專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分枝型聚乙二醇及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分枝型聚乙二醇及其制備方法。
背景技術(shù)：
在當(dāng)今的藥物傳送領(lǐng)域，聚乙二醇修飾(聚乙二醇化，PEG化，PEGylation)是一類(lèi)被廣泛使用的重要方法，特別是在改善蛋白質(zhì)及多肽藥物的臨床應(yīng)用方面被認(rèn)為是目前最成功的技術(shù)之一(J.Clin.Pharmacokinet，2000，40539；J.Adv.Drug Deliv.Rev.，1993，1091；J.Eur.J.Pharm.Biopharm.，2004，58185)。然而這項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問(wèn)題，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)藥物在PEG化后通常會(huì)導(dǎo)致其生物活性大大降低。但近來(lái)有研究表明，當(dāng)采用一種具有特殊結(jié)構(gòu)的PEG進(jìn)行修飾時(shí)，可以明顯降低修飾后藥物的活性損失，這種具有特殊結(jié)構(gòu)的PEG被稱(chēng)為分枝型PEG(Branched PEG)。和線性PEG相比，分枝型PEG不僅可以最大限度地保留被修飾后藥物的生物活性，而且其特有的“類(lèi)傘型”結(jié)構(gòu)可以更有效地保護(hù)蛋白質(zhì)在體內(nèi)不被水解，可以更有效地阻止抗體接近蛋白質(zhì)藥物，從而大大增加蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，同時(shí)大大降低其在體內(nèi)的免疫源性(J.Bioconjugate Chem.，1995，662；J.Drug Discovery Today，2005，101451；J.Bioactive Compatible Polym.，1997，12196；J.Bioconjug.Chem.，2001，12515；J.Control Release，1996，40199)。
目前國(guó)內(nèi)外研究和使用的分枝型PEG主要是以賴(lài)氨酸(Lys)為中心分子的二枝化PEG(Lys-(PEG)2；J.Bioorg.Med.Chem.Lett.，2002，12177；J.Adv.Drug Deliv.Rev.，2003，551261；J.Bioorg.Med.Chem.，2004，125031)，Lys-(PEG)2在修飾蛋白質(zhì)時(shí)是以蛋白質(zhì)上的氨基作為修飾位點(diǎn)，雖然通過(guò)氨基修飾蛋白質(zhì)是迄今為止最常用的方法，而且通常也是在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG化時(shí)被采用的首選方案，但這種方法也存在不足，最突出的問(wèn)題就是由于蛋白質(zhì)分子中可反應(yīng)的氨基通常不止一個(gè)而使產(chǎn)物中存在大量的異構(gòu)體，而這種異構(gòu)體的混合物通常是很難分離純化的，而且，如果氨基恰好處于蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)上，則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活。為了解決這個(gè)問(wèn)題，目前的PEG化技術(shù)在向著“定點(diǎn)修飾”方向發(fā)展，即修飾劑只在指定的位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)。定點(diǎn)修飾不僅可以大幅度降低產(chǎn)物中異構(gòu)體的生成，而且還可以通過(guò)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子上被修飾位點(diǎn)的位置來(lái)盡可能地保留其藥物活性。
對(duì)半胱氨酸上的巰基進(jìn)行修飾是蛋白質(zhì)修飾化學(xué)中最有效的定點(diǎn)修飾手段之一(J.Adv.Drug Deliv.Rev.，2002，54459；WO9903887；WO9955377)，因?yàn)樵谔烊坏鞍踪|(zhì)中半胱氨酸通常含量很少，而通過(guò)基因工程技術(shù)可以用一個(gè)半胱氨酸替換蛋白質(zhì)分子中的一個(gè)不重要的氨基酸殘基，用這種方法幾乎可以將一個(gè)半胱氨酸殘基導(dǎo)入被修飾蛋白質(zhì)分子序列中的任何位置。
蛋白質(zhì)化學(xué)中對(duì)巰基的研究由來(lái)已久，可與其反應(yīng)的基團(tuán)有很多，其中馬來(lái)酰亞胺是較好的一種，巰基與馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)上的雙鍵通過(guò)加成反應(yīng)而結(jié)合，反應(yīng)條件溫和，可在中性或弱堿性(pH(7.5～8.5))條件下進(jìn)行。馬來(lái)酰亞胺作為聚乙二醇衍生物的常用基團(tuán)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在對(duì)蛋白質(zhì)或者多肽的改性修飾上，但到目前為止，相關(guān)的修飾劑都是采用線性聚乙二醇，在分枝型聚乙二醇修飾劑中，還未見(jiàn)到報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于蛋白質(zhì)及多肽藥物巰基定點(diǎn)修飾，并可大大降低修飾后藥物的活性損失的分枝型聚乙二醇和它的制備方法。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種分枝型聚乙二醇，它的結(jié)構(gòu)為 式中n為≥1的整數(shù)，優(yōu)選n＝1～18的整數(shù)，m為4～500的整數(shù)。
