專利名稱：：包含具免疫刺激序列iss之寡核苷酸的疫苗其中iss與抗原綴合并通過緩沖條件和其他...的制作方法包含具免疫刺激序列ISS之寡核苷酸的疫苗其中ISS與抗原綴合并通過緩沖條件和其他賦形劑穩(wěn)定與相關(guān)申請交互參考本申請要求在2005年3月4日遞交的美國臨時專利申請60/658,947的優(yōu)先外又，其公開內(nèi)容在本文整體引用作為參考。關(guān)于聯(lián)邦發(fā)起的研究或項目的陳述不適用。關(guān)于壓縮盤附件不適用。
背景技術(shù)：
：消退不同病理的免疫應(yīng)答(如在病毒感染、細菌感染、癌癥和變應(yīng)性反應(yīng)中觀察到的那些)對宿主的整體健康非常重要。成功消退感染、癌癥或變應(yīng)性反應(yīng)可能取決于免疫應(yīng)答的類型和強度。免疫接種(其中使用抗原引起進一步的免疫應(yīng)答)可能有助于成功地消退感染、癌癥和/或變應(yīng)性反應(yīng)。WO98/16247公開了免疫刺激多核苷酸-免疫調(diào)節(jié)分子綴合物的組合物。WO01/35991中描述了含有與抗原連接的免疫刺激序列的免疫調(diào)節(jié)組合物。使用免疫調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法公開于WO01/12223。本文所述所有出版物、參考文件、專利申請、專利出版物和專利在本文引用其整體作為參考。發(fā)明概述本文提供了包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物，其中綴合物分子包含綴合配偶體以及包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，其中所述組合物還包含能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分。在一些實例中，綴合物配偶體為抗原，例如變應(yīng)原。在其他實例中，變應(yīng)原選自甲殼動物變應(yīng)原、昆蟲變應(yīng)原、哺乳動物變應(yīng)原、軟體動物變應(yīng)原、植物變應(yīng)原和真菌變應(yīng)原。在其他實例中，變應(yīng)原為植物變應(yīng)原豚草(Ragweed)抗原Amba1。在一些實例中，綴合物分子為如本文所述的AIC。在一些實例中，于約2°C至約8°C的溫度，經(jīng)直角光散射(RightAngleLightScatter,RALS)測量，組合物包含多于約70%非聚集體形式的所述綴合物分子。在其他實例中，于約2'C至約8"C的溫度，經(jīng)直角光散射(RALS)測量，組合物包含多于約80%、多于約90%、多于約95%或多于約97%非聚集體形式的所述綴合物分子。在其他實例中，包含綴合物配偶體的組合物包含能夠維持pH的組分，所述組分選自非極性組分和非負電荷組分。在其他實例中，能夠維持pH的組分為組氨酸。在一些實例中，組氨酸以約1mM至約50mM的濃度存在于組合物中。在其他實例中，組氨酸以約5mM至約20mM的濃度存在于組合物中。又在其他實例中，能夠維持pH的組分為磷酸鹽。在一些實例中，磷酸鹽以約5mM至約50mM的濃度存在于組合物中，而在其他實例中，為約20mM至約50mM。在一些實例中，組合物具有約6.0至約9.0的pH范圍。在一些實例中，組合物具有約7.0至約8.0的pH范圍；而在其^f也實例中，pH范圍約7.5至約8.0。在一些實例中，綴合物分子包含ISS，所述ISS包含六聚體基序AACGTT。在其他實例中，ISS包含基序GACGCTCC;GACGTCCC;GACGTTCC;GACGCCCC;AGCGTTCC;AGCGCTCC;AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTCCC;AACGCCCC;AACGTTCC;AACGCTCC;GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;GACGCTCG;GACGTCCG;GACGCCCG;GACGTTCG;AGCGCTCG;AGCGTTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;AACGTCCG;AACGCCCG;AACGTTCG;AACGCTCG;GGCGTTCG;GGCGCTCG;GGCGTCCG;GGCGCCCG;GACGCT;GACGTC;GACGTT;GACGCC;GACGCU;GACGUC;GACGUU;GACGUTGACGTU;AGCGTT;AGCGCT;AGCGTC;AGCGCC;AGCGUUAGCGCU;AGCGUC;AGCGUT;AGCGTU;AACGTQAACGCCAACGTT;AACGCT;AACGUC;AACGUU;AACGCU;AACGUT:AACGTU;GGCGTT;GGCGCT;GGCGTC;GGCGCC;GGCGUUGGCGCU;GGCGUC;GGCGUT或GGCGTU。又在其他實例中，ISS包含序列5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:1);5，-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA誦3，(SEQIDNO:2);5，-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA國3，(SEQIDNO:3);5，-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3,(SEQIDNO:4);5，-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC3，(SEQIDNO:5);5，-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3,(SEQIDNO:6);5，-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:7)或5，畫TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3，(SEQIDNO:8),其中B為5-溴胞嘧咬。在其他實例中，ISS包含5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，。在一些實例中，綴合物配偶體為抗原，而在其他實例中為變應(yīng)原。又在其他實例中，變應(yīng)原選自甲殼動物變應(yīng)原、昆蟲變應(yīng)原、哺乳動物變應(yīng)原、軟體動物變應(yīng)原、植物變應(yīng)原和真菌變應(yīng)原。在其他實例中，變應(yīng)原為植物變應(yīng)原豚草抗原Amba1。在一些實例中，包含綴合物配偶體的組合物還包含選自組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一些實例中，M酸為甘氨酸；在一些實例中，甘氨酸以約230mM至約285mM的濃度存在于組合物中。在其他實例中，組合物還包含選自乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、山梨糖醇和葡萄糖的糖類。在一些實例中，糖類為蔗糖。在一些實例中，蔗糖以約1%至10%的濃度存在于組合物中。在其他實例中，糖類為山梨糖醇。在一些實例中，山梨糖醇以約3%至約5%的濃度存在于組合物中。又在其他實例中，本文提供包含綴合物分子、濃度范圍約lmM至約50mM的組氨酸、和濃度范圍約50mM至約300mM的甘氨酸的組合物，其中所述組合物具有約6.0至約9.0的pH范圍。在其他實例中，本文提供的包含綴合物分子的組合物還包含約1%到10%范圍的山梨糖醇或約200mM至約250mM濃度的蔗糖。在一些實例中，組合物具有約7.0至約8.0的pH范圍。在其他實例中，本文提供包含綴合物分子、5mM組氨酸和285mM甘氨酸，pH范圍約7.0至約8.0的組合物。在其他實例中，本文提供包含綴合物配偶體、20mM組氨酸和270mM甘氨酸，pH范圍約7.0至約8.0的組合物。在其他實例中，本文提供包含20mM組氨酸、50mM甘氨酸和3.8。/o山梨糖醇，pH范圍約7.0至約8.0的組合物。在其他實例中，本文提供包含20mM組氨酸、50mM甘氨酸和210mM蔗糖，pH范圍約7.0至約8.0的組合物。本發(fā)明提供液體形式的、凍干形式的和從凍干形式重構(gòu)的液體形式的組合物。本發(fā)明還提供用于制備和使用本文所述組合物(其包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子，例如但不僅限于AIC)的方法，和包含這類組合物的試劑盒和制口口o附圖簡述圖l顯示如實施例5中所述通過RALS確定的離子強度、時間和溫度對AIC的影響。對照為10mM磷酸鈉、141.7mMNaCl,pH7.2(從左至右的棒為各對照和NaCl濃度的tO、t730C、t740C、t1430C)。圖2A-2C顯示如實施例5所述在t7(30。C)時0.1MNaCl基礎(chǔ)緩沖液(BB)中AIC的SEC-HPLC層析圖。圖2A為215nm;圖2B為260nm;圖2C為280nm。圖3顯示如實施例5中所述通過外源熒光測量的pH、時間和溫度對AIC的影響。對照為10mM磷酸鈉、141.7mMNaCl，pH7.2(從左至右的才奉為各pH值的tO、t7-30C、t7-40C、tl4-30)。圖4A-4C.圖4A顯示pH對AIC:t0SEC-HPLC(215nm)的影響。圖4B顯示pH、時間和溫度(40。)對AIC:t7SEC-HPLC(215nm)的影響。圖4C顯示pH、時間和溫度(30匸)對AIC:t14SEC-HPLC(215nm)的影響。對照為10mM磷酸鈉、141.7mMNaCl，pH7.2。。/oMRc為"/o單體回收；VoTotRc為o/?？偦厥眨磺襇Rect0為0時間的單體回收(對圖4A而言，從左至右的棒為各Ctl(對照)、PBS對照和各pH值的％非聚集體、％MRc和。/。TotRc。對于圖4B-4C，從左到右的棒為各Ctl(對照)、PBS對照和各pH值的。/。非聚集體、％MRc和％TotRc)。圖5顯示如實施例中所示通過RALS測量的組分組合、時間和溫度對AIC的影響。PBS對照為10mM砩酸鈉、141.7mMNaCl，pH7.2(從左到右的才奉為各組合物的t0、t7、tl4和t28)。發(fā)明詳述本文描述了包含綴合物分子的組合物，其中綴合物分子包含綴合物配偶體和包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)組合物中綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性取決于溫度、鹽和pH條件。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當在包含磷酸鈉和氯化鈉的組合物中于2-8'C以液體貯存時，包含抗原的綴合物分子隨時間發(fā)生聚集。還發(fā)現(xiàn)低pH引起包含抗原的綴合物分子在低離子強度的條件下可逆地聚集。本文提供了開發(fā)用于最小化或降低綴合物分子聚集的組合物，以及用于制備和使用這類組合物的方法。本文描述了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子于約2'C至約8'C的溫度結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在一些實例中，綴合物分子包含抗原，例如變應(yīng)原。在一些實例中，變應(yīng)原為經(jīng)純化的短豚草抗原(Ambal)。因此，本文提供了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子包含于約2'C至約8'C結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Amba本文描述了包含綴合物分子和能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分。在一些實例中，組合物包含多于70%,多于80%，多于卯％，多于95%，多于97%,多于98。/o或多于99。/o的于約2。C至約8。C的溫度為非聚合體形式的所述綴合物分子。在一些實例中，組合物包含多于70%,10多于80%,多于90%,多于95%或多于97%的在至多約1周、至多約2周、至多約3周、至多約4周、至多約6周、至多約8周、至多約10周、至多約12周、至多約14周、至多約16周、至多約18周、至多約20周、至多約22周、至多約24周、至多約1年或至多約2年的時期內(nèi)為非聚集體形式的所述綴合物分子。在一些實例中，聚集通過直角光散射(RALS)測量。