專利名稱：治療心房顫動的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類藥物和獸醫(yī)藥物的領(lǐng)域，并且具體涉及治療心血 管疾病的化合物，特別是，治療心房顫動的化合物。
背景技術(shù)：
心房顫動是最常見的心律失常并與實質(zhì)發(fā)病率和死亡率相關(guān)。其 發(fā)病率和流行性正在增加并意味著正在增加的臨床負擔和經(jīng)濟負擔(當前流行性為總?cè)丝诘?%)。除了諸如心悸、頭暈、呼吸困難及其它 的嚴重臨床癥狀以外，心房顫動是75歲以上人群中缺血性中風的單一 最重要的因素?？傮w上，心房顫動占醫(yī)院接納的心血管疾病的5%以上。 在約90%的病例中，心房顫動在存在例如高血壓性心臟病、充血性心 力衰竭或心臟瓣膜病的其它心臟病下發(fā)生。僅在10%的病例中，心房 顫動的確在沒有心臟異常的情況下產(chǎn)生("孤立的"心房顫動)。可區(qū)分三 種形式的心房顫動(l)陣發(fā)性心房顫動，其特征在于具有秒至天的持 續(xù)時間的自限性心房顫動的發(fā)作；(2)持續(xù)性心房顫動，其不確定地持 續(xù)直至經(jīng)醫(yī)藥干預(yù)而終止；(3)永久性心房顫動，其不能通過藥理復(fù)律 或電復(fù)律而終止。研究表明，心房顫動是由在心房附近隨機移動的多種再進入微電 波造成的。這些微波是由電觸發(fā)物引起的，所述電觸發(fā)物通常位于由左 心房延伸至肺靜脈近端5 cm至6 cm部分的心肌袖。 一旦心房顫動被觸 發(fā)，心房中影響負責心率失常持續(xù)性的其電性質(zhì)、機械性質(zhì)和代謝性質(zhì) 的變化就產(chǎn)生了(心房重構(gòu))。在心房顫動存在下，心室率控制被提高了， 并且如果不能用藥物治療來降^f氐速率控制，心室率控制導致心室擴張和 收縮功能的損傷，通常稱為心動過速性心肌病。中風和血栓栓塞是與心 房顫動相關(guān)的死亡和發(fā)病率的主要原因，其潛在的病理生理基礎(chǔ)是與血 流異常(例如心房阻塞)和內(nèi)皮損傷或心內(nèi)膜損傷相關(guān)的栓前狀態(tài)或高凝狀態(tài)。正如心臟病學的其它分科中，診斷和治療心率失常在過去的四十年 間已取得重大進展。盡管有許多的進步，真正治療心率失常和預(yù)防心律 失常猝死僅在少數(shù)患者中完成。目前，心房顫動療法包括減少心房顫動 相關(guān)征狀、預(yù)防血栓栓塞并發(fā)癥以及在適當時候終止該心律失常。通常有兩種處理心房顫動的方法a)處理心律失常自身和b)降低血栓 栓塞風險(參見MB. Iqbal " a/.， "Recent developments in atrial fibrillation (心房顫動的最新進展)"，British Medical Journal 2005， vol. 330， pp. 238-43)。處理心律失常包括心律控制(恢復(fù)和保持竇性心律)以及速率控 制。藥理學上，心律控制和速率控制是用抗心律失常藥物(I類和III類抗 心律失常藥劑)來處理的。目前使用的抗心律失常藥的實例有氟卡尼、普 羅帕酮、胺碘酮、多非利特、伊布利特以及心得怡。非藥理學地，心律 控制和速率控制是用電復(fù)律、基于心房的起搏治療、植入型心房除顫器、 射頻導管消融以及外科迷宮手術(shù)來處理的。降低血栓栓塞風險以及因此的中風預(yù)防在治療策略上是最重要的。 藥理學上，阿司匹林和華法林在大多數(shù)患者中被推薦以預(yù)防心房血栓形 成和血栓栓塞事件。高危患者試驗的集合數(shù)據(jù)表明，華法林在預(yù)防中風 上優(yōu)于阿司匹林，但用華法林的大出血風險是用阿司匹林的兩倍?？傊?， 抗凝處理需要基于年齡、并存病和禁忌癥單獨調(diào)整。非藥理學上，降低 血栓栓塞風險目前是通過除去左心耳處理或使用導管處理(方法在研究中)。最新研究已強調(diào)了藥理學上和非藥理學上的處理策略的新方法。最 有前景的藥劑是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和血管緊張素II受體阻 斷藥物。蛋白酶抑制劑、具有足夠選擇性和專一性的磷酸酶或抗氧化劑 也可提供新的治療策略以降低或逆轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)改變、心房擴張、以及收縮功 能障礙。然而，治療心房顫動的問題還遠沒有得到滿意的解決。發(fā)明概述發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)公知的藥物化合物群，即所述腺苷A2A受體拮抗劑， 可用于制備針對包括人類的哺乳動物的心房顫動的藥物。本發(fā)明源自令人驚奇的發(fā)現(xiàn)所述腺苷a2a受體存在于人類心房心肌細胞中并參與作為心房顫動基礎(chǔ)的病理機制。特別地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，作為質(zhì)膜中功能性物質(zhì)的所述同型二聚腺苷a2a受體物質(zhì)的表達在心房顫動患者內(nèi)上調(diào)。電生理學實驗已證實，這樣的患者的心房肌細胞中，腺苷a2a受體的活化導致以4丐波測量的自發(fā)肌漿網(wǎng)鈣釋放的蛋白激酶A介導的增加。此外，使用兩種不同實驗方法(共焦鈣成像和膜片鉗技術(shù))，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)腺苷A2A受體拮抗劑降低在心房顫動中發(fā)現(xiàn)的升高的鈣波頻率。的確，腺苷a2a受體拮抗劑不僅逆轉(zhuǎn)激動劑對鈣波的刺激作用， 而且降低基礎(chǔ)鈣波頻率。
