專利名稱：：更年期障礙預防·改善劑及功能性飲食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于獲得預防改善伴隨更年期發(fā)病的各種癥狀的作用的更年期障礙預防.改善劑及功能性飲食品。
背景技術(shù)：
：更年期障礙是指閉經(jīng)前后來自卯巢的女性荷爾蒙(雌激素)分泌量降低導致的身體.精神的癥狀不定的自訴癥狀。然后，隨著年齡的增長，開始出現(xiàn)皮膚老化、高血脂癥、骨質(zhì)疏松癥、腦功能降低等各種癥狀。針對上述癥狀，已知給與女性荷爾蒙的荷爾蒙補充療法(HRT)是有效的。但是，2002年7月，WHI(女性健康促進會，Woman'sHealthInitiative)發(fā)表的使用5年時的中間結(jié)果中，報道了給與雌激素導致的乳腺癌發(fā)生率增加等危險。因此，現(xiàn)在人們要求更安全的更年期治療。已知日本人的更年期障礙的癥狀比歐美人輕。有報導認為其原因與大豆或大豆發(fā)酵食品的攝取有關(guān)。即，一般認為是由于大豆所含的異黃酮具有雌激素樣活性。除大豆之外，攝取多種食物時均呈現(xiàn)出雌激素樣活性。作為攝取時呈現(xiàn)雌激素樣活性的植物，已知有芝麻、亞麻籽、杜仲等，實際上，市售有以上述植物為原料的添加劑(supplement)等。另夕卜,Milder等(IvonE丄Milderetal.，Br丄Nutr.,93，393-402(2005))報告了測定來自植物的各種食品中的4種木酚素(落葉松樹脂醇、松脂醇、開環(huán)異落葉松樹脂酚、羅漢松脂素(matairesinol))的含量的結(jié)果。迄今為止已有關(guān)于含有在攝取時呈現(xiàn)雌激素樣活性的木酚素的杜仲的更年期障礙諸癥狀改善效果的報告，在中藥大辭典、中華人民共和國藥典中記載有"具有補肝腎、強筋骨、安胎的效果，治療腰、3背酸痛、足膝虛弱(膝蓋麻痹)、殘余尿、女性的不正常出血、早流產(chǎn)、高血壓，，等。另外，在專利文獻l中具體給出了抗高血脂癥功能。木酚素之一的松脂醇二葡糖苷利用腸內(nèi)細菌的作用除去糖，經(jīng)由松脂醇、落葉松樹脂醇、開環(huán)異落葉松樹脂酚等，最終代謝為腸二醇(enterodiol)、腸內(nèi)酯(enterolactone),呈現(xiàn)雌激素樣活性(圖1)(Li-HuaXie,etal.，Chem.Pham.Bu11.51(5)508-515(2003))。但是，至今為止，幾乎仍未闡明何種細菌或細菌群具有代謝木酚素的活性以及各種代謝中間體的何種成分具有雌激素樣活性。通過攝取芝麻、亞麻籽、杜仲或以它們?yōu)樵系奶砑觿┧玫男Ч某潭纫蛉硕?。作為其原因之一，認為受到腸內(nèi)細菌群因各人而不同的影響。即，多數(shù)情況下，人攝取生藥時，該生藥所含的有效成分被腸內(nèi)細菌代謝.活化，呈現(xiàn)效果，但也有下述情況，即因腸內(nèi)細菌的種類和菌數(shù)的不同，有效成分不進行代謝活化，即使攝取也得不到其效果。因此，為了預防改善更年期障礙得到雌激素樣活性，與直接攝取植物中所含的木酚素相比，預先將木酚素代謝活化后進行攝取，可期待更高的效杲。另一方面，將木酚素進行化學轉(zhuǎn)化，選擇性地得到活性高的雌激素用活性中間體并不簡單。因此，一般認為為了得到更年期障礙的預防.改善作用，開發(fā)通過生物學的方法預先將木酚素代謝'活化的方法是有用的。本說明書中引用的參考文獻如下所述。下述文獻中記載的內(nèi)容均作為本說明書的一部分引用于此。這些文獻均不是針對本說明書的現(xiàn)有技術(shù)。專利文獻l:專利第3435415號公報非專利文獻l:IvonE丄Milderetal"Br丄Nutr.，93，393-402(2005)非專利文獻2:Li-HuaXieetal.,Chem.Pham.Bu11.51(5),508—515(2003)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供用于預防.改善更年期障礙有用的藥物和功能性飲食品。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)代謝木酚素能生成雌激素樣活性中間體，從而完成了本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明，提供一種制備雌激素樣活性中間體的方法，其特征在于將木酚素和嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)。優(yōu)選木酚素為松脂醇或杜仲樹脂酚。還優(yōu)選木酚素為杜仲木酚素。