專(zhuān)利名稱(chēng)：抗fviii免疫反應(yīng)的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)阻遏可內(nèi)吞抗原的免疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)Fvm(因子vm)的 內(nèi)吞作用來(lái)抑制抗Fvm免疫反應(yīng)。
背景技術(shù)：
甲型血友病是一種與x染色體的異常有關(guān)的遺傳性疾病，患者表現(xiàn)出自
身不能凝血。這種疾病是由于干預(yù)凝血的蛋白即因子VIII(FVIII)的基因突變
而造成的，所述基因突變導(dǎo)致血液中完全不存在Fvm或者部分缺乏Fvin。
甲型血友病是最常見(jiàn)的影響血液凝結(jié)的缺乏癥在法國(guó)，5000個(gè)男性中 就有l(wèi)個(gè)患此病，占血友病患者的80%。其它類(lèi)型的血友病，乙型血友病， 侵害了 20%的血友病患者；乙型血友病是由于缺乏其它凝血因子即因子IX
而造成的。
目前對(duì)于血友病(甲型或乙型)的治療包括靜脈給藥不足或缺乏的凝血
因子。在法國(guó)，提供的用于治療血友病的Fvni是藥劑的形式，該藥劑源于
由法國(guó)國(guó)家分割和生物技術(shù)組織實(shí)驗(yàn)室(Laboratoire Frar^ais du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB))或國(guó)際藥物實(shí)驗(yàn)室提供的血液， 還為由基因工程技術(shù)制備的重組藥劑的形式。事實(shí)上，已經(jīng)分離出編碼FVIII 的DNA，并且該DNA已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(Wood et al., Nature (1984) 312:330-337)，并已從cDNA推導(dǎo)出它的氨基酸序列。
分泌的FVm是一種分子量為300 kda (2332個(gè)氨基酸)的糖蛋白，該糖 蛋白在激活固有凝血途徑中起關(guān)鍵作用。從N-末端到C-末端，無(wú)活性的FVIII 由6個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成Al (1-372位殘基)、A2 (373-740位殘基)、B (741-1648 位殘基)、A3 (1649-2019位殘基)、Cl (2020-2172位殘基)和C2 (2173-2332 位殘基)。分泌后，F(xiàn)VIII與保護(hù)其免受血漿蛋白酶分解的血管性血友病因子 (WF)相互作用。FVIII以此形式在血液中循環(huán)。通過(guò)凝血酶切割之后，F(xiàn)VIII 與WF分離。該切割造成了結(jié)構(gòu)域B的丟失并使FVIII活化為由結(jié)構(gòu)域Al、 結(jié)構(gòu)域A2和輕鏈A3-C1-C2構(gòu)成的異二聚體形式。FVIII以此形式在血漿中 循環(huán)。該異二聚體由重鏈(A1、 A2)和輕鏈(A3、 Cl、 C2)構(gòu)成。
當(dāng)FVIII被灌注入血友病患者體內(nèi)時(shí)，在患者的血流中FVIII結(jié)合到 VWF上。活化的FVIII起到類(lèi)似于活化的因子IX的輔助因子的作用，促進(jìn) 因子X(jué)轉(zhuǎn)化為活化的因子X(jué)?；罨囊蜃覺(jué)將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶。然 后凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，形成凝血。
在FVIII的給藥中面臨的主要問(wèn)題是患者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)FVIII的抗體， 被稱(chēng)為"抑制抗體"。這類(lèi)抗體消除了FVIII的凝血活性，因此FVIII—旦灌 注就會(huì)失活。給予的凝血因子在能夠阻止出血(一種嚴(yán)重的血友病并發(fā)癥) 之前已失活，因而治療變得無(wú)效。此外，某些遺傳性非血友病患者可產(chǎn)生針 對(duì)內(nèi)源FVIII的抑制劑這是一種獲得性血友病。
抗Fvni抗體對(duì)Fvm功能的干擾機(jī)制有很多種，包括干擾fviii的蛋 白酶切割和干擾Fvni與多種協(xié)同因子的相互作用，所述協(xié)同因子如血管性
血友病因子(VWF)、磷脂(PL)、因子IX、活化的因子X(jué)(FXa)、或活化的蛋 白C(APC)。
FVIII的特異性免疫反應(yīng)啟動(dòng)的第一階段是抗原提呈細(xì)胞對(duì)FVIII的內(nèi) 吞作用。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是最有效的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，并且是一類(lèi)罕見(jiàn) 的能夠激活原始天然T細(xì)胞的APC。因而樹(shù)突狀細(xì)胞能夠啟動(dòng)對(duì)抗原(1,2) 的特異性免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)受體介導(dǎo)或巨吞飲來(lái)內(nèi)吞抗原；在體內(nèi)， 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞是有利的。 樹(shù)突狀細(xì)胞的表面有大量?jī)?nèi)吞受體，其中的大部分依賴(lài)二價(jià)離子，主要 是鈣(圖l)。由于它們的糖類(lèi)識(shí)別域(CRD)，大量?jī)?nèi)吞受體對(duì)抗原上的糖 殘基是特異性的，且被稱(chēng)為C型凝集素受體(CLR)。因而抗原上的甘露糖 殘基可被樹(shù)突狀細(xì)胞表面上的一系列甘露糖敏感性CLR所識(shí)別，該樹(shù)突狀 細(xì)胞包括甘露糖受體(MR, CD206)、 DC-SIGN受體(CD209)、樹(shù)突狀細(xì)胞C 型凝集素(dectin)、 DEC-205(CD205)。甘露聚糖是這類(lèi)對(duì)甘露糖敏感的甘 露糖敏感性CLR，特別是MR和DC-SIGN (3-5)的配體。樹(shù)突狀細(xì)胞的 DC-SIGN分子與T淋巴細(xì)胞的ICAM-3分子結(jié)合。這種特異性相互作用似 乎在啟動(dòng)樹(shù)突狀細(xì)胞和TL之間的免疫突觸中發(fā)揮重要作用。淋巴細(xì)胞的活 化被抗DC-SIGN阻遏抗體所抑制。
FVIII分子包括25個(gè)共有序列(Asn-Xxx-Thr/Ser)，它們是與N結(jié)合的潛 在糖基化位點(diǎn)，已證實(shí)其中的20個(gè)被糖基化(6)。 一些與N結(jié)合的糖基保留 在FVIII-BDD上(刪除結(jié)構(gòu)域B的重組FVin， Refacto， Wyeth) (7)。源于
血漿的Fvm和重組Fvm都表現(xiàn)出相似的糖基化圖譜，具有以半乳糖或甘
露糖結(jié)束的殘基(8, 9)。
因而FVIII和FVIII-BDD是樹(shù)突狀細(xì)胞表面上的CLR的候選配體。
