專利名稱：：疫苗生產(chǎn)方法疫苗生產(chǎn)方法本發(fā)明涉及進行碳二亞胺縮合反應(yīng)的改進方法。具體地說，本發(fā)明涉及使用碳二亞胺縮合進行的糖和蛋白的綴合。本發(fā)明還涉及含本發(fā)明的糖-蛋白綴合物的可制備免疫原性組合物。在免疫學(xué)中將細菌莢膜多糖廣泛用于預(yù)防細菌疾病已有多年。但是，此應(yīng)用的問題在于免疫應(yīng)答的T非依賴性特性。因此，這些抗原在低齡兒童中的免疫原性差。此問題已通過將多糖抗原綴合至蛋白載體(T輔助表位源)得以克服，然后可使用該載體激發(fā)T依賴性免疫應(yīng)答，甚至在生命的第一年中也可以。本領(lǐng)域已知多種綴合4支術(shù)?？赏ㄟ^如在US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中所記載的直接還原性胺化法制備綴合物。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508?；蛘撸Y合法可借助1-氰基-4-二甲氨基吡啶鏡四氟硼酸鹽(CDAP)對糖的羥基的活化而生成氰酸酯。活化的糖由此可直接或經(jīng)間隔(連接)基偶聯(lián)至載體蛋白上的氨基。例如，氰酸酯可與己二胺或己二酸二酰肼(ADH或AH)偶聯(lián)，并使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學(xué)法經(jīng)蛋白載體上的羧基將氨基衍生化的糖綴合至載體蛋白上。這類綴合物描述于PCT公布申請WO93/15760UniformedServicesUniversity以及WO95/08348和WO96/29094。另參見ChuC.等，Infect.Immunity,1983245256。一般來說，蛋白載體上以下類型的化學(xué)基團可用于偶聯(lián)/綴合A)羧基(例如經(jīng)天冬氨酸或谷氨酸)，可使用碳二亞胺化學(xué)法將其與糖部分上的天然或衍生化氨基綴合；B)氨基(例如經(jīng)賴氨酸)，可使用碳二亞胺化學(xué)法將其與糖部分上的天然或衍生化羧基綴合；C)巰基(例如經(jīng)半胱氨酸)；D)羥基(例如經(jīng)酪氨酸)；E)咪唑基(例如經(jīng)組氨酸)；F)胍基(例如經(jīng)精氨酸)；和G)吲哚基(例如經(jīng)色氨酸)。在糖上，一般來說以下基團可用于偶聯(lián)OH、COOH或NH2。醛基可在本領(lǐng)域已知的不同處理(例如高^典酸鹽、加酸水解、過氧化氫等)之后產(chǎn)生。直接偶聯(lián)法糖-OH+CNBr或CDAP—氰酸酯+雨2-蛋白質(zhì)—綴合物糖-醛+NHr蛋白質(zhì)—席夫堿(Schiffbase)+NaCNBH3—綴合物糖-COOH+雨2-蛋白質(zhì)+EDAC—綴合物糖-麗2+COOH-蛋白質(zhì)+EDAC—綴合物經(jīng)間隔基(連接物)法直接偶聯(lián)糖-OH+CNBr或CDAP~>氰酸酯+NH2——NH2—糖——麗2+COOH-蛋白質(zhì)+EDAC—綴合物糖-OH+CNBr或CDAP—氰酸酯+NH2——SH—糖——SH+SH-蛋白質(zhì)(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或在例如通過SPDP修飾蛋白的氨基后獲得的天然蛋白)—糖-S-S-蛋白質(zhì)糖-OH+CNBr或CDAP—氰酸酯+NH2——SH—糖——SH+馬來酰亞胺-蛋白質(zhì)(氨基修飾)~>綴合物糖-COOH+EDAC+NH2——NH2—糖-順2+EDAC+COOH-蛋白質(zhì)—綴合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH—糖-SH+SH-蛋白質(zhì)(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或在例如通過SPDP修飾蛋白的氨基后獲得的天然蛋白)—糖-S-S-蛋白質(zhì)糖-COOH+EDAC+NH2——SH—糖——SH+馬來酰亞胺-蛋白質(zhì)(氨基修飾)-綴合物糖-醛+NH2——NH2—糖——NH2+EDAC+COOH-蛋白質(zhì)—綴合物可以觀察到，碳二亞胺化學(xué)法(例如使用EDAC)對于綴合反應(yīng)是非常便利的，因為其利用了糖和/或蛋白上的基團，這些基團可天然存在，或者可容易地通過衍生化插入。還通過肽鍵便利地連接各部分。碳二亞胺(RNONR')是具有丙二烯結(jié)構(gòu)的不飽和化合物(Nakajima和Ikada1995BioconjugateChem.6:123-130;Hoare和Koshland1967JBC242:2447-2453)。該化學(xué)物質(zhì)在其反應(yīng)pH(4.5-6.5)相對不穩(wěn)定，因此在本領(lǐng)域傾向于將糖/蛋白/碳二亞胺綴合反應(yīng)的所有組分一起加入。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)要綴合的糖和蛋白的性質(zhì)，通過將反應(yīng)的某些組分緩慢加入混合物中可獲得對疫苗應(yīng)用較好的最終綴合物特性。這樣做可實現(xiàn)一種或多種利益/改善，例如綴合物中的糖產(chǎn)量、綴合物的可除菌過濾性、綴合更好控制、更容易重現(xiàn)和/或防止部分內(nèi)部交聯(lián)。因此，在一個實施方案中，提供一種使用碳二亞胺縮合化學(xué)法將糖與蛋白載體綴合的方法，其中糖包含(例如作為其重復(fù)單元的一部分)或經(jīng)衍生化后包含氨基和/或羧基，其中蛋白載體包含或經(jīng)衍生化后包含氨基和/或羧基，所述方法包括以下步驟I)如果蛋白載體同時包含氨基和羧基，而糖包含氨基和羧基之中的任一個，貝'J:a)將糖和進行綴合所需的等份碳二亞胺混合，和b)在35秒至6小時的時間段內(nèi)加入所需的等份蛋白載體；II)如果糖同時包含氨基和羧基，而蛋白載體包含氨基和羧基之中的任一個，貝寸a)將蛋白載體和進行綴合所需的等份碳二亞胺混合，和b)在35秒至6小時的時間段內(nèi)加入所需的等份糖；III)如果糖同時包含氨基和羧基，而且蛋白載體也同時包含氨基和羧基，貝'J:a)將蛋白載體和糖混合，和b)在35秒至6小時的時間段內(nèi)加入進行綴合所需的等份碳二亞胺。發(fā)明詳述可使用任意合適的碳二亞胺，只要其能夠在水性介質(zhì)中綴合糖和蛋白。在一個實施方案中，碳二亞胺可為EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)[也稱為EDC]，或者可為非EDAC的碳二亞胺。術(shù)語"糖"在本說明書全文中可指多糖或寡糖，并包括這二者。糖可指脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)。在使用之前，多糖(例如細菌多糖)可從來源菌林(例如細菌)分離出來，或者從來源菌林分離出來后通過已知方法(參見例如EP497524和EP497525;ShousunChenSzu等-CarbohydrateResearch第152巻，第7-20頁(1986))如微流化法分級至某種程度。多糖可依大小分級，以便降低多糖樣品的粘度和/或改善綴合產(chǎn)物的過濾性。寡糖的重復(fù)單元較少(典型地為5-30個重復(fù)單元)，典型地為水解多糖。術(shù)語"蛋白載體"意欲涵蓋小肽和大的多肽("OkDa)這二者。顯然，大的多肽更有可能同時包含無任何修飾的活性氨基和羧基。就本發(fā)明而言，"天然"多糖是指還未經(jīng)處理的糖，因為處理的目的是降低糖的大小。在正常純化程序中可使多糖的大小略微降低。這樣的糖仍是天然的。只有在多糖已經(jīng)歷分級技術(shù)的情況下，多糖才不被看作是天然的。就本發(fā)明而言，"以最多x2的因數(shù)分級"是指糖經(jīng)過處理，預(yù)期糖的大小下降，但將大小保持在天然多糖大小的一半以上。x3、x4等以相同方式解釋，即糖經(jīng)過處理，預(yù)期多糖的大小下降，但將大小保持在天然多糖大小的1/3、1/4等以上。在上述方法的步驟b)中，用于加入所有等份的終組分的35秒至6小時時間_艮可為50秒至5小時、1分鐘至4小時、2分鐘至3小時、3分鐘至2小時、4-60分鐘、5-50分鐘、6-40分鐘、7-30分鐘或8-20分鐘。所述時間段可為1分鐘至5小時、10分鐘至4小時、20分鐘至3小時、30分鐘至2小時、40-90分鐘或50-70分鐘。該時間可按照要綴合的精確的糖和蛋白作出調(diào)整。在一個實施方案中，在所述時間段內(nèi)以恒定速率(這使用以恒定速率運轉(zhuǎn)的泵便利地實現(xiàn))向反應(yīng)混合物中加入等份的終組分(例如碳二亞胺、糖或蛋白)，備選地，可在所述時間段內(nèi)分階段加入。盡管這可以多種方式實施，但一般來說，應(yīng)在整個時間段內(nèi)加入各份的等分試樣。例如，可在前半個時間^歐加入至少1/4的等份試樣，在后半個時間段加入至少1/4的等份試樣。在整個時間段內(nèi)，例如以mL或mg量度的等份試樣'a，的總量可以4_100個階段('s，)加入。在一個實施方案中，安排所述階段，使得在所有階段都導(dǎo)入相等量(a/s)。在一個實施方案中，所述階段在整個時間段'p，(以秒計)內(nèi)均勻地間隔。