一并考慮，這些結(jié)果提示，腺苷a2a受體介導的細胞內(nèi)釣通量的失調(diào)對纖維性顫動的心房的復(fù)雜電重構(gòu)起作用。這些事實佳腺苷A2A受體拮抗劑成為治療心房顫動的選擇性治療性藥劑。先前，并且作為最接近的研究，本發(fā)明人僅描述了來自心房顫動發(fā) 作的患者的分離的右心房肌細胞表現(xiàn)出比來自沒有該心律失常的患者的肌細胞更頻繁的自發(fā)肌漿網(wǎng)Ca"釋放(參見L. Hove-Madsen " a/., "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes (心房實貞動與來自人類心房 肌細胞中肌漿網(wǎng)的增加的自發(fā)釣釋放相關(guān))"，Circulation 2004, vol. September, pp. 1358-63)。因此，本發(fā)明涉及腺苦a2a受體拮抗劑在制備預(yù)防和/或治療包括 人類的哺乳動物的心房顫動的藥物中的用途。以下的"腺苦a2a受體 拮抗劑"將被稱為"a2a拮抗劑"而"腺苷a2a受體"則稱為"Am受 體"。本發(fā)明的這方面可以可選擇地表述為通過拮抗A2A受體而預(yù)防和 /或治療心房顫動的方法，所述方法包括給予有效量的a2a拮抗劑以及 合適量的可接受的稀釋劑或載體至需要其的哺乳動物(優(yōu)選人類)。相對于本領(lǐng)域公知的其它藥劑，使用a2a拮抗劑的優(yōu)點在于所述 a2a拮抗劑特異地靶向心房顫動患者。因此，功能性二聚a2a受體的表 達在具有正常心房尺寸且沒有心房顫動前史的患者中是低的，而該二 聚受體物質(zhì)的表達在患有心房顫動的患者中強烈地上調(diào)。相反，目前 使用的其它藥劑對調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)多種功能起關(guān)鍵作用的受體或通道更廣泛地起作用。因此，釣拮抗劑將不僅通過抑制L型4丐通道降低釣過載， 而且降低心臟收縮性。此外，L型鈣電流還調(diào)節(jié)平滑肌功能以及分泌細胞， 因而具有不希望的鈣拮抗劑的副作用。A^受體腺苷是體內(nèi)全部代謝活性的細胞產(chǎn)生的噤呤核苷。腺苷通過四種已 鑒定的不同亞型的細胞表面受體(A,、 A2A、 A2B和A3)發(fā)揮其作用，所述 受體屬于G蛋白偶聯(lián)的受體超家族。A,和A"禺聯(lián)抑制性G蛋白，而A2A和A2B偶聯(lián)刺激性G蛋白。A2A受體主要發(fā)現(xiàn)于大腦，發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞兩者內(nèi)(在紋狀體和伏核中具有最高水平，在嗅球和下丘腦與 海馬區(qū)具有中高水平)。在紋狀體中，所述A2A受體調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋 》文和功能(參見H. Kase & a/. "Progress in pursuit of therapeutic A2a antagonists: the adenosine A2a receptor selective antagonist KW 6002: research and development toward a novel nondopaminergic therapy for Parkinson's disease (尋求治療性A2A拮抗劑的進展腺苷A2A受體選擇性 拮抗劑KW 6002:新的治療帕金森病的非多巴胺能療法的研究與開 發(fā))"，Neurology 2003. vol. 61. pp. 97-100)。在外周組織中，已知A2a受體 存在于血小板、中性白細胞、脾、胸腺、內(nèi)皮和血管平滑肌細胞中，在 其中引起強有力的允許對冠心病患者的心肌灌注進行評估的冠狀血管舒 張(參見Z. Gao & a/" "Novel short-acting A2a adenosine receptor agonists for coronary vasodilatation: inverse relationship between affinity and duration of action of A2A agonists (新的冠狀血管舒張的短效A2A腺苷受體激動劑在 A2A激動劑的親和性與作用持續(xù)時間之間的負相關(guān))"，J. Pharmacol. Exp. 1te2001,vo1. 298, pp. 209-18)。然而，直到現(xiàn)在A2A受體也從未在人類 心房心肌細月包中定4立。治療心房顫動的合適的化合物通常，拮抗劑是與所述受體結(jié)合而不活化所述受體的分子。它與所 述內(nèi)源配體或底物竟爭所述受體上的結(jié)合位點，并因此抑制所述受體轉(zhuǎn) 導應(yīng)答內(nèi)源性配體結(jié)合的細胞內(nèi)信號的能力。拮抗劑以幾種方式起作用。其可以以足夠的親和性和專一性與腺苦結(jié)合或螯合，以基本上干擾、阻斷或以其它方式防止腺苷與所述A2A受體結(jié)合，從而抑制(inhibiting)、壓 制(suppressing)或造成所述腺苷介導的生物學活性的停止。