有幾種能減弱抗Fvm免疫反應(yīng)的治療方法、可促進(jìn)凝血的藥劑、以及 灌注大量或中間量的Fvm以誘導(dǎo)耐受性，例如，利用能剌激產(chǎn)生Fvm的
合成激素——去氨加壓素的治療，所述藥劑的例子如凝血酶原復(fù)合體濃縮物
或活化的凝血酶原復(fù)合體濃縮物，重組因子VIIa。然而，這類(lèi)方法成本很高
并且效果不好。
另一個(gè)更新的抵制Fvm抑制抗體的策略設(shè)想了給予抗獨(dú)特型抗體(可
與其它抗體的可變區(qū)域相互作用的抗體)，使所述抑制抗體無(wú)效(Saint-R6my JMetal. (1999) Vox Sang; 77 (suppl 1) : 21-24)。因?yàn)槎嗫寺∶庖叻磻?yīng)的體內(nèi)分 析的復(fù)雜性，己經(jīng)分離出針對(duì)FVIII特定結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。并分離出K 型IgG4的人單克隆抗體LE2E9。該抗體針對(duì)FVIII的結(jié)構(gòu)域Cl ，抑制FVIII 的輔助因子活性和FVIII與vWF的結(jié)合(Jacquemin et al. (2000) 95:156-163)。通過(guò)同樣的方法，分離出了由甲型血友病患者的帶抑制因子的 記憶性B細(xì)胞譜系制備的、被稱(chēng)為B02C11(k型IgG4)的針對(duì)FVIII結(jié)構(gòu)域 C2的人單克隆抗體(Jacquemin et al. Blood 1998 Jul 15;92 (2):496-506)。 B02C11識(shí)別FVIII的結(jié)構(gòu)域C2并抑制FVIII與VWF和磷脂的結(jié)合。它完
全抑制天然的和活化的Fvm的凝血活性。單克隆抗體的另一實(shí)例是針對(duì)
FVIII的結(jié)構(gòu)域A2的抗體BOIIB2。抗體BOIIB2抑制了 FVIII的99%的活 性。通過(guò)與結(jié)構(gòu)域A2結(jié)合，它可干擾并抑制FIXa的結(jié)合，進(jìn)而抑制FIXa 的酶活性，所述FIXa在FVIII的該結(jié)構(gòu)域具有低親和力的結(jié)合位點(diǎn)?？稍O(shè) 想的第二種作用模式是通過(guò)促進(jìn)從復(fù)合體上分裂出結(jié)構(gòu)域A2來(lái)干擾FVIII 異二聚體形式(A2:A1禾卩A3:C1:C2)與FVIII異三聚體形式(A2和Al和 A3:C1:C2)之間的平衡，使它們沒(méi)有功能(Ananyeva NM et al. (2004) Blood Coagul Fibrinolysis, Mar; 15(2): 109-24. Revue)。
但是，抗FVIII免疫反應(yīng)是多克隆的，患者產(chǎn)生的FVIII抑制抗體并非
必須都要針對(duì)Fvm的單一結(jié)構(gòu)域。
包括給藥針對(duì)抗FVIII抗體的抗獨(dú)特型抗體的治療方法只能部分中和患 者產(chǎn)生的抗FVIII免疫反應(yīng)，所述抗FVIII抗體針對(duì)FVIII的單一結(jié)構(gòu)域。 沒(méi)有哪種治療方法能在抗FVIII免疫反應(yīng)出現(xiàn)之前有效地作用并避免它。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的這種不足，申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)了可以阻斷免疫系統(tǒng)細(xì) 胞對(duì)FVIII的內(nèi)吞作用并延長(zhǎng)FVIII的半衰期，所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞能夠內(nèi)吞 抗原從而抑制抗FVIII抗體的形成。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種去糖基的因子vm或其片段，相對(duì)于
天然的因子VIII，該去糖基的因子VIII或其片段的相互作用的能力以及被可
內(nèi)吞抗原的細(xì)胞內(nèi)吞的能力減弱或被抑制。
根據(jù)另一特別有利的實(shí)施方式，該去糖基的因子VIII或其片段與所述可
內(nèi)吞抗原細(xì)胞的表面上的受體相互作用的能力減弱或被抑制，尤其是與甘露
糖特異性受體的相互作用，更尤其是甘露糖受體CD206或DC-SIGN受體 CD209 (樹(shù)突狀細(xì)胞特異性的細(xì)胞間粘附分子3(ICAM-3)-捕捉非整聯(lián)蛋白)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式，所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞 (APCs)，尤其是，樹(shù)突狀細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選方式， 所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞選自巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝庫(kù)普弗 細(xì)胞(liver Kupffer cell )。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述因子VIII或其片段是在未使用選 自由已用的神經(jīng)氨酸酶、P-半乳糖苷酶和a-甘露糖苷酶所組成的組中的一種 或多種酶的條件下被去除掉糖基的。
根據(jù)發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述因子VIII或其片段是通過(guò)內(nèi)切葡萄 糖苷酶類(lèi)(尤其是內(nèi)切-P-N-乙?；被咸烟擒彰割?lèi))的單一酶作用而被去 除掉糖基的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，所用的酶具有切斷寡甘露糖型和 混合型的糖結(jié)構(gòu)的能力，但不具有切斷復(fù)合型的糖結(jié)構(gòu)的能力。
在一個(gè)具體方式中，所述內(nèi)切-(3-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶類(lèi)的酶選自由 內(nèi)切-P-N-乙?；被咸烟擒彰窮1和內(nèi)切-P-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶H所 組成的組中，例如腦膜膿毒性金黃桿菌(黃桿菌屬)(Ozo^o6"^〃'謂 fF/avo6fl"eWMmJ附e"/"go"; ricM附)的內(nèi)切-卩-N-乙?；被咸烟擒彰窮l或 皺褶鏈霉菌(浙取omj;c^^am^)的內(nèi)切-(3-N-乙?；被咸烟擒彰窰。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明的去糖基的因子VIII或其片段被用 作一種藥物，特別是用于治療血友病患者的藥物，尤其是治療甲型或乙型血 友病的藥物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明的去糖基的因子VIII或其 片段還被用于制備用來(lái)治療血友病患者或治療甲型或乙型血友病的藥物，并