因此，如果1個階段在時間段'p，的時間0發(fā)生，則隨后每個階段都可在為p/(s-l)的時刻發(fā)生。在步驟b)中加入的等份終組分的體積可依據(jù)在期望的時間段內(nèi)等份試樣加入到反應(yīng)中的容易程度而作出調(diào)整。碳二亞胺可作為水性溶液(典型地在加入反應(yīng)物前緩沖至pH7.5)或作為固體粉末(例如在水性介質(zhì)中易溶的EDAC)加入。當然，如果碳二亞胺是最后加入到反應(yīng)物中的組分(情形III步驟b)),則可使用緩慢溶解的碳二亞胺，使得全部等份粉末同時被加入到反應(yīng)物中，但其以和期望的時間段一致的速率溶解，在所述時間段內(nèi)，所述等份試樣可用于反應(yīng)。如果蛋白和/或糖沒有氨基或羧基(或者僅有其中一個)，則其可被衍生化，以給它一個(或給它已沒有的另一個)。例如，對于僅含活性羥基的糖(例如腦膜炎球菌血清群A莢膜糖)，應(yīng)使用該類糖進行氨基或羧基衍生化，使得可進行EDAC縮合。這可在重復(fù)亞單元中發(fā)生，或者可為僅存在于^t分子末端的基團。應(yīng)當指出的是，在發(fā)生衍生化的情況下，僅部分衍生化所述部分可能有益。對于具有重復(fù)單元的糖，靶表位可存在每個重復(fù)單元中。因此，如果發(fā)生部分衍生化(就此而言指0.5-20%、1-15%、3-12%或5-10%的目標反應(yīng)基實際上被衍生化)，則其可能具有保留大部分表位和防止太多交聯(lián)的益處。如果糖或蛋白已經(jīng)僅具有氨基或羧基(例如傷寒沙門氏菌GSWmo"e//a0^/7/>々Vi糖，其天然具有羧基但不具有氨基)，則可發(fā)生衍生化，以給予其另一類基團(即給予Vi氨基)。但是，應(yīng)當指出的是，由于衍生化可為部分的，所以該作用可將本發(fā)明的優(yōu)選反應(yīng)由I型變?yōu)閙型。例如，如果Vi糖與既含氨基又含羧基的蛋白載體綴合，則情形I在步驟b)中緩慢地加入等份蛋白。如果用氨基部分衍生化Vi糖羧基，則其將同時具有羧基和氨基，由此在步驟b)中緩慢加入等份碳二亞胺的情形III變得最相關(guān)。衍生化可通過加入異-或同-雙官能連接物發(fā)生，也可用和以上對糖-蛋白綴合步驟所述相似的化學(xué)法(例如CDAP或碳二亞胺化學(xué)法)發(fā)生。連接物可具有4-20、4-12或5-10個碳原子，并可具有兩個活性氨基、兩個活性羧基或每種一個(例如己二胺、6-氨基己酸或己二酸二酰肼)。典型地，通過使大量過量的連接物與要衍生化的糖和/或蛋白載體反應(yīng)發(fā)生衍生化。這使得衍生化以最小的部分內(nèi)交聯(lián)發(fā)生(要不然例如在使用碳二亞胺縮合以氨基衍生化糖上的羧基時，這些部分內(nèi)交聯(lián)可能發(fā)生)。可使用諸如滲濾的技術(shù)容易地去除過量的連接物。在一個實施方案中，糖包含活性羥基作為其重復(fù)單元的一部分，所述重復(fù)單元經(jīng)連接物上的氨基被部分衍生化(例如用CDAP化學(xué)法)。在另一個實施方案中，糖包含活性氨基作為其重復(fù)單元的一部分，所述重復(fù)單元經(jīng)連接物上的羧基被部分衍生化(例如用碳二亞胺化學(xué)法)。在又一個實施方案中，糖包含活性羧基作為其重復(fù)單元的一部分，所述重復(fù)單元經(jīng)連接物上的氨基被部分衍生化(例如用碳二亞胺化學(xué)法)。進行綴合所需的等份碳二亞胺(無論是在本發(fā)明反應(yīng)的步驟a)還是b)中提供)為每mg糖0.01-3mg、0.05-2mg或0.09-1mg碳二亞胺。盡管這些數(shù)字針對EDAC為碳二亞胺計算，但如果使用任意其它碳二亞胺，則這些數(shù)字可作如下調(diào)整將在所述范圍中的數(shù)字乘以(其它碳二亞胺的分子量)/(EDAC的分子量)。一般來說，在本發(fā)明方法中，糖可在步驟b)中以0.5-50mg/ml的終濃度存在。這取決于糖的大小和性質(zhì)以及任意衍生化的程度。例如，對于寡糖，需要較大的濃度，^f旦對于大的多糖，小得多的濃度可能更適合。如果要用氨基或羧基部分衍生化最末端，則較小的濃度可能是適合的，以減少任意交聯(lián)的可能性。蛋白載體可在步驟b)中以1-50mg/ml的終濃度存在。在本發(fā)明方法中，蛋白載體與糖的初始比率可為5:1至1:5、4:1至1:1或3:1至2:1(重量/重量)。這再次取決于糖的大小和性質(zhì)以及任意衍生化的程度。鹽濃度(例如NaCl)也可以才艮據(jù)糖/蛋白的性質(zhì)改變。通常，在本發(fā)明方法的步驟b)中可存在約0.2MNaCl，但可為0-2M、0.1-1M或0.2-0.5M。對于本發(fā)明方法的步驟b)中的pH，反應(yīng)pH可為其中碳二亞胺有活性的任意pH—例如pH4.5-6.5、4.7-6.0或5-5.5。典型地，根據(jù)需要通過加入酸/堿在整個反應(yīng)中保持該pH。EDAC通常在pH7.5是穩(wěn)定的，但如果綴合需要于更高的pH進行，則已知保持反應(yīng)中間體穩(wěn)定的化合物(例如N-羥基琥珀酰亞胺)也可存在于反應(yīng)的步驟b)中，在此情況下步驟b)中的反應(yīng)pH可保持在pH4.5-7.5。本發(fā)明方法的步驟b)中的反應(yīng)溫度可為4-37。C、10-32°C、17-30°C或22-27。C，典型地在整個反應(yīng)中保持。在本發(fā)明方法中，一旦已在步驟b)中加入全部等份，則反應(yīng)典型地再保持10分鐘至72小時、20分鐘至48小時、30分鐘至24小時、40分鐘至12小時、50分鐘至6小時或1-3小時。反應(yīng)一完成就將pH調(diào)節(jié)至7.5-9(如果存在N-羥基琥珀酰亞胺，則調(diào)節(jié)至該范圍的較高位)，以回到碳二亞胺的穩(wěn)定pH范圍。一旦綴合，就可通過將其注射到大小排阻層析柱(例如SephacrylS400HR，Pharmacia)上由未反應(yīng)的組分、游離糖等中純化出糖-蛋白綴合物。這典型地在2-8。C進行。綴合物可過濾除菌，然后儲存。最后，可將有效劑量(例如每劑1-20)dg、2-15)ig或3-10iig糖)的糖-蛋白綴合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑(例如鹽或佐劑)一起配制，以生產(chǎn)免疫原性組合物或疫苗。就本發(fā)明的糖而言，可使用本發(fā)明方法綴合病毒、真菌、細菌或真核來源的任意糖。所述糖可為傷寒沙門氏菌(5^/附^^//00^"')的Vi糖，或者為非Vi的糖。所述糖可為得自流感嗜血桿菌(//.^y/i^加e)b型的莢膜糖Hib，或者可為非Hib的糖。在一個實施方案中，所述糖為細菌莢膜糖，例如從選自以下的細菌獲得的糖腦膜炎奈瑟氏球菌(iV.附em'"g"W!'s)血清群A(MenA)、B(MenB)、C(MenC)、W135(MenW)或Y(MenY),月申炎鏈5泉菌(5Vre/tococcws/"ewmom'ae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F,B群鏈球菌Ia、Ib、II、ffl、IV、V、VI或VII型，金黃色葡萄球菌OSfap/ococcwsawrews)5型、金黃色葡萄球菌8型、傷寒沙門氏菌(Sa/mo"e〃aO/p/z/)(Vi糖)、霍亂弧菌(P76n'oc/io/erae)或流感嗜血桿菌(H!'My7Me"加e)b型。所述糖的重均分子量可為1000-2000000、5000-1000000、賜00掘000、50000-400000、75000-300000或100000-200000。糖的分子量或平均分子量在本文是指糖在綴合之前用MALLS測量法測得的重均分子量(Mw)。MALLS技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，典型地如在實施例2中所述進行。為了對糖進行MALLS分析，可組合使用兩個柱CTSKG6000和5000PWxI),用水洗脫糖。4吏用光散射檢測器(例如配有488nm的10mW氬激光的WyattDawnDSP)和干涉折射計(例如配有P100傳感器和498nm紅色濾光片的WyattOtilabDSP)檢測糖。在一個實施方案中，糖的多分散性為1-1.5、1-1.3、1-1,2、1-1.1或1-1.05,在與載體蛋白綴合后，綴合物的多分散性為1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1,0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性測量都通過MALLS進行。所述糖可為天然多糖，或者可以不超過2、4、6、8、10或20倍的因數(shù)被分級(例如通過微流化法[例如通過EmulsiflexC-50裝置]或其它已知技術(shù)[例如熱、化學(xué)、氧化、超聲等方法])。寡糖可顯著地被進一步分級[例如通過已知的熱、化學(xué)或氧化方法]。這些糖中大部分的結(jié)構(gòu)都是已知的(因此無論它們天然具有用于碳二亞胺化學(xué)法的任意氨基或羧基，還是具有可用氨基或羧基衍生化的任意其它反應(yīng)基(參見下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>IX)SNmen/Mcat/Hi在PEA上有在KDO上有OH所述糖可為細菌脂寡糖或脂多糖(參見上表)，例如從選自以下的細菌獲得腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌屬或粘膜炎莫拉氏菌。