另外優(yōu)選雌激素樣活性中間體為開環(huán)異落葉松樹脂酚。其他方案中，本發(fā)明提供一種含有與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素作為有效成分的更年期障礙預防.改善劑以及更年期障礙預防改善用功能性飲食品。通過攝取與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素或通過同時攝取嗜酸乳桿菌和木酚素，可以預防或改善更年期障礙。本發(fā)明的更年期障礙預防.改善劑及含有該更年期障礙預防.改善劑的功能性飲食品以已經(jīng)被確認了其安全性的、被經(jīng)口攝取的木酚素作為有效成分，所以可以安全地經(jīng)口攝耳又。[圖l]圖l表示作為木酚素的一種的松脂醇.二葡糖苷經(jīng)腸內(nèi)細菌作用的假想代謝途徑。具體實施方式以下，更詳細地i兌明本發(fā)明。本發(fā)明的更年期障礙預防'改善劑含有通過與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)而被代謝.活化的木酚素作為有效成分，其效果比攝取代謝'活化前的木酚素高。作為木酚素，例如可以舉出杜仲木酚素、亞麻籽木酚素、芝麻木酚素等。優(yōu)選木酚素為杜仲木酚素。木酚素在嗜酸乳桿菌的作用下首先從木酚素糖苷轉(zhuǎn)化為苷元(aglucon)。進一步，松脂醇、杜仲樹脂酚被嗜酸乳桿菌代謝活化，轉(zhuǎn)化為各種雌激素樣活性中間體。本說明書中，所謂雌激素樣活性中間體包含下述兩種物質(zhì)該物質(zhì)本身具有雌激素樣活性的物質(zhì)，以及攝取后在生物體內(nèi)被進一步代謝轉(zhuǎn)化為具有雌激素樣活性的物質(zhì)的物質(zhì)。雌激素樣活性中間體包含落葉松樹脂醇和開環(huán)異落葉松樹脂酚等。本發(fā)明中優(yōu)選雌激素樣活性中間體為開環(huán)異落葉松樹脂酚。如下述實施例所示，本發(fā)明中可見木酚素被嗜酸乳桿菌代謝，生成雌激素樣活性中間體，并且該雌激素樣活性中間體實際上具有向雌激素受體結(jié)合的結(jié)合能。作為嗜酸乳桿菌的菌抹，沒有特別限定，例如可以舉出嗜酸乳桿菌CL-0062抹(獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號FERMBP-4980，保藏日1994年3月4日)、嗜酸乳桿菌L92林(獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號FERMBP-4981，保藏日1994年3月4日)等。嗜酸乳桿菌CL-0062抹具有以下的細菌學性質(zhì)。1.形態(tài)學性質(zhì)l)細胞的形狀桿菌、2)運動性無、3)有無孢子無、4)革蘭氏染色性陽性。2.生理學性質(zhì)l)過氧化氫酶陰性、2)吲哚生成陰性、3)硝酸鹽的還原陰性、4)對氧的態(tài)度兼性厭氧性菌、5)在15。C下生長無、6)利用均聚乳酸發(fā)酵由葡萄糖生成DL(-)乳酸，未產(chǎn)生氣體。7)各種碳水化物的分解性葡萄糖；+、乳糖；+、甘露糖；+、果糖；+;半乳糖；+、蔗糖；+、阿拉伯糖；-、麥芽糖；+、木糖；-、鼠李糖；-、纖維二糖(cellobiose);+、海藻糖；+、蜜二糖(melibiose);+、棉子糖；+、甘露醇；-、山梨醇；-、七葉苷；+、水楊苷；+、N-乙酰基葡糖胺；+、苦杏仁苷；+、龍月旦雙糖；+、4公三糖；-、糊4青；+、淀4分；-。嗜酸乳桿菌L92抹具有以下的細菌學性質(zhì)。1.形態(tài)學性質(zhì)l)細胞的形狀桿菌、2)運動性無、3)有無孢子無、4)革蘭氏染色性陽性。2.生理學性質(zhì)l)過氧化氬酶陰性、2)。引哚生成陰性、3)硝酸鹽的還原陰性、4)對氧的態(tài)度兼性厭氧性菌、5)在15。C下生長無、6)利用均乳酸發(fā)酵由葡萄糖生成DL(-)乳酸，未產(chǎn)生氣體。7)各種碳水化物的分解性葡萄糖；+、乳糖；+、甘露糖；+、果糖；+;半乳糖；+、蔗糖；+、阿拉伯糖；-、麥芽糖；+、木糖；-、鼠李糖；-、纖維二糖；+、海藻糖；+、蜜二糖；-、棉子糖；+、甘露糖；-、山梨糖；-、七葉苷；+、水楊苷；+、N-乙?；咸前?；+、苦杏仁苷；+、龍膽雙糖；+、松三糖；-、糊4青；-、淀粉；-。木酚素可以從芝麻、亞麻籽、杜仲等中容易地得到。作為木酚素，特別優(yōu)選杜仲木酚素。杜仲木酚素除可以使用杜仲的樹皮或葉的提取液或?qū)⑻崛∫哼m當分離、濃縮、精制等使用之外，還可以將該提取液或其濃縮物進行冷凍干燥、噴霧干燥等制成粉末進行使用。