專利名稱：：重組人鐵調素腺病毒、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因工程
技術領域：
，特別是涉及一種利用重組腺病毒載體攜帶人鐵調素(Hepcidin)基因、從而在生物體內能夠自主表達鐵調素蛋白的重組人鐵調素腺病毒、其制備方法及應用。
背景技術：
：鐵調素(Hepcidin)是一個富含半胱氨酸的抗菌多肽。2001年Park等人首次從人尿中分離到這一多肽，并將其命名為鐵調素。人鐵調素包含有20、22和25個氨基酸多肽等三種組成形式。25個氨基酸多肽是鐵調素的主要存在形式。鐵調素基因位于人的第19號染色體上，由三個外顯子和兩個內含子組成，轉錄后的mRNA長約為0.4kb。NorthernBolt的分析結果顯示，鐵調素的基因在肝臟特異表達，心臟、脊髓、肺表達很少，前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸、腎臟和膀胱幾乎沒有表達。鐵調素及其在鐵調節(jié)中作用的認識是進入21世紀后鐵代謝領域中最重要的突破性進展。無論對臨床診斷還是治療各類貧血及高鐵負荷相關疾病，其意義均是巨大的。大量研究包括我們的結果己經證實，在外周組織參與鐵代謝如小腸鐵吸收以及肝臟、網(wǎng)織紅細胞和RE系統(tǒng)鐵轉運的蛋白，如載鐵蛋白(Tf,Transferrin)及其受體(TfR,TransferrinReceptor)、細胞色素b(Dcytb:DuodenalCytochromeb)、二價金屬離子轉運蛋白(DMT1，DivalentMetalTransporter1)、膜鐵轉運蛋白l(FP1，F(xiàn)erroportin1)、銅藍蛋白(CP,Ceruloplasmin)和膜鐵轉運輔助蛋白(HP,Hephaestin)在腦內均有表達。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)并在國際上首先報導了腦有能力表達鐵調素。我們的實驗也己初步顯示腦室內注射鐵調素可降低腦內鐵水平，說明鐵調素能調節(jié)腦鐵代謝，參與腦鐵平衡的維持。這些結果也顯示外源性鐵調素可能具有有效降低因各種原因引起的異常增高的腦鐵，達到防治神經退行性疾病的目的。本項目將系統(tǒng)研究腦室內注射鐵調素對帕金森氏病動物模型腦內鐵含量，以及對主要鐵攝取蛋白(載鐵蛋白受體和二價金屬離子轉運蛋白l)和鐵釋放蛋白(膜鐵轉運蛋白l，膜鐵轉運輔助蛋白和銅藍蛋白)表達的影響。完成我們最近的研究發(fā)現(xiàn)并在國際上首先報導了腦有能力表達鐵調素。我們的實驗也己初步顯示腦室內注射鐵調素可降低腦內鐵水平，說明鐵調素能調節(jié)腦鐵代謝，參與腦鐵平衡的維持。早在1991年，我們已經發(fā)現(xiàn)腦鐵的失調以及鐵誘導的氧化應激，是促進神經退行性變的重要誘因。實驗數(shù)據(jù)顯示，腦鐵的失調至少是某些神經退行性疾病(例如帕金森氏病PD以及老年性癡呆AD)的起病的始發(fā)原因之一。鐵調素(Hepcidin)將成為治療鐵代謝紊亂疾病(任何類型鐵過載引起的疾病)一種新的藥物。然而，鐵調素由于蛋白分子量小，而且具有4個二硫鍵，導致出現(xiàn)制備純化困難以及容易降解等問題，極大限制了其作為藥物的應用范圍。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術的上述問題，提供一種在生物體內能夠自主表達鐵調素蛋白、從而提升體內鐵調素(hepcidin)水平的重組人鐵調素腺病毒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述重組人鐵調素腺病毒的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述重組人鐵調素腺病毒在制備藥物方面的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)，其包含有人鐵調素(hepcidin)基因與腺病毒載體。所述人鐵調素基因插入所述腺病毒基因組中。所述人鐵調素基因為分泌型人鐵調素基因。所述人鐵調素基因的表達讀碼框包含巨細胞病毒(CMV)啟動子、分泌型人鐵調素(hepcidin)基因以及下游的polyA信號。所述人鐵調素基因含有序列表中SeqIDNo.l所示的序列。所述腺病毒為缺陷型腺病毒。所述腺病毒為1型腺病毒。所述腺病毒為缺失了El區(qū)的缺陷型腺病毒。