區(qū)框架具有最佳同源性的蛋白序列，由此選擇人的V框架區(qū)。第二步，利用計算機作出該鼠V區(qū)的三級結構模型，以便觀察框架中最可能與鼠CDR作用的氨基酸殘基，然后將這些鼠氨基酸殘基重疊在人的同源框架上。他們這種利用帶假定鼠接觸殘基之人類同源框架的方法受體特異性抗體(Queen等，1989，出處同上)，以及皰滲病毒(HSV)特異性抗體(Co等，1991,美國國家科學院學報88:2869-2873,"用于抗病毒治療的人源化抗體")。根據(jù)以上在WO90/07861中所述的兩步法，Queen等總結了設計人源化免疫球蛋白的幾個關^l定。第一個關鍵是，用通常同源于將被人源化的非人類供體免疫球蛋白的特定人類免疫球蛋白的框架作為人類受體，或用來自多種人類抗體的框架作為共有框架。第二個關鍵是，如果人類受體的殘基是不常見的，而框架中特異性殘基處的供體殘基是人類序列中常見的，則優(yōu)選用供體氨基酸而不是受體氨基酸。第三個關鍵是，在緊鄰CDR的位點使用供體框架的氨基酸殘基而不用受體的。也可用另一種方法(參見Tempest,1991，生物4支術9:266-271，"對人類單克隆抗體進行整形以抑制人類呼吸道合胞病毒的體內感染，，)，和作為標準，利用分別衍生自NEWM和REI重鏈和輕鏈的V區(qū)框架在不隨才幾導入小鼠殘基的情況下進行CDR移植。利用Tempest等，1991的方法構建基于NEWM和REI的人源化抗體，其優(yōu)勢是，NEWM和REI可變區(qū)的三維結構已通過X線晶體成像分析得知，并因此可構建CDR與V區(qū)框架殘基的特異性相互作用的模型。本發(fā)明的處理方法對具有這些情況的人類和動物受試者均有效。可應用本發(fā)明的動物受試者包括作為寵物馴養(yǎng)或為商業(yè)目的馴養(yǎng)的動物和牲畜。實例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。本發(fā)明方法中，抗體(包括如抗VLA-1抗體)可通過非胃腸道途徑給藥。本文中"非胃腸道"包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節(jié)內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、損傷內和顱內注射或灌注技術。本發(fā)明的藥用組合物包括本發(fā)明的任何化合物，或其可藥用的衍生物，以及任何可藥用的載體。本文中"載體，，包括已知的可接受的佐劑和載體。根據(jù)本發(fā)明，藥用組合物可以為無菌注射制劑，如無菌可注射的水性或油性懸浮液。這種懸浮液可根據(jù)本領域已知技術利用適當分散劑或濕潤劑和懸浮劑來配制。本發(fā)明的藥用組合物可口服。如果口服，可為口服能接受的任何劑型，包括但不限于膠嚢、片劑、含水懸浮液或溶液。局部應用時，可將藥用組合物配制為適當?shù)母鄤?，其中含有懸浮于或溶解于一或多種栽體中的活性成分。本發(fā)明的藥用組合物還可通過氣溶膠形式鼻內給藥，或通過噴霧器、干粉吸入器或計量型藥劑吸入器的使用而吸入給藥。本發(fā)明化合物能有效產生所需效應的劑量和用藥頻率取決于多種因素，如抑制劑的特性、受試者的個體大小、治療所要達到的目標、所治療的病理特性、所用的具體藥用組合物、以及施治醫(yī)生的判斷?；钚猿煞只衔锩咳談┝吭诩s0.00l-約100mg/kg體重時有效，優(yōu)選約0.1-約50mg/kg體重/天。最優(yōu)選抗體同系物以約0.1-約20mg/kg體重/天，優(yōu)選約O.l-約lOmg/kg體重/天的劑量每隔1-14天給藥一次。在另一優(yōu)選實施方案中，抗體以約0.3-1mg/kg體重腹膜內(I.P.)給藥。在另一優(yōu)選實施方案中，抗體以約5-12.5mg/kg體重靜脈內(I.V.)給藥。優(yōu)選給與有效量的抗體組合物以便能提供至少lpg/ml的血漿抗體水平。本領域技術人員可輕易檢驗本發(fā)明的拮抗劑是否具有所需效應。例如，可利用能檢測所給試劑的第二試劑來體外(或離體)檢測患者上皮樣品中所含細胞是否含有所述試劑。該第二試劑可以是，例如萸光染料標記的特異性針對所給試劑的抗體，其然后可以用標準FACS(焚光活化的細胞分揀術)分析來測量。或者，可通過患者細胞不能與被標記(如被焚光染料標記)的所給試劑結合或結合能力降低來體外(或離體)檢測所給試劑的存在。優(yōu)選的劑量應能使絕大多數(shù)刺猬狀陽性細胞產生可檢測的包被。優(yōu)選當使用抗體同系物時所述包被可維持1-14天。除非另外指明，本發(fā)明的實施可利用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白質化學、和免疫學的常規(guī)技術，它們均落在本領域技術人員的范圍內。這些技術文獻中有述。例如，參見，分子克隆實驗室手冊，第二版(Sambrook,Fritsch和Maniatis編)，冷泉港實驗室出版社，1989;DNA克隆，第I和II巻(D.N.Glover編)，1985;寡核苷酸合成(M丄Gait編)，1984;美國專利4683195號(Mullis等)；核;酸雜交(B.D.Hames和S丄Higgins編)，1984;轉錄和翻譯(B.D.Hames和SJ.Higgins編)，1984;動物細胞的培養(yǎng)(R丄Freshney編)，AlanR.Liss，Inc.,1987;固相化細胞和酶，IRL出版社，1986;分子克隆實用指南(B.Perbal),1984;酶學方法，第154和155巻(Wu等編)，學院出版社(AcedemicPress)，紐約；用于哺乳動物細胞的基因轉移栽體(J.H.Miller和M.P.Calos編)，1987，冷泉港實驗室；細胞和分子生物學中的免疫化學方法(Mayer和Walker編)，學院出版社，倫敦，1987;實驗免疫學手冊，第I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell編)，1986;小鼠胚的操作，冷泉港實驗室出版社，1986。