在其他實例中，組合物中綴合物分子的聚集通過內(nèi)源熒光(IF)、外源熒光(EF)和/或SEC-HPLC測量，其可與RALS組合或不與之組合。在一些實例中，綴合物分子包含抗原。抗原的實例為本領(lǐng)域已知，但不僅限于肽、脂質(zhì)、多糖、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。在一些實例中，抗原為變應(yīng)原。變應(yīng)原的實例為本領(lǐng)域已知并在文中描述，且包括但不僅限于甲殼動物變應(yīng)原、昆蟲變應(yīng)原、哺乳動物變應(yīng)原、軟體動物變應(yīng)原、植物變應(yīng)原和真菌變應(yīng)原。在一些實例中，變應(yīng)原為植物變應(yīng)原，例如豚草抗原。在一些實例中，變應(yīng)原為Ambal。因此，本文提供了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子包含Amba1,所述組合物還包含能夠?qū)⒔M合物pH范圍穩(wěn)定在約6.0至約9.0的組分，其中所述組合物包含多于約70%,多于約80%,多于約90%，多于約95%或多于約97%的于約2'C至約8'C的溫度為非聚集體形式的所述綴合物分子。在其他實施例中，包含綴合物分子的組合物還可包含以下的一種或多種l)氨基酸，2)糖類，3)表面活性劑，或4)其他合適的組分，只要組合物包含多于約70%,多于約80%,多于約90%，多于約95%或多于約97。/。的非聚集體形式的包含Amba1的所述綴合物分子。在一些實例中，組合物為液體形式。在其他實例中，組合物被凍干，并在其他實例中，組合物為從凍干形式重構(gòu)的液體形式。本文描述了包含綴合物分子的組合物，其中組合物中存在的綴合物分子少于約30%、少于約20%、少于約10%、少于約5%或少于約3%在約2'C至約8。C的溫度為聚集體形式。在一些實例中，組合物中存在的綴合物分子少于約30%、少于約20%、少于約10%、少于約5%或少于約3%在約2。C至約8。C的溫度在至多約1周、至多約2周、至多約3周、至多約4周、至多約6周、至多約8周、至多約10周、至多約12周、至多約14周、至多約16周、至多約18周、至多約20周、至多約22周、至多約24周、至多約l年或至多約2年的時期內(nèi)為聚集體形式。在一些實例中，組合物中綴合物分子的聚集通過直角光散射(RALS)測量。在一些實例中，綴合物分子包含抗原。通?？乖瓰殡摹⒅|(zhì)(例如除膽固醇外的固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。在一些實例中，抗原包括但不僅限于來自傳染因子的抗原，所述傳染因子包括原生動物、細菌、真菌(包括單細胞的和多細胞的)和病毒傳染因子。例如，來自寄生生物的抗原包括來自血吸蟲物種(例如曼氏血吸蟲(S.w朋^w/))的血吸蟲卵抗原(例如Sm-p40)以及來自弓形蟲物種(例如剛地弓形蟲(7:gomft7))的抗原。參閱例:i口Stadecker等(1998)Pflrawte/附附wiC20:217-221;Subauste等(1993)Cw/t.O//"./附附mwo/.5:532-527。在一些實例中，抗原為變應(yīng)原。變應(yīng)原的實例為本領(lǐng)域已知并在文中描述，且包括但不僅限于甲殼動物變應(yīng)原、昆蟲變應(yīng)原、哺乳動物變應(yīng)原、軟體動物變應(yīng)原、才直物變應(yīng)原和真菌變應(yīng)原。在一些實例中，變應(yīng)原為植物變應(yīng)原，例如豚草抗原。在一些實例中，變應(yīng)原為Ambal。因此，本文提供了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子包含Ambal,其中組合物中存在的綴合物分子少于約30%、少于約20%、少于約10%、少于約5%或少于約3%在約2'C至約8。C的溫度為聚合體形式。本文提供了包含如本文所述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的制備和使用方法。本文提供了用于調(diào)節(jié)哺乳動物宿主免疫應(yīng)答的方法，包括向哺乳動物宿主施用包含如本文所述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物；包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的藥學(xué)組合物；包含這樣的組合物的試劑盒，所述組合物包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子；和包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的制品。在一些實例中，制品包括包含綴合物分子的組合物，其中所述組合物包含多于約70%、多于約80%、多于約90%、多于約95%或多于約97%的在約2'C至約8'C為非聚集體形式的綴合物。在一些實例中，聚集通過RALS測量。在其他實例中，制品包括包含綴合物分子的液體組合物，在其他實例中，制品包含包含綴合物分子的凍干的組合物。又在其他實例中，制品包含包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的(從凍干的組合物復(fù)原)被復(fù)原的液體組合物。一戯^除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用本領(lǐng)域分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)在諸:i口7k/o/ecw/"rC7owiVig.'j丄tf6onito/yAfffwwtf/，第二版(Sambrook等，1989);廂c/eW^fe5y",/re5^(MJ.Gait編，1984);爿w/加ff/CW/CW似尸e(R.I.Freshney編,1987);^m必ooA:6>/五;cpm'挑e"to//附附""o/ogy(D.M.Weir&CC.Blackwell編)；(7ewe7)vww/cfactors/orA/a附附tf//"wO/Zs(J.M.Miller&M.P.Calos編，1987);Cwrew,尸rotoco/s/wMo/ec"/ar^/o/ogy(F.M.Ausubel等編，1987);尸o/ymemseCA似Vii^a"/ofi，(Mullis等編，1994);CWreWProtocol/附附w"。/ogv(J,E.Coligan等編，1991);/附附MwoflM^(DavidWild編，StocktonPressNY，1994)以及3fe幼orfso//m附朋tf/og/cfl/^4wfl/戸's(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines編,Weinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH,1993)和Gennaro等2000，ie附/"，/1..幼eiSc/e"ceflwfif^P/rflr附aqv,第20版,LipincottWilliamsandWilkins:Baltimore,MD.的文獻中有充分說明。定乂除非另有說明，本文使用單數(shù)形式的"一"、"一個/一種"和"所述"包括復(fù)數(shù)指代。例如，"一"ISS包括一種或多種ISS。本文使用術(shù)語"免疫刺激序列"或"ISS，，是指引起體外、體內(nèi)和/或離體可測量免疫應(yīng)答的多核苷酸序列。可測量免疫應(yīng)答的實例包括，但不僅限于抗原特異抗體的產(chǎn)生、細胞因子的分泌、淋巴細胞群如NK細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞等的激活或擴增。優(yōu)選ISS序列優(yōu)先激活Thl型應(yīng)答。用于本發(fā)明的多核苷酸含有至少一個ISS。本文使用"ISS"也是含ISS多核香酸的簡稱。本文使用"綴合物分子"是指包含ISS(即含ISS多核苷酸)和綴合物配偶體的分子或復(fù)合物。在一些實例中，ISS和綴合物配偶體直接或間接相連。這類綴合物鍵包括共價和/或非共價鍵。綴合物配偶體包括但不僅限于抗原。"綴合物分子群"是指一群ISS-綴合物配偶體(即與綴合物配偶體直接或間接連接或附著的ISS)。就本發(fā)明目的而言，應(yīng)理解這類群體不必須具有，并可具有或不具有定量的ISS與各綴合物配偶體附著。一般地，給定的群體會具有分子量分布(基于給定群體中不同程度的綴合)，并因此具有與綴合物配偶體綴合的ISS平均數(shù)量。應(yīng)理解由于例如不完全綴合和/或純化，本文所述的任何綴合物分子群體可含有游離綴合物配偶體(即未與ISS連接的綴合物配偶體)和/或游離ISS(即未與綴合物配偶體連接的ISS)分子。就本發(fā)明的目的而言，本文所述群體含有綴合物分子，但是不必只包含綴合物分子。本文使用"AIC，，綴合物分子是指與ISS綴合的豚草變應(yīng)原Amba1。組合物中綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是指其中綴合物分子基本上保持其物理穩(wěn)定性和完整性的組合物。組合物中綴合物分子的物理穩(wěn)定性通過組合物中綴合物分子的聚集量，即百分比(％)來測量。一般地，組合物中綴合物分子升高的聚集％與組合物中綴合物分子降低的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)。組合物中綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不要求組合物中綴合物分子的0%聚集，或如果組合物中存在綴合物配偶體時0%的游離(即未綴合的)綴合物配偶體聚集，或如果組合物中存在ISS時0。/。的游離(即未綴合的)ISS聚集。包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物是指這樣的組合物，其中多于約70%、多于約80%、多于約90%、多于約95%或多于約97%的綴合物分子以非聚集體的形式存在于組合物中。本文關(guān)于綴合物分子使用的短語"非聚集體形式"包括但不僅限于單體形式的綴合物分子。一般地，組合物中綴合物分子提高的單體％與組合物中綴合物分子提高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)。因此，包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子的組合物是指(即包括)這樣的組合物，其中至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少95%和至少約97。/。的綴合物分子在約2'C至約8匸的溫度以單體形式存在于組合物中。包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物是指(即包括)這樣的組合物，其中少于約30%、少于約20%、少于約10%、少于約5%或少于約3%的綴合物分子以聚集體存在于組合物中。用于測量結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的多種方法可在本領(lǐng)域獲得并在本文公開，其包括但不僅限于單獨或與其他本領(lǐng)域已知并在文中描述的方法組合的直角光散射(RALS)，所述其他方法包括但不僅限于IF、EF和SEC-HPLC。在一些實例中，組合物中綴合物分子的聚集％通過RALS測量。包含"不穩(wěn)定"綴合物分子的組合物是組合物中具有多于約30%、多于約40%、多于約50%、多于約60%、多于約70%、多于約80%、多于約卯％或多于約95%的綴合物分子以聚集體形式存在的組合物。在給定群體中給定參數(shù)(例如含ISS多核苷酸的數(shù)量或質(zhì)量)的"均值，，是指整個群體的參數(shù)總和除以群體成員數(shù)量。例如，附著于綴合物配偶體的含ISS多核苷酸的平均數(shù)量是指在綴合物配偶體分子群體中每個綴合物配偶體上含ISS多核苷酸的平均數(shù)量(即含ISS多核苷酸的總數(shù)除以綴合物配偶體的總數(shù))。如下文所述，該數(shù)量通常通過例如光鐠法測量的相對于綴合配偶體的多核苷酸重量確定來獲得。給定群體的"中值"數(shù)或重量是指一半群體高于它、一半群體低于它的數(shù)量或重量。例如，每綴合物配偶體上含ISS多核苷酸的中位數(shù)是指群體中一半綴合物配偶體中其每綴合物配偶體上含ISS多核香酸數(shù)量更低，一半數(shù)量更高。如本文可互換使用的術(shù)語"多核苷酸，，和"寡核苷酸"包括單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)、經(jīng)修飾的寡核苷酸和寡聚核苷或其組合。