LOS可為腦膜炎球菌免疫型L2、L3或L10。它們可通過堿處理其脂質(zhì)A部分脫毒。在一個實施方案中，MenA莢膜糖至少部分地被O-乙?；?，使得至少50%、60%、70%、80%、90%、950/?；?8%的重復(fù)單元在至少一個位置凈皮0-乙?；?。O-乙酰化例如存在于至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的重復(fù)單元的至少0-3位。在一個實施方案中，MenC莢膜糖至少部分地被O-乙?；?，使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的(a2—9)-聯(lián)NeuNAc重復(fù)單元在至少一個或兩個位置被O-乙酰化。O-乙?；绱嬖谟谥辽?0%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95°/。或98%的重復(fù)單元的0-7位和/或0-8位。在一個實施方案中，MenW莢膜糖至少部分地被0-乙酰化，使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98°/0的重復(fù)單元在至少一個或兩個位置被O-乙酰化。o-乙酰化例如存在于至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單元的0-7位和/或0-9位。在一個實施方案中，MenY莢膜糖至少部分地O-乙?；?，使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單元在至少一個或兩個位置被0-乙酰化。0-乙?；嬖谟谥辽?0%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98。/。的重復(fù)單元的7位和/或9位。O-乙酰化的百分率是指重復(fù)單元含O-乙?；陌俜致?。這可在糖綴合前和/或綴合后測得。蛋白載體可為任意肽或蛋白，其中可包含一個或多個T輔助表位。在本發(fā)明的一個實施方案中，蛋白載體選自TT、DT、CRM197、TT的C片段、流感嗜血桿菌的D蛋白、肺炎球菌PhtD和肺炎球菌溶血素。載體蛋白可為破傷風(fēng)類毒素(TT)、破傷風(fēng)類毒素C片段、破傷風(fēng)毒素的無毒突變體[注意，就本發(fā)明而言，所有這些TT變異體都被看作是相同類型的載體蛋白];白喉類毒素(DT)、CRM197、白喉毒素的其它無毒突變體[例如CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等，J.Biol.Chem.218;3838-3844，1973);CRM9、CRM45,CRM102、CRM103和CRM107，以及Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Frankel編著，MaecelDekkerInc,1992中描述的其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp、Gin或Ser和/或Ala158缺失或突變?yōu)镚ly,以及公開于US4709017或US4950740中的其它突變；至少一個或多個殘基Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534的突變，以及在US5917017或US6455673中公開的其它突變；或在US5843711中公開的片段](注意，就本發(fā)明而言，所有這些DT變異體都被看作是相同類型的載體蛋白)；肺炎球菌溶血素(Kuo等，(1995)InfectImmun63;2706-13)、OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白一通常由腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取一EP0372501);合成肽(EP0378881、EP0427347);熱激蛋白(WO93/17712、WO94/03208);百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177);細胞因子；淋巴因子；生長因子或激素(WO91/01146);含多種病原體源抗原的多種人CD4+T細胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Bamldoi等(2004)InfectImmun72;4884-7)、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)、鐵吸收蛋白(WO01/72337);艱難梭菌(Cj驕"7e)的毒素A或B(WO00/61761);流感嗜血桿菌D蛋白(EP594610和WO00/56360);肺炎球菌PhtA(WO98/18930,也稱為Sp36);肺炎球菌PhtD(公開于WO00/37105，也稱為Sp036D);肺炎球菌PhtB(公開于WO00/37105，也稱為Sp036B)或PhtE(公開于WO00/30299,稱為BVH-3)。在本發(fā)明的再一方面，提供一種通過本發(fā)明方法可獲得或已獲得的糖-蛋白載體綴合物(或免疫原性組合物或疫苗)。疾病的藥物中的用途，以及預(yù)防或治療疾病的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效劑量的本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗的步驟。所述用途或方法可用于由選自以下的細菌引起的疾病腦膜炎奈瑟氏球菌(^/V.me"/"g7'"必)，肺炎鏈球菌(5V，tococcusp"e謂om'ae)、粘膜炎莫拉氏菌(Mcato庁/wfe)、B群鏈球菌(GroupBStreptococcus)、金黃色葡萄球菌(5Va//^/ococcMSawreuy)、傷寒沙門氏菌(Sa/70we〃a妙/')、霍亂弧菌(FA"'oc/zo/erae)、大腸桿菌(￡.co//)或流感嗜血桿菌(//.本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包含DTPa或DTPw疫苗(例如疫苗中含有DT、TT以及全細胞百日咳(Pw)疫苗或無細胞百日咳(Pa)疫苗中的任一種(例如含有百日咳類毒素、FHA、pertactin、并任選地含有凝集素(agglutinogin)2和3)。這些組合還可以含有抗乙型肝炎的疫苗(例如其可含乙型肝炎表面抗原[HepB],該抗原任選地吸附到磷酸鋁上)。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含Hib、MenA和MenC糖綴合物，或Hib和MenC糖綴合物，或Hib、MenC和MenY糖綴合物，或MenA、MenC、MenW和MenY糖綴合物，其中至少一種、兩種或全部糖綴合物按照本發(fā)明方法制備。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地包含額外的病毒抗原，它們賦予如，本發(fā)明的免疫原性組合物包含來自麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹(MMR)或麻滲、腮腺炎、風(fēng)滲和水痘(MMRV)的抗原。在一個實施方案中，這些病毒抗原任選地與組合物中存在的腦膜炎球菌和/或Hib糖綴合物存在于同一容器中。在一個實施方案中，這些病毒抗原被凍干。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物還包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任選地為來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜嚢泡制備物，如在EP301992、WO01/09350、WO04/14417、WO04/14418和WO04/14419中所描述的。一般而言，本發(fā)明的免疫原性組合可包含每種糖綴合物的糖劑量介于0.1-20)Lig、2畫10iug、2-6pg或4-7pg糖之間。"(大)約"或"近似"就本發(fā)明而言被定義為在給定值的10%左右。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物被調(diào)節(jié)至或緩沖至pH7.0-8.0、pH7.2-7.6，或大約地或精確地調(diào)節(jié)至pH7.4。本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗任選地在存在穩(wěn)定劑(例如多元醇，例如蔗糖或海藻糖)的情況下被凍干。任選地，本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗包含用量足以增強對免疫原的免疫應(yīng)答的佐劑。