以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例化學試劑異硫氰酸熒光素(FITC)購自Sigma化學公司(St.Louis,MO)。巴豆油購自ICNBiochemicals(Aurora,OH)。Alsevers溶液中的全羊血獲自EastAcresBiologicals(Southbridge，MA)。I型大鼠尾部膠原蛋白和IV型小鼠膠原蛋白分另ll購自CollaborativeResearchInc.(Bedford,MA)和Gibco(Gaithersburg，MD)。6-8周齡的Balb/c雌性小鼠購自Taconic(Germantown,NY),基于Balb/c背景的alpl整合素缺陷型小鼠如前述(3)。實施例1卓^i鏖戎雄。制備不含疊氮鈉且只含少量內毒素的針對鼠抗原的功能封閉性mAb:Ha31/8(倉鼠抗-CD49a;整合素al)(Mendrick等，1995，Lab.Invest.72:367-375)，Hal/29(倉鼠抗-CD49b;整合素a2)(卩l(xiāng))(Mendrick等，1995，Lab.Invest.72:367-375;MendrickD丄.和D.M.Kelly，1993,Lab.Invest.69:690-702),倉鼠II組對照mAbHa4/8(倉鼠抗-KLH)(MendrickD丄.和D.M.Kelly,1993，Lab.Invest.69:690-702)，和PS/2(大鼠抗-CD49d;整合素a4卩l(xiāng)鏈)(Miyake等，1991，J.Exp.Med.173:599-607)。此外，以下針對鼠抗原的功能封閉性mAb是作為無疊氮鈉/低內毒素毒性制劑購自Pharmingen(SanDiego，CA):HM卩1-1(倉鼠抗-CD29;整合素卩l(xiāng)鏈)(Noto等，1995,Int.Immunol.7:835-842)，Ha2/5(倉鼠抗-CD29;整合素卩l(xiāng)鏈)(MendrickD丄.和D.M.Kelly,1993，Lab.Invest.69:690-702)，3E2(倉鼠抗-CD54，ICAM-1)(Scheynius等，1993，免疫學雜志150:655-663),5H10-27(大鼠抗-CD49e;整合素a5)(Kinashi，T.和T.A.Springer,1994，血細胞20:25-44)，GoH3(大鼠抗-CD49f;整合素a6)(Sonnenberg等，1987，生物學化學雜志262:10376-10383)，和大鼠同種型對照mAbR35-95(大鼠IgG2a)和R35-38(大鼠IgG2b)。^餘試驗。將Balb/c小鼠脾細胞用20ng/mlIL-2培養(yǎng)7-12天。細胞對I型和IV型膠原蛋白的粘附如前所述(Gotwals等，1996，臨床研究雜志，97:2469-2477)。簡短說，96孔Maxisorp板(Nunc,Napierville，IL)用10ng/mlIV型膠原蛋白或5(ig/mll型膠原蛋白包被，非特異性位點用r/。BSA封閉。IL-2活化的脾細胞用2pMBCECF[2，，7，-雙(羧乙基)-5(6)羧基焚光素五乙酰氧曱基酯〗(MolecularProbes，Eugene,OR)標記，并與10pg/ml所選mAb—起保溫15分鐘。然后在包被孔中加入105細胞的0.25%BSA-RPMI溶液，37°C保溫60分鐘。未結合的細胞通過用0.25%BSA-RPMI洗滌3次而除去。粘附用CytoFluor2350熒光讀板儀(Millipore,Bedford,MA)定量。測定已結合的細胞與所輸入細胞的總數(shù)之比，并計算相對于用對照mAb處理的細胞(設定為100%標準)的粘附百分率。減去僅用BSA包被的孔中細胞粘附的本底值。oc/yW々a2y87^活化冷勿應丄的4迷以及^^封所。由于白細胞在炎癥中所起的關鍵作用，我們決定檢驗抗almAb和抗a2mAb是否能封閉白細胞對膠原蛋白的粘附。為了獲得對al和a2都能高水平表達的白細胞，將小鼠T細胞用IL-2體外刺激7-12天。這些細胞高水平表達al和a2(圖1A)，并與IV型和I型膠原蛋白包被的表面很好地結合(圖1B)。對IV型膠原蛋白的粘附在單用抗almAb時被部分抑制，單用抗a2mAb時不受抑制。相反，對I型膠原蛋白的粘附被抗a2mAb完全抑制，單用抗almAb時僅顯示部分抑制?？筆1mAb以及抗al和a2mAb的組合可完全抑制對I型和IV型膠原蛋白的粘附。在證實aipi和a2|31整合素表達于活化T細胞上，和抗al和a2mAb能功能性封閉白細胞對膠原蛋白的粘附之后，我們使用這些mAb來研究所述整合素在炎性病癥的動物模型中的體內作用。實施例2^^,合,mJ6押辨D77/X吝。利用此前已公開的方案(Hurtrel等，1992，細胞免疫學142:252-263)獲得SRBC-誘導的遲發(fā)型超敏反應(DTH)應答。簡短說，小鼠于第0天背部皮下(s.c.)接種2x10SRBC的lOOplPBS溶液。第5天于右后足墊皮下注射1x108SRBC的25^1PBS溶液對小鼠進行攻擊?？乖舻?0小時后用工程卡尺(Mitutoyo/MTI，Paramus，NJ)測量足墊的厚度，并計算足墊腫脹的程度。結果表示為足墊厚度的平均增長百分率土SEM,計算公式是％增長=[1-(抗原攻擊的20小時后右足墊的厚度/抗原攻擊的20小時后未處理的左足墊的厚度)]x100。為了阻斷SRBC-誘導的DTH應答的效應期，在第5天于抗原攻擊的1小時前，腹膜內(i.p.)給與用實施例1所述方法制備的治療性mAb或對照mAb(10(^ig)。SRBC-誘導的DTH是一種明確定性的炎癥(尤其牛皮癬)的體內模型，其已用于證實各種細胞因子和粘附分子在炎癥中的重要性(Tedder等，1995,實驗醫(yī)學雜志181:2259-2264,Terashita等，1996,免疫學雜志156:4638-4643)。SRBC-敏感型小鼠在足墊抗原攻擊的1小時前接受抗整合素mAb,20小時后通過測量增加的足墊厚度來評估炎癥。