本發(fā)明還公開了上述重組人鐵調素腺病毒的制備方法，所述方法包括a、將人鐵調素(hepcidin)基因與所述腺病毒的Ad-track穿梭質粒連接構建Ad-track-hepcidin重組載體；b、使所述Ad-track-hepcidin重組載體線性化；c、腺病毒的骨架質粒轉化感受態(tài)細胞；d、Ad-track-hepcidin與腺病毒骨架質粒進行同源重組；e、使重組的病毒骨架質粒線性化后轉染細胞進行病毒包裝。其中步驟e的細胞優(yōu)選為HEK293細胞。本發(fā)明進一步公開了上述重組人鐵調素腺病毒在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。優(yōu)選的，所述鐵代謝紊亂疾病為任何類型鐵過載引起的疾病，或者所述鐵代謝紊亂疾病為任何類型的缺鐵性貧血。由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備了以下技術效果本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將人鐵調素(hepcidin)基因引入機體組織細胞，使病毒能在患者體內自主表達鐵調素蛋白。這種方法能夠克服外源蛋白質不穩(wěn)定、活性低、成本高以及免疫原性等缺點，并且能夠保持蛋白質二級以及高級空間結構的自然特性，使得這一療法成為大多數(shù)患者能夠接受并有能力支付的治療途徑。利用缺陷型腺病毒作為載體，具有以下優(yōu)點1.腺病毒載體工藝流程簡單，病毒滴度高；2.腺病毒載體轉染率高，可操作性好；3.腺病毒載體宿主范圍廣，安全可靠，致病性低；4.腺病毒載體免疫反應弱，外源基因表達穩(wěn)定持久；5.由CMV啟動子控制鐵調素(hepcidin)高效表達，調節(jié)體內血清鐵水平；6.由于在真核細胞內自主表達蛋白，其產物具有天然蛋白的構想與活性，能完全模擬天然表達情況。圖l是腺病毒穿梭質粒的多克隆位點圖；圖2是重組人鐵調素(hepcidin)生產工藝流程圖；圖3是Ad-hepc系統(tǒng)蛋白表達情況圖；圖4是以GFP為標記，觀察Ad-hepc系統(tǒng)感染細胞情況圖；圖5是構建高血清鐵動物模型并利用Ad-hepc系統(tǒng)進行體內實驗的血清鐵水平結果圖。圖6是構建高血清鐵動物模型并利用Ad-hepc系統(tǒng)進行體內實驗的組織鐵水平結果圖。圖7為實施例2中Ad-hepc的插入序列測定報告。具體實施例方式本發(fā)明針對鐵調素構建重組腺病毒表達體系(Ad-hepc)，提升體內鐵調素(hepcidin)的水平，調節(jié)體內血清鐵的濃度，降低鐵對于細胞的毒性，達到治療神經退行性疾病等鐵代謝相關疾病的目的。本發(fā)明的重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)，包括含有分泌型人鐵調素基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒為l型腺病毒(Adeasy-1，Adl)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，選擇了構建鐵調素的重組腺病毒，其載體系統(tǒng)為Adeasy-l。Adeasy-l是缺陷性腺病毒的骨架質粒，通過其穿梭質粒Ad-track-CMV將外源性基因與病毒骨架整合，從而包裝出具有廣泛感染性的重組腺病毒。包裝成功的重組腺病毒在一般的細胞內不能復制，具有安全、高效、簡單易行等優(yōu)點。Ad-hepc結構重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)載體缺失了El區(qū)，在普通細胞內'不能包裝為成熟病毒顆粒，為缺陷型病毒。人鐵調素(hepcidin)基因為目的基因。我們將人分泌型鐵調素基因插入病毒的基因組中，以雙CMV為其啟動子，綠色熒光蛋白(GFP)為其標記物，下游polyA尾為其終止信號區(qū)。本發(fā)明的目的基因人鐵調素基因含有序列表中SeqIDNo.l所示的序列。重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)生產工藝流程包括重組載體構建、載體線性化制備、轉染HEK293細胞、擴大培養(yǎng)、分離純化、冷凍干燥以及包裝制劑。具體地，重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)生產工藝流程包括a、將人鐵調素(hepcidin)基因與所述腺病毒的Ad-track穿梭質粒連接構建Ad-track-hepcidin重組載體；b、使所述Ad-track-hepcidin重組載體線性化；c、腺病毒的骨架質粒轉化感受態(tài)細胞；d、Ad-track-hepcidin與腺病毒骨架質粒進行同源重組；e、使重組的病毒骨架質粒線性化后轉染細胞進行病毒包裝。