可有利地與外源的因子vm組合使用。
根據(jù)本發(fā)明的另一 目的，本發(fā)明的去糖基的因子VIII或其片段可被用于 制備用來(lái)延長(zhǎng)外源的因子vin在血友病患者體內(nèi)的半衰期或降低外源的因 子VIII在血友病患者體內(nèi)的免疫原性的藥物。
本發(fā)明的另一方面還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物含有至少一種 本發(fā)明的去糖基的因子vni或其片段，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的佐劑 和/或賦形劑。
本發(fā)明最后的目的涉及含有甘露聚糖組合物在制備用來(lái)治療血友病患 者或治療甲型或乙型血友病的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
，該含 有甘露聚糖的組合物被用于制備用來(lái)延長(zhǎng)外源的因子vni在血友病患者體 內(nèi)的的半衰期或降低外源的因子vni在血友病患者體內(nèi)的免疫原性的藥物。 根據(jù)一種有利的實(shí)施方式，所述含有甘露聚糖的組合物還含有天然的外源的 因子vm、和/或本發(fā)明的去糖基的因子vni或其片段。
除非另有規(guī)定，在說(shuō)明書(shū)、摘要和權(quán)利要求中遇到的下列術(shù)語(yǔ)一般具有 如下的含義
通常，在說(shuō)明書(shū)、摘要和權(quán)利要求中，與天冬酰胺殘基(N)(該殘基可 以含于多肽中，如天然或去糖基的因子vm)相結(jié)合的糖鏈的定義是本領(lǐng)域
技術(shù)人員公知的，其具有由兩個(gè)N-乙?；被咸烟?GlcNAc)和三個(gè)甘露
糖組成的基本結(jié)構(gòu)，且其它單糖也可以接枝到該結(jié)構(gòu)上。所述基本結(jié)構(gòu)是通
過(guò)將兩個(gè)N-乙酰基氨基葡萄糖(GlcNAc)殘基在pi， 4位結(jié)合在一起而形成 的。其中一種與蛋白(通過(guò)天冬酰胺)形成N-糖苷鍵。另一種在pl， 4位 上與甘露糖殘基結(jié)合，該甘露糖殘基本身在a1,6和a1，3位上與2個(gè)甘露糖 殘基結(jié)合，例如Man oX-6l^^ Man al-3
本申請(qǐng)中的與天冬酰胺相結(jié)合的糖鏈都是以實(shí)例的方式給出的，但不應(yīng) 被認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明。
"觸角(Antennae)"是通過(guò)在末端甘露糖上添加單糖而形成的。由于
糖的特性，由此在三種類(lèi)型的多糖結(jié)構(gòu)之間形成區(qū)別
-"寡甘露糖"型結(jié)構(gòu)，是在所述基本結(jié)構(gòu)上添加甘露糖殘基；例如 Mto al-2 — Mwa al嚴(yán)5
Man ctl嚴(yán)6
鵬Ctl-2 — M助Cd-z 、M抑pi^lcN豐-4師Ac
1j^q ca-2 —媳n al-2 一 Man
-"復(fù)合"型結(jié)構(gòu)，是在所述基本結(jié)構(gòu)的末端甘露糖上結(jié)合N-乙?；?基葡萄糖殘基(LacNac: Gal卩1，4 GlcNAc)(依次添加GlcNAc和Gal并產(chǎn)生 GlcNAcT誦l，2，3，4禾f]5，然后產(chǎn)生GalT的活性)而形成的；例如
Gaipi-4GlcNAc )3l-2 Man 0tl-3
-"混合"型結(jié)構(gòu)，顧名思義是前述兩種結(jié)構(gòu)的混合物。在以下給出的
實(shí)例中，cd，6支鏈上的甘露糖單獨(dú)地被甘露糖殘基所取代，而al,3支鏈則被 一個(gè)或兩個(gè)N-乙?；被咸烟菤埢〈?br> Man al-6
"""""^ Man al-6 M抑al-y"-"^ Man pi-4Glc改Acpl"Gl。NAc
z
Gaipi-4GlcNAC P"2 Man Cll-S


圖l: FVIII和DC膜上的受體的圖示；
圖2a:在37。C和4'C條件下FVIII-BDD(-O-)和完整FVIII(1-)的內(nèi)化 (internalization)的差異；
圖2b:在4"C或37""C下FVIII和FVIII-BDD的內(nèi)化與時(shí)間的函數(shù)圖； 圖2c:在介質(zhì)、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘露聚糖或半乳糖存在的條 件下，F(xiàn)VIII的相對(duì)內(nèi)化率(％);
圖2d:在存在或不存在甘露聚糖的條件下，F(xiàn)Vin、 FVm-BDD、葡聚糖
和熒光素黃的相對(duì)內(nèi)化率(％);
圖2e: FVin、 FVin-BDD和葡聚糖的內(nèi)化抑制率(。/。)與甘露聚糖濃度增
長(zhǎng)的函數(shù)圖2f:在存在或不存在RAP或甘露聚糖的條件下，a2M的內(nèi)化；
圖3a:在存在抗MR和抗DC-SIGN抗體的條件下，F(xiàn)VIII和FVIII-BDD
的相對(duì)內(nèi)化率(％);
圖3b: HD420細(xì)胞對(duì)FVIII的內(nèi)化率(％ )與FVIII濃度(iiM)的函數(shù)圖； 圖3c:和CTLD1-3以及CTLD4-7結(jié)構(gòu)的結(jié)合強(qiáng)度與FVIII、 FVIII-BDD
和甘露聚糖的濃度^g/ml)的函數(shù)圖3d: FVIII和FVIII-BDD與CTLD1-3和CTLD4-7結(jié)構(gòu)的結(jié)合的抑制
率(％)與甘露聚糖的濃度Oig/ml)的函數(shù)圖4a: CD4+T細(xì)胞的增殖(cpm)與CD4+T: DC的比值的函數(shù)圖4b:通過(guò)測(cè)定產(chǎn)生的干擾素Y而確定的人抗FVIIITCD4+克隆D9E9
的活化；
圖5a: FVIII的凝血活性的抑制率(％); 圖5b:甘露聚糖對(duì)FVIII與VWF的結(jié)合的抑制率(％); 圖6:檢測(cè)FVIII上的糖的蛋白質(zhì)印跡(Westernblot); 圖7:由CTLD4-7-Fc檢測(cè)FVIII的蛋白質(zhì)印跡；圖8:經(jīng)Endo-Fl處理或不經(jīng)處理的FVIII的內(nèi)化抑制率(％); 圖9:CTLD(4-7)-Fc和FVIII-BDD (OD 492 nm)的結(jié)合與VWF濃度的函 數(shù)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要涉及一種化合物，該化合物能夠?qū)σ蜃覸III與可內(nèi)吞抗原細(xì) 胞之間的相互作用和所述細(xì)胞對(duì)因子VIII的內(nèi)吞作用進(jìn)行抑制。
事實(shí)上，申請(qǐng)人已證實(shí)某些化合物能夠抑制樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)FVIII的內(nèi)吞