PBS處理的小鼠和對照倉鼠Ig處理的小鼠顯示，抗原攻擊的20小時后足墊厚度增加60-70%(圖2)。與對照倉鼠Ig的處理相比，抗almAb或抗a2mAb分別導致對足墊厚度的68%和60%抑制?？筧l和a2mAb的組合導致71%抑制，證實相比于單用抗almAb或抗a2mAb幾乎沒有加成效應。用其它抗整合素mAb進行處理也能有效抑制DTH效應應答。用各種mAb處理顯示的抑制程度為49%(抗a4)，23%(抗a5)和57%(抗a6)。最后，能封閉共有(31整合素亞單位的mAb(mAbHMBI-l)使效應物DTH應答被抑制67%。實施例3^拔整合,責/^Z^伊辨C^iS放j教應吝。如前述(Gaspari等，1991，在《免疫學最新方法》，J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach，和W.Strober編，JohnWiley&Sons,紐約。4.2:1節(jié))評估對FITC的接觸性超敏反應(CHS)。簡短說，小鼠于第0天在已去毛的背部涂抹0.5。/oFITC的1:1丙酮/二丁基鄰苯二曱酸酯溶液100^1，使小鼠致敏。IO天后，通過在每只耳的雙側應用5^10.5%FITC來攻擊小鼠。于抗原攻擊時(第10天)和24小時后，用工程卡尺(Mitutoyo/MTI，Paramus,NJ)測量耳的厚度以確定耳腫脹應答，結果表示為基線耳厚度的平均增長百分率士SEM，耳厚度的增加的計算公式是％增長=[1-(抗原攻擊的24小時后耳的厚度/抗原攻擊時耳的厚度)]xl00。為了阻斷CHS應答效應期，在第10天于抗原攻擊的4小時前，腹膜內給與治療性mAb或對照mAb(250嗎)。經抗原致敏且僅用載體攻擊耳部的小鼠(載體對照)或耳部未經事先致敏而接受攻擊的小鼠(刺激劑對照)用作陰性對照(耳部厚度的增加從未超過2%)。由于CHS具有與DTH不同的機制并涉及不同的效應細胞，我們研究了抗整合素mAb對CHS應答效應期有何影響。在小鼠已去毛的背部應用FITC,使小鼠被半抗原致敏，10天后用FITC攻擊耳部導致在第二天發(fā)生炎性應答。FITC致敏小鼠經證實在抗原攻擊的24小時后厚度增加60-70%(圖3)。與已公開的結果(Scheynius等，免疫學雜志，150:655-663)—致，抗ICAM-1mAb處理導致耳部腫脹被抑制51%。與對照倉鼠mAb相比，小鼠在抗原攻擊的4小時前用抗al或抗a2mAb處理導致耳部腫脹分別被抑制37%和57%(圖3)。抗al和抗a2mAb的組合導致對耳部腫脹的稍強抑制作用(65%)。用針對pl整合素的其它mAb進行的處理表明，雖然抗a4和抗a5mAb與對照大鼠mAb相比，對FITC誘導的CHS效應物應答無抑制作用，但用抗a6mAb處理導致對效應物應答的86%抑制。最后，能封閉共有Pl整合素亞單位的mAb使CHS效應物應答被抑制74%。用不同小鼠品系(C57/BL6，129/Sv)和另一種致敏劑(唑S同)得到類似的CHS結果(數(shù)據(jù)未顯示)。與在SRBC-誘導的DTH模型中所見結果相似，對發(fā)炎的耳朵的組織學分析表明，水腫形成和白細胞浸潤均被抗al和抗a2mAb的處理抑制。與alpl和a2pi可在IL-2活化的脾細胞上表達的發(fā)現(xiàn)一致，對抗原致敏小鼠(FITC或唑酮)的淋巴結的分析表明，aipi和a2pl僅在CD44hlLFA"hi活化的CD4+和CD8+T細胞上表達(數(shù)據(jù)未顯示)。用抗al和抗a2mAb處理小鼠未導致這些細胞的刪除，表現(xiàn)為CHS模型中應答抗原致敏的脾臟和淋巴結中活化T細胞數(shù)未受影響。此外，效應細胞未出現(xiàn)功能性缺失，因為抗al和抗a2mAb對抗原致敏型小鼠的延長處理(10-16天)未能影響第20天時小鼠對抗原攻擊的炎性應答(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例4C//iS效j^吝^凝潛型V、虞#減>、。aipi在FITC介導型CHS之效應應答中的抑制作用可能由mAb介導，為排除這種可能性，在野生型小鼠和aipi整合素缺陷型小鼠中進行實驗(圖4)。野生型小鼠中效應期的MAb抑制作用與此前的結果一致，用抗al可導致耳部厚度被抑制56%,用抗a2為56。/。，用抗al和抗a2的組合為62%。未處理的alpl缺陷型小鼠與未處理的野生型小鼠相比，CHS效應期顯著減弱(耳部厚度分別增加30%和71%)。如所預計，未處理的aipi缺陷型小鼠耳部鐘脹的水平等價于抗almAb處理的野生型小鼠中的耳部腫脹水平。最后，能封閉a2(31的mAb在a1(31缺陷型小鼠中僅導致對耳部腫脹的略微增加的抑制作用，其與在接受抗al和抗a2mAb組合的處理的野生型小鼠中所見一致。實施例5DTH和CHS炎癥模型中所見的抗整合素mAb的抑制效應可能由抗al和抗a2mAb介導的總抗炎效應所致，為進一步排除這種可能性，研究了這些mAb在刺激性皮炎中的效應。為評估刺激性皮炎，在小鼠的每只耳朵的雙側涂抹0.8。/。巴豆油的丙酮溶液5^1。在應用該刺激劑的4小時之前給與治療性抗體或對照抗體。24小時后如上述測量耳部腫脹，并與應用巴豆油之前的耳部厚度比較。結果表示為如上所述的基線耳部厚度的平均增長百分率士SEM。僅涂抹了丙酮的小鼠(栽體對照辨為陰性對照。24小時后，用巴豆油處理的小鼠當與僅接受載體(丙酮)的小鼠相比時顯示耳部厚度的顯著增加(48。/。)。用抗al或抗a2mAb預處理的小鼠與PBS處理鼠或對照mAb處理鼠相比，巴豆油所致毒性耳部腫脹未受顯著影響(圖5)。對巴豆油處理的耳的組織學檢查表明，用抗al或抗a2mAb處理的小鼠與對照mAb處理鼠或PBS處理鼠相比，浸潤細胞的數(shù)量或類型或水腫的形成沒有差異(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例6a/y5/和a2yW^^貫義的押辦。