一種制備上述分枝型聚乙二醇的方法，包括下述步驟1)制備以保護(hù)氨基的谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇在反應(yīng)器中按9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸(Fmoc-Glu)與單甲氧基聚乙二醇(mPEG)的摩爾比為1∶2～3加入Fmoc-Glu與mPEG，所述mPEG分子量為200～20000，按照所述Fmoc-Glu摩爾數(shù)的1％～200％加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)，按照1摩爾Fmoc-Glu需10～200升溶劑的比例加入分析純有機(jī)溶劑，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解；然后按照所述Fmoc-Glu與N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的摩爾比為1∶2～4加入DCC，控制溫度為-10℃～30℃，反應(yīng)10～50小時(shí)后，停止控溫，攪拌至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)。過(guò)濾除去白色沉淀后，按DCC摩爾數(shù)的50％～100％加入草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后，過(guò)濾反應(yīng)物；將濾液在30℃～100℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2～1/10，自然降至室溫后，加入過(guò)量無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物以Fmoc保護(hù)氨基的谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇(Fmoc-Glu-(mPEG)2)。
所述mPEG分子量最好為750、2000或5000。所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述控制反應(yīng)溫度最好為-5℃～5℃；所述反應(yīng)時(shí)間最好為20-30小時(shí)。
2)步驟1產(chǎn)物Fmoc-Glu-(mPEG)2氨基保護(hù)基的脫除在反應(yīng)器中按照1克步驟1產(chǎn)物Fmoc-Glu-(mPEG)2加1毫升～5毫升溶劑的比例加入Fmoc-Glu-(mPEG)2和分析純有機(jī)溶劑，攪拌溶解后，加入相當(dāng)于溶液體積0.5～5倍的質(zhì)量濃度為5％～90％的哌啶的有機(jī)溶劑溶液，室溫?cái)嚢?.5～3小時(shí)后，在30℃～100℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2～1/10，自然降至室溫后，加入過(guò)量的無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇(H2N-Glu-(mPEG)2)。
所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述哌啶的有機(jī)溶劑溶液中哌啶質(zhì)量濃度最好為30％～70％。
3)制備馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸向反應(yīng)器中按端氨基脂肪酸與堿的摩爾比為1∶0.5～1加入端氨基脂肪酸和堿，加入適量溶劑，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解；將馬來(lái)酸酐溶于適量分析純有機(jī)溶劑，按所述端氨基脂肪酸與馬來(lái)酸酐的摩爾比為1∶1～2加入馬來(lái)酸酐溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，用鹽酸調(diào)節(jié)體系至酸性；過(guò)濾，濾渣用蒸餾水洗滌多次，至濾下液呈中性，干燥后得到白色粉末狀中間產(chǎn)物；將該中間產(chǎn)物置于裝有溫度計(jì)、分水器、冷凝管的反應(yīng)器中，按中間產(chǎn)物摩爾數(shù)的20～100倍加入分析純有機(jī)溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱攪拌使其溶解，按中間產(chǎn)物摩爾數(shù)的10％～200％加入催化劑，進(jìn)行回流反應(yīng)，直至分水器中無(wú)水相生成后，停止加熱，自然降至室溫，在80℃～160℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后得到產(chǎn)物馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸。
所述端氨基脂肪酸的結(jié)構(gòu)為 式中n為≥1的整數(shù)，優(yōu)選n＝1～18的整數(shù)。
所述的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀；所述的溶劑為水、二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述的有機(jī)溶劑為苯、甲苯、二甲苯、醋酸酐、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜中的一種或它們的混合物；所述的催化劑為三乙胺、對(duì)甲苯磺酸、醋酸鈉、醋酸鉀、硫酸銅中的一種或它們的混合物。
4)制備以谷氨酸為中心分子的含有帶一條間隔臂的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的分枝型聚乙二醇向反應(yīng)器中按步驟3制備的馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸∶N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)∶1-羥基苯并三唑(HOBt)的摩爾比為1∶1∶1加入馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-羥基苯并三唑(HOBt)，加入適量分析純有機(jī)溶劑，室溫?cái)嚢瑁磻?yīng)物溶解后，按步驟2制備的以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇∶所述馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸的摩爾比為1∶1～4加入所述以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇，控制溫度為-10℃～30℃，反應(yīng)10～50小時(shí)后，停止控溫，攪拌至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，過(guò)濾除去白色沉淀，然后，按DCC摩爾數(shù)的50％～100％加入草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后，過(guò)濾反應(yīng)物，將濾液在30℃～100℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2～1/10，自然降至室溫后，加入過(guò)量無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得本發(fā)明產(chǎn)物。