其中步驟e的細胞優(yōu)選為HEK293細胞。本發(fā)明的重組人鐵調素腺病毒可用于制備藥物組合物，該藥物組合物可用于治療鐵代謝紊亂疾病，包括任何類型鐵過載引起的疾病與任何類型缺鐵性貧血?？捎糜谥苽渌幬锝M合物時，本發(fā)明的重組人鐵調素腺病毒可以制備成液體制劑，偏堿性，PH8.0,凍干后為白色粉末，可跟水與任何比例混合，無味，可作為針劑、噴劑。本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將人鐵調素(hepcidin)基因引入機體組織細胞，使病毒能在患者體內自主表達鐵調素蛋白。這種方法能夠克服外源蛋白質不穩(wěn)定、活性低、成本高以及免疫原性等缺點，并且能夠保持蛋白質二級以及高級空間結構的自然特性，使得這一療法成為大多數(shù)患者能夠接受并有能力支付的治療途徑。利用缺陷型腺病毒作為載體，具有以下優(yōu)點-1、腺病毒載體工藝流程簡單，病毒滴度高；2、腺病毒載體轉染率高，可操作性好；3、腺病毒載體宿主范圍廣，安全可靠，致病性低；4、腺病毒載體免疫反應弱，外源基因表達穩(wěn)定持久；5、由CMV啟動子控制鐵調素(hepcidin)高效表達，調節(jié)體內血清鐵水平；6、由于在真核細胞內自主表達蛋白，其產物具有天然蛋白的構想與活性，能完全模擬天然表達情況。下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述。實施例l鐵調素基因插入重組如圖1所示，pTmck-CMV為重組腺病毒的穿梭質粒。我們將鐵調素基因兩端接上BglII與SalI酶切位點，并加上polyA尾作為終止信號區(qū)。酶切鐵調素基因與穿梭質粒，并將兩者用T4連接酶進行連接轉化，經篩選后，得到正確克隆，送測序公司測序鑒定。Ad-hepc結構重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)載體缺失了El區(qū)，在普通細胞內不能包裝為成熟病毒顆粒，為缺陷型病毒。人鐵調素(hepcidin)基因為目的基因。我們將人分泌型鐵調素基因插入病毒的基因組中，以雙CMV為其啟動子，綠色熒光蛋白(GFP)為其標記物，下游polyA尾為其終止信號區(qū)。實施例2重組人鐵調素腺病毒制備重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)生產工藝流程包括重組載體構建、載體線性化制備、轉染HEK293細胞、擴大培養(yǎng)、分離純化、冷凍干燥以及包裝制劑。具體見以下詳述及其生產工藝流程圖(見圖2)。1、目的基因hepcidin的獲取以含人基因組cDNA的作為模板，Pfii高保真酶PCR擴增。PCR熱擴增條件為95。C變性5min，95°C80s,58°C100s,72°C120s，30個循環(huán)，最后72'C保溫5min。產物約450bp。其引物序列為-上游引物(SeqlDNo.2):CTCACAGATCTGACAGAAGGCAAGATGGCACTAAG下游引物(SeqlDNo.3):TCAATGTCGACGCTGGGGTAGGACAGGAATAAATAPCR反應條件如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>2Ad-track-hepcidin穿梭質粒的構建A雙酶切PCR產物與A的－track質粒，37酶切過夜。酶切體系構建如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>B.QIAquickGelextractionkit試劑盒法凝膠回收酶切片斷；C.0.8%瓊脂糖凝膠電泳，利用定量Marker初步估計核酸濃度；D.T4連接酶4'C過夜，連接凝膠回收PCR產物與酶切質粒，連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注先加入DNA片斷與ddH20，45。C溫浴5min，且所有試劑加入前于0"C預冷。E.將連接產物轉化入DH-5a感受態(tài)細菌中，涂板37。C過夜16h;F.次日每個平板挑取較小的克隆10個，小量法提取質粒；G.雙酶切重組質粒；H.酶切產物5。/。聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色；I.挑選切出相應小片斷的克隆擴增，提取質粒；J.保存菌種與質粒，送樣品測序鑒定，結果與預期一致，如圖7所示。