由于aipi在關節(jié)炎患者滑膜中的浸潤細胞上良好表達，我們決定檢查抗al或抗a2mAb是否在前迷關節(jié)炎加速模型(Terato等，1992,免疫學雜志148:2103-2108;Terato等，1995，自身免疫22:137-147)中具有抑制作用。Arthrogen-CIA抗體試劑盒購自Stratagene(LaJolla,CA),關節(jié)炎用現(xiàn)有成熟技術(Terato等，1992，免疫學雜志148:2103-2108;Terato等,1995,自身免疫22:137-147)誘導。筒短說，關節(jié)炎通過第0天腹膜內(i.p.)注射4種抗II型膠原蛋白mAb(各lmg)的混合物，然后于第3天腹膜內注射50昭LPS來誘導。在隨后的3-4天中，小鼠腕關節(jié)、踝關節(jié)和趾逐漸腫脹。于第0天注射抗膠原蛋白mAb的4小時前，腹膜內給與治療性mAb或對照mAb(250昭)，在第3天給與LPS的4小時前，再次給與相同制劑，然后在整個實驗期間以3天的間隔持續(xù)給藥。從第3天開始，評估小鼠的關節(jié)炎進展。對每一肢的關節(jié)炎嚴重程度用一個四點系統(tǒng)評分O-正常；l-輕度紅腫，踝關節(jié)或腕關節(jié)的輕微腫脹；2=踝關節(jié)或腕關節(jié)的中度腫脹；3=包括部分趾、踝關節(jié)以及足部的嚴重腫脹；4=最嚴重的紅腫。Balb/c小鼠中，嚴重的關節(jié)炎在LPS注射的72小時后出現(xiàn)并持續(xù)3周以上。僅注射抗膠原蛋白mAb或僅注射LPS都未誘導關節(jié)炎。接受對照mAb處理的小鼠與用PBS處理的小鼠顯示相同嚴重程度的關節(jié)炎(圖6)。相比之下，單用抗almAb處理導致關節(jié)炎顯著減輕(78。/。)并持續(xù)實驗全程。單用抗a2mAb處理也出現(xiàn)有利效果，導致關節(jié)炎評分比對照mAb處理鼠的評分降低32%?？筧l和抗a2mAb的組合導致與單用抗almAb所得相似程度的抑制作用。實施例7戎a7和我ct2^理^義^紐應浸與的放^^逾歡夢為V^。對SRBC-謙導的DTH應答的進一步組織學分析證實了抗al和抗cc2mAb處理對所激發(fā)的炎性應答的調節(jié)能力(圖7)。SRBC-致敏小鼠的未受攻擊的足墊(圖7A)當與同一小鼠的SRBC-攻擊的足墊(圖7B)相比時，未顯示任何炎性細胞浸潤?？筧l和抗a2mAb分別或組合所處理的SRBC-致敏小鼠，當與對照mAb處理的小鼠相比時，在SRBC攻擊的足墊中找到的這些浸潤細胞的數(shù)量大大減少(圖7C-F)。對浸潤細胞的仔細檢查表明，大多數(shù)細胞為中性粒細胞，還有部分單核細胞和淋巴細胞，還證實抗al和抗a2mAb處理大大減少了這些細胞的數(shù)量(圖7G-H)。實施例8對義^細v敏浸河^a74這紐應的A瘦紐化避定。實施免疫組化以便更精確測定浸潤細胞的特征以及它們是否表達能與膠原蛋白結合的整合素(圖8)。檢查未處理小鼠的發(fā)炎足墊中的浸潤細胞是否表達aipi整合素和細胞譜系標志物(圖8)。發(fā)現(xiàn)aipi整合素在多種浸潤白細胞上表達(圖8A)。用雙免疫組化鑒定浸潤細胞的特性以及aipi表達的分布(圖8B)。利用細胞譜系標志物發(fā)現(xiàn)浸潤物中絕大部分為粒細胞/單核細胞(Mac-l+)，其中很多為中性粒細胞(Grl+)，還有少數(shù)T淋巴細胞(CD3+)(圖8B)。發(fā)現(xiàn)aipi整合素在所有三種細胞亞型中表達，其中al表達于Mac-l+粒細胞/單核細胞亞型，Grl+中性粒細胞亞型，以及絕大多數(shù)浸潤的CD3+T淋巴細胞上(圖8B)。詳細地免疫組化分析表明，盡管抗al和抗a2mAb處理減少了浸潤細胞的數(shù)量，但浸潤物的細胞組成未變(數(shù)據(jù)未顯示)。用FITC抗倉鼠mAb進行的免疫組化染色證實，抗al和抗a2mAb能定位于發(fā)炎的足墊中(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例9我《/^7w"6和戎a"2wl46，義的丼新以及在aJ^溜至、葳^對^夢義^^封。由于aipi在關節(jié)炎患者滑膜中的浸潤細胞上良好表達，我們決定檢查抗al或抗a2mAb是否在前述關節(jié)炎加速模型(Terato等，1992，免疫學雜志148:2103-2108;Terato等，1995，自身免疫22:137-147)中具有抑制作用。該模型涉及給小鼠注射抗II型膠原蛋白mAb的混合物，然后給與LPS,導致隨后3-7天中關節(jié)炎的進展。小鼠從第0天每隔3天給與mAb,并以3天的間隔評估關節(jié)炎進展。嚴重的關節(jié)炎在LPS注射的72小時后在所有小鼠中出現(xiàn)并持續(xù)3周以上。4叉注射抗膠原蛋白mAb或僅注射LPS都未誘導關節(jié)炎。接受對照mAb處理的小鼠與用PBS處理的小鼠顯示相同嚴重程度的關節(jié)炎(圖9A)。相比之下，單用抗cdmAb處理導致關節(jié)炎顯著減輕(79%或更高)并持續(xù)實驗全程。單用抗a2mAb處理也出現(xiàn)有利效果，導致關節(jié)炎評分比對照mAb處理鼠的評分降〗氐37%?？筧l和抗a2mAb的組合導致與單用抗almAb所得相似程度的抑制作用。所有小鼠用抗almAb處理都導致關節(jié)炎評分的下降，比用其它數(shù)種基于mAb的關節(jié)炎處理效果好，所述其它mAb如可溶性TNF受體Ig融合蛋白(Mori等，1996，免疫學雜志，157:3178-3182)、抗-Mac-1(Taylor等，1996，免疫學88:315-321)、抗a4(Seiffge,1996，風濕病學雜志(J.Rheumatol.)23:2086-2091)、和抗-ICAM-l(Kakimoto等，1992，細胞免疫學142:326-337)(圖9A)。與顯示al卩l(xiāng)在關節(jié)炎中重要性的基于mAb的數(shù)據(jù)一致，未處理的al缺陷型小鼠當與野生型小鼠比較時顯示關節(jié)炎評分的顯著降低(圖9B)。實施例10我w屈處埋對,悉^節(jié)義之^^"的f瘦夢的彩詢。