其中所述的有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述控制反應(yīng)溫度最好為-5℃～5℃；所述反應(yīng)時(shí)間最好為20～30小時(shí)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是合成了一種新型的可以對(duì)蛋白質(zhì)及多肽實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾的具有分枝型結(jié)構(gòu)的聚乙二醇衍生物。該化合物可以作為蛋白質(zhì)及多肽藥物修飾劑，與傳統(tǒng)的線性聚乙二醇修飾劑相比，本發(fā)明將大大降低被修飾藥物的生物活性損失。本發(fā)明采用谷氨酸作為中心核分子連接兩條聚乙二醇鏈段，通過(guò)對(duì)谷氨酸加保護(hù)基和采用混合溶劑的方法有效地解決了谷氨酸難溶于有機(jī)溶劑的問(wèn)題，該結(jié)構(gòu)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明在化合物分子中引入了馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，使其成為一種蛋白質(zhì)及多肽分子中巰基的定點(diǎn)修飾劑，從而可以大幅度降低修飾產(chǎn)物中異構(gòu)體的生成，而且還可以通過(guò)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子上被修飾位點(diǎn)的位置來(lái)盡可能地保留其藥物活性。本發(fā)明在引入馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)時(shí)增加了一條間隔臂，從而大大降低了修飾蛋白質(zhì)及多肽藥物時(shí)位阻效應(yīng)的發(fā)生，為修飾反應(yīng)的順利進(jìn)行提供了保障。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.Fmoc-Glu-(mPEG750)2的制備分別將3.7克Fmoc-Glu、22.5克分子量為750的單甲氧基聚乙二醇(mPEG750)和0.9克DMAP置于一長(zhǎng)頸燒瓶中，加入100毫升分析純二氯甲烷和10毫升分析純四氫呋喃，放入磁子，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解，10分鐘后，加入8.0克DCC，保持0℃條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢后，停止控溫，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)，過(guò)濾除去白色沉淀后，加入4.0克草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，將濾液在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20毫升后，自然降至室溫，加入200毫升無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物(Fmoc-Glu-(mPEG750)2)。
2.Fmoc-Glu-(mPEG750)2氨基保護(hù)基的脫除稱(chēng)取步驟1中的產(chǎn)物Fmoc-Glu-(mPEG750)220克，置于燒瓶中，加入20毫升分析純二氯甲烷，攪拌溶解后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的哌啶的二氯甲烷溶液20毫升，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20毫升，自然降至室溫后，加入200毫升無(wú)水乙醚中，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物(H2N-Glu-(mPEG750)2)。
3.6-馬來(lái)酰亞胺基己酸(6-MICA)的制備將26克6-氨基己酸(6-ACA)和7克氫氧化鈉混合置于一單口燒瓶中，加入100毫升蒸餾水，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解，繼續(xù)攪拌30分鐘；稱(chēng)取38克馬來(lái)酸酐，溶于100毫升分析純乙酸乙酯中，將該馬來(lái)酸酐溶液加入上述單口燒瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，加入200毫升濃度為1N的鹽酸溶液，攪拌15分鐘后，過(guò)濾，并用蒸餾水洗滌多次，至濾下液呈中性，將濾渣干燥后得中間產(chǎn)物6-馬來(lái)酸酰胺基己酸(6-MAICA)；在一個(gè)裝有溫度計(jì)、分水器、冷凝管的三口燒瓶中加入300毫升分析純甲苯和20毫升分析純二甲亞砜，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入23克上述中間產(chǎn)物6-MAICA，加熱攪拌，待反應(yīng)物溶解后，加入26毫升三乙胺，加熱至回流，反應(yīng)4小時(shí)，停止加熱，自然降至室溫，在120℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后得到產(chǎn)物6-MICA。
4.以谷氨酸為中心分子的含有帶一條間隔臂的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的分枝型聚乙二醇(MICA-Glu-(mPEG750)2)的制備將5.9克步驟3最終制備的6-MICA、5.8克DCC和3.8克HOBt加入一長(zhǎng)頸燒瓶中，然后加入100毫升分析純二氯甲烷，放入磁子攪拌，10分鐘后，加入15克步驟2制備的H2N-Glu-(mPEG750)2，保持0℃條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢后，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，過(guò)濾除去白色沉淀，然后，加入3.2克草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，將濾液在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至25毫升，自然降至室溫后，加入250毫升無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物MICA-Glu-(mPEG750)2。