在心肌細胞中且不存在內(nèi)源配體的A2A受體表現(xiàn)出基礎(chǔ)活性。該活 性可歸因于所述受體的組成性活性或內(nèi)源腺苷對所述受體的活化。在這 種情況下，可通過使用拮抗劑或反向激動劑P爭低該基礎(chǔ)活性而完成心房顫動的治療。本發(fā)明的一些A2A拮抗劑可展示反向激動作用。根據(jù)所述A2a受體的已知的定位和功能，到現(xiàn)在為止，A2A拮抗劑已用于對抗帕金森和其它CNS疾病(精神分裂癥、如阿爾茨海默病中的老年 癡呆、器質(zhì)性精神病等)。其中主要的是帕金森病。每種A2A拮抗劑都涉及用于本發(fā)明目的的用途。已經(jīng)深入研究了作為A2A拮抗劑的很多不同的化合物，所述化合物可分為兩大家族黃噤 呤書f生物和非黃噤呤雜環(huán)。在本發(fā)明的特別實施方案中，所述A2A拮抗劑是黃嘌呤衍生物或其藥物可接受的鹽。不同位置的不同取代基，及脫偶氮或偶氮類似物或者 所述噤呤環(huán)或者三或四元環(huán)衍生物/類似物的其它雜環(huán)類似物，可具有相似的A2A拮抗劑活性。在黃噤呤衍生物中， 一些化合物共有的優(yōu)選結(jié)構(gòu)是1,3，7-三烷基-8-苯乙烯基-黃噤呤結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實施方案中，所述A2A 拮抗劑是選自以下的化合物可可堿，所謂的DMPX (式1); KF 17837 (式 2);伊曲茶堿(istradefylline)，所謂的KW 6002 (式3);對-磺基苯乙烯基 -DMPX(式4); BS-DMPX(式5); MSX-2 (式6); CSC (式7);黃噤呤氨 基同源物(XAC，式8);以及MSX-3。在更優(yōu)選的實施方案中，所述A2A拮抗劑是KW 6002。該化合物目 前在帕金森病的三期臨床試驗中。在另一優(yōu)選實施方案中，所述Am拮 抗劑是MSX-2。在另一優(yōu)選實施方案中，所述A2A拮抗劑是MSX-3、 MSX-2的磷酸酯、MSX-2的前藥。已知表現(xiàn)A2A受體拮抗劑活性的其它黃嘌呤化合物在例如US 5484920、 US 5587378、 US 5543415和EP 1016407A1中描述。在本發(fā)明的另 一特別實施方案中，所述A2A拮抗劑是非黃嘌呤雜環(huán)。典型的非黃噤呤腺苷A2A拮抗劑可衍生自腺噤呤并代表最廣泛意義的腺噪呤衍生物，其包括帶有不同取代基的單環(huán)、二元環(huán)、三元環(huán)和四元環(huán)的化合物。已鑒定不是4汙生自腺嘌呤的具有A2A拮抗劑活性的另外的雜環(huán)化合物。已知表現(xiàn)出A2A受體拮抗性的一些2-氨基吡咬化合物(例如WO 02/14282、 WO 01/25210),并且還已知一些9-氨基嘧咬化合物(例如 US 2001/0027196)。在優(yōu)選實施方案中，所述A2A拮抗劑選自SCH 58261 (式9); ANR-82 (式10); ZM 241385 (式11); SCH 63390 (式12), CGS 15943 (式13), 8FB-PTP (式14); VER-6623 (還被稱為V2006，式15); (-)R,S-曱氟喹(式 16);以及7FB-PTP(式17)。在更優(yōu)選的實施方案中，在非黃嘌呤化合物 中的所述A2A拮抗劑是VER-6623。其它優(yōu)選作為A2A拮抗劑的化合物是式18的吡唑并嘧啶 (pyrazolopyrimidine)書f生物；式19的三峻并全鬼淋(triazoloquinoxaline) 衍生物；式20的9-取代的2-氨基-6-呋喃基-腺噤呤衍生物；以及式21、 22和23的三哇并三p秦(triazolotriazine)書1"生物。<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 0</formula>其它三唑并嘧咬A2A拮抗劑/〉開于例如WO 2004/029056、 WO 95/01356、 US 5565460、 WO 97/05138、 WO 98/52568、 WO 01/92264以 及PCT/US02/32630。具體地，取代的吡唑[4，3-e]-l,2,4-三唑-[l,5-c]嘧咬化 合物/>開于WO 2005/054245、 US 2004/220194以及US 2003212059。合適的A2A拮抗劑的其它具體實例包括公開于以下專利、專利申請和文章的化合物WO 95/01356、 US 6630475、 US 5935964、 WO 03/032996、 WO 03/048165 、 WO 03/048164、 WO 03/048163 、 WO 2005/042500、 WO 2005/058883、 WO 2005/040151、 WO 2005/039572、 WO 2004/092177、 US 2004138235、 WO 2004/019949、 WO 02/14282、 WO 2004/016605、 WO 03/082873、 US 5484920、 US 5703085、 WO 92/06976、 WO 94/01114、 US 5565460、 WO 98/42711、 WO 00/7201、 WO 99/43678、 WO 99/26627、 WO 01/92264、 WO 99/35147、 WO 00/13682、 WO 00/13681 、 WO 00/69464、 WO 01/40230、 WO 01/02409、 WO 01/02400、 EP 1054012、 WO 01/62233、 WO 01/17999、 WO 01/80893、 WO 02/14282、 WO 01/97786、 WO 01/16134、 WO 00/73307、 US 2005043315、 US 2003149060、 Baraldi & a/" "Recent developments in the field of A2a and A3 adenosine receptor antagonists (在A2A和A3腺苦受體拮抗劑領(lǐng)域的最新進 展)",European Journal of Medicinal Chemistry 2003, vol. 38, pp. 367-82; E. 