適宜的佐劑包括但不限于鋁鹽(磷酸鋁或氫氧化鋁)、角鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝桿菌細胞壁制備物、單磷酰脂質(zhì)A、霉菌酸衍生物、非離子型嵌段共聚物表面活性劑、QuilA、霍亂毒素B亞基、聚磷腈和衍生物以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOM),例如Takahashi等，(1990)Nature344:873-875描述的那些。對于腦膜炎奈瑟氏球菌或HibMen組合，不使用任何鋁鹽佐劑或根本不使用任何佐劑可能有利。至于所有的免疫原性組合物或疫苗，免疫原的免疫有效量必須憑經(jīng)驗確定?？紤]的因素包括免疫原性，免疫原是否與佐劑或載體蛋白或其它載體復(fù)合或共價連接、給藥途徑和要給予的免疫劑量的次數(shù)。活性物質(zhì)在本發(fā)明的藥物組合物或疫苗中可以變化的濃度存在。典型地，最小濃度的物質(zhì)是達到其期望用途必需的量，而最大濃度是保持在溶液中或均勻地懸浮在初始混合物中的最大量。例如，最小量的治療劑任選地提供單一治療有效劑量。對于生物活性物質(zhì)，最小濃度是在重構(gòu)時對生物活性必需的量，最大濃度是不能保持均勻懸浮的濃度。就單劑量單位而言，所述量是單次治療應(yīng)用的劑量。一般來說，預(yù)期每劑含有1-100嗎蛋白抗原，任選地含有5-50嗎或5-25嗎。例如，綴合物中細菌糖的劑量為10-20pg、5-10嗎、2.5-5)ig或1-2.5(ig糖。借助于經(jīng)系統(tǒng)或粘膜途徑給予本發(fā)明的疫苗制備物，所述疫苗可用于保護或治療對感染敏感的哺乳動物(例如人類患者)。人類患者任選地為嬰兒(12個月以下)、學(xué)步兒童(12-24、12-16或12-14個月)、兒童(2-10、3-8或3-5歲)、青少年(12-21、14-20或15-19歲)或成人。這些給藥可包括經(jīng)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或經(jīng)粘膜給予口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。優(yōu)選鼻內(nèi)給予治療肺炎或中耳炎的疫苗(可更有效地預(yù)防肺炎球菌的鼻咽部帶菌，由此減弱在其最早期的感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單劑給予，但其組分也可同時或在不同時間一起共給予(例如，如果疫苗中存在糖，則這些糖可在與給予細菌蛋白疫苗相同的時間或在其后l-2周單獨地給予，用于實現(xiàn)對彼此而言最佳的協(xié)同免疫應(yīng)答)。除了單一給藥途徑以外，還可使用2種不同的給藥途徑。例如，病毒抗原可ID(皮內(nèi))給予，而細菌蛋白可IM(肌20內(nèi))或IN(鼻內(nèi))給予。如果存在糖，則其可IM(或ID)給予，細菌蛋白可IN(或ID)給予。另外，本發(fā)明的疫苗可IM給予，用于初次免疫，以及IN給予，用于加強免疫。疫苗制劑一4殳i也描述于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.&NewmanM丄編著)(1995)PlenumPressNewYork)。脂質(zhì)體中的嚢化由Fullerton在美國專利4,235,877描述。本發(fā)明的再一方面是一種制備本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗的方法，所述方法包括以下步驟將通過本發(fā)明方法制備的本發(fā)明的MenA和MenC糖與還沒有按照本發(fā)明制備的MenW和MenY以及藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。本發(fā)明人意將本文的術(shù)語"包含"和"含有"在每種情況下都可任選地分別被"包括"和"由……組成"替換。本專利說明書中提及的所有參考文獻或?qū)＠暾埗荚诖艘胱鳛閰⒖肌１景l(fā)明在隨附的實施例中闡述。以下的實施例使用標準技術(shù)進行，這些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的和常規(guī)的，另外詳述的除外。這些實施例是說明性的，并不是對本發(fā)明的限制。實施例實施例1—多糖綴合物的制備實施例la—按照本發(fā)明制備腦膜炎球菌MenA和MenC莢膜多糖綴合物MenC-TT綴合物使用天然多糖(按MALLS測量超過150kDa)生產(chǎn)，或稍微微流化。MenA-TT綴合物使用按實施例2的MALLS方法測量超過60kDa的天然多糖或稍微微流化的多糖生產(chǎn)。分級通過使用勻漿器EmulsiflexC-50裝置的微流化進行。然后多糖通過0.2濾器過濾。為了將MenA莢膜多糖經(jīng)間隔基與破傷風(fēng)類毒素綴合，使用以下方法。通過偶聯(lián)化學(xué)法進行多糖和間隔基(ADH)的共價結(jié)合，借助于偶聯(lián)化學(xué)法，多糖在可控的條件下被氰化劑l-氰基-4-二甲氨基-吡啶鏡四氟硼酸鹽(CDAP)活化。間隔基通過其肼基與氰化PS反應(yīng)，以在間隔基和多糖之間形成穩(wěn)定的異脲鍵。用新鮮制備的100mg/mlCDAP的乙腈/水(50/50(體積/體積))溶液處理10mg/ml的MenA(pH6.0)[3.5g]溶液，以獲得CDAP/MenA比率為0.75(重量/重量)。1.5分鐘后，pH升至pH10.0。3分鐘后，加入ADH，以獲得ADH/MenA比率為8.9。溶液的pH降至8.75，保持此pH繼續(xù)反應(yīng)2小時(溫度保持在25°C)。將PSAAH溶液濃縮至其初始體積的1/4，然后使用截流分子量IOkDa的FiltronOmega膜以30倍體積的0.2MNaCl滲濾，過濾保留液。在綴合(碳二亞胺縮合)反應(yīng)前，對純化的TT溶液和PSAah溶液進行稀釋，以達到10mg/ml的PSAAH濃度和10mg/ml的TT濃度。將EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)加入PSah溶液(2g糖)，以便達到0.9mgEDAC/mgPSAah的最終比率。將pH調(diào)節(jié)至5.0。用振動泵(在60分鐘內(nèi))加入純化的破傷風(fēng)類毒素，以達到2mgTT/mgPSAah。所得溶液在+25。C于攪拌下放置60分鐘，以獲得120分鐘的最終偶聯(lián)時間。通過加入1MTris-HClpH7.5(1/10終體積)中和溶液，于+25。C放置30分鐘，然后于+2。C至+8。C放置過夜。使用10|im濾器澄清綴合物，并使用SephacrylS400HR柱(Pharmacia,Sweden)純化。用10mMTris畫HCl(pH7.0)、0.075MNaCl平衡柱子，綴合物(約660mL)上柱(+2。C至+8。C)。根據(jù)280nm光密度的變化選擇洗脫合并液。當吸光度增加至0.05時開始收集。繼續(xù)收集，直至Kd達到0.30。綴合物于+20。C經(jīng)過濾除菌，然后儲存于+2。C至十8。C。所得綴合物的多糖:蛋白比率為l:2-l:4(重量/重量)。為了將MenC莢膜多糖經(jīng)間隔基與破傷風(fēng)類毒素綴合，使用以下方法。通過偶聯(lián)化學(xué)法進行多糖和間隔基(ADH)的共價結(jié)合，借助于偶聯(lián)化學(xué)法，多糖在可控的條件下被氰化劑l-氰基-4-二甲氨基-吡啶鏡四氟硼酸鹽(CDAP)活化。間隔基通過其耕基與氰化PS反應(yīng)，以在間隔基和多糖之間形成穩(wěn)定的異脲鍵。用新鮮制備的100mg/mlCDAP的乙腈/水(50/50(體積/體積))溶液處理20mg/ml的MenC(pH6.0)[3.5g]溶液，以獲得CDAP/MenC比率為1.5(重量/重量)。1.5分鐘后，pH升至pH10.0。在活化pH加入5MNaCl，以達到2MNaCl的終濃度。3分鐘后，加入ADH,以獲得ADH/MenC比率為8.9。溶液的pH降至8.75,繼續(xù)反應(yīng)2小時(保持在25°C)。將PSCAH溶液濃縮至最低150mL，然后使用截流分子量10kDa的FiltronOmega膜以30倍體積的0.2MNaCl滲濾，過濾保留液。在綴合反應(yīng)前，用0.2MNaCl稀釋純化的TT溶液和PSCah溶液(2g規(guī)模)，以獲得15mg/ml的PSCah濃度和20mg/ml的TT濃度。將純化的破傷風(fēng)類毒素加入PSCAH溶液，以便達到2mgTT/mgPSCAH。將pH調(diào)節(jié)至5.0。用振動泵(在IO分鐘內(nèi))加入EDAC(16.7mg/ml的Tris0.1MpH7.5溶液)，以達到0.5mgEDAC/mgPSCAH的最終比率。所得溶液在+25。C于攪拌和pH調(diào)控下放置liO分鐘，以獲得120分鐘的最終偶聯(lián)時間。然后通過加入1MTris-HClpH9.0(1/10終體積)中和溶液，于+25。C放置30分鐘，然后于+2。C至+8。C^:置過夜。使用10pm濾器澄清綴合物，并使用SephacrylS400HR柱(Pharmacia,Sweden)純化。用10mMTris-HCl(pH7.0)、0.075MNaCl平衡柱子，綴合物(約460mL)上柱(+2。