實(shí)施例21.Fmoc-Glu-(mPEG2000)2的制備分別將4.1克Fmoc-Glu、60.0克分子量為2000的單甲氧基聚乙二醇(mPEG2000)和0.8克DMAP置于一長(zhǎng)頸燒瓶中，加入150毫升分析純二氯甲烷和15毫升分析純四氫呋喃，放入磁子，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解，15分鐘后，加入6.0克DCC，保持5℃條件下攪拌反應(yīng)26小時(shí)。反應(yīng)完畢后，停止控溫，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)。過(guò)濾除去白色沉淀后，加入3.2克草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，將濾液在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至30毫升后，自然降至室溫，加入300毫升無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物(Fmoc-Glu-(mPEG2000)2)。
2.Fmoc-Glu-(mPEG2000)2氨基保護(hù)基的脫除稱(chēng)取步驟1的產(chǎn)物Fmoc-Glu-(mPEG2000)245克，置于燒瓶中，加入50毫升分析純二氯甲烷，攪拌溶解后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％的哌啶的二氯甲烷溶液40毫升，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至35毫升，自然降至室溫后，加入350毫升無(wú)水乙醚中，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物(H2N-Glu-(mPEG2000)2)。
3.6-馬來(lái)酰亞胺基己酸(6-MICA)的制備將26克6-氨基己酸(6-ACA)和6克氫氧化鈉混合置于一單口燒瓶中，加入80毫升蒸餾水，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解，繼續(xù)攪拌20分鐘；稱(chēng)取34克馬來(lái)酸酐，溶于80毫升分析純乙酸乙酯中，將該馬來(lái)酸酐溶液加入上述單口燒瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，加入150毫升濃度為1N的鹽酸溶液，攪拌20分鐘后，過(guò)濾，并用蒸餾水洗滌多次，至濾下液呈中性，將濾渣干燥后得中間產(chǎn)物6-馬來(lái)酸酰胺基己酸(6-MAICA)；
在一個(gè)裝有溫度計(jì)、分水器、冷凝管的三口燒瓶中加入250毫升分析純甲苯及25毫升分析純二甲亞砜，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入23克上述中間產(chǎn)物6-MAICA，加熱攪拌，待反應(yīng)物溶解后，加入25毫升三乙胺，加熱至回流，反應(yīng)5小時(shí)，停止加熱，自然降至室溫，在120℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后得到產(chǎn)物6-MICA。
4.MICA-Glu-(mPEG2000)2的制備將5.0克步驟3最終制備的6-MICA、4.9克DCC和3.2克HOBt加入一長(zhǎng)頸燒瓶中，然后加入150毫升分析純二氯甲烷，放入磁子攪拌，15分鐘后，加入35克步驟2制備的H2N-Glu-(mPEG2000)2，保持5℃條件下攪拌反應(yīng)26小時(shí)。反應(yīng)完畢后，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，過(guò)濾除去白色沉淀，然后，加入2.6克草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，將濾液在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至35毫升，自然降至室溫后，加入350毫升無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物MICA-Glu-(mPEG2000)2。
實(shí)施例31.Fmoc-Glu-(mPEG5000)2的制備分別將4.4克Fmoc-Glu、150.0克分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)和0.7克DMAP置于一長(zhǎng)頸燒瓶中，加入300毫升分析純二氯甲烷和30毫升分析純四氫呋喃，放入磁子，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解，20分鐘后，加入7.2克DCC，保持-5℃條件下攪拌反應(yīng)30小時(shí)。反應(yīng)完畢后，停止控溫，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)。過(guò)濾除去白色沉淀后，加入3.5克草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，將濾液在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50毫升后，自然降至室溫，加入500毫升無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物(Fmoc-Glu-(mPEG5000)2)。
2.Fmoc-Glu-(mPEG5000)2氨基保護(hù)基的脫除稱(chēng)取步驟1的產(chǎn)物Fmoc-Glu-(mPEG5000)2100克，置于燒瓶中，加入100毫升分析純二氯甲烷，攪拌溶解后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的哌啶的二氯甲烷溶液70毫升，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1.5小時(shí)，在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至60毫升，加入600毫升冷乙醚中，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物(H2N-Glu-(mPEG5000)2)。