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至
所 描述的基于放射配體結(jié)合分析的方法。治療心房顫動優(yōu)選所述A2A拮抗劑對A2A受體具有選擇性。所有上述A2A拮抗劑對所述A2A受體都是具有選擇性的，但其中的選擇性程度是不同的。所述選擇性在不同物種(例如大鼠，人類)之間也會有些不同。所述A2A拮抗劑通過如引用的專利和申請中所述的已知方法制備。藥物組合物與給藥在治療方面，有效量是指足以影響有益的或所需的臨床結(jié)果的活性成分的量，所述有益的或所需的臨床結(jié)果是減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)或減i曼所述疾病或癥狀的進展，或以其它方式減少所述疾病或癥狀的病理后果。所述有效量通常是由醫(yī)師基于個別病例而確定。雖然根據(jù)本發(fā)明用于療法的所述活性化合物可以未加工的化學化合 物的形式給藥，但優(yōu)選可選擇地以生理可接受的鹽的形式，以連同一種 或多種佐劑、賦形劑、載體、緩沖液、稀釋劑和/或其它常用的藥物輔料 的藥物組合物引入所述活性成分。所述組分可通過任何可接受的具有相 似效用的藥劑給藥模式(包括直腸、口腔、鼻內(nèi)和透皮途徑)單劑量或多劑 量地給藥，所述給藥模式通過動脈內(nèi)注射、通過靜脈、 內(nèi)、腸胃外、 肌內(nèi)、皮下、口月l、局部、作為吸入劑、或者經(jīng)諸如支架或例如插入動 脈的圓柱形聚合物的浸漬或包被裝置。一種優(yōu)選的給藥模式是腸胃外，特別是通過注射。通過注射的給藥 形式包括水或油的混懸劑或乳劑，以及無菌水溶液劑?？诜o藥是另一 優(yōu)選給藥途徑。所述藥物組合物可以是以片劑、丸劑、粉劑、酏劑、混 懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、煙霧劑、膠嚢劑等形式。者給藥后提供快速的、持續(xù)的或延時的所述活性成分的釋放。口服給藥 的控釋藥物遞送系統(tǒng)包括包含包被聚合物的^存器或藥物聚合物基質(zhì)配 制物的滲透泵系統(tǒng)以及藥物溶出系統(tǒng)。用于本發(fā)明所述方法的另 一配制 物使用透皮遞送裝置("貼劑")。這樣的透皮貼劑可用來提供控量的所述 化合物的連續(xù)或不連續(xù)的注入。所述組合物優(yōu)選以單位劑量形式配制。該劑量取決于疾病的性質(zhì)和 嚴重性并且是在該醫(yī)師的判斷力內(nèi)確定。除非另外定義，本文使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普 通技術(shù)人員通常所理解的具有相同含義。貫穿本說明書和權(quán)利要求書，詞語"包括(comprise)"及其諸如"包括(comprising)"的變體不是為了排 除其它技術(shù)特征、添加劑、組分或步驟。本申請的摘要在此并入。本發(fā) 明的另外目的、優(yōu)點和特征在研究本說明書后將對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見或者可通過實施本發(fā)明而認識到。以下實施例和附圖是通過舉 例而提供，并且并非旨在限制本發(fā)明。附圖簡述

圖1:在心房顫動患者中的A2A受體表達的上調(diào)。圖2: A2A受體激動劑刺激包括在心房顫動患者內(nèi)自發(fā)肌漿網(wǎng)鈣釋i文的依賴PKA的增加。圖3: A2A拮抗劑降低心房顫動患者中自發(fā)肌漿網(wǎng)鈣的基礎(chǔ)釋放。實驗顯示鉗制電位為-80 mV下的自發(fā)INCX。
具體實施方式
附圖詳細說明圖1A表示剛剛分離的人類右心房肌細胞，其用抗A2a受體(第1、4、 7和IO幅)和抗肌球蛋白(第2幅)、抗a-輔肌動蛋白(第5幅)、抗連接 蛋白-43(第8幅)或抗RyR(第ll幅)雙重染色。所述雙重免疫焚光圖像 (第3、 6、 9和12幅)的疊印揭示了所述A2A受體與a-輔肌動蛋白的共定 位以及A2A受體與所述蘭尼堿受體RyR的重疊分布。圖1B顯示來自瞬時 轉(zhuǎn)染的具有人類A2a受體的HEK細胞的細胞膜(陽性對照，C+)以及由具 有竇性心律(SINUS)或心房顫動(AF)的個體獲取的人類心房心臟膜，所述 膜由SDS-PAGE解析并使用兔抗A2A受體抗體而進行免疫印跡。"雙"意 指二聚體而"單，，意指單體。圖1C顯示圖1B的免疫印跡的相對密度計掃描(RDS)。 A2A受體(單體加二聚體)的總量以黑條顯示。A2A受體單體(白條)和二聚體(灰條)的相對量使用每一道中的A2A受體(二聚體加單體)的總 和而標準化。