作用，如甘露聚糖和去糖基的Fvni。
申請(qǐng)人還證實(shí)了甘露聚糖能夠抑制FVIII特異性T細(xì)胞的增殖而不阻遏
Fvni的凝血活性或Fvin與vwf的相互作用。
尤其是，該化合物能夠抑制因子VIII與可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞上的受體之間 的相互作用，該受體與所述細(xì)胞對(duì)因子VIII的內(nèi)吞作用相關(guān)。
因而本發(fā)明還包括除Fvm以外的、阻遏了內(nèi)吞fviii的細(xì)胞上的受體 的化合物，和經(jīng)修飾的Fvin分子，為完整分子或其片段，其與內(nèi)吞細(xì)胞相 結(jié)合的能力弱于天然fviii。因此，這兩種化合物都能抑制可內(nèi)吞抗原的免 疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)Fvm的內(nèi)吞作用。
對(duì)于經(jīng)修飾的Fvm分子或其片段，所述Fvm化合物抑制它自身的相 互作用、以及可內(nèi)吞的細(xì)胞對(duì)于它的內(nèi)吞作用因此，相對(duì)于天然的Fvni， 對(duì)經(jīng)修飾的Fvm分子或其片段的內(nèi)吞作用就減少了。優(yōu)選地，相對(duì)于天然 的Fvm，該Fvm在其糖基化水平上被修飾。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，所述受體是甘露糖特異性的，尤其優(yōu)選所
述甘露糖特異性受體是甘露糖受體CD206或DC-SIGN (樹(shù)突狀細(xì)胞特異性 的細(xì)胞間粘附分子3(ICAM-3)-捕捉非整聯(lián)蛋白)受體CD209。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞是抗原提呈細(xì)
胞，例如樹(shù)突狀細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的化合物能夠抑制抗原提呈細(xì)胞對(duì)FVIII的內(nèi)吞作用，并
可以抑制啟動(dòng)免疫反應(yīng)的Fvin多肽提呈。因此，本發(fā)明的化合物抑制抗 Fvin抗體的產(chǎn)生并降低Fvni的免疫原性。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞選自巨噬細(xì) 胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝庫(kù)普弗細(xì)胞。
這些細(xì)胞為清除fviii而將其內(nèi)吞。通過(guò)抑制這些細(xì)胞對(duì)fviii的內(nèi)吞
作用，本發(fā)明的化合物減少了這種FVIII清除途徑，增加了FVIII的循環(huán)量
并延長(zhǎng)了Fvm的半衰期。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物在制備用于與外源fviii組合治療血友病 的藥物中的應(yīng)用。
尤其是，該藥物可用于降低外源的Fvni在血友病患者體內(nèi)的免疫原性 和/或延長(zhǎng)外源的Fvm在血友病患者體內(nèi)的半衰期。
在這種情況下，為了其凝血活性，將藥物和外源fviii或其片段一起給藥。
尤其是，為降低外源的Fvm在血友病患者體內(nèi)的免疫原性和減延長(zhǎng)外 源的fviii在血友病患者體內(nèi)的半衰期，將甘露聚糖用于制備與外源的fviii 組合治療血友病的藥物。
此外本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的Fvm或其片段在制備用于治療血友病的藥 物中的應(yīng)用，相對(duì)于天然Fvin，可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞對(duì)所述經(jīng)修飾的FVin 或其片段的內(nèi)吞作用降低了。
尤其是，該Fvm或Fvm的片段是去甘露糖基的。
在這種情況下，所述藥物含有免疫原性小于天然Fvm的fviii，其半 衰期相對(duì)于天然fviii延長(zhǎng)了，但保持了全部的凝血活性。
此外本發(fā)明涉及了一種藥物組合物，該藥物組合物含有至少一種本發(fā)明
中的化合物、和一種或多種藥學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑。 以下實(shí)施例解釋本發(fā)明但不限制其范圍。
實(shí)施例l:制備源于單核細(xì)胞的人樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)
相對(duì)于以前公開(kāi)的方法(29),由單核細(xì)胞制備DC在培養(yǎng)液上有所變化。 簡(jiǎn)要而言，通過(guò)在含有補(bǔ)充了 10X人AB型血清、谷氨酰胺和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液的塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿上粘附60分鐘，從健康的成年供者的肝素化白 細(xì)胞血小板層("血沉棕黃層")分離出單核細(xì)胞。用培養(yǎng)液溫和地洗滌3次以 去除非粘附細(xì)胞。在500 IU/ml購(gòu)自研發(fā)系統(tǒng)(R&D Systems) (Lille,法國(guó))的 重組人白介素"4(rhlL-4)、和1000 IU/ml購(gòu)自Immunotools(Friesoythe,德國(guó))的 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的存在下，在補(bǔ)充了 1%的人 AB型血清和抗生素的X-VIVO 15培養(yǎng)液(Cambrex Bio Sciences, Paris, France) 中培養(yǎng)粘附的單核細(xì)胞。每?jī)商旄鼡Q一半含有所有附加成分的培養(yǎng)液。培養(yǎng) 5天后，獲得了與DC中富含的成分相對(duì)應(yīng)的非粘附細(xì)胞和弱粘附細(xì)胞，將 其洗滌并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2:完整的重組人FVIII和去除了結(jié)構(gòu)域B的重組人FVm與熒光素 的結(jié)合
將完整的重組人FVIII(IOOO國(guó)際單位，Kogenate， Bayer)或去除了結(jié)構(gòu)域 B的重組人FVIII(FVm-BDD)(lOOO國(guó)際單位，Refacto,Wyeth)用水溶解，并 于4°C下在含有CaCl2的5 mM重碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.2)進(jìn)行透析，然后在 4°C與熒光素5-異硫氰酸酯(FITC) (I型異構(gòu)體，Sigma-Aldrich， Saint Quentin Fallavier，法國(guó))偶聯(lián)7-8小時(shí)。再將標(biāo)記好的FVIII在RPMI 1640培養(yǎng)液中 透析以去除未偶聯(lián)的FITC。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)布雷德福法 (Bradford method)對(duì)FVIII-FITC進(jìn)行定量測(cè)定。