接受對照mAb或抗almAb處理的野生型關節(jié)炎小鼠(第8天)的關節(jié)與正常未處理小鼠的關節(jié)經目測比較并進行組織學比較(圖10)。根據(jù)目測結果，對照mAb處理鼠顯示整個足部包括腳趾紅腫，而抗almAb處理鼠即使在任一關節(jié)或腳趾有任何炎癥，其癥狀也很輕微。組織學檢查顯示，對照mAb處理的關節(jié)炎關節(jié)有重大改變，滑膜下(subsynovial)組織有炎性細胞的廣泛浸潤，關節(jié)表面有細胞粘附，并有以蛋白聚糖損失為表現(xiàn)的顯著軟骨破壞(圖10)。與此前的報道(Terato等，1992，免疫學雜志148:2103-2108;Terato等，1995,自身免疫22:137-147)—致，該模型中的絕大多數(shù)浸潤細胞為中性粒細胞。小鼠經抗almAb處理大大減少了炎性浸潤物的量以及軟骨破壞的程度(圖10)。實施例11^蘆^的發(fā)蘭西缺乏沐巴敘敏而被延i^,戎cdm屈對^節(jié)義的押浙^缺乏^S細應的緣況T^:^。為測定哪種細胞類型可能在膠原蛋白mAb誘導型關節(jié)炎模型中很重要，我們比較了野生型B6-129小鼠和RAG-l-缺陷型B6-129小鼠發(fā)生關節(jié)炎的能力(圖11)。RAG-1(重組活化基因-l)基因的遺傳缺失導致成熟T和B淋巴細胞的完全丟失(Mombaerts等，1992，細胞68:869-877)。野生型小鼠和RAG-l-缺陷型小鼠均發(fā)生關節(jié)炎，但在RAG-l-缺陷型小鼠中誘導動力學顯著減慢(圖11)。這些結果提示，盡管淋巴細胞與這種關節(jié)炎模型相關，但它們并非該疾病的發(fā)生和進展所必需。已公開的關于檢查RAG-1-缺陷型小鼠在其它關節(jié)炎模型中的效應的報道也發(fā)現(xiàn)，T和B淋巴細胞的丟失推遲了關節(jié)炎的發(fā)生(Plows等，1999,免疫學雜志162:1018-1023)。用抗almAb處理野生型小鼠或RAG-l-缺陷型小鼠徹底抑制了關節(jié)炎(圖11)。這些結果證實，抗almAb在該模型中的效應并不依賴于淋巴細胞的存在，而且正如此前的實驗(圖9)所提示，抗almAb在預防疾病方面的效應可能是通過它對表達al的其它細胞，如巨噬細胞和中性粒細胞的作用而實現(xiàn)。實施例12戎a7m46^^^浙量該務^#浙。由于抗almAb處理在預防關節(jié)炎方面的驚人效果，我們進一步將研究深入至劑量應答分析(圖12)。從第0天開始每3天腹膜內給與不同劑量的mAb。與較早的數(shù)據(jù)一致，250嗎抗almAb導致幾乎完全阻止關節(jié)炎。低至100嗎的抗almAb在抑制該模型的關節(jié)炎方面僅部分有效，更低的劑量對關節(jié)炎評分無任何可辨別的影響(圖12)。實施例13^^a7""6治^T犖瓶^，義伴分。由于抗almAb在預防關節(jié)炎中的效應，我們嘗試對正在發(fā)展疾病的小鼠進行治療。通過在第0天給小鼠注射抗II型膠原蛋白mAb的混合物，然后在第3天給與LPS而誘導關節(jié)炎。然后用抗almAb或可溶性TNF受體Ig融合蛋白從第4天開始治療小鼠。在于第4天開始接受抗almAb的小鼠體內，當與自第4天開始接受對照倉鼠mAb的小鼠相比時，關節(jié)炎的進展被徹底阻斷(圖13)?？筧lmAb治療性給藥所見抑制程度很徹底，且與抗almAb預防性給藥(自第O天始)所見水平相同(圖13)。相比之下，自第4天開始的TNF受體Ig融合蛋白的治療與對照Ig融合蛋白相比僅導致對關節(jié)炎評分的60-70%抑制(圖13)?？筧lmAb和TNF受體Ig融合蛋白的聯(lián)合處理能徹底抑制關節(jié)炎評分，由于抗almAb單獨處理對關節(jié)炎的徹底抑制效應，這并不奇怪。總之，這些結果表明，抗almAb的治療性處理可有效抑制關節(jié)炎評分，比TNF拮抗劑的治療性處理效果好。實施例14錄#械的義磬和謬^！。從全長cDNA(Kern等(1994)生物學化學雜志269,22811-22816;Ignatius等(1990)細胞生物學雜志111,709-720)經聚合酶鏈反應(PCR)(PCRCORE試劑盒；BoehringerMannheim公司，德國)擴增人和大鼠al(31整合素結構域I的序列，所用人特異性引物為5，-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3，[正向];5，-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3，[反向]，大鼠特異性引物為5，-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3，[正向];5,-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3，[反向]。將所得PCR擴增產物純化，連接至pGEX4t-i(Pharmacia),轉化至感受態(tài)DH5a細胞(LifeTechnologies)中。篩選氨千青霉素抗性菌落中45kDa谷胱甘肽S-轉移酶-結構域I融合蛋白的表達。選出用于進一步鑒定的克隆的質粒DNA中插入子的序列通過DNA測序"i正實。制備大鼠/人嵌合al-I結構域(RAH)(MORPH誘變試劑盒；5引物-3引物)，將大鼠的殘基G92、R93、Q94和L97(圖14)分別替換為人的相應殘基V、Q、R、和R。攜有RAH結構域I的克隆通過診斷性Stul限制酶位點的丟失而鑒定，插入子通過DNA測序證實。人的al-I結構域的氨基酸序列示于圖15。實施例15錄溝械掙并'勝的Z^。已證實單克隆抗體在研究整合素亞單位的結構和功能關系時是非常有效的探針。例如，mAb已廣泛用于研究(31亞單位中與活化構象相關的區(qū)域(Qu，A.和Leahy,D丄(1996)結構4,931-942)。因此，為鑒定可用于al-I結構域構象變化的潛在4笨針，我們制備了針對人的al-I結構域的一組mAb?？筧l-I結構域單克隆抗體的產生。