C至+8。C)。根據(jù)280nm光密度的變化選擇洗脫合并液。當吸光度增加至0.05時開始收集。繼續(xù)收集，直至Kd達到0.20。綴合物于+20。C經(jīng)過濾除菌，然后儲存于+2。C至+8°C。所得綴合物的多糖:蛋白比率為l:2-l:4(重量/重量)。進行在10-45分鐘內(nèi)加入EDAC的各種實驗一在每種情況下均獲得良好品質(zhì)的MenC綴合物。但是，如果最后將TT載體緩慢加入MenC-ADH+EDAC混合物，則產(chǎn)生無法純化的凝膠-綴合物。還進行了將EDAC—齊加入反應(yīng)中的實驗，但綴合物的最終TT/PS比率(2.7/1)(重量/重量M氐于經(jīng)其中在10分鐘內(nèi)加入EDAC的反應(yīng)獲得的綴合物(3.3/l);而且，相對于所檢測的通過其中在IO分鐘內(nèi)加入EDAC的反應(yīng)制備的綴合物的抗原性，otTT和otPS抗原性均較低。關(guān)于多糖衍生化的近似百分率的說明MenCAH:在用ADH進行CDAP處理后，約3.47%的羥基被ADH衍生化(估計每個重復(fù)單元有2個可用羥基)。對于MenA:約11.5%的羥基被ADH衍生化(認為每個重復(fù)單元僅有1個可用羥基)。實施例lb—肺炎球菌莢膜PS3多糖綴合物的制備1)PS03-TT^方法PS03-TT^208通過Emulsiflex分級給PS稱重(以10%理論含水量為準)。將天然PS以初始濃度3mg/ml在2MNaCl中溶解過夜。分級前，用5pm截流濾器澄清天然PS的-容&。在活化步驟前使用勻漿器EMULSIFLEXC-50裝置降低多糖的分子量和粘度。分級效率取決于循環(huán)壓力、活塞補給壓力和總循環(huán)次數(shù)。為了提升分級效率(并因此降低總循環(huán)次數(shù))，用具有固定幾何形狀的室(MicrofluidicsF20Y-0.75|um互作室)替換Emulsiflex的勻化室。分級的目標是降低PS的分子量和粘度，而其抗原性沒有關(guān)鍵下降。以6000±500psi進行尺度降低，之后在處理過程中進行粘度檢測。當達到2.0±0.2cp的目標時停止分級。分級的PS經(jīng)0.22|Lim過濾在Millipak40膜(截流0.22mm)上以10ml/分鐘的流速過濾分級的PS。TTf汴生化于25。C在持續(xù)攪拌條件下在T?？刂频乃≈羞M4亍衍生化步驟。將TT稀釋在NaCl0.2M中，以獲得25mg/ml的TT終濃度。將ADH以固體形式加入到TT溶液中，以達到0.2M終濃度。在全部ADH溶解后，用HCl將溶液設(shè)定在pH6.2±0.1。然后向TT/ADH溶液中加入EDAC，以達到0.02M終濃度。用HCl將pH設(shè)定在6.2土0.1,并在1小時內(nèi)保持在pH調(diào)控下。在衍生化步驟后，用NaOH升高pH至pH9.5，以終止反應(yīng)。在2小時內(nèi)使溶液處于pH調(diào)控下，然后進行滲濾步驟。TTAH衍生物經(jīng)滲濾以去除未反應(yīng)的ADH和EDAC副產(chǎn)物。在centramate膜(0.09m2，10kDa截流分子量)上進行滲濾。溶液對20體積的0.2MNaCl透析。通過在滲濾5、10、15和20倍體積后定量透過液中的ADH(TNBS測定)進行滲濾步驟的跟蹤。經(jīng)0.22pm過濾最后在0.22iLim截流膜(Mmipack40)上以10ml/分鐘的流速過濾TTAH。然后將過濾的TTah儲存于-70。C。PS3-TTAH綴合物處理條件如下初始PS3濃度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TTAH/PS3比率1.5/1(重量/重量)，EDAC濃度0.5mg/mgPS,TT濃度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用2MNaCl稀釋50mgPS3,以獲得2mg/ml的PS終濃度。用0.2MNaCl稀釋純化的TTah溶液，以獲得10mg/ml的濃度。用HC1將PS3溶液調(diào)節(jié)至pH5。將EDAC以固體形式加入到PS3溶液中，以便達到0.5mgEDAC/mgPS的終濃度。用HC1將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.05，在11分鐘內(nèi)手動加入TTah(等^f分試樣/分鐘)。所得溶液于+25。C在攪拌和pH調(diào)控下溫育109分鐘，以獲得120分鐘的最終偶聯(lián)時間。然后，通過加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分鐘。最后用5膜澄清綴合物，并注射到SephacrylS々OOHR柱上。2)PS03國TT生處理PS03^-TT215通過Emulsiflex分級同上。用0.22nm過濾分級的PS同上。PS3衍生化于25。C在持續(xù)攪拌條件下在T?？刂频乃≈羞M行衍生化步驟。用2MNaCl稀釋PS3，以獲得3mg/ml的PS終濃度。將PS溶液設(shè)定在pH6.0,然后加入CDAP(0.25mg/mgPS,以100mg/ml溶解在乙腈/WFI混合物中)。用NaOH升高pH至pH9.5，然后加入ADH(8.9mgADH/mgPS，以100mg/ml溶解在0.2MNaCl中)。將pH保持在9.5，并在60分鐘內(nèi)保持調(diào)控。衍生化的百分率等于2.4%(2.4mgADH/100mgPS)。這可用已知技術(shù)檢測TNBS用于評價ADH;DMAB或間苯二酚(Monsigny等，(1988)Anal.Biochem.175,525-530)用于PS定量。在此情況下，TNBS劑量為228嗎/ml，PS劑量為5250嗎/ml。已知ADH的分子量為174.2,PS3的重復(fù)單元的分子量為338.27(具有1個C00H和4個OH),有1.3iamolADH/15.52iamol重復(fù)單元，或1.3jimolADH/62.08pmol活性羥基。2.09%的PS3羥基為ADH修飾的羥基。PS3AH衍生物經(jīng)滲濾以去除未反應(yīng)的ADH和CDAP副產(chǎn)物。在UFP-30-C-H24LA膜(42cm2，30kDa截流分子量)上進行滲濾。溶液對20倍體積的0.2MNaCl透析。通過在滲濾5、10、15和20倍體積后定量透過液中的ADH(TNBS測定)進行滲濾步驟的跟蹤。經(jīng)0.22nm過濾最后在0.22|Lim截流膜(Millipack40)上以10ml/分鐘的流速過濾PSAH。然后將過濾的PS3AH儲存于4。C。PS3AH-TT綴合物處理條件如下初始PS3濃度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TT/PS3AH比率1.5/1(重量/重量)，EDAC濃度0.5mg/mgPS,TT濃度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用0.2MNaCl稀釋50mgPS3AH，以獲得2mg/ml的PS終濃度。用0.2MNaCl稀釋純化的TT溶液，以達到10mg/ml的濃度。用HCl將PS3AH溶液調(diào)節(jié)至pH5。將EDAC以固體形式加入到PS3ah溶液中，以便達到0.5mgEDAC/mgPS的終濃度。用HC1將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.05,在10分鐘內(nèi)用實驗振動泵加入TT。所得溶液于+25。C在攪拌和pH調(diào)控下溫育110分鐘，以獲得120分鐘的最終偶聯(lián)時間。然后，通過加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分鐘。最后用5膜澄清綴合物，并注射到SephacrylS400HR柱上。3)PS03^-TT處理PS3^-TT217通過Emulsiflex分級同上。用0.22nm過濾分級的PS同上。PS3衍生化如對215綴合物一樣。滲濾如對215綴合物一樣。經(jīng)0.22nm過濾如對215綴合物一樣。PS3AH-TT綴合物處理條件如下初始PS3濃度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TT/PS3ah比率1.5/1(重量/重量)，EDAC濃度0.5mg/mgPS，TT濃度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用2MNaCl稀釋50mgPS3AH，以獲得2mg/ml的PS終濃度。用0.2MNaCl稀釋純化的TT溶液，以獲得10mg/ml的濃度?；旌螾S3ah和TT溶液，用HCl調(diào)節(jié)至pH5。將EDAC溶解Tris1MpH7.5緩沖液中。每分鐘加入40)ulEDAC(10分鐘，以達到EDAC/PS比率(0.5mgEDAC/mgPS))。所得溶液于十25。C在攪拌和pH調(diào)控下溫育110分鐘，以獲得120分鐘的最終偶聯(lián)時間。然后，通過加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分鐘。最后用5pm膜澄清綴合物，并注射到SephacrylS400HR柱上。4)PS03M-TT處理PS3M-TT218通過Emulsiflex分級同上。