實(shí)施例3:采用ELISA將甘露糖受體(MR)的構(gòu)建體與FVIII結(jié)合 甘露糖受體，CTLD(4-7)-FC和CR-FNII-CTLD(l-3)-CR-Fc的構(gòu)建體 (construct)是由英國(guó)諾丁漢大學(xué)(University of Nottingham)皇家醫(yī)藥中心 (Queen's Medical Centre)分子醫(yī)藥科學(xué)學(xué)院(School of Molecular Medical Sciences)的Luisa Martinez-Pomares博士贈(zèng)予的。該構(gòu)建體與完整的重組人 FVIII的結(jié)合和與去除了結(jié)構(gòu)域B的重組人FVin的結(jié)合既可通過(guò)測(cè)定與包 覆有配體的ELISA板(甘露聚糖作為陽(yáng)性對(duì)照)的結(jié)合而直接檢測(cè)也可通 過(guò)抑制試驗(yàn)而間接檢測(cè)。用以154 mM NaCl梯度稀釋的FVIII溶液(起始濃 度為50昭/ml)將ELISA板包覆過(guò)夜。TTBS緩沖液(Tris-HCl 10 mM， pH 7.5， Ca2+ 10 mM, NaCl 154 mM和0.05%吐溫-20)用于所有的洗滌過(guò)程。用含3 %牛血清白蛋白(BSA)的TBS緩沖液(不含吐溫-20的TTBS)封閉不反應(yīng)的 位點(diǎn)。然后將板在含3 %牛血清白蛋白的TBS緩沖液中室溫下與2或lOpg/ml 的所述構(gòu)建體一起孵育2小時(shí)。利用人IgG的Fc部分特異性的偶聯(lián)HRP鼠 抗體(克隆JDC陽(yáng)IO， Southern Biotechnology Associates, Inc. AL,美國(guó))來(lái)檢測(cè) MR構(gòu)建體的結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)底物OPD (鄰苯二胺，Sigma)測(cè)定HRP的活性。 測(cè)定492nm的吸光率。對(duì)于抑制試驗(yàn)，用各種形式的FVIII(5.56 pg/ml)包覆 所述板。在孵育包覆有FVIII的板之前，將10 Hg/ml CTLD(4-7)-Fc構(gòu)建體和 各種濃度的甘露聚糖在室溫下一起孵育30分鐘。如上所述測(cè)定吸光率。 結(jié)果圖3c和3d
甘露糖受體含有8個(gè)C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLDs): CTLDs 4-7對(duì)甘露糖 化結(jié)構(gòu)具有親合力，而CTLDs 1-3則沒(méi)有。
如圖3c所示，甘露聚糖表現(xiàn)出與CTLD(4-7)-Fc的特異性結(jié)合。FVIII 和FVIII-BDD都表現(xiàn)出特異性的與CTLD(4-7)-Fc的劑量依賴(lài)性的相互作用， 而不與構(gòu)建體CTLD(l-3)結(jié)合，這表明FVIII結(jié)構(gòu)域B以外的糖基(可能表 現(xiàn)為甘露糖化)允許分子與MR相互作用。
用CTLD(4-7)-Fc預(yù)孵育的甘露聚糖以劑量依賴(lài)方式抑制兩種形式的 FVin與CTLD(4-7)-Fc的結(jié)合。這可反映出MR已被甘露聚糖飽和的DCs 的狀況，從而抑制對(duì)FVIII的內(nèi)吞。
實(shí)施例4:源于單核細(xì)胞的人DCs對(duì)FVIII的內(nèi)化的體外實(shí)驗(yàn) 材料和方法
將實(shí)施例l制得的DCs(0.4x105細(xì)胞/孔，96-孔板，100 pl/ L)和各種劑 量的由實(shí)施例2制得的偶聯(lián)熒光素的配體(FVIII-FITC， BDD-FVIII-FITC)在 X-VIVO培養(yǎng)液中分別于4°C或37°C孵育0、 15、 60和120分鐘。孵育之后， 用冷PBS洗滌細(xì)胞并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。為檢測(cè)參與內(nèi)化的受體，在 添加偶聯(lián)熒光素的配體之前，將細(xì)胞與O、 0.001、 0.01、 0.1和lmg/ml的甘 露聚糖(Sigma-Aldrich， Saint Quentin Fallavier,法國(guó))于37°C預(yù)孵育30分鐘。 除了 FVIII-FITC和FVIII-BDD-FITC,使用購(gòu)自Biomac (Leipzig,德國(guó))的偶 聯(lián)FITC的人a2-巨球蛋白-MA(a2M)、購(gòu)自分子探針(Molecular Probes) (Leiden，荷蘭)的葡聚糖-FITC(分子量40,000)和購(gòu)自Sigma-Aldrich的熒光素 黃(LY-CH)。 FVin內(nèi)化的檢測(cè)也是在存在20嗎/ml的抗甘露糖受體單克隆抗 體(PAM-l,同型IgGl)或抗DC-SIGN單克隆抗體((AZN-D1，同型IgGl)或偶 聯(lián)PE-Cy的鼠IgG"BD Pharmingen,法國(guó))的情況下進(jìn)行的。為檢測(cè)DC-SIGN 是否參與FVIII的內(nèi)吞，將經(jīng)DC-SIGN轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的由野生型EBV轉(zhuǎn)化 的B淋巴細(xì)胞株HD-420和各種濃度的FVIII-FITC(0， 0.036， 0.072禾卩0.143 pM)在補(bǔ)充了 10%FCS (胎牛血清)和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液中孵育2小 時(shí)。對(duì)DCs進(jìn)行分析。
結(jié)果 圖2a, b
根據(jù)劑量和時(shí)間，DCs成比例地內(nèi)化完整FVIII和FVTII-BDD。計(jì)算的AMFI值表示在37°C和4°C孵育2小時(shí)后FVIII陽(yáng)性DCs的不同標(biāo)記。結(jié)果表 明FVIII內(nèi)化是一個(gè)活躍的過(guò)程。選擇2小時(shí)的孵育期和0.143 的配體濃度
進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 圖2c
細(xì)胞和5mM EDTA的預(yù)孵育明顯降低了不成熟DCs對(duì)FVIII的內(nèi)化(完 整FVIII和FVIII-BDD的抑制率分別為58.1±11.1°/。和62.4±11.4%)，從而證 實(shí)了依賴(lài)于二價(jià)離子的受體的作用。利用特異性競(jìng)爭(zhēng)性配體檢測(cè)DCs上可能 的FVIII受體(即CD91/LRP， ASGPR，甘露糖受體)。聯(lián)合受體的38 kD蛋 白(RAP)阻遏了 LDL受體家族成員如CD91/LRP對(duì)配體的內(nèi)吞作用。過(guò)量的 RAP不會(huì)避免DCs對(duì)FVIII的內(nèi)吞作用。而且，C型凝集素受體ASGPR的 競(jìng)爭(zhēng)性配體——D-半乳糖，無(wú)論是否具有結(jié)構(gòu)域B都不能明顯減少FVIII的 內(nèi)化。相反地，添加甘露聚糖(lmg/ml)明顯減少了 FVIII的內(nèi)吞作用(完整 FVIII和FVIII陽(yáng)BDD的抑制率分別為35.0±10.0%和41.3±17.2%; p<0.05)。這 表明了甘露糖敏感性CLRs直接或間接參與了 FVIII的內(nèi)化。
