專利名稱：鎢酸鋰在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鎢酸鋰作為有效成分在治療神經(jīng)退行性疾病，治療糖尿病引起的神經(jīng)病變，治療腦缺血(包括腦功能障礙)及其相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)，又稱老年性癡呆，是一種以進行性記憶減退、認知障礙以及人格改變?yōu)榕R床特征，以大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域出現(xiàn)細胞外老年斑(senile plaque，SP)、細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和膽堿能神經(jīng)元丟失為病理特征的神經(jīng)退行性疾病。
SP略成球形，其主要成分為β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)。新產(chǎn)生的Aβ是可溶的，不僅沒有神經(jīng)毒性，還具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)作用。但Aβ老化、聚集，則產(chǎn)生神經(jīng)毒性，是引起AD主要病理改變的分子基礎(chǔ)。Aβ沉積在胞外，周圍被潰變的軸突與樹突、激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞包圍形成SP。
除了SP，另一個診斷AD的病理指標是NFT。NFT為雙螺旋絲結(jié)構(gòu)，由過度磷酸化的tau蛋白組成。后者是一種多功能的微管相關(guān)蛋白，能穩(wěn)定微管，促進微管的裝配。由此可見，治療AD的關(guān)鍵在于阻止Aβ的聚集、拮抗其神經(jīng)毒性及降低tau蛋白的過度磷酸化，減少NFT的形成。
隨著年齡的增長，AD患病率呈明顯上升趨勢。一般認為，超過65歲，每5歲AD患者所占比例增加一倍。目前世界人口逐年老化，該病發(fā)病率進一步升高，使其在老年人群中所占比例進一步擴大。AD已成為65歲以上人群癡呆最常見的病因，在發(fā)達國家已被認為是一個主要的公眾健康問題，成為人類繼心血管病、癌癥、中風之后的第四號殺手。
目前用于治療AD的藥物主要有膽堿酯酶抑制劑(ChEI)、鈣離子拮抗劑、抗氧化劑、抗炎藥物、他汀類降血脂藥物、腦代謝激活劑及某些中藥天然藥物?，F(xiàn)有的治療AD藥物大多是針對該病的某些癥狀進行治療，缺乏對已知病因的干預(yù)。
鎢酸鈉目前正進行治療I期糖尿病的臨床試驗，它通過使葡萄糖載體(GLUT)、胰腺β細胞恢復(fù)正常，增加胰島素活性和胰腺β細胞數(shù)量發(fā)揮治療糖尿病的作用。近來研究表明它還是GSK-3的抑制劑，在神經(jīng)細胞中，它可以在Ser-9位點磷酸化GSK-3β，使GSK-3滅活，從而抑制tau蛋白的過度磷酸化。
長期的鋰鹽治療也能抑制GSK-3β，同時能增加重要的保護性蛋白Bcl-2的水平，以抑制細胞凋亡。
GSK-3是一種Ser/Thr蛋白激酶，是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的直接底物之一，活化的PKB與GSK-3結(jié)合，誘導(dǎo)GSK-3向細胞膜轉(zhuǎn)移，磷酸化其N端的Ser活性位點(GSK-α作用位點為Ser21，而GSK-β為Ser9)使之失活。GSK有許多不同的底物，如tau蛋白、c-Jun轉(zhuǎn)錄子、β-catenin、cyclinD1、胰島素受體底物(IRS-1)、eLF2B等，tau和β-catenin在AD等中樞退行性疾病的發(fā)病中起重要作用。同時GSK還是Wnt信號通路的重要組成部分。
GSK-3還在PI3-K/PKB對細胞生長調(diào)節(jié)、尤其在抗凋亡過程中發(fā)揮重要功能。Marianna等在Rat-1成纖維細胞以及未分化嗜鉻細胞瘤PC12細胞中表達、催化失活的GSK-3，結(jié)果顯示失活GSK-3可阻止由PI3-K或PKB受抑制所致的細胞凋亡。近來還發(fā)現(xiàn)，PKB通過抑制GSK-3可增加cyclin D的積累促進細胞進入細胞周期，促進細胞增殖，而GSK-3抑制劑——氯化鋰(LiCl)可以刺激突起(軸突和樹突)生長。
Aβ是APP在β、γ分泌酶的共同參與下水解產(chǎn)生的多肽。生理狀態(tài)下，Aβ濃度低，是一種可溶性物質(zhì)。病理情況下大量產(chǎn)生，并由可溶性形式轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘摩?折疊結(jié)構(gòu)，逐漸聚集形成老年斑的核心。Aβ可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡、過氧化損傷、炎癥反應(yīng)等產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，如Aβ可以直接產(chǎn)生羥自由基，自由基可以直接或間接造成谷氨酸轉(zhuǎn)運體的功能降低，突觸間隙谷氨酸堆積觸發(fā)興奮毒作用。Phiel等研究證實GSK-3α通過針對γ分泌酶的特異性底物或接近其復(fù)合物的底物調(diào)節(jié)γ分泌酶的活性，他們在細胞水平觀察到，用LiCl減少GSK-3α的表達，可使Aβ40及Aβ42的產(chǎn)量分別降低45％及43％。在AD大鼠腦中，應(yīng)用LiCl后，不溶性Aβ40及Aβ42也各減少62％及51％。Sheng等發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠海馬神經(jīng)元Aβ40及Aβ42含量增加，但機制不詳；在癡呆鼠模型，飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗可以增加Aβ40及Aβ42的產(chǎn)生，并伴有γ分泌酶活性的增加。進一步研究顯示，此類鼠腦中胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑障礙，并可能通過降低PKB活性而影響GSK-3α的活性，從而導(dǎo)致Aβ產(chǎn)物的增加。曲忠森等報道糖尿病引起的Aβ40生成異常增加可能是通過GSK-3途徑，LiCl可明顯降低Aβ的生成。