寡核苷酸可以是線性或環(huán)狀構(gòu)型的，或寡核苷酸可線性或環(huán)狀區(qū)段兩者均含有。寡核苷酸為通常通過磷酸酯鍵結(jié)合的核苷多聚體。核苷由鍵合在糖上的嘌呤(腺噤呤或鳥噤呤，或其衍生物)或嘧咬(胸腺嘧咬、胞嘧咬或尿嘧咬，或其衍生物)威基組成。DNA中的四個核苷單位(或堿基)稱為脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷和脫氧胞苷。核苷酸為核苷的磷酸酯。本文使用術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)"或"調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，，包括免疫刺激效應(yīng)以及免疫抑制效應(yīng)。免疫刺激效應(yīng)包括但不僅限于直接或間接地增強細胞或體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)。免疫刺激效應(yīng)的實例包括但不僅限于提高的抗原特異性抗體的產(chǎn)生；淋巴細胞種群例如NK細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞等的激活或增殖；提高的免疫刺激細胞因子合成，所述細胞因子包括但不僅限于IL畫I、IL-2、IL誦4、IL國5、IL國6、IL畫IO、IL-12、IFN-a、IFN-p、IFN-y、TNF-a等。免疫抑制效應(yīng)包括直接或間接降低細胞或體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)。免疫抑制效應(yīng)包括但不僅限于抗原特異性抗體產(chǎn)生的減少，例如減少的IgE產(chǎn)生；具有免疫抑制活性(如引起免疫耐受)的淋巴細胞或其他細胞群體的激活；以及對某些細胞功能具有抑制效應(yīng)的細胞因子合成的提高。實例之一為IFN-Y，其似乎封閉IL-4誘導(dǎo)的向IgE和IgGl的類別轉(zhuǎn)換，從而降低這些抗體亞類的水平。"綴合程度"是指給定群體中綴合的平均程度。如本文所述，綴合程度可通過任何結(jié)構(gòu)和/或功能參數(shù)單獨或組合表征。術(shù)語"抗原"是指被抗體或T細胞抗原受體特異性識別并結(jié)合的物質(zhì)?？乖砂?、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、復(fù)合糖類、糖、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂質(zhì)和磷脂；其部分及其組合。抗原可以是天然發(fā)現(xiàn)的或合成的。適用于與ISS—起施用的抗原包括能夠引發(fā)B細胞或T細胞抗原特異性應(yīng)答的任何分子。優(yōu)選地，抗原引發(fā)特異于所述抗原的抗體應(yīng)答。半抗原包括在"抗原"的范圍內(nèi)。半抗原是其自身無免疫原性，但是與含有抗原決定蔟的免疫原性分子綴合后^C賦予免疫原性的低分子量化合物。小分子可能需要凈皮半抗原化從而被賦予抗原性。優(yōu)選在一些實例中，本發(fā)明的抗原包括肽、脂質(zhì)(例如固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖如用于流感嗜血桿菌(He附0/^"附/wyZ"ewz")疫苗的多糖、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。"佐劑"是指下述物質(zhì)其被添加至免疫原性物質(zhì)如抗原時非特異地增強或加強接觸混合物的受體宿主對所述物質(zhì)的免疫應(yīng)答。術(shù)語"肽"是其長度和組成足以影響生物應(yīng)答(例如抗體產(chǎn)生或細胞因子活性)的多肽，無論所述肽是否為半抗原。通常，肽長度為至少六個氨基酸殘基。術(shù)語"肽"還包括經(jīng)修飾的氨基酸(無論是否天然或非天然存在)，這類修飾包括但不僅限于磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、脂化和甲基化。"抗原肽"可包括經(jīng)純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)粗提取物、減毒或滅活的病毒、細胞、微生物，或這類肽的片段。相應(yīng)地，"抗原肽"或"抗原多肽，，是指顯示一種或多種抗原特性的多肽整體或部分。因此，例如"Amba1抗原多肽"或"Amba1多肽抗原，，是來自Amba1的顯示抗原特性(即與抗體或T細胞受體特異性結(jié)合)的氨基酸序列，無論是整個序列、部分序列和/或修飾序列。"遞送分子"或"遞送載體"是便于、允許和/或增強ISS和/或抗原至特定位點和/或涉及特定時間的遞送的化學(xué)部分。遞送載體可以額外地刺激或不刺激免疫應(yīng)答。"對抗原的變應(yīng)性應(yīng)答"是指通常表征為嗜酸性粒細胞和/或抗原特異性IgE產(chǎn)生及其所產(chǎn)生效應(yīng)的免疫應(yīng)答。如本領(lǐng)域所7>知，IgE與IgE受體在肥大細胞和嗜堿性粒細胞上結(jié)合。隨后接觸為IgE所識別的抗原后，所述抗原在肥大細胞和嗜堿性粒細胞上與IgE的交聯(lián)引起這些細胞的脫粒，所述脫粒包括但不僅限于組胺釋放。應(yīng)理解并預(yù)期，術(shù)語"對抗原的變應(yīng)性應(yīng)答"、"變態(tài)反應(yīng)"和"過敏癥"等同適用于一些本發(fā)明的方法中。另外，應(yīng)理解并預(yù)期，本發(fā)明的方法包括等同適用于預(yù)防變應(yīng)性應(yīng)答以及治療預(yù)先存在的過敏癥的方法。本文使用術(shù)語"變應(yīng)原"是指受試者接觸時引發(fā)變應(yīng)性應(yīng)答的抗原或分子(通常為蛋白質(zhì))的抗原性部分。例如通過風團和潮紅測試或本領(lǐng)域已知的任何方法所顯示的那樣，受試者一般對所述變應(yīng)原是過敏的。接觸一種分子時即便僅有小部分受試者顯示變應(yīng)性(例如IgE)免疫應(yīng)答，該分子也被稱為變應(yīng)原。本領(lǐng)域已知許多分離的變應(yīng)原。這些變應(yīng)原包括但不僅限于本文所提供的變應(yīng)原。術(shù)語"脫敏"是指施用遞增劑量的受試者對其顯示敏感性的變應(yīng)原的方法。用于脫敏的變應(yīng)原劑量實例為本領(lǐng)域已知，參閱例如Fornadley(1998)Oto/"/^"go/C//w.A^r幼爿附.31:111-127。"抗原特異性免疫療法"是指涉及抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原特異性調(diào)節(jié)的任何形式的免疫療法。在變態(tài)反應(yīng)的上下文中，抗原特異性免疫治療包括但不僅限于脫敏療法。"個體"是指脊推動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物包括但不僅限于人、靈長動物、農(nóng)場動物、體育動物、嚙齒類和寵物。物質(zhì)的"有效量，，或"足夠量"是指足以達到有利的或期望的結(jié)果，包括臨床結(jié)果的量，同樣，"有效量"取決于其使用語境。在施用調(diào)節(jié)針對抗原的免疫應(yīng)答的組合物的語境中，包含ISS-綴合物配偶體(即ISS和綴合物配偶體)的組合物的有效量AA以獲得與單獨施用抗原時所獲得的免疫應(yīng)答相當?shù)恼{(diào)節(jié)的量。有效量可在一次或多次施用中施用。本文使用術(shù)語"共施用"是指在時間上足夠接近地施用至少兩種不同物質(zhì)以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，共施用是指同時施用至少兩種不同物質(zhì)。"刺激"免疫應(yīng)答如Thl應(yīng)答，是指應(yīng)答的提高，其可起于應(yīng)答的引發(fā)和/或增強。"變態(tài)反應(yīng)相關(guān)紊亂"是指由抗原特異性IgE免疫應(yīng)答的效應(yīng)引起的紊亂。這類效應(yīng)可包括，但不僅限于低血壓和休克。過敏反應(yīng)是變態(tài)反應(yīng)相關(guān)紊亂的一個實例，其中組胺被釋放進循環(huán)中，引起血管舒張并提高毛細血管通透性，導(dǎo)致循環(huán)中血漿的顯著流失。過敏反應(yīng)可全身性發(fā)生(整個身體經(jīng)受相關(guān)效應(yīng))，且可局部發(fā)生(反應(yīng)僅限于特定靶組織或器官)。"IgE相關(guān)紊亂"是部分表征為提高的IgE水平(其可持續(xù)或不持續(xù))的生理條件。IgE相關(guān)紊亂包括，但不僅限于變態(tài)反應(yīng)和變應(yīng)性反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)相關(guān)紊亂(描述于下文)、哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎、蕁麻滲、休克、膜翅目昆蟲蟄咬變態(tài)反應(yīng)(hymenopterastingallergies)和藥物變態(tài)反應(yīng)以及寄生蟲感染。該術(shù)語還包括這些紊亂的相關(guān)表現(xiàn)。一般地，這類紊亂中的IgE為抗原特異性的。如本文使用并如本領(lǐng)域所公知的，"治療，，是用于獲得有利或期望的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的途徑。就本發(fā)明目的而言，有利或期望的臨床結(jié)果包括但不僅限于減輕或改善一種或多種癥狀、減小疾病的程度、穩(wěn)定(即不惡化)疾病的狀態(tài)、預(yù)防疾病的擴散、延遲或減緩疾病逸艮、改善或減輕疾病狀態(tài)以及消退(部分或全部)，無論是否可以檢測。"治療"還可指與未接受治療的預(yù)期存活期相比延長存活期。"減輕"疾病或紊亂是指與不治療紊亂相比，紊亂或疾病狀態(tài)的程度和/或不期望的臨床表現(xiàn)被減輕和/或進展的時間過程被減緩或延長。特別是在變態(tài)反應(yīng)語境中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣，減輕可基于針對變應(yīng)原的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)而發(fā)生。另外，減輕在施用一次劑量時不一定會發(fā)生，而經(jīng)常在施用一系列劑量時發(fā)生。因此，足以減輕應(yīng)答或紊亂的量可以在一次或多次施用中施用。被ISS-綴合物配偶體或ISS抗原"引發(fā)"的"抗體效價"或"抗體量"是指施用綴合物或抗原后的時間點測量的給定抗體的量。"Thl相關(guān)抗體"是其產(chǎn)生和/或增加與Thl免疫應(yīng)答相關(guān)的抗體。例如，IgG2a是小鼠中的Thl相關(guān)抗體。就本發(fā)明目的而言，Thl相關(guān)抗體的測量可以是一種或多種這類抗體的測量。例如在人中，測量Thl相關(guān)抗體可以4半隨測量IgGl和/或IgG3。"Th2相關(guān)抗體"是其產(chǎn)生和/或增加與Th2免疫應(yīng)答相關(guān)的抗體。例如，IgGl是小鼠中的Th2相關(guān)抗體。就本發(fā)明目的而言，Th2相關(guān)抗體的測量可以是一種或多種這類抗體的測量。例如在人中，測量Th2相關(guān)抗體可以4半隨測量IgG2和/或IgG4。"阻抑"或"抑制"功能或活性(如細胞因子產(chǎn)生、抗體產(chǎn)生或組胺釋放)是指與除目的條件或參數(shù)外其他條件相同時相比，或者可選地，與另一條件相比，降低功能與活性。例如，阻抑組胺釋放的綴合物分子群體與例如抗原單獨i秀導(dǎo)的組胺釋放相比降低組胺釋放。作為另一實例，阻抑抗體產(chǎn)生的綴合物分子群體與例如抗原單獨產(chǎn)生的抗體程度和/或水平相比，降低抗體的程度和/或水平。逸舍凝合錄為、于^遂合參本發(fā)明部分涉及包含綴合物分子的組合物，其中綴合物分子包含綴合物配偶體和包含免疫刺激序列(iss)的多核苷酸，并部分涉及制備和使用這類化合物的方法。本發(fā)明還部分涉及包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物以及制備及使用這類組合物的方法。