在圖2A中，記錄所述膜電位鉗制于-80mV下，心肌細胞暴露于200 nM的CGS 21680之前(對照)、之中(CGS)和之后(清洗，W)的自發(fā)lNcx。 水平和垂直定標線條分別對應(yīng)于30 s和100 pA。圖2B顯示CGS 21680 對自發(fā)Na-Ca交換電流數(shù)量(以每30 s掃描的事件計，e/s)的刺激作用的 時間曲線。條狀物上的粗線表示應(yīng)用CGS 21680的時段。圖2C顯示所述 A2A拮抗齊U ZM 241385 (1 pM)如何能夠回復(fù)200 nM CGS 21680對自發(fā) Incx的刺激作用。水平和垂直定標線條分別對應(yīng)于30s和100pA。圖2D是來自8例未患有心房顫動的對照患者和11例患有心房顫動的患者的心 肌細胞中CGS作用的小結(jié)。使用配對t檢驗來評價CGS 21680的作用并 且p值在條狀物上面給出。IncxF是指Incx頻率。圖2E表明加入10|liM H-89消除了 5例患者中200 nMCGS 21680的刺激作用。ANOVA顯示所 述處理對波頻率的顯著作用(p-0.001)并且后測給出CGS比對照的 p=0.03、 CGS比CGS+H-89的p=0.002和CGS+89比對照的p=0.05。在圖3A中，所述A2A拮抗劑SCH 58261 (50 nM)引起心房顫動患者 樣本中所述自發(fā)Incx頻率的可逆降低。水平和垂直定標線條分別對應(yīng)于 30 s和100pA。在圖3B中，A2A拮抗劑降低了由共焦釣成像(左幅，n=6) 或膜片鉗技術(shù)(右幅，n-7)兩者測量的所述自發(fā)鈣波頻率(WF)。 50 nM 的ZM 241385和SCH 58261的作用是可比較的并被合并。對共焦實驗使 用非配對t檢驗以及對膜片鉗實驗使用配對t檢驗的統(tǒng)計學顯著性在條 狀物以上給出。人類右心房內(nèi)A,A受體的表達和定位通過免疫印跡研究人右心房心肌細胞內(nèi)A2A受體的存在。結(jié)果表明A2A受體存在于右心房中，并且所述受體的單體物質(zhì)和二聚物質(zhì)兩者 都在該組織中表達，所述A2A受體在來自竇性心律心房的樣本中是占 少數(shù)的二聚形式。A2A受體在心房心肌中的定位通過共焦顯微術(shù)在用 抗所述受體A2a和抗肌球蛋白、a-輔肌動蛋白、連接蛋白-43或所述RyR 的抗體雙重標記的樣本中進行研究。所述A2A受體按沿所述心肌纖維 的橫向帶型而表達并與所述細胞骨架相關(guān)蛋白a-輔肌動蛋白在肌節(jié)的Z線水平下共定位。A2a受體的分布在來自患有及未患有心房顫動的患 者的樣本內(nèi)定性地相似。在患有心房顫動的患者中A，A受體表達的上調(diào)分離的心房肌細胞保持所述A2A受體帶型以及與a-輔肌動蛋白的定 居和與心房組織樣本中可見的RyR的重疊分布(參見圖1A)。在來自患有 和未患有心房顫動的患者的心肌細胞中未發(fā)現(xiàn)受體定位的不同(數(shù)據(jù)未顯 示)。通過Western印跡測量的A2A受體蛋白水平在患有心房顫動的患18者中顯著提高(參見圖lB-困1C)，并且有趣地，存在于所述細胞表面上的功能性形式的所述二聚a2a受體物質(zhì)在心房顫動中顯著增加(參見圖1C)。在血管中未發(fā)現(xiàn)顯著不同。因此，這些結(jié)果不僅第一次證明 A2A受體在人類心房肌細胞中的表達，還證明其主要以所述同型二聚 形式在患有心房顛動的患者中的上調(diào)。A7A受體的激動劑刺激在患有心房顫動的患者中引起自發(fā)肌漿網(wǎng)(SR) 4丐釋》文的依賴PKA的增力口在來自竇性心律患者以及患有心房顫動的患者的分離的心房肌細 胞中分析A2A受體激動劑對自發(fā)S R鉀釋放的作用。對局部非傳播4丐釋 放(鉤火花)以及來自所述SR的再生鈣釋放(鉤波)均進行分析。與所述A2A 受體激動劑CGS 21680 (200 nM)的預(yù)賻育增加了患有心房顫動的患者中 的鈣波數(shù)但不增加未患有所述心律失常的患者中的鈣波數(shù)。為了確定CGS 21680對自發(fā)SR釣釋放的作用對于對所述膜電位的 作用是否是次級的，使用膜片鉗技術(shù)以將所述膜電位鉗制在-80 mV。 這并不阻止CGS 21680可逆地增加作為由其活化的Na-Ca交換電流(Ijsrcx) 而測量的自發(fā)4丐波數(shù)(參見圖2A和圖2B)。的確，此方法證實了心房顫動 患者內(nèi)CGS 21680的顯著刺激作用(參見圖2D)。因此，由CGS 21680引 起的增加的自發(fā)SR鉤釋放是由于所述RyR活性的依賴a2a受體的調(diào)節(jié)。 CGS 21680的特異作用由所述兩種選擇性a2a拮抗劑ZM 241385 (參見圖 2C)和SCH 58261而逆轉(zhuǎn)。由于a2a受體偶聯(lián)Gs蛋白，激動劑介導的受體活化應(yīng)當增加cAMP 水平，這將依次導致PKA活化和RyR磷酸化。為了檢驗Am受體是 否經(jīng)PKA的依賴cAMP的活化而發(fā)揮其作用，4吏用所述選擇性PKA 抑制劑H-89。 CGS 21680在來自患有心房顫動的患者的肌細胞的刺激作 用被H-89消除了(參見圖2E)，證實自發(fā)SR釣釋放的依賴AM受體的調(diào) 節(jié)事實上是由PKA活化介導的。有趣地，H-89不僅消除了 CGS 21680 的作用，事實上，還使自發(fā)鈣釋放減少到比應(yīng)用CGS 21680之前記錄的 基線顯著更低的水平。用共焦顯微術(shù)對鈣火花與鈣波的分析證實了 A2A 受體介導的自發(fā)鉤釋放的PKA依賴性。