用0.22fxm過濾分級的PS同上。PS3衍生化于25。C在持續(xù)攪拌條件下在T?？刂频乃≈羞M行衍生化步驟。用2MNaCl稀釋PS3，以獲得3mg/ml的PS終濃度。加入固體形式的EDAC，以達到0.1mg/mgPS的EDAC/PS比率。在完全溶解后，將溶液的pH設(shè)定在5。然后使用振動泵在44分鐘內(nèi)加入ADH(8.9mgADH/mgPS,以100mg/ml溶解在0.2MNaCl中)(盡管如此仍存在過量的ADH，直接加入應(yīng)當也是可以的)。將pH保持在5.0±0.1，并在120分鐘(44'+76')內(nèi)保持調(diào)控。通過使用氫氧化鈉增加pH至7.5終止反應(yīng)。衍生化的百分率等于3.7%(mgADH/mgPS)。TNBS劑量為220嗎/ml，PS劑量為5902嗎/ml，因此有1.26pmolADH/17,44)iimol重復(fù)單元(，moI活性COOH基團)。因此，7.22%的PS3羧基為ADH修飾的COOH基團。滲濾PS3AH衍生物經(jīng)滲濾以去除未反應(yīng)的ADH和EDAC副產(chǎn)物。在UFP-30-C-H24LA膜(42cm2，30kDa截流分子量)上進行滲濾。溶液對23倍體積的0.2MNaCl透析。通過在滲濾5、10、15和20倍體積后定量透過液中的ADH(TNBS測定)進行滲濾步驟的跟蹤。經(jīng)0.22pm過濾最后在0.22iam截流膜(Millipack40)上以10ml/分鐘的流速過濾PSAH。然后將過濾的PS3ah儲存于4°C。PS3AH-TT綴合物處理條件如下初始PS3ah濃度2mg/ml的2MNaCl溶液，初始TT/PS3AH比率1.5/1(重量/重量)，EDAC濃度0.5mg/mgPS，TT濃度10mg/ml的0.15MNaCl溶液。用0.2MNaCl稀釋50mgPS3AH，以獲得2mg/ml的PS終濃度。用0.2MNaCl稀釋純化的TT溶液，以獲得10mg/ml的濃度。將PS3AH和TT溶液混合在一起。用HC1將pH調(diào)節(jié)至5.0±0,05。在IO分鐘內(nèi)手動加入EDAC(每分鐘加入相等部分的等份試樣)。所得溶液于+25。C在攪拌和pH調(diào)控下溫育110分鐘，以獲得120分鐘的最終偶聯(lián)時間。然后，通過加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分鐘。最后用5pm膜澄清綴合物，并注射到SephacrylS400HR柱上。結(jié)論使用碳二亞胺化學(xué)法在綴合步驟中制備不同的綴合物。在反應(yīng)溶液中加入的最后組分可為TT蛋白或EDAC試劑。加入時間對所得的綴合物可能有一定影響。PS3MTT215和217綴合物使用相同的組分和條件制備這兩種綴合物。這兩種綴合物中加入最后組分的方式是不同的。PS3AHTT217綴合物產(chǎn)生的產(chǎn)物滿足體外標準。該產(chǎn)物通過在IO分鐘內(nèi)加入EDAC制備。但是，PS3ahTT215綴合物無法在無菌膜上過濾。對于此綴合物，在反應(yīng)介質(zhì)中加入的最后組分是TT(在IO分鐘內(nèi))。這兩種綴合物的最終TT/PS比率明顯不同(0.98/1對0.50/1)。如果首先向PSah(同時具有活性氨基和羧基)加入EDAC，則這可導(dǎo)致多糖上存在的肼基和羧基內(nèi)部交聯(lián)，因此可在于IO分鐘內(nèi)加入TT后產(chǎn)生更多具有更差的最終比率的交聯(lián)綴合物。對PS3AHTT217綴合物未觀察到該作用。通過在10分鐘內(nèi)加入EDAC使TT摻入完成得較好，這可能歸因于較低的內(nèi)部交聯(lián)以及PS3ah的肼基和蛋白的羧基之間較好的相互交聯(lián)。對218綴合物而言，由于PS3EDAC衍生化僅部分衍生化多糖(以保持大部分多糖表位的完整性)，又同時存在活性氨基和羧基，因此這是在最終綴合步驟中緩慢加入EDAC也有益的原因。但是，在最終綴合步驟中緩慢加入TT對其中TT被ADH衍生化(并包含氨基和羧基)的208綴合物是有益的，而PS3留下其天然-OH和-COOH活性基團作為其重復(fù)亞基的一部分。將EDAC加入到PS3中沒有以上交聯(lián)作用，緩慢加入衍生化TT所得的綴合物具有良好的體外特征一參見下文。體外特征:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*相對于208綴合物實施例lc一本發(fā)明的傷寒沙門氏菌Vi多糖綴合物的制備通過Emulsiflex分級給PS稱重(以15%理論含水量為準)。將天然PS以初始濃度7mg/ml在WFI中溶解過夜。在分級前，用10|nm截流濾器以50ml/分鐘流速澄清天然PS的溶液。在活化步驟前使用勻漿器EMULSIFLEXC-50裝置降低多糖的分子量和粘度。分級效率取決于循環(huán)壓力、活塞補給壓力和總循環(huán)次數(shù)。為了提升分級效率(并因此降低總循環(huán)次數(shù))，用具有固定幾何形狀的室(MicrofluidicsF20Y-0.75|im互作室)替換Emulsiflex的勻4匕室。分級的目標是降j氐PS的分子量和粘度，而其抗原性沒有關(guān)鍵下降。以15000±500psi進行尺度降低，之后在處理過程中進行粘度檢測。當達到5.0±0.3cp的目標時停止分級。分級的PS經(jīng)0.22|im過濾在Millipak40膜(截流0.22mm)上以10ml/分鐘的流速過濾分級的PS。過濾的分級PS儲存于-20。C。多糖Vi的衍生化于25。C在攪拌下將1.5g分級的ViPS溶解在EPI中(5mg/ml)。將13.35gADH(8.9mgADH/mgPS)加入PS溶液。在完全溶解后，用1NHC1調(diào)節(jié)pH至pH5.0±0.05。加入固體形式的EDAC(O.lmg/mgPS)。將溶液置于25。C達60分鐘。然后通過加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在25。C放置至少30分鐘(最長2小時)。使用TNBS劑量(mgADH/100mgPS)估計衍生化水平為4.55%。TNBS劑量為200pg/ml,PS劑量為4034嗎/ml;因此，有0.0697pmolADH/16.46jumol重復(fù)單元(分子量245)。有1.3pmolADH/16.46pmolVi上的活性COOH基團，因此7%的ViCOOH基團是ADH修飾的COOH基團。PSViAH衍生物經(jīng)滲濾以去除未反應(yīng)的ADH和EDAC副產(chǎn)物。在centramate膜(0.09m2，10kDa截流分子量)上進行滲濾。溶液對20倍體積的0.2MNaCl透析。通過在滲濾3、5、10和20倍體積后定量透過液中的ADH(TNBS測定)進行滲濾步驟的跟蹤。經(jīng)0.22nm過濾最后在0.22pm截流膜(Millipack40)上以10ml/分鐘的流速過濾PSViAH。然后將過濾的PSVUh于+2/十8。C儲存最多4天。PSViAH-TT綴合物處理條件如下初始PSViAH濃度2mg/ml的0.2MNaCl溶液，初始TT/PSViAH比率2.5/1(重量/重量)，EDAC濃度:0.25mg/mgPS，TT濃度:10mg/ml的0.2MNaCl溶液。用0.2MNaCl稀釋1gPSViAH，以獲得2mg/ml的PS終濃度(糖醛酸劑量)。用0.2MNaCl稀釋純化的TT溶液，以獲得10mg/ml的濃度。將TT加入到PSVUh溶液中，以便達到2.5mgTT/mgPS的最終比率。用1NHCl將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.05。然后加入EDAC溶液(7.5mg/ml的0.1MTrispH7.5溶液)(在10分鐘內(nèi)并使用振動泵)，以達到0.25mgEDAC/mgPSViAH。所得溶液于+25。C在攪拌和pH調(diào)控下溫育50分鐘，以獲得60分鐘的最終偶聯(lián)時間。然后，通過加入1MTris-HClpH7.5中和溶液，并在+25。C放置30分鐘。綴合物于4。C轉(zhuǎn)移，并在層析步驟前于持續(xù)緩慢攪拌下放置過夜。純化在SephacrylS400HR上洗脫前，使用10Kleenpak濾器澄清綴合物。流速固定在100ml/分鐘。然后將綴合物注射到SephacrylS400HR上，基于Kd值收集合并液。使用以下標準進行合并液收集由280nm的OD=0.05開始收集，當Kd=0.22時終止。過濾除菌在過濾前，使母液回到室溫。然后綴合物在Opticap4"除菌膜上過濾。流速固定在30ml/分鐘。分析所得綴合物的最終TT/PS比率(重量/重量)為2.44/1，游離PS含量為3.7%,ocPS/ocPS抗原性為58%。實施例ld—其它多糖綴合物的制備通過Chu等(InfectionandImmunity1983，40(1);245-256)開發(fā)的偶聯(lián)化學(xué)法進行流感嗜血桿菌(Hib)PRP多糖與TT的共價結(jié)合。通過加入CNBr并于pH10.5溫育6分鐘活化HibPRP多糖。降低pH至pH8.75,加入己二酸二酰肼(ADH)，再繼續(xù)溫育90分鐘。使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)經(jīng)碳二亞胺縮合將活化的PRP偶聯(lián)至純化的破傷風(fēng)類毒素。