本文描述了本發(fā)明所涵蓋的ISS和綴合物配偶體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，本發(fā)明所涵蓋的綴合物分子可具有不同且獨特的生物特性，基于綴合物配偶體、綴合物分子中存在的ISS的類型和數(shù)量，以及ISS和綴合物配偶體之間綴合的平均程度。在一些實例中，綴合物配偶體為蛋白質(zhì)，例如抗原或變應(yīng)原。在一些實例中，綴合物配偶體包含變應(yīng)原Amba1。在其他實例中，ISS可以是大于6個堿基或堿基對的任何長度的多核苷酸，而在一些實例中其包含序列5，-胞嘧啶(C)，鳥嘌呤-3，(g)，而在其他實例中包含序列5，-嘌呤，嘌呤，c，g，嘧啶，嘧啶-3，(如5'-AACGTT-3'),而在其他實例中為大于15個堿基或堿基對，而在其他實例中大于20個堿基或堿基對長度。在一些實例中，ISS包含序列5，一噪吟，噪呤，c，g，嘧啶，嘧啶，c，g-3，；或序列5'-嘌呤，嘌呤，C，g，嘧啶，嘧啶，C，C-3，；或序列5'-T,C，G-3，。在一些實例中，ISS包含5'誦TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，。在一些實例中，綴合物分子包含綴合于包含5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，的ISS的Amba1。這類組合物可用于例如治療和^^斷方法，其中維持綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是必須的。含有與抗原連接的免疫刺激序列(ISS)的綴合物分子公開于PCT出版物WO01/35991、WO98/16247和WO01/12223中，其公開內(nèi)容在本文明確引用作為參考。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)組合物中綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性取決于溫度、鹽和pH條件。發(fā)現(xiàn)組合物中存在的磷酸鈉、氯化鈉、帶負電荷組分和/或極性組分使得包含變應(yīng)原的綴合物分子在高于O'C或更高的溫度在液體組合物中不穩(wěn)定。發(fā)現(xiàn)低pH引起包含變應(yīng)原的綴合物分子在低離子強度的條件下可逆聚集。不受理論束綽，認為由于綴合物分子中因ISS的存在所致的負電荷，合物中存在的綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)添加帶負電荷的組分如氯化鈉會引起包含ISS的綴合物分子聚集，從而變得不穩(wěn)定。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含綴合物分子的組合物中的親核物質(zhì)如疊氮化物或甚至低氯化鈉會使綴合物分子不穩(wěn)定。多種組合物中包含變應(yīng)原的綴合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性如本文所述表征。設(shè)計實驗評估組合物中綴合物分子可能的結(jié)構(gòu)改變作為pH、溫度、時間以及組合物條件(如離子強度和表面活性劑存在)的函數(shù)。如本文所述，將包含約0.1ftg到200jig濃度范圍的經(jīng)純化的與ISS共價連接的短豚草抗原AMBa1(在本文稱為Ambal-ISS寡核苷酸綴合物或"AIC")的綴合物分子的說明性實例透析為含有多種離子強度和多種pH條件的組合物，然后通過^f吏用內(nèi)源熒光(IF)、外源熒光(EF)和直角光散射(RALS)分析，同時對所述綴合物分子進行溫度改變。IF、EF和RALS在文中描述于實施例中。使綴合物分子經(jīng)受剪切應(yīng)力并通過RALS和尺寸排阻色鐠高效液相色語(SEC-HPLC)分析。相同的方法(即IF、EF、RALS和SEC-HPLC)平行使用，以檢測包含AIC的組合物在存在磷酸鈉和氯化鈉(在本文實施例中稱為PBS)時的凍熔敏感性。被設(shè)計用于闡釋組合物中AIC結(jié)構(gòu)變化的實驗結(jié)果在文中包括實施例和表IO、11和12中描述。表10顯示用于維持pH條件的多種組分的分析結(jié)果。相應(yīng)地，在一些實例中，用于維持包含綴合物分子的組合物pH條件的組分包括pH7.5的組氨酸、pH8.0的組氨酸、pH7.5的磷酸鹽、pH8.0的磷酸鹽、pH7.0的磷酸鹽、pH7.0的組氨酸或pH6.5的組氨酸。如本文所述，對于組合研究(即包含綴合物分子的組合物中的組分組合)而言，制備包含組氨酸的組合物。表ll顯示多種氨基酸的分析結(jié)果。相應(yīng)地，在一些實例中，用于包含綴合物分子的組合物中的氨基酸包括組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸或丙氨酸。對于組合研究(即包含綴合物分子的組合物中的組分組合)而言，制備包含甘氨酸的組合物。表12顯示多種糖類的分析結(jié)果。相應(yīng)地，在一些實例中，包含綴合物分子的組合物包括糖類，如乳糖、蔗糖、甘露糖或麥芽糖。實施例6描述了組合研究的結(jié)果。本文提供了組合物，其包含在約2'C至約8x:溫度結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子。在一些實例中，組合物為液體形式，而在其他實例中為凍干形式。本文提供了組合物，其包含結(jié)果穩(wěn)定綴合物分子和能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分。在一些實例中，所述組分能夠?qū)H范圍維持在約7.0至約8.0,在其他實例中，范圍約7.5至約7.8,而在其他實例中，pH約7.5。在一些實例中，能夠?qū)H范圍維持在約6.0至約9.0的組分具有中性電荷或堿性電荷。在一些實例中，能夠?qū)H范圍維持在約6.0至約9.0的組分為非極性的。在一些實例中，能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分選自組氨酸或磷酸鹽。在一些實例中，能夠維持pH的組分以這樣的量存在于組合物中，所述量足以使多于約70%、多于約80%、多于約卯％、多于約95%或多于約97%的所述綴合物分子在約2。C至約8'C的溫度為非聚集體的形式。綴合物分子的聚集可通過本文所公開的方法如直角光散射(RALS)或本領(lǐng)域已知的方法測量。在其他實例中，包含綴合物分子的組合物還可包含下述一種或多種l)氨基酸，2)糖類，3)表面活性劑，和4)其他合適的可藥用載體，只要組合物包含多于70%、多于80%、多于卯％、多于95%或多于97%的非聚集體或單體形式的所述綴合物分子。在一些實例中，氨基酸選自組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸。在一些實例中，氨基酸為組氨酸或甘氨酸。在一些實例中，糖類選自乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、山梨糖醇和葡萄糖。在一些實例中，糖類為山梨糖醇或蔗糖。本文提供了這樣的組合物，其包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子和能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分。本文提供了這樣的組合物，其包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子、能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分以及M酸。本文提供了這樣的組合物，其包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子、能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分以及糖類。本文提供了這樣的組合物，其包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子、能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分、氨基酸以及糖類。在一些實例中，包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物還包含表面活性劑。在一些實例中，組合物為液體形式，而在其他實例中為凍干形式。本發(fā)明包括由凍干形式重構(gòu)的液體形式的包含綴合物分子的組合物。如本文所述，多種液體形式的組合物的評估鑒定了在約2'C至8X:的溫度維持AIC結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的組合物，所述組合物包含本文所述的AIC(包括約30ug/ml和約60ug/ml的濃度)并包含每摩爾Amb1a(平均分子量約65kDa)平均約4.0摩爾的ISS。在一些實例中，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性維持至少6個月。這些包含AIC的組合物包括但不僅限于包含約1mM至約50mM范圍組氨酸的組合物；包含約1mM至約50mM范圍組氨酸和約50mM至約300mM范圍甘氨酸的組合物；包含約1mM至約50mM范圍組氨酸和占組合物約1%至約5%范圍山梨糖醇的組合物；包含約1mM至約50mM范圍組氨酸、約50mM至約300mM范圍甘氨酸和占組合物約1%至約5%范圍山梨糖醇的組合物；所述組合物均具有約7.0至約8.0的pH范圍。本文提供了包含AIC(如本文所述，其可以是低的(L)、中等的(M)或高的(H))的組合物，其中組合物中的AIC在約2'C至8'C的溫度是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的，其包括但不僅限于5mM組氨酸、285mM甘氨酸，pH范圍約7.0至約8.0的或約pH7.5;20mM組氨酸、270mM甘氨酸，pH范圍約7.0至約8.0或約pH7.5;.20mM組氨酸、50mM甘氨酸、3.8%山梨糖醇，pH范圍約7.0至約8.0或約pH7.5;和'20mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM山梨糖醇，pH范圍約7.0至約8.0或約pH7.5?；诒疚墓_的實驗結(jié)果，下文顯示了預(yù)測為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的其他AIC組合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>度和時間以及溶液條件(即離子強度、表面活性劑等)的函數(shù)進行繪圖，以確定組合物中綴合物分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的條件。凝合浙乾偶琳本發(fā)明涵蓋的綴合物配偶體包括但不僅限于抗原，如肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、復(fù)合糖類、糖、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂質(zhì)和磷脂；其部分及其組合。在一些實例中，抗原可來自傳染因子，包括原生動物、細菌、真菌(包括單細胞和多細胞的)和病毒傳染因子。例如來自寄生生物的抗原包括來自血吸蟲物種(如曼氏血吸蟲)的血吸蟲卵抗原(例如Sm-40)和來自弓蟲物種(例如剛地弓形蟲)的抗原。參閱例如Stadecker等(1998)尸flmw'teJ畫w朋/.20:217-221;Subauste等(1993)Ci77r.O戶./附聽朋/.5:532-527?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的純化技術(shù)從其來源中分離抗原，或更便利地使用重組方法制備抗原。抗原性的肽可包括經(jīng)純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質(zhì)、蛋白粗提取物、減毒的或滅活的病毒、細胞、微生物或這類肽的片段。免疫調(diào)節(jié)肽可以是天然的或化學(xué)或酶促合成的。本領(lǐng)域已知的任何化學(xué)合成法是合適的。液相肽合成可用于構(gòu)建中等大小的肽，或可使用固相合成用于化學(xué)構(gòu)建肽。Atherton等(1981)/^，/^Sw/eMZ.C7^附.362:833-839。也可使用蛋白水解酶偶聯(lián)氨基酸以產(chǎn)生肽。或者可通過使用細胞的生化機器，或通過從生物來源中分離獲得肽?