雌性Robertsonian小鼠(JacksonLabs)用經完全弗氏佐劑(LifeTechnologies)乳化的25jag純化人型aipi腹膜內免疫(Edwards等(1995)生物學化學雜志270，12635-12640)。經腹膜內給與以不完全弗氏佐劑(LifeTechnologies)乳化的25嗎aipi而加強免疫3次。顯示了最高抗al-I結構域滴度的小鼠在融合前腹膜內給與lOOiigaipi而加強免疫一次，并在融合的前一天靜脈給與50嗎aipi。使脾細胞與FL653骨髓瘤細胞以1:6的比例融合，并以100,000和33，000/孔鋪板于96孔組織培養(yǎng)板中。通過單色FACS評估上清結合alpl整合素的能力。在FACS分析之前，使上清與未轉染的K562細胞一起保溫以便去除僅與P亞單位結合的IgG。隨后，將懸浮于FACS緩沖液(1。/。胎牛血清(FCS)的PBS,含0.5。/。NaN3)中的、用al整合素亞單位轉染的3-5x104K562細胞(K562-al)與上清一起于4'C保溫45分鐘，洗滌后，與偶聯(lián)至藻紅蛋白的抗小鼠IgG—起保溫。細胞用FACS緩沖液洗滌兩次后，在BectonDickinson流式細胞儀上分析。篩選所得雜交瘤上清結合al-I結構域的能力。簡短說，96孔板(Nunc)每孔加入30昭/ml人型al-I結構域-GST融合蛋白的PBS溶液4'C包被過夜。平板用PBS洗滌，用T/。BSA-PBS封閉，將雜交瘤上清與結構域I室溫保溫l小時。用含0.03。/。吐溫20的PBS充分洗滌后，加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)反應1小時。末次洗滌后，加入lmg/ml對硝基苯磷酸(pNPP)在0.1M甘氨酸、1mMZnCl2、和1mMMgCl2中的溶液室溫靜置30分鐘，然后讀取平板的O.D.405。檢測所選上清在抑制K562-al依賴性對IV型膠原蛋白的粘附中的能力。將K562-al細胞用含0.25%BSA的DMEM中的2mM2，，7，-(雙-2-羧乙基-5和6)羧基熒光素五乙酰氧曱基酯(BCECF;MolecularProbers)37。C標記30分鐘。已標記的細胞用結合緩沖液(10mMHepes,pH7.4;0.9%NaCi;和2%葡萄糖)洗滌，再重懸于添加了5mMMgCl2的結合緩沖液中，終濃度為1x1()6個細胞/ml。將50^11上清與等體積的2x105K562-al細胞在96孔板的各孔中一起保溫。然后將平板離心，除去上清。將細胞重懸于結合緩沖液中，轉移至膠原蛋白包被板的孔中，37X:保溫1小時。保溫后，通過用結合緩沖液洗3次而除去未粘附的細胞。粘附的細胞在Cytofluor(Millipore)上分析。我們最初鑒定了19個雜交瘤，它們的上清可與表達aipi整合素的人類白血病K562細胞(K562-al)結合并與al-I結構域結合。分別從這些雜交瘤純化免疫球蛋白，并抬r驗它們封閉K562-al或al-I結構域與IV型膠原蛋白結合的能力。這些mAb可分為兩類能封閉aipi功能的和不能封閉al卩l(xiāng)功能的。例如，克隆AEF3、BGC5和AJH10產生的mAb與al-I結構域結合(圖16A，BGC5的數(shù)據(jù)未顯示)，但僅有AJH10可抑制al-I結構域依賴性IV型膠原蛋白粘附(圖16B)或K562-al對IV型膠原蛋白的粘附(圖16C)。對互補決定區(qū)的測序。為確立該組mAb的克隆起源，我們通過PCR擴增了12-19種抗體的CDR并進行了測序(數(shù)據(jù)未顯示)。將分離自1()7個雜交瘤(FastTrackmRNA分離試劑盒，Invitrogen)的2jagmRNA用以下引物各25pM進行逆轉錄(Ready-To-GoYouPrimeFirstStrandKit,PharmaciaBiotech):重鏈VH1FOR-2(Michishita等(1993)細胞72,857-867);輕鏈，VK4FOR，其限定4種不同寡聚物(Kem等(1994)生物學化學雜志269,22811-22816)。對每種雜交瘤而言，重鏈和輕鏈在分別4次PCR反應中用以下寡聚物的各種組合來擴增l)重鏈VH1FR1K(Kamata等(1995)生物學化學雜志270，12531-12535)、VH1BACK、VH1BACK(Baldwin等(1998)結構6，923-935)、VHfrla、VHfrlb、VHfrle、VHfrlf、VHfrlg(Ignatius等(1990)細胞生物學雜志111，709-720)、或VH1FOR-2(Michishita，M.，Videm,V.，和Arnaout，M.A.(1993)細胞72，857-867);2)輕鏈VK1BACK(Baldwin等(1998)結構6,923-935)、VK4FOR、VK2BACK寡聚物(Kem等(1994)生物學化學雜志269,22811-22816)、或VKfrla、VHfrlc、VHfrle、VHfrlf(Ignatius等(1990)細胞生物學雜志111,709-720)。對產物進行擴增(95。C5分鐘，然后以94°C1分鐘、55°C2分鐘、72°C2分鐘進行50輪，最后72"C10分鐘)，凝膠純化(QIAquick,Qiagen),然后直接用所列各種寡聚物在ABI377測序儀上測序。產生功能封閉性mAb的克隆的序列在所有互補決定區(qū)(CDR)和間隔框架區(qū)中幾乎都相同，表明這些雜交瘤是克隆相關的。實施例16名^伊遽和為、浙。非封閉性抗體的可變區(qū)序列顯著不同于封閉抗體中發(fā)現(xiàn)的克隆相關家族的序列。由于封閉抗體似乎起源于一個克隆，我們選擇一個(AJH10)進行進一步鑒定。免疫印跡。切自綿羊主動脈的平滑肌細胞層，以及K562-al細胞用在50mMHepes，pH7.5，150mMNaCl，10mM苯曱基磺酰氟(PMSF)，20嗎/ml抑蛋白酶肽，10pg/ml亮抑蛋白酶肽，lOmM乙二胺四乙酸(EDTA)中的1%Triton-X100提取。