圖2d
采用典型的甘露糖敏感性CLRs的配體即葡聚糖和熒光素黃(ly)確認(rèn)了 甘露聚糖對(duì)于甘露糖敏感性CLRs的特異性，無(wú)論是何種受體，熒光素黃的 內(nèi)化都是通過(guò)巨吞飲進(jìn)行。在存在甘露聚糖的條件下，葡聚糖的內(nèi)化被阻遏 至80%，而ly的內(nèi)化卻不受影響。
圖2e
甘露聚糖對(duì)抗原內(nèi)化的中和效應(yīng)與FVIII、 FVIII-BDD和葡聚糖的劑量 成比例，而與抗原濃度無(wú)關(guān)。有趣的是，各種抗原具有相似的甘露聚糖飽和 濃度(IOO pg/ml)，表明這些抗原的甘露聚糖敏感性?xún)?nèi)吞是經(jīng)由相似的甘露糖 敏感性受體進(jìn)行的。
圖2f
Fvm可與多種內(nèi)吞受體相互作用。
活化的ct2M是一種特異性地靶向內(nèi)吞受體CD91/LRP的甘露糖化的蛋 白，其可用作模式抗原。據(jù)發(fā)現(xiàn)，如果有其他內(nèi)吞受體參與，a2M上的甘露 糖化的殘基的表達(dá)就不影響抗原的內(nèi)化。因而，當(dāng)存在過(guò)量的RAP時(shí)，a2M 的內(nèi)化被完全抑制，而不受甘露聚糖的影響。
這些結(jié)果間接表明FVIII上的甘露糖化部分是獨(dú)特的，并且使FVIII具 有比其它甘露糖化抗原更強(qiáng)的對(duì)抗原提呈細(xì)胞(APC)的吸引力。
圖3a和3b
在DCs和其它APCs表面的某些受體是甘露聚糖敏感性的，包括甘露糖 受體MR(CD206)和DC-SIGN受體(CD209)?？贵wPMA-1 (抗MR)抑制了 20,22 。％的FVIII內(nèi)化和37.35%的FVIII-BDD內(nèi)化，這表明MR參與了對(duì)FVIII 的內(nèi)吞。在FVIII的內(nèi)吞中，甘露聚糖的作用比抗MR單克隆抗體的作用更 為明顯，這可由DCs對(duì)FVIII的內(nèi)化涉及了幾種還未表征出來(lái)的甘露聚糖敏 感性受體來(lái)解釋。另一方面，由甘露聚糖增加的抑制可能是因?yàn)镸R具有幾 個(gè)糖識(shí)別域(CRDs):因此多糖化的甘露聚糖的抑制比僅針對(duì)MR的第4個(gè) CRD的抗體PAM-1的抑制更有效。
抗體AZN-D1 (抗DC-SIGN)沒(méi)有抑制不成熟DCs對(duì)FVIII的內(nèi)化，而抑 制了 17.6X的對(duì)FVm-BDD的內(nèi)化。經(jīng)轉(zhuǎn)染B細(xì)胞的DC-SIGN表達(dá)不允許 FVIII內(nèi)吞的增長(zhǎng)。
這些數(shù)據(jù)表明DC-SIGN在人DCs對(duì)FVm的內(nèi)化作用中是次要角色。
實(shí)施例5:自體CD4+T細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)
將實(shí)施例1的DCs與甘露聚糖(l mg/ml)在37匸孵育30分鐘。在2小時(shí) 內(nèi)，加入在RPMI 1640培養(yǎng)液(Kogenate, Bayer)中透析的FVIH(40 ^g/m， 0.143 ^M)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并和LPS(l pg/50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)在完全培養(yǎng)液
中孵育48小時(shí)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌并和采用MACS細(xì)胞分離試劑盒 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach，德國(guó))從相應(yīng)供者的PBMC中獲得的自 體CD4十T細(xì)胞一起培養(yǎng)(用補(bǔ)充了 10。/。男性AB型血清的RPMI 1640培養(yǎng) 液，在每孔200 pl的圓底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng))。每孔中CD4+T細(xì)胞的 量維持恒定(100000個(gè)細(xì)胞/ L)，而DCs的量是變化的(三種，即5,000， 10,000 和15，000DCs)，使得T: DC細(xì)胞的比值為20:1、 10:1、 6.6:1。
培養(yǎng)4天后，每孔加入0.5^Ci的氚標(biāo)記胸腺嘧啶。16小時(shí)后收集細(xì)胞 并計(jì)算并入的放射性。
結(jié)果圖4a
甘露聚糖減少了高達(dá)40%的人DCs對(duì)FVIII的內(nèi)吞。
圖4a:在加入FVIII之前，實(shí)施例1的DCs單獨(dú)孵育或與甘露聚糖一起
孵育。在LPS中成熟后，將DCs和自體CD4+T輔助細(xì)胞一起孵育。甘露聚
糖將T細(xì)胞增殖降低到與陰性對(duì)照相當(dāng)?shù)乃健?br> 實(shí)施例6: FVIII特異性T細(xì)胞的克隆活性的體外試驗(yàn) 洗滌之后，將實(shí)施例1的DCs重懸于含10%FCS的DMEM:F12 (l:l)培 養(yǎng)液中，并在圓底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔引入10000個(gè)DCs。與甘露聚糖 (1 mg/ml)—起孵育30分鐘后，將DCs和5000個(gè)D9E9 (FVIII特異性的T細(xì) 胞克隆)在含10%FCS禾B 20 U/ml的rhlL-2和各種劑量的整體FVIII或 FVIII-BDD (10， 8， 6, 4， 2嗎/ml)的DMEM:F12 (l:l)培養(yǎng)液中37*€培養(yǎng)20小 時(shí)。與D9E9細(xì)胞相似，在10 pg/ml的整體FVIII或FVIII-BDD下培養(yǎng)由 EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞LE2E9株和B02C11株。對(duì)照條件則維持缺乏FVIII、 D9E9或DCs的狀態(tài)。作為陰性對(duì)照，hrFIX (Benefix, Baxter)和細(xì)胞一起在 等摩爾濃度的FVIII下孵育。孵育期結(jié)束后收集懸浮物，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明 利用人干擾素Y Duo Set試劑盒(DY285， R&D Systems)檢測(cè)所產(chǎn)生的干擾素
結(jié)果圖4b