為了將木酚素和嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)，在含有木酚素的培養(yǎng)基中添加嗜酸乳桿菌的菌體，通常通過靜置或攪拌培養(yǎng)，例如在溫度25。C45。C下、優(yōu)選在30。C45。C下進行培養(yǎng)。木酚素例如可以以MeOH溶液等形態(tài)添加至終濃度為O.Ol-10mM。優(yōu)選將預先在MRS培養(yǎng)基、GAM培養(yǎng)基、乳培養(yǎng)基等中在37t:進行前培養(yǎng)2024小時的嗜酸乳桿菌菌體用作促酵物。初產(chǎn)菌數(shù)優(yōu)選為105-1(f個/ml左右。培養(yǎng)時間為3168小時，優(yōu)選為1296小時。乳酸酸度為1.5以上時可以停止培養(yǎng)。可以根據(jù)所用的菌種適當選擇好氧/厭氧條件。為了通過將木酚素與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)所得的木酚素代謝中間體呈現(xiàn)雌激素樣活性，代謝中間體必須與雌激素受體結(jié)合。雌激素受體結(jié)合能例如通過進行MCF-7細胞的增殖活性評價，或使用酵母進行雌激素受體分析進行調(diào)查。另外，為了調(diào)查木酚素代謝中間體對生物體的作用，將與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素經(jīng)口給與摘除了卵巢的更年期模型動物，以該動物的骨密度或血中膽固醇等為指標，確定其效果?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素調(diào)制成醫(yī)藥制劑，從而制得本發(fā)明的更年期障礙預防改善劑。例如，將與乳酸菌一起培養(yǎng)的木酚素與藥學上能允許的載體或介質(zhì)具體而言為滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、混懸劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味劑、賦型劑、載色劑、防腐劑、粘合劑等適當?shù)亟M合并混合，進行制劑化。用于經(jīng)口給藥時，可以制成片劑、丸劑、糖衣劑、膠嚢劑、液體制劑、凝膠、糖漿、糊劑、懸濁液等。本發(fā)明的更年期障礙預防改善劑除含有與乳酸菌一起培養(yǎng)的木酚素作為有效成分外，還可以含有其他具有更年期預防.改善效果的公知成分。本發(fā)明的更年期障礙預防改善劑的經(jīng)口攝取量，可以根據(jù)給藥時間或其繼續(xù)性等適當?shù)剡x擇，以得到所希望的效果。給藥量因年齡、體重、癥狀、治療效果、給藥方法、處理時間等而不同，通常成人每人在l次lmg1000mg的范圍，可以l日l次數(shù)次地進行給藥。需要說明的是，由于木酚素及乳酸菌均能食用，所以從安全性來看給藥量沒有限制。本發(fā)明的更年期障礙預防改善劑的給與可以在產(chǎn)生更年期伴隨的諸多癥狀之后進行，還可以在為了預防上述癥狀的期間內(nèi)持續(xù)每天給與或間歇地給與。本發(fā)明的其他方案中，提供了含有與乳酸菌一起培養(yǎng)的木酚素的功能性飲食品。本發(fā)明的功能性飲食品中，與乳酸菌一起培養(yǎng)的木酚素的配合比例可以根據(jù)功能性飲食品的形態(tài)或攝取持續(xù)性等適當選擇，沒有特別限定。作為上述功能性飲食品的形態(tài)，例如可以舉出酸奶、乳酸菌飲料等發(fā)酵乳制品、配合有發(fā)酵乳乳清、或其濃縮物等的各種加工飲食品、茶飲料、干燥粉末、片劑、膠嚢劑、顆粒劑等。上述功能性飲食品中可以添加糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、香味增強劑(flavor)或上述物質(zhì)的混合物等添加物。另外，還可以含有植物木酚素的提取液。本發(fā)明的功能性飲食品是含有本發(fā)明的更年期障礙預防.改善劑的食品及飲料，可以作為訴求預防或改善伴隨更年期諸癥狀的、例如特定的保健用食品等。本發(fā)明的功能性飲食品的攝取量和攝取時間沒有特別限定，例如，可以針對更年期障礙的各種癥狀，在必需改善效果的情況等之前持續(xù)或間歇地攝取、以及在上述情況出現(xiàn)之后持續(xù)地或間歇地攝取。明書的一部分引用于其中。另外，作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的申請即曰本專利申請2005-221984號說明書及附圖記載的內(nèi)容均作為本說明書的一部分引用于其中。實施例以下，參見實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。