3.6-馬來(lái)酰亞胺基己酸(6-MICA)的制備將26克6-氨基己酸(6-ACA)和6.5克氫氧化鈉混合置于一單口燒瓶中，加入90毫升蒸餾水，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解，繼續(xù)攪拌30分鐘；稱(chēng)取36克馬來(lái)酸酐，溶于90毫升分析純乙酸乙酯中，將該馬來(lái)酸酐溶液加入上述單口燒瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，加入180毫升濃度為1N的鹽酸溶液，攪拌20分鐘后，過(guò)濾，并用蒸餾水洗滌多次，至濾下液呈中性，將濾渣干燥后得中間產(chǎn)物“6-馬來(lái)酸酰胺基己酸”(6-MAICA)；在一個(gè)裝有溫度計(jì)、分水器、冷凝管的三口燒瓶中加入280毫升分析純甲苯和25毫升分析純二甲亞砜，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入23克上述中間產(chǎn)物6-MAICA，加熱攪拌，待反應(yīng)物溶解后，加入26毫升三乙胺，加熱至回流，反應(yīng)6小時(shí)，停止加熱，自然降至室溫，在120℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后得到產(chǎn)物6-MICA。
4.MICA-Glu-(mPEG5000)2的制備將4.0克步驟3最終制備的6-MICA、3.9克DCC和2.6克HOBt加入一長(zhǎng)頸燒瓶中，然后加入200毫升分析純二氯甲烷，放入磁子攪拌，20分鐘后，加入70克步驟2制備的H2N-Glu-(mPEG5000)2，保持-5℃條件下攪拌反應(yīng)30小時(shí)。反應(yīng)完畢后，自然升至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，過(guò)濾除去白色沉淀，然后，加入2.1克草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，將濾液在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50毫升，自然降至室溫后，加入500毫升無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物MICA-Glu-(mPEG5000)2。
權(quán)利要求
1.一種分枝型聚乙二醇，其特征在于它的結(jié)構(gòu)式為 式中，n為≥1的整數(shù)，m為4～500的整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分枝型聚乙二醇，其特征在于n為1～18的整數(shù)。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述的分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于包括以下步驟a.在反應(yīng)器中按9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸與單甲氧基聚乙二醇的摩爾比為1∶2～3加入9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸與單甲氧基聚乙二醇，所述單甲氧基聚乙二醇分子量為200～20000，按照所述9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸摩爾數(shù)的1％～200％加入4-二甲氨基吡啶，按照1摩爾9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸需10～200升溶劑的比例加入分析純有機(jī)溶劑，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解；然后按照所述9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸與N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1∶2～4加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺，控制溫度為-10℃～30℃，反應(yīng)10～50小時(shí)后，停止控溫，攪拌至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)；過(guò)濾除去白色沉淀后，按N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺摩爾數(shù)的50％～100％加入草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后，過(guò)濾反應(yīng)物；將濾液在30℃～100℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2～1/10，自然降至室溫后，加入過(guò)量無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物以9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇；b.在反應(yīng)器中按照1克步驟a產(chǎn)物以9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇加1毫升～5毫升溶劑的比例加入以9-芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇和分析純有機(jī)溶劑，攪拌溶解后，加入相當(dāng)于溶液體積0.5～5倍的質(zhì)量濃度為5％～90％的哌啶的有機(jī)溶劑溶液，室溫?cái)嚢?.5～3小時(shí)后，在30℃～100℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2～1/10，自然降至室溫后，加入過(guò)量的無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得產(chǎn)物以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇；c.