Arai等在一側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)的動物模型上發(fā)現(xiàn)，在同側(cè)腦梗死灶周圍的皮層及遠離病灶的雙側(cè)海馬，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和TrkB mRNA表達均增加。Kokaia等發(fā)現(xiàn)MCAO 2h后，在缺血的周邊區(qū)BDNF mRNA表達明顯增加，海馬的CA1區(qū)的表達也增加，再灌注2h表達水平最高。Schabitz等在MCAO阻塞前24h開始給大鼠腦室內(nèi)注射BDNF，結(jié)果表明其腦缺血后梗死灶較對照組明顯縮小。
Kiprianova等在整個大腦半球缺血的模型上向腦室內(nèi)連續(xù)注射BDNF后發(fā)現(xiàn)，BDNF能防止海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡。由此可見，腦缺血缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)源性BDNF和TrkB mRNA的表達增加，在缺血缺氧狀態(tài)下，BDNF能促進神經(jīng)細胞的存活和損傷修復(fù)。
中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)是學(xué)習(xí)、記憶神經(jīng)環(huán)路的重要組成部分，BDNF可支持海馬和前腦膽堿能神經(jīng)元存活和分化，上調(diào)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達，并可通過影響海馬膽堿能神經(jīng)傳遞發(fā)揮促進學(xué)習(xí)、記憶的作用。此外，BDNF能增強海馬突觸后NMDA受體磷酸化，使本已下調(diào)的NMDA受體功能逆轉(zhuǎn)，從而誘導(dǎo)長時程增強(long-term potentiation，LTP)，而后者被認為是學(xué)習(xí)記憶的細胞模式。由此可見，BDNF對學(xué)習(xí)、記憶功能障礙性疾病的治療具有應(yīng)用前景。
Hashimoto等研究表明，LiCl能提高皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)BDNF的含量，激活TrkB受體。
經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，鎢酸鋰目前只限于化學(xué)工業(yè)上的應(yīng)用，尚無治療相關(guān)疾病的報道或?qū)＠暾垺?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供鎢酸鋰在制藥中的應(yīng)用，特別是應(yīng)用在神經(jīng)退行性疾病、糖尿病引起的神經(jīng)病變、腦缺血(包括腦功能障礙)及其相關(guān)疾病的治療藥物的制備中。
鎢酸鈉(sodium tungstate)的分子式為Na2WO4，其陽離子鈉并無活性；而氯化鋰(lithium chloride)的分子式為LiCl，其陰離子的活性也非常有限；鎢酸鋰(lithiumtungstate)的分子式為Li2WO4，陰、陽離子都有活性，二者發(fā)揮協(xié)同作用，更好地抑制GSK-3的活性。通過抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以減少SP；通過抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的過度磷酸化，以減少NFT。由此預(yù)見，鎢酸鋰將成為一個非常有前途的治療神經(jīng)退行性疾病、治療糖尿病引起的神經(jīng)病變、治療腦缺血(包括腦功能障礙)及其相關(guān)疾病的藥物。
通過藥效學(xué)試驗證明，本發(fā)明提供的鎢酸鋰能明顯改善神經(jīng)退行性疾病、糖尿病引起的神經(jīng)病變、腦缺血(包括腦功能障礙)等所引起的癥狀，且無明顯毒副作用。通過抑制GSK-3α的活性，降低Aβ的生成，以減少SP；通過抑制GSK-3β的活性，抑制tau蛋白的過度磷酸化，以減少NFT。
本發(fā)明與以往技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點由于鎢酸鋰陰、陽離子均有活性，二者發(fā)揮協(xié)同作用，可以更好地抑制GSK-3的活性，降低Aβ的生成，以減少SP；抑制tau蛋白的過度磷酸化，以減少NFT。
具體實施例方式
實施例1鎢酸鋰促進新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元突起生長的作用如表1-2所示，低濃度鎢酸鋰組與溶媒對照組相比，突起總數(shù)、突起長度、有突起的神經(jīng)元數(shù)目均無顯著性差異；中濃度鎢酸鋰組和高濃度鎢酸鋰組與溶媒對照組相比，突起總數(shù)、突起長度、有突起的神經(jīng)元數(shù)目均有顯著性增加，而以高濃度鎢酸鋰組的作用顯著。且效果優(yōu)于氯化鋰組、鎢酸鈉組和氯化鋰+鎢酸鈉組。