FVIII誘導(dǎo)了 D9E9細(xì)胞的劑量依賴(lài)型活化，其在甘露聚糖存在時(shí)被抑 制了高達(dá)84X(B)。FIX存在時(shí)的不增殖表明了T細(xì)胞的增殖是特異性的(A)。
甘露聚糖不能防止FVIII、LE2E9沖激的自體B細(xì)胞對(duì)D9E9的活化(C)。 這表明甘露聚糖對(duì)降低FVIII免疫原性的潛在作用只在FVIII特異性B細(xì)胞 未被剌激(即在以前未經(jīng)治療的患者體內(nèi))、或治療后未產(chǎn)生抑制因子的情況 下可以被開(kāi)發(fā)用于治療。
結(jié)論-
因甘露聚糖的存在而誘發(fā)的FVin內(nèi)化的減少使得呈遞到CD4+ T細(xì)胞的 源于FVm的多肽減少，因而T淋巴細(xì)胞的活化減弱。
實(shí)施例7:凝血試驗(yàn)
將正常人血漿和相同體積的甘露聚5^(0到4,000 mg/ml)在37'C孵育2小 時(shí)。并采用人胎盤(pán)凝血酶原為催化劑(Dade Behring Marburg GmbH， Marburg， 德國(guó))，耗盡FVIII的血漿(Dade Behring Marburg GmbH， Marburg，德國(guó))為底 物和纖維蛋白計(jì)時(shí)器(Sysmex CA500， Dade Behring)，通過(guò)一步凝血試驗(yàn)測(cè)定 殘余的FVIII活性。在Owren-Koller緩沖液(Diagnostica Stago, Asnidres，法國(guó)) 中進(jìn)行稀釋。
結(jié)果圖5a
甘露聚糖不阻遏FVin的凝血活性。
實(shí)施例8: FVIII和VWF結(jié)合的ELISA試驗(yàn)
ELISA板(Nunc， Roskilde，丹麥)用每孔2pg/ml的VWF(VWF， Willefectin， LFB, Les Ulis，法國(guó))在PBS(pH 7.4)中于37。C包覆1小時(shí)。用含1%脫脂牛奶
和0.1 %吐溫20的PBS于37°C1小時(shí)使板浸透。將FVin(0.3 (ig/ml)單獨(dú)、或 與甘露聚糖(O.Ol到4 mg/ml)、或與B02C11 (人單克隆抗FVIIIIgG)—起在封閉 緩沖液中37'C預(yù)孵育1小時(shí)，然后將其加入到包覆有VWF的孔中37'C孵育1 小時(shí)。將鼠單克隆抗FVIII IgG (mAb6) (3 pg/ml)在37'C孵育1小時(shí)。利用與鏈 霉卵白素過(guò)氧化物酶和它們的底物偶聯(lián)的兔抗鼠IgG抗體(Jackson Laboratories) 來(lái)顯示反應(yīng)。通過(guò)只含有VWF的孔中的非特異性結(jié)合來(lái)修正結(jié)合值，并以 FVIII的殘余結(jié)合百分率表示?？捎^察到未包覆的孔中沒(méi)有結(jié)合FVm。 結(jié)果圖5b
甘露聚糖不干擾FVIII與VWF的相互作用。 實(shí)施例9:研究去甘露糖的FVIII的內(nèi)化作用
在第一階段，將FVIII-BDD和三種不同的內(nèi)切糖苷酶EndoFl、 EndoF2 和EndoF3 (Sigma)—起孵育。將未處理的FVIII-BDD和經(jīng)EndoFl 、 EndoF2 和EndoF3處理的FVin-BDD通過(guò)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 上。以HRP為陽(yáng)性對(duì)照，利用糖蛋白檢測(cè)試劑盒(Sigma)檢測(cè)糖。EndoFl是 唯一的可有效切斷FVin-BDD上的糖殘基的內(nèi)切糖苷酶。
第二階段，按生產(chǎn)商的說(shuō)明利用EndoFl將FVIII-BDD去糖基，經(jīng) SDS-PAGE分離并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法顯色。將37昭的FVIII-BDD加入7.5% SDS-PAGE凝膠的各孔中并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后利用10 pg/ml的 CTLD(4-7)-Fc構(gòu)建體和偶聯(lián)堿性磷酸酶(左)或膠體金(Protogold)(右) 的抗人IgG來(lái)顯色(cf.圖7)。與EndoFl孵育后FVIII-BDD分子量的改變證 實(shí)了 EndoFl的有效的去糖基作用。FVIII-BDD與EndoFl的孵育使得 CTLD(4-7)-Fc結(jié)構(gòu)不能識(shí)別FVIII,證明去除了甘露糖殘基。
最后，測(cè)定了FITC標(biāo)記的去甘露糖的FVIII-BDD內(nèi)化的抑制率。偶聯(lián) FITC的經(jīng)EndoFl (0.143 )iM)處理的或未經(jīng)處理的FVIII-BDD與實(shí)施例1的
DCs(100pl，每孔4 x 1()5細(xì)胞)在不含血清的X-VIVO培養(yǎng)液中于37。C或4 'C孵育。預(yù)先將細(xì)胞與甘露聚糖(1 mg/ml)在適宜的地方37'C預(yù)孵育30分鐘。 孵育2小時(shí)后，將細(xì)胞洗滌并利用FACS測(cè)定平均強(qiáng)度(mfi)。 FVin-BDD的 內(nèi)化以?xún)H存在未處理的FVIII時(shí)計(jì)算的mfi來(lái)表示(cf.圖8)。
未去糖基時(shí)，甘露聚糖對(duì)FVIII-BDD內(nèi)化的抑制率開(kāi)始為45 ± 7%。在 與EndoFl孵育后為23.5 ± 14.4%。存在甘露聚糖時(shí)進(jìn)一步降低了 36%，表 明經(jīng)EndoFl處理的FVIII以依賴(lài)甘露糖受體的方式被部分內(nèi)化。
這可通過(guò)以下任一事實(shí)來(lái)解釋
-EndoFl對(duì)FVin的處理僅部分去除甘露糖化的殘基。
-或EndoFl留下了還是甘露糖受體的配體的N-乙?；被咸烟菤埢?br> 實(shí)施例10:研究VWF對(duì)甘露糖受體識(shí)別FVIII的影響
用FVIII-BDD (5.56 |ig/ml， 0.033 ^M)包覆ELISA板。將VWF (0到1 ^M)
和10 pg/ml的CTLD(4-7)-Fc構(gòu)建體在室溫下孵育30分鐘，并加入固定化的
FVIII-BDD。采用偶聯(lián)HRP的鼠抗人Fc抗體和底物OPD來(lái)顯示該構(gòu)建體與
FVin-BDD的結(jié)合(cf.圖9)。
添加可溶的VWF可將CTLD(4-7)-Fc與固定化的FVIH的相互作用控制在有
限范圍內(nèi)(在過(guò)量的VWF: FVin比值下抑制43%)，這表明VWF僅部^F擾甘露
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權(quán)利要求
1、一種去糖基的因子VIII或其片段，相對(duì)于天然的因子VIII，該去糖基的因子VIII或其片段的相互作用的能力以及被可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞內(nèi)吞的能力減弱或被抑制。