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)用于制備肽。還可使用標準技術(shù)如親和層析分離肽。一般地，抗原為肽、脂質(zhì)(例如除膽固醇外的固醇、脂肪酸和砩脂)、多糖、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。這些可通過本領(lǐng)域已知的若干方法獲得，包括使用化學(xué)和酶促方法分離和合成。在某些情況下(例如對許多固醇、脂肪酸和磷脂而言)，分子的抗原性部分是可商業(yè)獲得的。來自傳染因子的抗原可使用本領(lǐng)域已知方法獲得，例如來自天然病毒或細菌提取物、來自4皮傳染因子感染了的細胞、來自經(jīng)純化的多肽、來自重組產(chǎn)生的多肽和/或合成肽。在一些實例中，抗原為變應(yīng)原。重組變應(yīng)原的實例在表l中提供，并包括但不僅限于甲殼動物變應(yīng)原、昆蟲變應(yīng)原、哺乳動物變應(yīng)原、軟體動物變應(yīng)原、植物變應(yīng)原和真菌變應(yīng)原。在一些實例中，變應(yīng)原為植物變應(yīng)原。在其他實例中，變應(yīng)原為豚草抗原Amba1。許多變應(yīng)原的制備為本領(lǐng)域公知，包括但不僅限于豚草花粉變應(yīng)原抗原E(j附6fl/)的制備(Rafhar等(1991)/.說tf/.266:1229-1236)、塵螨主要變應(yīng)原"w/;/和Z)er尸//的制備(Chua等(1988)/五jc/;.167:175-182;Chua等(1990)/"tj/fe/^vj/^/./附/Mimo/:91:124-129)、白樺花粉5Cv/的制備(Breiteneder等(1989)8:1935-1938)、家養(yǎng)貓變應(yīng)原i^/rf/的制備(Rogers等(1993)Afo/./附/wmw0/.30:559-568)和來自樹木花粉的蛋白質(zhì)抗原的制備(Elsayed等(1991)/C//"./"ve"5^;//.204:17-31)。如前所迷，來自樹木的變應(yīng)原是已知的，包括來自樺樹(birch)、杜松(juniper)和柳杉(Japanesecedar)的變應(yīng)原。用于體內(nèi)施用的來自草花粉的蛋白質(zhì)抗原制備已有報導(dǎo)。Malley(1989)/及叩/w/./w附"wo/.16:173-186。如表1所示，在一些實例中，變應(yīng)原為食品變應(yīng)原，例如花生變應(yīng)原如Arahl,而在一些實例中，變應(yīng)原為草變應(yīng)原，例如黑麥變應(yīng)原如LoIpI。表l顯示了涵蓋在本發(fā)明中的變應(yīng)原列表。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在一些實例中，抗原來自傳染因子，包括原生動物、細菌、真菌(包括單細胞和多細胞的)和病毒傳染因子。合適病毒抗原的實例描述于本文并為本領(lǐng)域已知。細菌包括流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌(TKvcoAacteri'w附似&/^1|/仍&)和百日咳博德特氏桿菌(^WYfete/to/;e/Y"^/"。原生動物傳染因子包括癡疾癡原蟲、利什曼原蟲物種、錐蟲物種和血吸蟲物種。真菌包括白色念珠菌(CVmt/油fl/Aicfl"s)。在一些實例中，抗原為病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不僅限于核心蛋白如HIVgag蛋白(包括但不僅限于膜錨定(MA)蛋白、核心衣殼(CA)蛋白和核衣殼(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基質(zhì)(M)蛋白和流感病毒核衣殼(NP)蛋白。討論流感疫苗接種的參考文獻包括Scherle和Gerhard(1988)7V"漢Sd1/5^85:4446-4450;Scherle和Gerhard(1986)/.￡"xp.ATM.164:1114-1128;Granoff等(1993)Kflcd"e11:S46-51;Kodihalli等(1997)/Mra/.71:3391-3396;Ahmeida等(1993)Kacc/we11:1302-1309;Chen等(1999)17:653-659;Go雷kova和Smimov(1997)Fra/.(1997)41:251-257;Koide等(1995)13:3-5;Mbawuike等(1994)Fffc""e12:1340-1348;Tamura等(1994)Kcd"e12:310-316;Tamura等(1992)///m附""o/.22:477-481;Hirabayashi等(19卯)8:595-599?？乖嚯牡钠渌麑嵗秊閷τ诖罅總魅疽蜃佣砸阎男吞禺惢騺喰吞禺愋钥乖?，包括但不僅限于腺病毒、單純皰滲病毒、乳頭狀瘤病毒、呼吸道合胞病毒和痘病毒。許多抗原性肽和蛋白質(zhì)是已知的，并可在本領(lǐng)域中獲得；其他的可使用常MJt術(shù)鑒定。關(guān)于針對肺瘤形成的免疫接種，免疫調(diào)節(jié)肽可包括肺瘤細胞(活的或經(jīng)輻照的)、肺瘤細胞提取物或肺瘤抗原的蛋白質(zhì)亞基(如Her-2/neu、Marti)、癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)節(jié)苷脂、人乳脂肪球(HMFG)、粘蛋白(MUCI)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特異性抗原(PSA)和酪氨酸酶。以免疫為基礎(chǔ)的避孕疫苗可通過包含與ISS—起施用的精子蛋白質(zhì)形成。Lea等(1996)1307:263。減毒的和滅活的病毒在本文適用于作為抗原。這些病毒的制備為本領(lǐng)域公知，并且許多可以商業(yè)獲得(參閱例如Physicians'DeskReference(1998)第52版，MedicalEconomicsCompany,Inc.)。例如脊髓灰質(zhì)炎病毒可作為IPOL(PasteurMerieuxConnaught)和ORMUNE(LederleLaboratories)獲得，甲型肝炎病毒可作為VAQTA(Merck)獲得，麻療病毒可作為ATTENUVAX(Merck)獲得，腮腺炎病毒可作為MUMPSVAX(Merck)獲得，風滲病毒可作為MERUVAXII(Merck)獲得。另夕卜，減毒的和滅活的病毒如HIV-1、HIV-2、單純皰滲病毒、乙型肝炎病毒、輪狀病毒、人和非人乳頭瘤病毒和腦慢病毒(slowbrainvirus)能夠提供肽抗原。在一些實例中，抗原包含病毒載體，例如牛痘、腺病毒和金絲雀痘?？乖蒦f吏用本領(lǐng)域已知的純化技術(shù)從其來源中分離，或可更便利地使用重組方法制備?？乖噪目砂ń?jīng)純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)粗提取物、減毒的或滅活的病毒、細胞、微生物或這類肽的片段。免疫調(diào)節(jié)肽可以是天然的或化學(xué)或酶促合成的。本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成的任何方法是合適的。液相肽合成可用于構(gòu)建中等大小的肽，或可使用固相合成用于化學(xué)構(gòu)建肽。Atherton等(1981)^/^eZ尸/^"W.C&肌362:833-839。也可使用蛋白水解酶偶聯(lián)氨基酸以產(chǎn)生肽。Kullmann(1987)五w^附"ric5^"^es/s，CRCPress,Inc.?；蛘呖赏ㄟ^使用細胞的生化機器，或通過從生物來源中分離獲得肽?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)用于制備狀。Hames等(1987)7hmsmWowawd7hi57a,/ow.'J尸m"/ca/々/7raflc/r，IRLPress。還可4吏用標準4支術(shù)如親和層析分離肽。在一些實例中，抗原為肽、脂質(zhì)(例如固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖(例如流感嗜血桿菌疫苗中使用的多糖)、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。這些可通過本領(lǐng)域已知的若干方法獲得，包括使用化學(xué)和酶促方法分離和合成。在某些情況下(例如對許多固醇、脂肪酸和磷脂而言)分子的抗原性部分是可商業(yè)獲得的。用于所述組合物和使用所述組合物的方法中的病毒抗原的實例包括，但不僅限于HIV抗原。這類抗原包括，但不僅限于來自HIV包膜糖蛋白(包括但不僅限于gpl60、gpl20和gp41)的抗原。已知眾多HIV基因和抗原的序列。例如洛斯阿拉莫斯國家實驗室(LosAlamosNationalLaboratory)HIV序列數(shù)據(jù)庫收集、組織和注釋HIV核苷酸和氨基酸序列。該數(shù)據(jù)庫可通過因特網(wǎng)由http:〃hiv-web.lanUov/以及年刊中獲得，參閱^T"附""7Crov,'尸"s^s^m"J/Z)iSCo附/7ertdi'M附(l列ft口1998版)。來自傳染因子的抗原可使用本領(lǐng)域已知的方法獲得，例如從天然病毒或細菌提取物中、從用傳染因子感染的細胞中、從經(jīng)純化的多肽中、從重組產(chǎn)生的多肽和/或合成多肽中獲得。根據(jù)本發(fā)明，綴合物分子含有至少一個ISS,并且能夠含有多個ISS。ISS可在多核苷酸中相鄰，或它們可被多核普酸中其他核苷酸堿基分隔開。ISS已在本領(lǐng)域描述，并可使用顯示多方面免疫應(yīng)答的標準測定法容易地鑒定，例如細>1包因子分泌、抗體產(chǎn)生、NK細胞激活和T細胞增殖。參閱例如WO97/28259;WO98/16247;WO99/11275;Krieg等(1995)7Vfl,""374:546-549;Yamamoto等(1992a);Ballas等(1996);Klinman等(1997);Sato等(1996);Pisetsky(1996a);Shimada等(1986)//w./77:808-816;Cowdery等(1996)/J附附w朋/.156:4570-4575;Roman等(1997)和Lipford等(1997a)。ISS可以是大于6個堿基或堿基對的任何長度，并且通常包含序列5，胞嘧啶，鳥嘌呤-3，，特別是包含序列5，嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧咬-3，(如5，-AACGTT-3，)，優(yōu)選在一些實例中為大于15個堿基或堿基對，更優(yōu)選在一些實例中大于20個堿基或堿基對長度。ISS還可包含序列5，-噤呤，嘌呤,C，G嘧啶，嘧啶，C，G-3，。ISS還可包含序列5，-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，C-3，。如以下多核苷酸序列所示，ISS還可包含序列5，-T，C，G-3，。在一些實例中，ISS包含任何以下序列GACGCTCC;GACGTCCC;GACGTTCC;GACGCCCC;AGCGTTCC;AGCGCTCC;AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTCCC;AACGCCCC;AACGTTCC;AACGCTCC;GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;GACGCTCG;GACGTCCG;GACGCCCG;GACGTTCG;AGCGCTCG;AGCGTTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;AACGTCCG;AACGCCCG;AACGTTCG;AACGCTCG;GGCGTTCG;GGCGCTCG;GGCGTCCG;GGCGCCCG。在一些實例中，ISS包含任何以下序列GACGCT;GACGTCGACGTT;GACGCC;GACGCU;GACGUC;GACGUU;GACGUTGACGTU;AGCGTT;AGCGCT;AGCGTC;AGCGCC;AGCGUUAGCGCU;AGCGUC;AGCGUT;AGCGTU;AACGTC;AACGCCAACGTT;AACGCT;AACGUC;AACGUU;AACGCU;AACGUTAACGTU;GGCGTT;GGCGCT;GGCGTC;GGCGCC;GGCGUUGGCGCU;GGCGUC;GGCGUT;GGCGTU。在一些實例中，免疫調(diào)節(jié)多核苷酸包含序列5'畫TGACTGTGAACGTTCGAGATGA誦3，(SEQIDNO:1)。