A7A受體阻斷減少基礎(chǔ)自發(fā)SR鈣釋放人類心房肌細胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP張力在所述L型鈣電流的神經(jīng)激素調(diào) 節(jié)的研究中被主張。本發(fā)明人的觀察結(jié)果，即PKA阻斷劑H-89將所述 鈣波頻率降低至基線水平以下，進一步提示在人類心房肌細胞中存在依 賴A2a受體的J^出cAMP張力。與此觀點一致，應(yīng)用于顯示升高的基 礎(chǔ)SR鈣釋放的來自心房顫動患者的細胞的A2A受體選擇性拮抗劑 SCH 58261或ZM 241385顯著降低由共焦顯微術(shù)或膜片鉗技術(shù)測量的所 述釣波頻率(參見圖3)。人類樣本在本研究中使用來自經(jīng)歷心臟手術(shù)的總共54例患者的心臟組織樣 本。盡管所述心房組織樣本是由通常會在手術(shù)期間棄去的組織組成的， 但仍從每例患者獲得在本研究中使用的許可。本研究是由圣波醫(yī)院(Sant PauHospital)(巴塞羅那，西班牙*理委員會批準的。所述54例患者中的17例有心房顫動史而剩余的患者沒有這種心律 失常。25例患者不患有心房顫動但確實有左心房擴張(左心房直徑〉40 mm)。用于具體實驗序列的患者數(shù)在合適處標明。將采用Ca^拮抗劑治 療的患者從本研究中排除。未發(fā)現(xiàn)顯著影響所述所測量參數(shù)的其他患者 藥物治療。為免疫組織化學分析，總共8例患有心房顫動的患者(左心房 直徑53.8 ± 6.8 mm)和15例沒有心房擴張并且沒有心房顫動史的患者(左 心房直徑36.5 ±3.4 mm)作為對照。抗體使用以下第一抗體兔親和純化的抗A2A受體多克隆抗體VC21-Ab，其針對與A2A受體的第二細胞外環(huán)相應(yīng)的肽而開發(fā)；兔抗A2A受體抗體(Clone PA1誦042， Affinity BioReagents， Golden, CO, U.S.A.);小鼠抗慢肌月幾 球蛋白抗體(Clone NOQ7.5.4D， Chemicon International, Temecula， California, U.S.A.);小鼠抗a-輔肌動蛋白抗體(Clone EA-53, SigmaAldrich Chemical Co., St. Louis， MO, U.S.A.);小鼠抗連接蛋白-43抗體(Clone 2,Transduction Laboratories, Lexington, KY, U.S.A.);小鼠抗蘭尼減受體抗體 (Clone C3-33, Calbiochem, San Diego， California, U.S.A.)。使用的第二抗體 為ALEXAFLUOR488⑧偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG (1/1000)、 TEXAS RED 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG (1/2000) (Molecular Probes， Eugene, OR， U.S.A.)、辣 根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG (1/60000) (Pierce Chemical Co., Rockford， IL， U.S.A.)和兔抗小鼠IgG (1:2000) (Dako， Glostrup, Denmark)。肌細月包分離如前所述由人類心房組織樣本分離肌細胞(參見L. Hove-Madsen & a/" "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes (心房顫動 與來自人類心房肌細胞中肌漿網(wǎng)的增加的自發(fā)鉤釋放相關(guān))"，Circulation 2004， vol. 110， pp. 1358-63)。簡言之，將所述樣本漂洗，在含有30 mM 丁 二酮單肝(BDM)的不含釣的溶液中切成小片，以M含有0.5 mg/ml膠原 酶(Worthington type 2(2型)，318 u/mg)和0.5 mg/ml蛋白酶(Sigma type XXIV(XXIV型)，11 u/mg solid(固體))的不含Ca2+的溶液中在35。C下孵 育。45分鐘后，將該組織從所述酶溶液中移除并且用巴斯德移液管將細 胞在不含Ca"的溶液中分軟。所述剩下的組織在含有0.4 mg/ml膠原酶的 新鮮的不含釣的溶液中消化3x15分鐘。含有分歉的細胞的溶液在600 rpm下離心lmin，在不含4丐的溶液中重懸，然后將鈣逐漸增加至1 mM。 實驗4又z使用具有清晰橫紋且沒有肉芽形成的伸長的細胞。陽性對照細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM, Sigma Aldrich Chemical Co.) 中生長HEK-293細胞。通過磷酸鉤沉淀，用編碼人類A2A受體的DNA 瞬時轉(zhuǎn)染細月包(參見M. Canals & a/. "Adenosine A2A-dopamine D2 receptor-receptor heteromerization: qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy transfer (腺苦Aw多巴胺D2受體-受體異聚化通過熒光和生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移的定性和定量評價)"，J. Biol. Chem. 2003， vol. 278, pp. 46741-9)。