樣品在4-20%梯度膠上進行SDS-PAGE,然后電轉移至硝酸纖維素膜上。印跡用TBS中的5%干奶粉封閉；用含0.03%吐溫20的TBS洗滌，然后與抗體在含0.05。/。NaN3的封閉緩沖液中保溫2小時。然后如前述洗滌印跡膜，使之與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG—起保溫1小時，再次洗滌，然后用ECL試劑(Amersham)處理。再使印跡膜于膠片(Kodak)上曝光30-60秒，然后顯色。免疫印跡(圖17A)和FACS分析(圖17B)證實，AJH10與人、家兔和綿羊的aipi整合素反應，但不與大鼠的aipi整合素反應，提示封閉性mAb與進化保守的線性表位結合。非封閉性mAb在免疫印跡中無反應，也不與除人類以外的其它物種反應。實施例17潛種誠對辰,f^的趁合為二,厲離f該襲型al-I結構域在大腸桿菌中表達為GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)融合蛋白，其在序列連接處含有凝血酶切割位點。細胞在PBS中裂解后，將澄清的上清上樣至已用PBS充分洗滌過的谷胱甘肽S印harose4B層析柱(Pharmacia)。al-I結構域-GST融合蛋白用50mMTris-HCl，pH8.0,5mM谷胱甘肽(還原型)洗脫。在變性研究中，結構域I用50mMTris，pH7.5中的凝血酶裂解，并從GST融合配對物上純化出來。添加DTT至2mM，將樣品上樣至谷胱甘肽Sepharose4B層析柱。將流通級分和洗滌級分匯總，上樣至QSepharoseFF柱(Pharmacia)。al-I結構域用50mMTris-HCl，pH7.5，10mM2-巰基乙醇，75mMNaCl洗脫。純化的結構域I通過電噴射電離質譜分析(ESI-MS)來展示其預定質量(Lee等(1995)結構3,1333-1340，871Da)，其在SDS-PAGE上作為一條帶遷移，該蛋白在Superose6FPLC柱(Pharmacia)上的大小排阻層析中以相應大小的單個峰形式洗脫。及^^為V^f96孔板用lpg/mlIV型膠原蛋白(Sigma)或I型膠原蛋白(CollaborativeBiomedical)4°C包被過夜，用Triton緩沖液(O.l%TritonX-100;1mMMnCl2;25mMTris-HCl;150mMNaCl)洗柱，用25mMTris-HCl;150mMNaCl(TBS)中的3%牛血清清蛋白(BSA)封閉。將在含1mMMnCb和3%BSA的TBS中系列稀釋的al-I結構域-GST融合蛋白在所述包被板上室溫保溫1小時，用Triton緩沖液洗滌。所結合的al-I結構域用以下試劑檢測10pg/ml生物素化抗GST多克隆抗體(Pharmacia)的系列稀釋液；在含1mMMnCl2和3%BSA的TBS中1:3000稀釋的ExtrAvidin辣根過氧化酶(Sigma),和l-步ABTS(2，2，-連氮-雙[3-乙基苯并噻唑啉磺酸];Pierce)。將平板置于微滴板讀板儀(MolecularDevices)上讀取O.D.405。潛果。人和大鼠(95。/。與人的相同)的al-I結構域在大腸桿菌中以GST融合蛋白的形式表達，并通過谷胱甘肽Sepharose純化。用前述基于ELISA的試驗(Qu,A.，和Leahy，D丄(1995)美國國家科學院學報92,10277-1028l)的改良試驗檢查這兩種蛋白與I和IV型膠原蛋白結合的能力。人的al-I結構域結合IV型膠原蛋白的效力優(yōu)于結合I型膠原蛋白的效力(圖18A)。al-I結構域特異性抗體可消除針對這兩種配體的結合(有關I型膠原蛋白的數(shù)據(jù)未顯示)，但a2-I結構域特異性抗體不行(圖18B)。Mr+和Mg"均可刺激結合，而EDTA將結合降低至本底水平(圖18C)。在人和大鼠的al-I結構域之間未檢測到配體結合的可測量的差異，提示物種間序列的差異并不與功能相關(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，al-I結構域特別需要陽離子來進行有效配體結合。實施例18M/A4S差^/#近的所離子該^^4在嫂差。我們利用了以下現(xiàn)象AJH10識別人的al-I結構域序列，因此可定位針對alpl功能封閉性mAb的表位，但它不能識別大鼠的al-I結構域序列。人和大鼠的序列僅相差12個氨基酸，其中4個位于與MIDAS基元內的關鍵性蘇氨酸(圖14A,aa98)相鄰的6個氨基酸(aa91-96,圖14A)中。為了檢驗以下假說，即所述6個氨基酸Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg包含用于封閉mAb的表位，我們構建了一個嵌合結構域I(RAH)，其中將大鼠殘基G92、R93、Q94和L97分別替換為人的相應殘基V、Q、R和R。AJHIO，以及所有功能封閉性mAb可識別該嵌合結構域I(RAH;圖14B)。為了在al-I結構域的三級結構中參照MDAS結構域將這些殘基定向，我們用a2-I結構域的晶體結構坐標構建了al-I結構域的模型。用人類a2-I結構域的X線晶體結構(Ward等(1989)自然341，544-546)建立人類al-I結構域的相似模型。該模型用InsightII的相似模型構建模塊(homologymodelingmoduleofInsightII)(2.3,5版,BiosymTechnologies)來構建。使用CHARMM程序(Clackson等(1991)自然352，624-628),其中用到全氫原子參數(shù)組22和兩倍于原子間距的距離依賴性介電常數(shù)。我們首先對al-I結構域的所有原子用1kcal/(moi人2)質量-權重諧波定位約束(mass-weightedharmonicpositionalconstraints)進4亍1000步的陵降極'卜化(steepestdescentminimization)。