在其他實例中，ISS包含任何以下序列5，-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:2);5，-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3，(SEQIDNO:3);5'國TGACTGTGAACGTTCCAGATGA國3，(SEQIDNO:4);5，TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3，(SEQIDNO:5);5，畫TGACTGTGAABGTTCCAGATGA畫3，(SEQIDNO:6),其中B為5-溴胞嘧i定；5，-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:7)，其中B為5-溴胞嘧p定；和5，-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA畫3，(SEQIDNO:8),其中B為5-溴胞嗜啶。ISS和/或含ISS的多核苷酸可包含修飾。ISS的修飾包括本領(lǐng)域已知的任何^f務(wù)飾，但不僅限于3，OH或5，OH基團的修飾、核苷酸威基的修飾、糖組分的修飾和磷酸基團的修飾。多種這類修飾在下文描述。ISS可以是單鏈或雙鏈DNA以及單鏈或雙鏈RNA或其他被修飾的多核苷酸。ISS可以包括或不包括一個或多個回文區(qū)，其可存在于上述六聚體基序中或可延伸至該基序外。ISS可包含額外的側(cè)翼序列，其中一些在文中描述。ISS可包含天然存在的或經(jīng)修飾的、非天然存在的堿基，并可包含經(jīng)修飾的糖、磷酸和/或末端。例如磷酸修飾包括但不僅限于甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酰胺(橋接或非橋接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并可使用任何組合。也可使用其他非磷酸酯鍵。在一些實例中，本發(fā)明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯主鏈。也可以使用本領(lǐng)域已知的糖修飾和本文所述的其他糖修飾，并與任何磷酸修飾組合，所述糖修飾例如2'-烷氧基-RNA類似物、2，-氨基-RNA類似物和2'-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體。堿基修飾的實例包括但不僅限于向ISS胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分(例如5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)。ISS可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)和核酸合成設(shè)備合成，所述方法包括但不僅限于酶促方法、化學(xué)方法以及較大寡核苷酸序列的降解。參閱例如Ausubel等(1987)和Sambrook等(1989)。當酶促組裝時，可用連接酶如T4DNA或RNA連接酶將單個單元連接。美國專利No.5,124,246。寡核苷酸降解可通過4吏寡核苷酸接觸核酸酶完成，如美國專利No.4,650,675中所述。ISS還可使用常規(guī)多核苷酸分離操作進行分離。這類操作包括但不僅限于使探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢測共享的核苷酸序列、對表達文庫進行抗體篩選以檢測共享的結(jié)構(gòu)特征，以及通過聚合酶鏈式反應(yīng)合成特定的天然序列?？煞蛛x、通過重組方法合成或化學(xué)合成環(huán)狀I(lǐng)SS。當通過分離或通過重組方法獲得環(huán)狀I(lǐng)SS時，在一些實例中ISS是質(zhì)粒。更小環(huán)狀寡核苷酸的化學(xué)合成可使用文獻中描述的任何方法進行。參閱例如Gao等(1995)iV"c/"c^"Vfc及仏23:2025-2029和Wang等(1994)7Vwc/"c^c/必及仏22:2326-2333。用于制備寡核苷酸和經(jīng)修飾寡核苷酸的技術(shù)為本領(lǐng)域已知。含有磷酸二酯鍵的天然存在的DNA或RNA通常如下合成將合適的核苷亞磷酰胺與3，端附著在固相支持物上的正在延伸的寡核苷酸的5，羥勤目繼偶聯(lián)，然后將中間體亞磷酸三酯氧化為磷酸三酯。一旦合成了所需寡核苷酸序列，則將所述寡核苷酸從支持物上移除，去保護磷酸三酯基團為磷酸二酯基團，并使用氨水或其他堿將核苷堿基去保護。參閱例如Beaucage(1993)"OligodeoxyribonucleotideSynthesis"iniVotocofe0//g朋wc/eWcfey朋Jy4鼎/og51，分w幼es/51iVo/)eWe51(Agrawal編)HumanaPress,Totowa,NJ;Warner等(1984)Z>AM3:401和美國專利No.4,458,066。ISS還可包含磷酸酯經(jīng)修飾的寡核苷酸。包含經(jīng)修飾的磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵的寡核苷酸的合成為本領(lǐng)域7>知。綜述參閱Matteucci(1997)"OligonucleotideAnalogs:anOverview"in(9//gowwc/eoftVfesfl5177rmipeMftV:々ew&，(DJ.Chadwick和G.Cardew編)JohnWileyandSons,NewYork,NY?？筛街诒景l(fā)明寡核苷酸的糖或糖類似物部分上的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基團)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。上述磷酸類似物的制備及其向核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸和寡核苷酸中的摻入本身是已知的，并不需要在本文詳細描述。Peyrottes等(1996)7Vwc/"c爿"Vfe及d24:1841-1848;Chaturvedi等(1996)7V"c7e/c24:2318-2323;和Schultz等(1996)7V"c/"cJd24:2966-2973。例如硫代磷酸酯寡核苷酸的合成與用于天然存在寡核苷酸的合成類似，除了氧化步驟被硫化步驟替換外(Zon(1993)"OliognucleosidePhosphorothioates"iniP/vtoco/s/o/*6W/og"Mc/eCV/es朋J^4fia/og51，/Syw幼ey/sawrf尸ro/7e"/es(Agrawal編)HumanaPress,165-1卯頁)。類4以地也4笛述了其他磷酸類似物的合成，如磷酸三酯(Miller等(l971)X4C593:6657-6665)、非橋接亞磷酰胺(Jager等(1988)歷oc/^附.27:7247-7246)、N3，至P5，亞磷酰胺(Nelson等(1997)/OC62:7278-7287)和二硫代磷酸酯(美國專利No.5,453,496)。也可使用其他基于非磷修飾的寡核苷酸(Stirchak等(1989)7V"cfeic爿ciVfe及仏17:6129-6141)。帶有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸與帶有磷酸二酯主鏈的寡核香酸相比可更具免疫原性，且在注射進宿主后顯示更抗降解。Braun等(1988)141:2084-2089和Latimer等(1995)Mo/,/附imw"0/.32:1057-1064。本發(fā)明使用的含ISS多核苷酸可包含核糖核苷酸(包含核糖作為唯一的或主要的糖組分)、脫氧核糖核香酸(包含脫氧核糖作為主要的糖組分)或如本領(lǐng)域已知，經(jīng)修飾的糖或糖類似物可摻入在ISS中。因此，除核糖和脫氧核糖之外，糖部分可以是戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖和糖"類似物"環(huán)戊基。糖可以是吡喃糖或呋喃糖的形式。在ISS中，糖部分在一些實例中為核糖、脫氧核糖、阿拉伯糖或2'-0-烷基核糖的呋喃糖苷，并且糖可以以a或p異頭構(gòu)型附著于相應(yīng)的雜環(huán)堿基。糖修飾包括但不僅限于2，-烷氧基-RNA類似物、2，-氨基-RNA類似物和2，-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體。這些糖或糖類似物和相應(yīng)的"核苷"(其中這類糖或類似物附著于雜環(huán)堿基(核酸堿基))的的制備本身已知，并不需要在本文描述，除非這類制備涉及任何特定實例。在ISS制備中也可進行糖修飾，并與任何磷酸修飾組合。摻入在ISS中的雜環(huán)堿基或核酸堿基可以是天然存在的主要嘌呤和嘧咬堿基(如上所述，即尿嘧咬或胸腺嘧咬、胞嘧啶、腺噤呤和鳥嘌呤)，以及所述主要堿基天然存在的修飾和合成的修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，只要滿足了本發(fā)明的其他標準，可在本領(lǐng)域獲得大量包含多種雜環(huán)堿基和多種糖部分(和糖類似物)的"合成的，，非天然核苷，所述ISS可包括除天然存在核酸五種主要堿基組分外的一種或數(shù)種雜環(huán)堿基。然而在一些實例中，ISS中的雜環(huán)堿基包括但不僅限于尿嘧啶-5-基、胞嘧咬-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥噤吟_8-基、4-氨基吡咯并[2,3-d嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-dl嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2.3-^嘧啶-3-基等基團，其中嘌呤通過9-位附著于ISS的糖部分，通過l-位附著于吡咯烷，通過7-位附著于吡咯并嘧啶，通過1-位附著于吡唑并嗜咬。ISS可包含至少一個如上所述經(jīng)修飾的堿基，如在共同擁有的美國專利No.6，562，798(USSN324，191)和國際申請WO99/62923中所述。如本文使用術(shù)語"經(jīng)修飾的堿基"與"堿基類似物"同義，例如"經(jīng)修飾的胞嘧啶"與"胞嘧啶類似物"同義。類似地，"經(jīng)修飾的"核苷或核苦酸在本文定義為與核苷或核苷酸"類似物"同義。^修飾的實例包括但不僅限于向ISS胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分。在一些實例中，吸電子部分為囟素。這類經(jīng)#^飾的胞嘧啶可包括，但不僅限于氮雜胞嘧咬、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環(huán)胞嘧啶、胞嘧啶阿糖胞苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5，6-二氫胞嘧咬、5-碘胞嘧啶、羥基脲、碘尿嘧咬、5-硝基胞嘧啶、尿嘧咬和任何其他嘧咬類似物或經(jīng)修飾的嘧咬。堿基經(jīng)修飾的核苷的制備，以及使用所述堿基經(jīng)修飾的核苷作為前體合成經(jīng)修飾的寡核苷酸已描述于例如美國專利4,910,300、4,948,882和5,093,232。這些堿基經(jīng)修飾的核苷被設(shè)計為它們可通過化學(xué)合成摻入寡核苷酸的末端或內(nèi)部位置。這類堿基經(jīng)修飾的核苷(無論存在于寡核苷酸的末端或內(nèi)部位置)可作為肽或其他抗原的附著位點。其糖部分經(jīng)修飾的核苷也已描述(包括但不僅限于例如美國專利4,849,513、5,015,733、5，118，800、5,118,802)并可類似地使用。在一些實例中，含ISS的多核苷酸短于約任何以下長度(堿基或堿基對)10,000、5,000、2500、2000、1500、1250、1000、750、500、300、250、200、175、150、125、100、75、50、25、10。在一些實例中，含ISS的多核苷酸長于約任何以下長度(威基或堿基對)6、7、8、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、750、1000、2000、5000、7500、10000、20000、50000。在一些實例中，含ISS的多核苷酸為長于約6個堿基或堿基對長度且短于約200個堿基或堿基對長度。