在轉(zhuǎn)染后24小時或48小時收獲所述細胞。自發(fā)SR鈣釋放使用激光掃描共焦顯微鏡(Leica TCS SP2 AOBS, Germany)檢測在加 入fluo-3的細胞中的鉤火花和鉤波。所述實驗溶液含有(按mM): NaCl 136、 KC14、 NaH2PO40.33、 NaHC03 4、 CaCl22、 MgCl21.6、 HEPES 10、 葡萄糖5、丙酮酸5， (pH = 7.4)。在500 nm至650 nm收集在488 nm下 激發(fā)的衰減至1%至5%的熒光發(fā)射物。以1 kHz的掃描速率在2 x 10.24 s 期間測量靜息狀態(tài)下鉤火花和釣波。釣火花作為經(jīng)所述鈣火花中心的3 pm切片的信號團的增加而被檢測，但在相鄰的3 pm切片沒有任何可檢 測到的增加。在兩或更多相鄰的3 pm切片的所述信號團的增加計作釣波。 每一鈣火花的幅度及其半衰期是由所述鈣火花瞬時的衰減期的指數(shù)擬合 確定的。對每一細胞確定所述鈣火花頻率并將該頻率標準化為所述掃描 的細胞長度。膜片鉗使用軟件控制的膜片鉗放大器(EPC 10， HEKA, Germany)將與鈣波有 關(guān)的所述瞬時向內(nèi)的Na-Ca交換電流記錄在所述穿孔膜片結(jié)構(gòu)中。所述 移液管電阻是1.5 MQ至4 MQ。實驗是在室溫下進行并且在所述接入電 阻是穩(wěn)定的且已降至小于5倍所述移液管電阻時開始。所述細胞外溶液 含有(按mM》NaCl 127、四乙銨(TEA) 5、 HEPES 10、 NaHC03 4、 NaH2P04 0.33、葡萄糖10、丙酮酸5、 CaCl22、 MgCl2 1.8, (pH = 7.4)。所述移液 管溶液含有(按mM):天門冬氨酸109、 CsC147、 Mg2ATP3、 MgCl2l、 磷酸肌酸二鈉5、 Li2GTP0.42、 HEPES 10以及250 jig/ml兩性霉素B, (pH = 7.2)。將所述A2A受體激動劑CGS 21860、拮抗劑ZM 241385和SCH 58261、以及蛋白激酶A抑制劑H-89全部溶于DMSO中并作為10 mM 的儲備溶液而保存?？舍尫趴Х纫虻腟R鈣含量是通過將細胞瞬時暴露于 10 mM咖啡因而測量的。假定所述Na-Ca交換器的化學計量關(guān)系為 3Na+: 1 Ca2+,將所得Na-Ca交換電流的時間積分轉(zhuǎn)化為由所述SR釋;^文的 鉤的pmole(10'18 mol)。豸史據(jù)分析和統(tǒng)計在不知道所述患者的臨床數(shù)據(jù)的情況下進行電生理學和共焦鈞成像實驗。對來自相同患者的細胞內(nèi)記錄的所述Ca"火花和Ca"波取平均值。 除非另外說明，來自每一患者的平均值用于統(tǒng)計分析并且表達為平均土標 準誤。對數(shù)據(jù)集檢驗正態(tài)性。當檢驗特異作用時，使用t檢驗來評價顯著 性差異。ANOVA用于比較多種作用而q檢驗后測用于評估特異作用的顯 著性。膜制備在含有5 mM Tris-HCl (pH 7.4，緩沖液A)的0.32 M蔗糖冰冷溶液中， 用Polytron勻漿器(Kinematica， PTA20TS轉(zhuǎn)子，設(shè)置5，三個15 s時段) 石皮碎細胞之后通過離心得到膜。通過在4。C、 1000xg下(3500rpm，采用 75Ti型轉(zhuǎn)子)離心30min而分離細胞碎片。所述上清液在4。C、 26000 x g 下(20000 rpm，采用75Ti型轉(zhuǎn)子)離心30 min并且沉淀物在i復(fù)沖液A中 重懸，37°C下孵育30 min以及在相同條件下離心。沉淀物在0.3 M KC1 中重懸，在4。C下攪拌過夜，在4°C 26000 x g下(20000 rpm，采用75Ti 型轉(zhuǎn)子)離心30 min并如上所述用緩沖液A清洗一次。最終的沉淀物(膜 碎片)在50 mM的Tris-HCl中重懸并在-80。C下冷凍。如前述所述(參見 C. Herrera, ef a/" "Adenosine A2b receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells(在淋巴細胞和培養(yǎng)細胞中腺苷A2B受體表現(xiàn)為細胞表面腺苷 脫氨酶的可選錨定蛋白)"，Mol. Pharmacol. 2001， vol. 59， pp. 127-34)獲得 來自轉(zhuǎn)染的HEK細胞的膜上清液。通過雙金雞寧酸法對蛋白定量(Pierce Chemical Co.)。凝膠電泳和免疫印跡通過在37°C加熱2 h用SDS-PAGE樣本緩沖液(8 M尿素，2% SDS, 100 mM DTT, 375 mM Tris， pH 6.8)處理來自人類細胞或瞬時轉(zhuǎn)染的HEK 細胞的膜并將其通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在10%凝膠中解析。使用 半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜并且用所述標明的抗體和隨后的辣23根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG (1/60000)將其免疫印跡。