表1鎢酸鋰對培養(yǎng)48h大腦皮層神經(jīng)元的影響(x±s，n＝10)

與溶媒對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01表2鎢酸鋰對不同培養(yǎng)期大腦皮層神經(jīng)元存活數(shù)的影響(x±s，n＝10)

與溶媒對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實施例2鎢酸鋰降低M146L細胞分泌的Aβ42含量M146L細胞株為轉(zhuǎn)染了人類AD患者APP及突變型PS-1基因的CHO細胞。應(yīng)用ELISA法定量檢測Aβ42的產(chǎn)量。如表3所示低劑量的鎢酸鋰對Aβ42的生成沒有影響，中、高劑量的鎢酸鋰可以明顯降低Aβ42的產(chǎn)量，特別是高劑量組抑制率超過70％，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。且效果優(yōu)于氯化鋰組、鎢酸鈉組和氯化鋰+鎢酸鈉組。
表3鎢酸鋰對M146L細胞分泌的Aβ42的影響(x±s，n＝8)

與溶媒對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實施例3鎢酸鋰降低側(cè)腦室注射鏈脲霉素模型鼠的Aβ1-40、Aβ1-42含量鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)是一種亞硝基脲衍生物，在外周可以選擇性破壞胰島細胞，引起葡萄糖代謝紊亂，導(dǎo)致糖尿病；在中樞可以阻斷胰島素受體自身磷酸化和內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)障礙。
選取成年SD大鼠20只，隨即分為5組正常對照組、溶劑對照組、鎢酸鋰低、中、高劑量組。溶劑對照組和鎢酸鋰低、中、高劑量組采用腦立體定位儀于雙側(cè)側(cè)腦室各注射STZ10μl(3mg/kg)，第3天重復(fù)注射。正常對照組按上述方法以等量生理鹽水替代STZ。造模1周后，鎢酸鋰低、中、高劑量組采用腦立體定位儀于雙側(cè)側(cè)腦室各注射鎢酸鋰2μl，4μl，8μl(濃度為1mmol/L)。
免疫組化結(jié)果表明溶劑對照組與鎢酸鋰低劑量組海馬及皮層均可見大量棕褐色Aβ1-40、Aβ1-42陽性細胞，胞質(zhì)及軸突、樹突均清晰著色。正常對照組與鎢酸鋰高劑量組陽性細胞數(shù)很少。而鎢酸鋰中劑量組介于二者之間。
實施例4鎢酸鋰降低了注射鏈脲霉素造成2型糖尿病鼠的tau蛋白磷酸化程度選取成年SD雄性大鼠20只，其中16只高脂高糖高蛋白飲食，4只正常飲食為對照組。8周后，隨機從高脂高糖高蛋白飲食組中取8只，按照20～25mg/kg劑量腹腔一次性注射鏈脲霉素，造成2型糖尿病模型(T2DM組)。余8只高脂高糖高蛋白飲食大鼠為肥胖模型(OB組)按照上述方法腹腔注射檸檬酸緩沖液。1周后，T2DM組和OB組各隨機取4只，采用腦立體定位儀于海馬背側(cè)分別注射鎢酸鋰2μl(濃度為4mmol/L)。蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果表明，糖尿病模型組及肥胖模型組中tau蛋白在位點Ser199、Thr212、Thr217及Ser396上的磷酸化程度顯著高于對照組；而鎢酸鋰組則與對照組無明顯差異。
實施例5鎢酸鋰促進新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達應(yīng)用ELISA法定量檢測BDNF的產(chǎn)量。如表4所示低劑量的鎢酸鋰對BDNF的生成沒有影響，中、高劑量的鎢酸鋰可以明顯提高BDNF的產(chǎn)量，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。
表4鎢酸鋰對皮層神經(jīng)元分泌的BDNF的影響(x±s，n＝8)

與溶媒對照組比較*P＜0.05，**P＜0.0權(quán)利要求
1.鎢酸鋰在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.鎢酸鋰在制備治療糖尿病引起的神經(jīng)病變的藥物中的應(yīng)用。
3.鎢酸鋰在制備治療腦缺血及腦功能障礙藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鎢酸鋰在制藥中的應(yīng)用，特別是在治療神經(jīng)退行性疾病、糖尿病引起的神經(jīng)病變、腦缺血包括腦功能障礙藥物的制備中應(yīng)用。由于鎢酸鋰陰、陽離子都有活性，二者發(fā)揮協(xié)同作用，可以更好地抑制GSK－3的活性。通過抑制GSK－3α的活性，降低Aβ的生成，以減少SP；通過抑制GSK－3β的活性，抑制tau蛋白的過度磷酸化，以減少NFT。通過提高皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)BDNF的含量，在缺血缺氧狀態(tài)下，促進神經(jīng)細胞的存活和損傷修復(fù)，改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙。
文檔編號A61P25/00GK101036669SQ20071002772
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者羅煥敏, 翁文 申請人:暨南大學(xué)