摔^潛種々危^源，脊勝#綏合#》于舉#通常本發(fā)明和本文所述的綴合物分子的種類或群體可通過任何大量結(jié)構(gòu)和/或功能特性來區(qū)分和/或定義，包括(a)與抗原附著或連接的含ISS多核苷酸的平均數(shù)量；(b)與抗原附著或連接的含ISS多核苷酸的中位數(shù)；(c)含ISS多核苷酸的平均質(zhì)量與抗原平均質(zhì)量的比率；(d)含ISS多核苷酸中位質(zhì)量與抗原中位質(zhì)量的比率；(e)(i)與(ii)的比率(i)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合所需的ISS-抗原綴合物的濃度；(ii)以相同程度抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合所需的抗原濃度(如下文所述，這些比率通常，但不必須在50。/。抑制時計算)；(f)對于抗原是變應(yīng)原的情況，(i)與(ii)的比率(i)從抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放組胺所需的ISS-抗原綴合物濃度；(ii)從抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中以相同程度釋放組胺所需的抗原濃度(如下文所述，這些比率可以在，但不必須在40。/。組胺釋放時計算)；(g)(i)與(ii)的比率(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl相關(guān)抗體和Th2相關(guān)抗體的總和；(ii)由抗原引發(fā)的Thl相關(guān)抗體和Th2相關(guān)抗體的總和；(h)(i)與(ii)的比率(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl相關(guān)抗體；(ii)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Th2相關(guān)抗體；(i)與抗原單獨相比差異的細胞因子產(chǎn)生鐠；(j)抗原特異抗體制備的抑制程度。本文所述的所有種類和實例可由上文所列特性中的一個、一個以上和/或任何組合描述和/或定義。因此，本發(fā)明提供包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子群體的組合物，所述綴合物分子包含抗原和一個或多個包含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，其中所述群體包含任一個或任多個本文所述特性(單獨或任意組合)。所迷特性(包括比率)可使用本領(lǐng)域和本文所述的標準技術(shù)測量，并應(yīng)理解任意的這些特性可以以多種體系測量，包括體內(nèi)體系如脊推動物和哺乳動物，包括例如小鼠和/或人。例如，根據(jù)上文，并基于涉及Amba1和含ISS22聚體多核苷酸(5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA曙3，，SEQIDNO:l)的，見察結(jié)果，"H"類由任意以下特性單獨或任意組合定義(a)每抗原分子平均至少約5.5個含ISS多核苷酸，且在一些實例中為6個；(b)(i)含ISS多核苷酸平均質(zhì)量與(ii)抗原平均質(zhì)量的比率為(i)約或可選地至少約35、40或45至(ii)約40。(c)(i)與(ii)的比率為約3.5至約6.0或更多(包括但不僅限于7.0、8.0、9.0、10.0、15、20、25、30、35、40、45、50或更多)或可選地為至少約以下4壬一3.5、4.0、4.5、5,0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10、15、20、25(如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括所列數(shù)字)(i)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合50%所需的ISS-抗原綴合物濃度，(ii)抑制抗原特異性抗體與抗原的結(jié)合50%所需的抗原濃度；(d)例如在抗原為變應(yīng)原的情況中，(i)與(ii)的比率為大于約300、大于約500、大于約750、大于約1000、大于約1250、大于約1400、大于約1500(上限可以是任何數(shù)字，包括但不僅限于750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000):(i)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40。/。組胺所需的ISS-抗原綴合物濃度，(ii)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40。/。組胺所需的抗原濃度；(e)(i)與(ii)的比率約為以下任意或可選地小于約以下任意10、7、5、4、3.5、3.0;2.5、2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1:(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照所施用抗原的單位質(zhì)量)。(f)(i)與(ii)的比率約為以下任意或可選地小于約以下任意1.0、0.7、0.6、0.5、0.4、0.35;0.3;0.25、0.2、0.15、0.11、0.075、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01:(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照與綴合物施用量相比所施用抗原的10倍單位質(zhì)量)。(g)(i)與(ii)的比率約為以下任意或可選地小于約以下任意60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5:(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照與綴合物施用量相比所施用抗原的單位質(zhì)量)；(h)(i)與(ii)的比率約為以下任意或可選地大于約以下任意4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10。如果表達為范圍，上限可以是包括所列的以及其他的任何數(shù)字，例如15、20、25、30、40、50、60、75、80、卯、100:(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由綴合物引發(fā)的Th2-相關(guān)抗體的效價；(i)與施用相同量未連接的含ISS多核苷酸和抗原比較，或與單獨施用相同量的抗原比較，抑制抗原特異性抗體的產(chǎn)生(包括Thl-相關(guān)和/或Th2-相關(guān)抗體的產(chǎn)生)。"M"類由以下任意特性單獨或任意組合定義(a)每個抗原分子平均約3個至約5個含ISS多核苷酸；(b)(i)含ISS多核苷酸平均質(zhì)量與(ii)抗原平均質(zhì)量的比率為(i)約20、約25、或約30至(ii)約40;(c)(i)與(ii)的比率為約2.5至約3.0，或可選地約3.25:(i)抑制抗體與抗原結(jié)合50%所需的ISS-抗原綴合物濃度，(ii)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合50%所需的抗原濃度；(d)例如當抗原為變應(yīng)原時，(i)與(ii)的比率為約100至約200，或可選地約100,或可選地約為約75至約250:(i)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40%組胺所需的ISS-抗原綴合物的濃度，(ii)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40%組胺所需的抗原濃度，(e)(i)與(ii)的比率為約13,或可選地為約IO或約12至約IOO(或在一些實例中約12至約50):(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照所施用綴合物的單位質(zhì)量)；(f)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)與由抗原引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照與綴合物施用量相比所施用綴合物的IO倍單位質(zhì)量)的比率為約1.3，或可選地為約1.0或約1.2至約IO(或在一些實例中約1.2至約5.0);(g)(i)與(ii)的比率約為約70至約500:(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照與綴合物施用量相比所施用抗原的單位質(zhì)量)；(h)(i)與(ii)的比率為約2至約4:(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由綴合物引發(fā)的Th2相關(guān)抗體的效價。"L"類由以下任意特性單獨或任意組合定義(a)每個抗原分子平均少于約3個含ISS多核苷酸；(b)(i)含ISS多核苷酸平均質(zhì)量與(ii)抗原平均質(zhì)量的比率為(i)約15或可選地小于約15(在一些實例中為約IO或可選地小于約10)至(ii)約40;(c)(i)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合50。/。所需的ISS-抗原綴合物濃度與(ii)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合50%所需的抗原濃度的比率為小于約2.0，或可選地約2.0;(d)例如當抗原為變應(yīng)原時，(i)與(ii)的比率為小于約75,或可選地約75(在一些實例中小于約60，或可選地約60)至約200,或可選地至約100:(i)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40%組胺所需的ISS-抗原綴合物的濃度，(ii)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40%組胺所需的抗原濃度，(e)(i)與(ii)的比率為約150，或可選地多于以下任意100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800。如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括所列數(shù)字。其中(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照所施用綴合物的單位質(zhì)量)。(f)(i)與(ii)的比率約為以下任意或可選地大于約以下任意10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80,其中(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由抗原引發(fā)的Thl-和Th2-相關(guān)抗體的總效價(按照與綴合物施用量相比所施用綴合物的IO倍單位質(zhì)量)；(g)(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)與(ii)由抗原引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價的比率為約500或以上，包括但不僅限于約500或以上，約600或以上，約700或以上，約800或以上，約卯O或以上，約1000或以上。如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括但不僅限于600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、3500、400、4500、5000^(h)(i)與(ii)的比率約為以下任意或可選地少于約以下任意2.0、1.5、1.25，其中(i)由ISS-抗原綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體的效價(按照每單位質(zhì)量施用的綴合物所引發(fā)的抗體)，(ii)由綴合物引發(fā)的Th2相關(guān)抗體的效價。根據(jù)本文描述可以清楚，應(yīng)理解可產(chǎn)生任何大量的綴合物分子群體，并且"L"、"M"和"H"的分類是綴合物分子群體種類的幾個實例。