使用化 學發(fā)光的才企觀'j試劑盒(SuperSignal， West Pico Chemiluminiscent substrate, Pierce)顯影免疫反應(yīng)性條帶。免疫染色為免疫組織化學，將人類心房組織包埋于OCT中并在液氮冷卻的異 戊烷中冷凍。在冷卻至18。C的低溫恒溫器中切8微米切片。將切片收集 至SUPERFROST PLUS (BDH Chemicals Ltd.， Poole， United Kingdom)載 玻片上、空氣干燥并在-70。C儲存。為免疫熒光，將切片在溶于Tris緩斷30 min。用親和純化的抗A2A受體(VC21， 25 jxg/ml)以及用抗a-輔肌動 蛋白(1:500稀釋)、抗肌球蛋白(2 pg/ml)、抗連接蛋白-43 (2.5 pg/ml)和抗 蘭尼堿受體(6.5iig/ml)在室溫下孵育所述載玻片1小時，然后在TBS中 清洗3次持續(xù)10 min。將ALEXA FLUOR 488 偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG 和TEXAS RED⑧偶聯(lián)的山羊抗兔IgG應(yīng)用于以1:2000稀釋的阻斷液。漂 洗切片并用VECTASHIELD⑧免疫熒光培養(yǎng)基(Vector Laboratories Inc.， Burlingame， CA, U.S.A.)將其固定。為免疫細胞化學，將新分離的人類心 肌細胞接種于包被多聚D-賴氨酸的24 mm玻璃蓋玻片中。粘附后，在磷 酸鹽緩沖液中漂洗分離溶液細胞并在室溫下用溶于PBS的2%低聚曱醛 固定20 min。用PBS清洗細胞并用0.1 M甘氨酸孵育5 min以淬滅所述 醛基基團。用PBS清洗之后，用溶于PBS中的0.2% Triton-X-100可滲透 化處理肌細胞15min。然后用PBS清洗細胞，在室溫下用10%的馬血清 阻斷30min并用接下來的第一抗體兔多克隆抗A2a受體(10嗎/ml)、抗 oc-輔肌動蛋白(1:500稀釋)、抗肌球蛋白(1:500稀釋)和抗連接蛋白-43 (1:150稀釋)在室溫下孵育1小時，用PBS清洗3次并在其中用與ALEXA FLUOR 488⑧偶聯(lián)的抗小鼠抗體和/或與TEXAS 11￡0@偶聯(lián)的抗兔抗體染 色。最后，再將細胞漂洗3次并用VECTASHIEU^將其固定。用萊卡 TCS 4D共焦激光掃描顯微鏡(Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany)進行共焦顯樣M竟》見察。
權(quán)利要求
1.腺苷A2A受體拮抗劑在制備預(yù)防和/或治療包括人類的哺乳動物的心房顫動的藥物中的用途。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是黃嘌呤衍生物或其藥物可接受的鹽。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述A2A拮抗劑選自具有下式 的化合物的化合物<formula>formula see original document page 2</formula>
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是還被稱為 KW 6002的式(3)的化合物。
5. 如權(quán)利要求3所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是還被稱為 MSX-2的式(6)的化合物。
6. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是權(quán)利要求3 定義的式(6)的化合物的磷酸酯。
7. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是吡唑并嘧咬 衍生物。
8. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是三唑并喹喔啉矛汙生物。
9. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是三唑并三。秦衍生物。
10. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是選自具有下式的化合物的化合物<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>
11.如權(quán)利要求IO所述的用途，其中所述A2A拮抗劑是還被稱為VER-6623的式(15)的4匕合物。
全文摘要
腺苷A_2A受體拮抗劑可用于制備抗包括人類的哺乳動物心房顫動的藥物。已發(fā)現(xiàn)所述腺苷A_2A受體存在于人類心房心肌細胞中并參與作為心房顫動基礎(chǔ)的病理機制。使用A_2A拮抗劑相對于本領(lǐng)域公知的其它藥劑的優(yōu)點在于所述A_2A拮抗劑特異地靶向患有心房顫動的患者。
文檔編號A61K31/498GK101325956SQ200680046601
公開日2008年12月17日 申請日期2006年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者克里斯塔·穆勒, 卡門·路易斯比薩特, 弗朗西斯科·斯如拉阿爾費瑞茲, 拉斐爾·弗朗克費爾南德茲, 讓·辛卡庫斯庫洛拉, 雷夫·浩烏-馬德森 申請人:西瑪生物醫(yī)學信息公司