2、 根據(jù)權(quán)利要求i所述的去糖基的因子vm或其片段，其中，該去糖 基的因子vni或其片段與所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞的表面上的受體相互作用 的能力減弱或被抑制。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述受體為甘露糖特異性受體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述受 體為甘露糖受體CD206、或樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子3-捕捉非整聯(lián) 蛋白受體CD209。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段， 其中，所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞為抗原提呈細(xì)胞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述抗 原提呈細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段， 其中，所述可內(nèi)吞抗原的細(xì)胞選自巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝 庫(kù)普弗細(xì)胞。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述去糖基是在沒(méi)有使用選自由神經(jīng)氨酸苷酶、P-半乳糖苷酶、和a-甘露糖苷酶所組成的組中的一種或多種酶的條件下實(shí)現(xiàn)的。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段， 其中，所述去糖基是通過(guò)內(nèi)切葡萄糖苷酶類(lèi)中的單一酶作用而實(shí)現(xiàn)的。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述內(nèi) 切葡萄糖苷酶類(lèi)的酶為內(nèi)切-P-N-乙?；被咸烟擒彰?。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述 內(nèi)切-P-N-乙?；被咸烟擒彰妇哂星袛喙迅事短切秃突旌闲偷奶墙Y(jié)構(gòu)的 能力，而不具有切斷復(fù)合型的糖結(jié)構(gòu)的能力。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中， 所述內(nèi)切-(3-N-乙?；被咸烟擒彰高x自由內(nèi)切-P-N-乙酰基氨基葡萄糖苷 酶Fl和內(nèi)切-p-N-乙?；被咸烟擒彰窰所組成的組中。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述 內(nèi)切-(3-N-乙?；被咸烟擒彰窮l為黃桿菌屬腦膜膿毒性金黃桿菌的內(nèi)切 -卩-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶Fl 。
14、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的去糖基的因子VIII或其片段，其中，所述 內(nèi)切-(3-N-乙?；被咸烟擒彰窰為皺褶鏈霉菌的內(nèi)切-l3-N-乙?；被?萄糖苷酶H。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段，該去糖基的因子VIII或其片段被用作藥物。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片 段，該去糖基的因子VIII或其片段被用作治療血友病患者的藥物。
17、 根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片 段，該去糖基的因子VIII或其片段被用作治療甲型或乙型血友病的藥物。
18、 權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段在 制備用于治療血友病患者的藥物中的應(yīng)用。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的去糖基的因子VIII或其片段的應(yīng)用，所述 去糖基的因子VIII或其片段用于制備與外源的因子VIII組合治療血友病患 者的藥物。
20、 權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段在 制備用于治療甲型或乙型血友病的藥物中的應(yīng)用。
21、 權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段在 制備用于延長(zhǎng)外源的因子VIII在血友病患者體內(nèi)的半衰期的藥物中的應(yīng)用。
22、 權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段在 制備用于降低外源的因子VIII在血友病患者體內(nèi)的免疫原性的藥物中的應(yīng) 用。
23、 一種藥物組合物，該藥物組合物含有至少一種如權(quán)利要求1-14中的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段、和一種或多種藥學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑。
24、 一種含有甘露聚糖的組合物在制備用于治療血友病患者的藥物中的 應(yīng)用。
25、 一種含有甘露聚糖的組合物在制備用于治療甲型或乙型血友病的藥 物中的應(yīng)用。
26、 一種含有甘露聚糖的組合物在制備用于延長(zhǎng)外源的因子VIII在血友 病患者體內(nèi)的半衰期的藥物中的應(yīng)用。
27、 一種含有甘露聚糖的組合物在制備用于降低外源的因子VIII在血友 病患者體內(nèi)的免疫原性的藥物中的應(yīng)用。
28、 根據(jù)權(quán)利要求24-27中的任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述含有甘 露聚糖的組合物還含有天然型的外源的因子VIII、和/或如權(quán)利要求1-14中 的任意一項(xiàng)所述的去糖基的因子VIII或其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠抑制可內(nèi)吞抗原的免疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)因子VIII(FVIII)的內(nèi)吞作用的化合物，以及該化合物在制備用于治療血友病的藥物中的醫(yī)藥用途，以降低FVIII的免疫原性和/或延長(zhǎng)FVIII的半衰期。
文檔編號(hào)A61K31/715GK101356193SQ200680048672
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者A·什圖魯, J·貝里, S·V·卡韋里, S·拉科魯瓦-德斯姆斯, S·達(dá)斯古普塔 申請(qǐng)人:Lfb生物科技公司;國(guó)家健康科學(xué)研究所(國(guó)家科技研究機(jī)構(gòu))