3、Pme-I線性化重組質粒利用Pme-I內切酶線性化穿梭質粒，凝膠回收線形化片斷。酶切系統(tǒng)構建如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4、Adeasy-l質粒轉化BJ5183，構建Ad-BJ5183細菌株A.用冷卻的無菌吸頭，吸取BJ5183感受態(tài)細胞20(^1至無菌離心管中；B.按照比例稀釋Adeasy-l質粒；C.每組取lOpl加入感受態(tài)細胞中；D.混勻內容物，冰浴30min;E.將管置42。C循環(huán)水浴中，恰恰放置90s，不要搖動；F.迅速轉至冰浴中，冷卻2min;G.每管加800pl無抗生素LB培養(yǎng)基；37。C緩慢(45rpm)振蕩45min;H.取20(V1至含氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板，均勻涂布菌液；I.倒置平板，37°C，16h。J.次日觀察結果，看生長菌落多寡是否與濃度梯度一致。5、Ad-track-hepcidin穿梭質粒與Adeasy-l同源重組A.將目的基因插入穿梭載體的多克隆位點，轉化E.coli-DH5a，鋪卡那霉素抗性LB平板，挑取克隆，接種于5ml卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37。C震搖過夜，次晨提取質粒，PCR或酶切鑒定。B.提取的穿梭質粒經Pme-I酶切過夜，充分線性化(不完全消化往往產生較高的背景，從而降低重組率，將線性化質粒去磷酸化有助于降低背景信號)，凝膠純化。C.將回收的線性化載體轉入Ad-BJ5183感受態(tài)細胞內，鋪卡那霉素抗性LB平板，置于37'C孵箱內培養(yǎng)14-16小時。D.挑取較小的克隆15-20個，接種于卡那抗性液體LB培養(yǎng)基5ml中，37。C震搖過夜。次晨收菌，立即提取質粒，酶切鑒定，選擇成功重組的克隆，大量擴增，命名為Ad-hepcidin。6、病毒骨架Pac-I線性化利用Pac-I內切酶線性化上述病毒骨架質粒，37'C酶切過夜，以便在293A細胞中包裝病毒。酶切體系構建如下10xbuffer5jxl謂xBSA0.5plPac畫IlplAd國hepcidinDNA40ulddH203，總體積50|al7、病毒骨架鑒定與純化滅菌取10^il線形化病毒骨架雙酶切鑒定，體系同前所述。鑒定后純化酶切產物A.收集多管酶切產物，等體積酚-氯仿抽提2次；B.等體積氯仿單獨抽提1次；C.加入1/10體積3MNaAC(PH5.2)以及2.5倍體積冰的無水乙醇，至于-80。C1小時；D.4。C，16000r/min，離心10min;E.冰冷的75%乙醇洗滌沉淀，4'C放置過夜；F.4。C，12000r/min，離心5min，移至超凈臺上操作；G.棄上清，無菌環(huán)境下干燥15min;H.5(^1無菌ddH20溶解沉淀；1.取2pil電泳，測定核酸濃度。8、病毒包裝A.將線性化質粒轉染入HEK292細胞；B.放置15天左右，每隔3天換液一次。待細胞出現(xiàn)彗星狀熒光收毒;C.大量擴增病毒，約培養(yǎng)100個9cm培養(yǎng)皿的細胞量后，進行超速梯度離心純化；D.透析后測定滴度，分裝后保存于-80度。實施例3Ad-hepc系統(tǒng)感染以及表達實驗1、接種C6細胞1.5Xl()7個細胞于9cm培養(yǎng)皿(Coming)中，37°C，5%0)2培養(yǎng)過夜；2、感染前換5ml無血清培養(yǎng)基；3、每個培養(yǎng)皿加0.5nl實施例2中制備得到的純化病毒；4、分別培養(yǎng)0h，6h，12h,24h，48h5、按照時間點收集細胞；6、Real-timePCR定量檢測不同時間點鐵調素表達情況；7、統(tǒng)計結果。結果如圖3、4所示，12小時左右鐵調素表達已經達到空白對照組的8.1倍，并且持續(xù)表達。實施例4Ad-hepc體內實驗(血清鐵與組織鐵測定)1.選擇3月齡SD大鼠雄雌各10只，按性別隨機分為兩組；2.兩組實驗鼠均以高鐵飼料(購自SIGMA)喂養(yǎng)3個月，構建高血清鐵大鼠模型，并測定血清鐵濃度；3.實驗組注射Ad-hepc病毒稀釋液，每次劑量為約1X10^個病毒顆粒，每3天注射一次，3次為一療程；對照組注射PBS等滲鹽水；4.一療程結束后，分別于3、6、9、12、15、18天抽取血清，按常規(guī)方法利用生化儀器測定血清鐵濃度。5.最后處死大鼠，分別取心臟、大腦組織標本，凍干后利用測鐵試劑盒測定組織鐵含量。結果發(fā)現(xiàn)，從第6天開始，實驗組血清鐵濃度開始下降，12天達到正常血清鐵水平。組織鐵測定顯示實驗組的組織含鐵量顯著降低。結果如圖5、圖6所示。以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