實施例1.嗜酸乳桿菌的木酚素代謝功能評價各種微生物的木酚素代謝功能。使用MRS培養(yǎng)基或GAM培養(yǎng)基在37。C下將下述表1-3所示的各種微生物前培養(yǎng)20-24小時，以1-3%植菌在10mlMRS培養(yǎng)基或GAM培養(yǎng)基中。添加杜仲木酚素(松脂醇或杜仲樹脂酚)直至培養(yǎng)基中的最終濃度為0.5mM,在37。C下繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)時地進行采樣，添加的木酚素被代謝轉(zhuǎn)化為開環(huán)異落葉松樹脂酚的情況可用HPLC定量地測定。50%以上的木酚素被轉(zhuǎn)化的試樣用O表示，幾乎未轉(zhuǎn)化的試樣用x表示。結(jié)果示于表l-3。[表l]表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表l-3可知，嗜酸乳酸菌具有由松脂醇生成開環(huán)異落葉松樹脂酚的能力。并且，表明至少這次測定的嗜酸乳酸菌的菌林具有由松脂醇生成開環(huán)異落葉松樹脂酚的能力。該結(jié)果表示嗜酸乳酸菌具有將木酚素代謝活化轉(zhuǎn)化為雌激素樣活性中間體的能力。實施例2.木酚素及其代謝產(chǎn)物與雌激素受體的結(jié)合在含有重組表達的人型雌激素受體cx或(3的pH7.4的10mM三羥曱基氨基曱烷緩沖液(TrisBuffer)(含有0.1。/。BSA、10%甘油、lmMDTT)中，使lmM試樣(松脂醇'二葡糖苷、松脂醇、開環(huán)異落葉松樹脂酚)和0.5nM的氚水平化的雌二醇在25度下反應2小時。反應結(jié)束后，回收洗滌受體，根據(jù)通常方法測定與受體結(jié)合的氚水平化的雌二醇量。以0.5nM卩H]雌二醇與受體結(jié)合的量為100。/Q，計算分別添加木酚素或代謝中間體時的卩H]雌二醇的結(jié)合度，用IOO減去該結(jié)合度得到的值為結(jié)合抑制率。結(jié)果示于下表。[表4]表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由以上結(jié)果可以確認，木酚素及其代謝產(chǎn)物具有與雌激素受體的結(jié)合能力。另外可知，實際上在嗜酸乳桿菌中，伴隨代謝為松脂醇'二葡糖苷—松脂醇—開環(huán)異落葉松樹脂酚，與雌激素受體的結(jié)合能力增強，開環(huán)異落葉松樹脂酚與松脂醇二葡糖苷相比，與松脂醇結(jié)合的結(jié)合抑制率較高，為10倍左右。由以上可知，木酚素被嗜酸乳桿菌代謝，通過之后發(fā)生的靶向基因表達而發(fā)揮各種作用，由此可期待能得到更年期障礙預防改善效果。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明對更年期障礙的預防改善有用。權(quán)利要求1、一種雌激素樣中間體的制備方法，其特征在于，將木酚素與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中，木酚素是松脂醇或杜仲樹脂酚。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其中，木酚素是杜仲木酚素。4、如權(quán)利要求l3中任一項所述的方法，其中，雌激素樣活性中間體是開環(huán)異落葉松樹脂酚。5、一種更年期障礙預防改善劑，其中，含有與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素作為有效成分。6、一種更年期障礙預防改善用功能性飲食品，其中，含有與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素作為有效成分。全文摘要本發(fā)明涉及通過將杜仲木酚素等木酚素與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)來制備開環(huán)異落葉松樹脂酚等雌激素樣活性中間體的方法。本發(fā)明還提供一種含有與嗜酸乳桿菌一起培養(yǎng)的木酚素作為有效成分的更年期障礙預防·改善劑以及更年期障礙預防·改善用功能性飲食品。文檔編號A61K35/74GK101253270SQ20068003218公開日2008年8月27日申請日期2006年7月27日優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日發(fā)明者中村憲夫,吉村千秋,增山明弘,服部征雄,高野俊明申請人:卡爾皮斯株式會社