向活化的PRP中加入EDAC，以達到0.6mgEDAC/mg活化的PRP的最終比率。調(diào)節(jié)pH至5.0，加入純化的破傷風(fēng)類毒素，以達到2mgTT/mg活化的PRP。所得溶液在溫和攪拌下放置3天。在通過0.45pm膜過濾后，在用0.2MNaCl平衡的sephacrylS500HR(Pharmacia,Sweden)柱上純化綴合物。MenC-TT綴合物使用天然多糖(按MALLS測量超過150kDa)生產(chǎn)，或稍微微流化。使用按實施例2的MALLS法測量超過60kDa的天然多糖或稍樣"鼓流化的多糖生產(chǎn)MenA-TT綴合物。使用按MALLS(參見實施例2)測得約100-200kDa的已分級多糖生產(chǎn)MenW和MenY-TT綴合物。使用勻漿器EmulsiflexC-50裝置通過微流化分級。然后通過0.2|um濾器過濾多糖?；罨椭苯优悸?lián)如在WO96/29094和WO00/56360中所述進行。簡單地講，將在2MNaClpH5.5-6.0中10-20mg/ml濃度的多糖與CDAP溶液(IOOmg/ml在乙腈/WFI(50/50)中新鮮制備的溶液)混合，達到0.75/1或1.5/1的最終CDAP/多糖比率。1.5分鐘后，用氬氧化鈉將pH升高至pH10.0。3分鐘后，加入破傷風(fēng)類毒素，以達到1.5/1(MenW)、1.2/1(MenY)、1.5/1(MenA)或1.5/1(MenC)的蛋白/多糖比率。反應(yīng)持續(xù)1-2小時。在偶聯(lián)步驟后，加入甘氨酸至7.5/1的甘氨酸/PS(重量/重量)最終比率，調(diào)節(jié)pH至pH9.0?；旌衔锓胖?0分鐘。使用10|LimKleenpak濾器澄清綴合物，然后加到SephacrylS400HR柱上，使用洗脫緩沖液150mMNaCl、10mM或5mMTrispH7.5。在Opticap4除菌膜上過濾臨床批。所得綴合物的平均多糖:蛋白比率為1:1-1:5(重量/重量)。實施例2——使用MALLS測定分子量將檢測器偶聯(lián)至HPLC大小排阻柱，從該柱洗脫出樣品。一方面，激光散射檢測器檢測大分子溶液在16個角度散射的光強度，另一方面，在線放置的干涉折射計允許測定洗脫的樣品量。根據(jù)這些強度可以確定溶液中大分子的大小和形狀。重量的平均分子量(Mw)定義為所有物質(zhì)的重量乘以它們各自的分子量的和再除以所有物質(zhì)的重量和。a)重均分子量-Mw-b)數(shù)均分子量-Mn-c)均方根半徑-尺-和112是平方半徑，定義為:2、2Rw或(r)w=~",''——,w，r2(-m廣是發(fā)散中心i的質(zhì)量，-r廣是發(fā)散中心i和大分子重力中心之間的距離)。d)多分散性定義為比率-Mw/Mn-。通過將腦膜炎球菌多糖加到聯(lián)用的兩個HPLC柱(TSKG6000和5000PWxI)上，并借助于MALLS對腦膜炎球菌多糖進行分析。將25(il多糖加到所述柱上，并用0.75ml過濾水洗脫。使用光散射檢測器(WyattDawnDSP，配有10mW的488nm氬激光)和干涉折射計(WyattOtilabDSP,配有P100傳感器和498nm紅色濾光片)檢測多糖。所有樣品的分子量多分散性和回收率都使用Astra4.72軟件中的1級多項式擬合通過Debye法計算。實施例3—評價連接物在MenACWY綴合疫苗中的MenA中作用的臨床實驗在1:1:1:1:1隨機實驗中，將單劑不同的MenACWY疫苗制劑給5組25名15-19歲的青少年受試者施用。測試的制劑為Fl—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA綴合物中含有AH(ADH)間隔基(按照實施例1制備)一5/5/5/5嗎F2—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA綴合物中含有AH間隔基(按照實施例1制備)一2.5/5/2.5/2.5|ugF3—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA綴合物中含有AH間隔基(按照實施例1制備)一5/5/2.5/2.5嗎F4—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，在任何綴合物中都沒有間隔基一5/5/5/5嗎對照組一MencevaxACWY接種后30天，取受試者血樣。血樣用于評價疫苗接種后1個月SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW135和SBA-MenY應(yīng)答者的百分率。疫苗應(yīng)答定義為1)對于初始血清陰性受試者一在接種后1個月時的抗體效價>1/32,或2)對于初始血清陽性受試者一抗體效價>接種前抗體效價的4倍。結(jié)果如在下表中所示，在MenA綴合物中使用間隔基導(dǎo)致抗MenA的免疫應(yīng)答增加。加入AH間隔基時應(yīng)答者的百分率由66%升高至90-95%。這可反映為SBAGMT從4335增加至10000，以及GMC由5增加至20-40。令人驚奇的是，使用AH間隔基還導(dǎo)致抗MenC的免疫應(yīng)答增加，這可由應(yīng)答者的百分率增加和SBAGMT的增加看出。當引入間隔基時，還可以看到抗MenY(6742-7122)和抗MenW(4621-5418)的SBA-GMT增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實施例4—評價連接物在MenACWY綴合疫苗中的MenA和MenC綴合物中的作用的臨床實驗在1:1:1:1:1隨機實驗中，將單劑不同的MenACWY疫苗制劑給5組25名15-19歲的青少年受試者施用。測試的制劑為Fl—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA和MenC綴合物中含有AH間隔基(按照實施例1制備)一2.5/2.5/2.5/2.5|tigF2—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA和MenC綴合物中含有AH間隔基(按照實施例1制備)一5/5/2.5/2.5嗎F3—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA和MenC綴合物中含有AH間隔基(按照實施例1制備)一5/5/5/5嗎F4—MenACWY與破傷風(fēng)類毒素綴合，MenA綴合物中含有AH間隔基(按照實施例1制備)一5/5/5/5嗎對照組一MencevaxACWY接種后30天，取受試者血樣。血樣用于評價疫苗接種后1個月SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW135和SBA-MenY應(yīng)答者的百分率。疫苗應(yīng)答定義為1)對于初始血清陰性受試者一在接種后1個月時的抗體效價>1/32，或2)對于初始血清陽性受試者一抗體效價>接種前抗體效價的4倍。結(jié)果如在下表中所示，MenC綴合物中引入AH間隔基導(dǎo)致抗MenC的免疫應(yīng)答增加。這表現(xiàn)為SBAGMT由1943增加至4329，以及抗PSCGMC由7.65增加至13.13。抗MenA、MenW和MenY的良好免疫應(yīng)答得以保持。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>權(quán)利要求1.一種使用碳二亞胺縮合化學(xué)法將糖與蛋白載體綴合的方法，其中所述糖包含(例如作為其重復(fù)單元的一部分)或經(jīng)衍生化后包含氨基和/或羧基，其中所述蛋白載體包含或經(jīng)衍生化后包含氨基和/或羧基，所述方法包括以下步驟I)如果所述蛋白載體同時包含氨基和羧基，而所述糖包含氨基和羧基之中的任一個，則a)將糖和進行綴合所需的等份碳二亞胺混合，和b)在35秒至6小時的時間段內(nèi)加入所需的等份蛋白載體；II)如果所述糖同時包含氨基和羧基，而所述蛋白載體包含氨基和羧基之中的任一個，則a)將蛋白載體和進行綴合所需的等份碳二亞胺混合，和b)在35秒至6小時的時間段內(nèi)加入所需的等份糖；III)如果所述糖同時包含氨基和羧基，而且所述蛋白載體也同時包含氨基和羧基，則a)將蛋白載體和糖混合，和b)在35秒至6小時的時間段內(nèi)加入進行綴合所需的等份碳二亞胺。2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)中的所述時間段為50秒至5小時、1分鐘至4小時、2分鐘至3小時、3分鐘至2小時、4-60分鐘、5-50分鐘、6-40分鐘、7-30分鐘或8-20分鐘。3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)中的所述時間段為1分鐘至5小時、10分鐘至4小時、20分鐘至3小時、30分鐘至2小時、40-90分鐘或50-70分鐘。4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述碳二亞胺是EDAC(l-乙基-3-(3-二曱基-氨基丙基)碳二亞胺)或非EDAC的碳二亞胺。