該極小化后，再對al-I結構域的C-a原子以0.1kcal/(mol人2)的約束進行1000步的陡降和5000步的Adopted-BasisNewtonRaphson，以避免與a2-I結構域X線晶體結構的顯著偏差。al卩l(xiāng)和a2|31整合素序列顯示51%的同一性，且不含插入或缺失，提示兩種I結構域的總體結構相似。預計金屬配位(coordination)位點在al-I結構域和a2-I結構域中相同，包含對應于封閉性mAb的表位的殘基位于螺旋a3和螺旋a4之間的一個環(huán)中，其包含在MIDAS基元內的、對于陽離子結合關鍵性的蘇氨酸。al-I結構域模型預測出Q92上的酰胺氮原子(圖14A)與S32的相鄰殘基I33上的羧基形成氬鍵。因此，包含所述表位的環(huán)可能在穩(wěn)定MIDAS區(qū)域方面起作用。盡管本發(fā)明已通過舉例說明和用于明確理解目的的實施例在一定程度上進行了詳細說明，但本領域技術人員顯而易見的是，可在實踐中進行特定的改變和修飾。因此，這些說明和實施例都不應理解為限制本發(fā)明的范圍，該范圍應由所附權利要求書來限定。序列表<110>比奧根艾迪克MA公司(BiogenIdeeMA，Inc.)<120>VLA-1的單克隆封閉抗體及其在炎性疾病的治療中的應用<130>A076PCT<140>PCT/US00/15004<141>2000-06-01<150>60/185336<151>2000-02-29<150>60/137038<151>1999-06-01<160>9<i70>用于Windows4.0的FastSEQ〈210>1<211>26<212>腿<213〉人(HomoSapiens)<400〉1caggatccgtcagccccacatttcaa26<210〉2〈211>26《212>DNA<213>人(HotnoSapiens)<400〉2tcctcgagggettgeagggeaaatat26<210>3<211>26<212>薩〈213>大鼠<400〉3caggatccgtcagtcctacatttcaa26200710084925.9說明書第32/34頁<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><212>PRT<213〉人(HomoSapiens)<400〉6ValSerPro1CysSerThrlieTyrPro35ArgMetAsp50GlyGluAsn65GluGluValG丄nThrMetThrGluArg115AspGlyGlu130CysGluAsp145TyrAsnArgSerlieAlaGluLeuAla195AlaLeuGlu210ThrPheGinValValAsnSerlieAlaProValGinGlu51015GinLeuAsplieVallieValLeuAspGlySerAsnSer202530TrpAspSerValThrAlaPheLeuAsnAspLeuLeuLys4045lieGlyProLysGinThrGinValGlylieValGinTyr5560ValThrHisGluPheAsnLeuAsnLysTyrSerSerThr707580LeuValAlaAlaLysLyslieValGinArgGlyGlyArg859095ThrAlaLeuGlyThrAspThrAlaArgLysGluAlaPhe100105110AlaArgArgGlyValLysLysValMetVallieValThr120125SerHisAspAsnHisArgLeuLysLysVallieGinAsp135140GluAsnlieGinArgPheSerlieAlalieLeuGlySer150155160GlyAsnLeuSerThrGluLysPheValGluGlulieLys165170175SerGluProThrGluLysHisPhePheAsnValSerAsp180185190LeuValThrlieValLysThrLeuGlyGluArgliePhe200205Ala<210>7<211>6<212>PRT<213>大鼠<400>7GlyArgGinGlyGlyLeu15<210>8<211〉6<212>PRT<213〉人(HomoSapiens)<400>8ValGinArgGlyGlyArg15<210>9<211>6〈212>PRT<213>人(Homo〈400〉9ValGinArgGlyGlyArg1權利要求1.一種治療受試者的炎性病癥的方法，該方法包括給與該受試者一種藥用組合物，該藥用組合物包含有效量的可治療所述炎性病癥的α1β1功能性封閉抗體或該抗體的片段，其中所述α1β1功能性封閉抗體或其片段能與VLA-1的一種表位結合，且其中所述表位包含圖15的氨基酸殘基92-97。2.—種治療關節(jié)炎的方法，其包括給與關節(jié)炎患者一種組合物，該組合物包含一種功能性封閉抗體或該抗體的片段，所述抗體或片段能與VLA-1的一種表位結合，其中所述表位包含圖15的氨基酸殘基92-97,而且所述組合物的給藥量將達到，當與對照抗體所治療的受試者相比，能有效地將關節(jié)炎評分降低約65%或更多。3.權利要求2的方法，其中所述關節(jié)炎評分的降低為79%或更多。4.權利要求2的方法，其中所述關節(jié)炎評分的降低為85%或更多。5.權利要求2的方法，其中所述關節(jié)炎評分的降低為90%或更多。6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述受試者為人。8.權利要求2-7中任一項的方法，其中所述受試者患有類風濕性關節(jié)炎。全文摘要本發(fā)明公開了一種治療炎性病癥，尤其是治療關節(jié)炎的方法。該方法包括給與一種能結合VLA-1的一種表位的功能性封閉抗體。文檔編號A61P19/00GK101099865SQ20071008492公開日2008年1月9日申請日期2000年6月1日優(yōu)先權日1999年6月1日發(fā)明者安東寧·德福格羅爾斯,維克托·科特利安斯基,羅伊·洛布,菲利普·戈特瓦爾斯申請人:比奧根艾迪克Ma公司