向反應(yīng)器中按端氨基脂肪酸與堿的摩爾比為1∶0.5～1加入端氨基脂肪酸和堿，加入適量溶劑，室溫下攪拌使反應(yīng)物溶解；將馬來(lái)酸酐溶于適量分析純有機(jī)溶劑，按所述端氨基脂肪酸與馬來(lái)酸酐的摩爾比為1∶1～2加入馬來(lái)酸酐溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，用鹽酸調(diào)節(jié)體系至酸性；過(guò)濾，濾渣用蒸餾水洗滌多次，至濾下液呈中性，干燥后得到白色粉末狀中間產(chǎn)物；將該中間產(chǎn)物置于裝有溫度計(jì)、分水器、冷凝管的反應(yīng)器中，按中間產(chǎn)物摩爾數(shù)的20～100倍加入分析純有機(jī)溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱攪拌使其溶解，按中間產(chǎn)物摩爾數(shù)的10％～200％加入催化劑，進(jìn)行回流反應(yīng)，直至分水器中無(wú)水相生成后，停止加熱，自然降至室溫，在80℃～160℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后得到產(chǎn)物馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸，所述端氨基脂肪酸的結(jié)構(gòu)為 式中，n為≥1的整數(shù)；d.向反應(yīng)器中按步驟c制備的馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸∶N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺∶1-羥基苯并三唑的摩爾比為1∶1∶1加入馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑，加入適量分析純有機(jī)溶劑，室溫?cái)嚢瑁磻?yīng)物溶解后，按步驟b制備的以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇∶所述馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸的摩爾比為1∶1～4加入所述以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇，控制溫度為-10℃～30℃，反應(yīng)10～50小時(shí)后，停止控溫，攪拌至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)完畢后，過(guò)濾除去白色沉淀，然后，按N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺摩爾數(shù)的50％～100％加入草酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后，過(guò)濾反應(yīng)物，將濾液在30℃～100℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2～1/10，自然降至室溫后，加入過(guò)量無(wú)水乙醚，劇烈攪拌，得白色沉淀，過(guò)濾并充分洗滌，干燥后得本發(fā)明產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于所述步驟a中，單甲氧基聚乙二醇分子量為750、2000或5000；所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述控制反應(yīng)溫度為-5℃～5℃；所述反應(yīng)時(shí)間為20～30小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于所述步驟b中有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述哌啶的有機(jī)溶劑溶液中哌啶質(zhì)量濃度為30％～70％。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于所述步驟c中端氨基脂肪酸的結(jié)構(gòu)式中n為1～18的整數(shù)；堿為氫氧化鈉或/和氫氧化鉀，所述的溶劑為水、二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述的有機(jī)溶劑為苯、甲苯、二甲苯、醋酸酐、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜中的一種或它們的混合物；所述的催化劑為三乙胺、對(duì)甲苯磺酸、醋酸鈉、醋酸鉀、硫酸銅中的一種或它們的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于所述步驟d中，有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、丙酮中的一種或它們的混合物；所述控制反應(yīng)溫度為-5℃～5℃；所述反應(yīng)時(shí)間為20～30小時(shí)。
全文摘要
一種分枝型聚乙二醇，結(jié)構(gòu)式如圖，式中，n為≥1的整數(shù)，m為4～500的整數(shù)。一種制備所述分枝型聚乙二醇的方法，包括以下步驟1.制備以9－芴甲氧羰基保護(hù)氨基的谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇；2.制備以谷氨酸為中心分子的分枝型聚乙二醇；3.制備馬來(lái)酰亞胺基脂肪酸；4.制備本發(fā)明產(chǎn)物分枝型聚乙二醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是合成了一種新型的可以對(duì)蛋白質(zhì)及多肽實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾的具有分枝型結(jié)構(gòu)的聚乙二醇衍生物；降低被修飾藥物的生物活性損失；降低了修飾蛋白質(zhì)及多肽藥物時(shí)位阻效應(yīng)的發(fā)生，為修飾反應(yīng)的順利進(jìn)行提供了保障。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101029131SQ200710034550
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2007年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日
發(fā)明者李效東, 劉克良, 王孝杰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué), 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所