5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述進行綴合所需的等份碳二亞胺為每mg糖0.01-3mg、0.05-2mg或0.09-1mg碳二亞胺。6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述糖和/或蛋白載體經(jīng)衍生化后包含氨基或羧基。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述衍生化是通過加入異雙官能連接物或同雙官能連接物實現(xiàn)的。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述連接物具有4-12個碳原子。9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述連接物具有兩個活性氨基。10.權(quán)利要求7-9中任一項的免疫原性組合物，其中所述連接物是ADH。11.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述連接物具有兩個活性羧基。12.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述連接物在其一端具有活性氨基，而在其另一端具有活性羧基。13.權(quán)利要求7-12中任一項的方法，其中所述衍生化通過使大量過量的連接物與要衍生化的糖和/或蛋白載體反應(yīng)而發(fā)生。14.權(quán)利要求7-13中任一項的方法，其中所述糖包含作為其重復(fù)單元的一部分的活性羥基，所述糖經(jīng)連接物上的氨基被部分衍生化。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述糖用CDAP化學(xué)法部分衍生化。16.權(quán)利要求7-13中任一項的方法，其中所述糖包含作為其重復(fù)單元的一部分的活性氨基，所述糖經(jīng)連接物上的羧基被部分衍生化。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述糖用碳二亞胺縮合化學(xué)法部分衍生化。18.權(quán)利要求7-13中任一項的方法，其中所述糖包含作為其重復(fù)單元的一部分的活性羧基，所述糖經(jīng)連接物上的氨基被部分衍生化。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述糖用碳二亞胺縮合化學(xué)法部分衍生化。20.權(quán)利要求1-19中任一項的方法，其中步驟b)中的所述等份碳二亞胺、糖或蛋白載體使用泵以恒定速率加入。21.權(quán)利要求1-19中任一項的方法，其中步驟b)中的所述等份碳二亞胺、糖或蛋白載體在所述時間段內(nèi)分階段加入。22.權(quán)利要求21的方法，其中在前半個時間段加入至少1/4等份試樣，在后半個時間段加入至少1/4等份試樣。23.權(quán)利要求21或22的方法，其中等份試樣'a，以4-100個階段's，力口入。24.權(quán)利要求23的方法，其中在每個階段加入a/s等份試樣。25.權(quán)利要求23或24的方法，其中如果1個階段在時間段'p，的0時發(fā)生，則隨后的每個階段都在為p/(s-l)的時刻發(fā)生。26.權(quán)利要求1-25中任一項的方法，其中所述糖在步驟b)中以0.5-50mg/ml的終濃度存在。27.權(quán)利要求1-26中任一項的方法，其中蛋白載體與糖的初始比率為5:1至1:5、4:1至1:1或者3:1至2:1(重量/重量)。28.權(quán)利要求1-27的方法，其中在步驟b)中存在的鹽例如NaCl的濃度為0-2M、0.1-1M或0.2-0.5M。29.權(quán)利要求1-28中任一項的方法，其中蛋白載體在步驟b)中以1-50mg/ml的終濃度存在。30.權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中步驟b)中的反應(yīng)pH保持在pH4.5-6.5、4.7-6.0或5-5.5。31.權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中在步驟b)的反應(yīng)中還存在N-羥基琥珀酰亞胺，步驟b)中的反應(yīng)pH保持在pH4.5-7.5。32.權(quán)利要求1-31中任一項的方法，其中步驟b)中的反應(yīng)溫度保持在4-37。C、10-32°C、17-30。C或22-27。C。33.權(quán)利要求1-32中任一項的方法，其中所述等份試樣在步驟b)中已全部加入后，將反應(yīng)再保持10分鐘至72小時、20分鐘至48小時、30分鐘至24小時、40分鐘至12小時、50分鐘至6小時或1-3小時。34.權(quán)利要求1-33中任一項的方法，其中所述反應(yīng)一完成就將pH調(diào)節(jié)至7.5-9。35.權(quán)利要求1-34中任一項的方法，所述方法包括后續(xù)步驟c)，其中糖-蛋白綴合物在大小排阻層析柱上純化。36.權(quán)利要求1-35中任一項的方法，所述方法包括后續(xù)步驟d)，其中糖-蛋白綴合物經(jīng)過濾除菌。37.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，所述方法包括后續(xù)步驟e)，其中將有效劑量的糖-蛋白綴合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制，以生產(chǎn)免疫原性組合物或疫苗。38.權(quán)利要求1-37中任一項的方法，其中所述糖是細菌莢膜糖，所述細菌莢膜糖例如從選自以下的細菌獲得腦膜炎奈瑟氏球菌(Wmem'"g/"tfc)血清群A、B、C、W135或Y，月申炎鏈球菌(&re/tococcwp"ezwzo"/ae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F,B群鏈球菌Ia、Ib、II、III、IV、V、VI或VII型，金黃色葡萄球菌(5Vap/zy/ococcwsawrew"5型、金黃色葡萄球菌OStop/zy/ococcwsawrei^)8型、傷寒沙門氏菌CSa/wo"e〃a(Vi糖)、霍亂弧菌(^n'oc/zo/erae)或流感嗜血桿菌(H/"/7we"zae)b型。39.權(quán)利要求1-38中任一項的方法，其中所述糖的重均分子量為1000-2000000、5000-1000000、10000-500000、50000-400000、75000-300000或100000-200000。40.權(quán)利要求1-39中任一項的方法，其中所述糖是天然多糖，或者以不超過x10的因數(shù)被分級(例如通過微流化法)。41.權(quán)利要求1-37中任一項的方法，其中所述糖是細菌脂寡糖或脂多糖，例如從選自以下的細菌獲得腦膜炎奈瑟氏球菌(TV.附e剛'"g/"cfo)、流感嗜血桿菌(//.f"/7we"加e)、大腸桿菌(五.co")、沙門氏菌屬(5^/,we〃")或粘膜炎莫拉氏菌(Mca旨r/zato)。42.權(quán)利要求1-41中任一項的方法，其中所述蛋白載體包含一個或多個T輔助表位。43.權(quán)利要求1-42中任一項的方法，其中所述蛋白載體選自TT、DT、CRM197、TT的C片段、流感嗜血桿菌的D蛋白、肺炎球菌PhtD和肺炎球菌溶血素。44.一種糖-蛋白載體綴合物，其通過權(quán)利要求1-43中任一項的方法獲4尋。45.—種免疫原性組合物或疫苗，其通過權(quán)利要求1-43中任一項的方法獲得。46.權(quán)利要求45的免疫原性組合物或疫苗在制備用于預(yù)防或治療疾病的藥物的用途。47.—種預(yù)防或治療疾病的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效劑量的權(quán)利要求45的免疫原性組合物或疫苗。48.權(quán)利要求46或47的用途和方法，其中所述疾病是由選自以下的細菌引起的腦膜炎奈瑟氏球菌(Wmem'"&^fo)，肺炎鏈球菌()SVrepfococcus/wewmow/ae)、津占膜炎莫氏4立菌(Mcatorr/za/^),B群鏈球菌(GroupBStreptococcus)、金黃色葡萄球菌(5"to//2y/ococcwsawrew》、傷寒沙門氏菌0Sa/附o"e〃a/)^/h')、霍亂弧菌(KZ6n'oc/zo/erae)、大腸桿菌(￡.co/Z)或流感嗜血桿菌(//./w/7wewzae)。全文摘要本申請公開了一種使用碳二亞胺縮合化學(xué)法進行糖-蛋白綴合反應(yīng)的改進方法。根據(jù)所涉及的糖或蛋白載體的性質(zhì)，可通過向反應(yīng)混合物中緩慢加入其中一種反應(yīng)組分，改善所得綴合物的品質(zhì)。本申請還提供免疫原性組合物，其中包含通過所公開的方法制備的糖-蛋白綴合物。文檔編號A61K39/095GK101247827SQ200680031178公開日2008年8月20日申請日期2006年6月23日優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日發(fā)明者P·迪維維耶,R·L·比曼斯申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司