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的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。序列表〈110〉〈120〉重組人鐵調素腺病毒、其制備方法及應用<130〉0710198PJE〈160>3〈170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉255〈212〉DNA〈213〉Homosapiens〈400〉1atggcactgagctcccagatctgggccgcttgcctcctgctcctcctxctcctcgccagc60ctgaccagtggctctgttttcccacaacagacgggacaacttgcagagctgcaaccccag120gacagagctggagccagggccagctggatgcccatgttccagaggcgaaggaggcgagac180acccacttccccatctgcattttctgctgcggctgctgtcatcgatcaaagtgtgggatg240tgctgcaagacgtag255〈210〉2〈211>35〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉2ctcacagatctgacagaaggcaagatggcactaag3513明虎遠忠嘯亞程錢葛柯汪〈210〉3〈211〉35〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉3tcaatgtcgacgctggggtaggacaggaataaata3權利要求1、一種重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)，其特征在于包含有人鐵調素(hepcidin)基因與腺病毒載體。2、根據(jù)權利要求1所述的一種重組人鐵調素腺病毒，其特征在于所述人鐵調素基因插入所述腺病毒基因組中。3、根據(jù)權利要求1或2所述的一種重組人鐵調素腺病毒，其特征在于:所述人鐵調素基因為分泌型人鐵調素基因。4、根據(jù)權利要求3所述的一種重組人鐵調素腺病毒，其特征在于所述人鐵調素基因的表達讀碼框包含巨細胞病毒(CMV)啟動子、分泌型人鐵調素(hepcidin)基因以及下游的polyA信號。5、根據(jù)權利要求1或2所述的一種重組人鐵調素腺病毒，其特征在于:所述腺病毒為缺陷型腺病毒。6、根據(jù)權利要求5所述的一種重組人鐵調素腺病毒，其特征在于所述腺病毒為1型腺病毒。7、根據(jù)權利要求5所述的一種重組人鐵調素腺病毒，其特征在于所述腺病毒為缺失了El區(qū)的缺陷型腺病毒。8、權利要求17中任意一項所述的重組人鐵調素腺病毒的制備方法，所述方法包括a、將人鐵調素(hepcidin)基因與所述腺病毒的Ad-track穿梭質粒連接構建Ad-track-hepcidin重組載體；b、使所述Ad-track-hepcidin重組載體線性化；c、腺病毒的骨架質粒轉化感受態(tài)細胞；d、Ad-track-hepcidin與腺病毒骨架質粒進行同源重組；e、使重組的病毒骨架質粒線性化后轉染細胞進行病毒包裝。9、權利要求17中任意一項所述的重組人鐵調素腺病毒在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。10、根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于所述鐵代謝紊亂疾病為鐵過載引起的疾病。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組人鐵調素腺病毒(Ad-hepc)，包含有人鐵調素(hepcidin)基因與腺病毒載體。本發(fā)明還公開了上述重組人鐵調素腺病毒的制備及其應用。本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將人鐵調素(hepcidin)基因引入機體組織細胞，使病毒能在患者體內自主表達鐵調素蛋白。文檔編號A61K48/00GK101358201SQ20071007546公開日2009年2月4日申請日期2007年7月31日優(yōu)先權日2007年7月31日發(fā)明者亞柯,汪程遠,葛嘯虎,錢忠明申請人:錢忠明;葛嘯虎;柯亞;汪程遠