改變并控制綴合程度從而控制免疫應(yīng)答調(diào)變類型的能力除本文所舉例的這些外，擴展至其他群體。給定可容易測量的結(jié)構(gòu)和功能特征后，建立任何大量群體充分落入本領(lǐng)域技術(shù)的范圍。因此，本發(fā)明還包括由以下任何(單獨或以任意組合)表征的綴合物群體(a)(i)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合50。/。所需的ISS-抗原綴合物濃度與(ii)抑制抗原特異性抗體與抗原的結(jié)合50%所需的抗原濃度的比率為大于約1.5、2.0、2.25、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.50、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0中任何。如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括所列數(shù)字(例如，綴合物群體可以是大于約2.0，大于約2.0且小于約5.5，大于約2.0且小于約20.0)。(b)(1)抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合50%所需的ISS-抗原綴合物濃度與(ii)抑制抗原特異性抗體與抗原的結(jié)合50%所需的抗原濃度的比率為小于約1.5、2.0、2.25、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.50、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0中任何。如果表達為范圍，則下限可以是任何所列數(shù)字以及零(例如，綴合物群體可以是小于約5.0，或可選地小于約5.0且大于約2.0)。(c)在抗原為變應(yīng)原的情況中，(i)從來自抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放40%組胺所需的ISS-抗原綴合物濃度與(ii)從來自抗原致敏個體嗜5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、80、90、95、100、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、卯0、950、1000、1100、1200、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000。如果表達為范圍，則上限可以是包括所列的任何數(shù)字?？蛇x地，該比率可以小于以下任意2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、80、卯、95、100、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000。如果表達為范圍，則下限可以是任何所列數(shù)字以及零。(d)每單位質(zhì)量ISS-抗原綴合物所引發(fā)的抗體效價(更特別地，IgG效價，例如Thl-和Th2-相關(guān)的IgG效價總和)與每單位質(zhì)量抗原所引發(fā)的抗體效價(更特別地，IgG效價，例如Thl-和Th2-相關(guān)的IgG效價總和)的比率為至少大于約以下任意0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2、5、10、15、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、卯0、1000、1250、1500、2000、2250、2500、2750、3000。如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括所列數(shù)字?？蛇x地，比率可以小于約以下任意0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1250、1500、2000、2250、2500、2750、3000。如果表達為范圍，則下限可以是零或任何所列數(shù)字。(e)綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體效價與綴合物引發(fā)的Th2-相關(guān)抗體效價(每單位質(zhì)量)的比率小于約以下任意20、15、12、10、7、5、4.5、4.25、4.0、3.75、3.5、3,25、3.0、2.5、2.0、1.5、1.25、1.0、0.5。如果表達為范圍，則下限可以是任何所列數(shù)字，包括零。可選地，該比率可以大于以下任意:0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5、5.0。如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括所列數(shù)字。(f)綴合物引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體效價與抗原引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體效價(每單位質(zhì)量)的比率小于約以下任意5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、卯0、800、700、600、500、400、300、200、150、100、50、75、60、50、40、45、30、35、25、20、14、10、5。如果表達為范圍，則下限可以是任何所列數(shù)字，包括零?？蛇x地，該比率可以大于約以下^f壬意10、20、50、60、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、800、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、3000、3500、4000、4500、5000。如果表達為范圍，則上限可以是任何數(shù)字，包括所列數(shù)字。綴合程度可以以多種方式控制，其均使用本領(lǐng)域公知的化學(xué)技術(shù)，并也描述于本文中?？刂凭Y合程度的一種方式為改變ISS相對于抗原上連接位點的當量。即恒定數(shù)或量的連接位點與特定量的ISS反應(yīng)。例如，對本文所例證的ISS-AmbaI綴合物分子而言，基于馬來酰亞胺活化的Amba1，4摩爾當量的5，硫代ISS、7摩爾當量的5，硫代ISS和17摩爾當量的5，硫代ISS與1摩爾當量的Amba1反應(yīng)，分別得到"L"、"M"和"H"群體。控制綴合程度的另一方式為用ISS飽和反應(yīng)，并改變抗原上可用的連接位點的量。連接位點可通過例如選擇提供期望數(shù)量連接位點的某一連接部分進行控制(例如，與氨基基團相反，選擇通過糖類連接)，或可選地通過控制連接活化反應(yīng)從而活化期望平均數(shù)的連接位點而進行控制。通常，給定的抗原具有最大數(shù)量的可能連接位點，取決于抗原-ISS連接的性質(zhì)。綴合的程度可通過這些用于連接ISS的連接位點的數(shù)量進行控制。因此，本發(fā)明還包括下述實例，其中附著于含ISS多核苷酸的連接位點的總數(shù)量平均百分比為至少約以下任意5%、10%、20%、30%、33%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、85%、88%、卯％、92%、95%、97%、98%?？蛇x地，本發(fā)明還包括下述實例，其中附著于含ISS多核苷酸的連接位點的總數(shù)量平均百分比小于約以下任意10%、20%、30%、33%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、85%、88%、卯％、92%、95%、97%、98%。連接位點的總數(shù)量由附著模式?jīng)Q定。例如，如果抗原通過游離氨基基團(例如賴氨酸)與含ISS多核苷酸連接，則連接位點的總數(shù)量為賴氨酸的數(shù)量。如果抗原通過巰基(例如通過半胱氨酸)連接，則連接位點的總數(shù)量為游離巰基基團的總數(shù)量。如果抗原通過糖類部分連接，則連接位點的總數(shù)量為糖類部分的總數(shù)量。就任何這些實例而言，附著于含ISS多核普酸的連接位點平均百分比可伴隨上文所列任何免疫調(diào)節(jié)特征(單獨或組合)。75^-戎#綏合##子神類種衷在綴合物分子群體可通過任何大量方式鑒定和/或表征，包括上文所列方式。例如，就結(jié)構(gòu)而言，綴合的程度可由以下描述(a)相對于抗原分子的ISS平均數(shù)或可選的中位數(shù)；(b)ISS與抗原總連接位點的比率；(c)ISS質(zhì)量(均值或中位數(shù))對抗原質(zhì)量(均值或中位數(shù))的比率；(d)ISS與抗原T細胞表位的比率；(e)ISS與抗原B細胞表位對比率。就功能(其包括但不僅限于免疫調(diào)節(jié))而言，本發(fā)明的綴合物分子群體可由以下表征(a)抗原特異性抗體應(yīng)答如IgG應(yīng)答的程度；(b)Thl-相關(guān)抗體與Th2-相關(guān)抗體的比率；(c)組胺釋放抑制程度；(d)與抗原特異性抗體竟爭結(jié)合抗原的程度；(e)ThL相關(guān)免疫應(yīng)答抑制程度；(f)Thl-相關(guān)細胞因子如干擾素的分泌；(g)Th2-相關(guān)細胞因子如IL-4和/或11-5的分泌。潛械在ISS-抗原綴合的程度可使用本領(lǐng)域已知的任何大量蛋白質(zhì)和核酸測量方法確定。例如，抗原和/或蛋白質(zhì)特異性檢測技術(shù)(例如抗原特異性抗體和/或考馬斯亮藍染色)和核酸特異性檢測技術(shù)(例如用可檢測標記的DNA探針雜交)可用于分析綴合反應(yīng)產(chǎn)物。使用合適的定量標準，可確定相對于抗原的多核苷酸量。與多肽結(jié)合的寡核苷酸量也可通過測量綴合物大小或分子量確定。綴合物分子大小可使用本領(lǐng)域已知方法確定，所述方法包括但不僅限于十二烷基石克酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析和尺寸排阻層析(SEC)。ISS-抗原綴合物分子可使用尺寸確定和/或分離技術(shù)及核酸和蛋白質(zhì)確定技術(shù)進行分析。例如使用SEC將綴合物分子反應(yīng)產(chǎn)物分級后，各級分的蛋白質(zhì)與核酸含量可分別通過所述級分在280nm和260nm的吸光度確定。以此種方式可將綴合物分子尺寸和核酸與蛋白質(zhì)檢測分析的結(jié)果組合以表征綴合物分子的結(jié)構(gòu)。各綴合物級分中多核苷酸量與蛋白質(zhì)量的比率指示每抗原分子的ISS分子平均數(shù)。潔表在本領(lǐng)域已知的多種方法可用于確定響應(yīng)ISS-抗原綴合物分子施用而產(chǎn)生的抗原特異性和抗體種類和/或抗體亞類。例如，標準ELISA型測定法可用于檢測并測量響應(yīng)多種ISS-抗原綴合物分子而產(chǎn)生的抗體的量、特異性和/或類型。在這類測定法中，例如抗原附著于基質(zhì)上，并與來自ISS-抗原綴合物分子處理個體的血清孵育。然后使用抗體特異性試劑(如特異于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE等的抗體)確定附著于基質(zhì)結(jié)合抗原的抗原特異性抗體量。本領(lǐng)域已知的方法可用于確定抑制抗原特異性抗體與抗原結(jié)合所需的ISS-抗原綴合物分子濃度，如本文所述的竟爭性ELISA測定法。本領(lǐng)域已知的方法可用于測量響應(yīng)ISS-抗原綴合物分子而從抗原致敏個體嗜堿性粒細胞中釋放的組胺量。例如，如本文所述，釋放至細胞培養(yǎng)物上清液的組胺量可在用不同濃度和/或制品的ISS-抗原綴合物分子處理來自變應(yīng)性個體血液的白細胞后確定。本領(lǐng)域已知的方法可用于確定響應(yīng)ISS-抗原綴合物分子施用而產(chǎn)生的細胞因子產(chǎn)生鐠。例如，用ISS-綴合物分子體外處理的細胞的上清液用于分析細胞因子的存在。由接觸ISS-抗原綴合物分子的淋巴細胞所產(chǎn)生的細胞因子量可使用標準ELISA型測定法測量。響應(yīng)ISS-抗原綴合物分子而產(chǎn)生的細胞因子譜也可使用標準細胞因子生物測定法確定，所述方法包括但不僅限于其中細胞存活依賴于特定細胞因子(例如IL-2)存在的方法，和其中特定細胞因子(例如干擾素)抑制病毒復(fù)制的方法。綴合物分子類別也可表征為施用后或相對于單獨施用抗原而言抗原特異性抗體抑制的程度。例如血清抗體水平可在施用ISS-抗原綴合物分子和/或單獨施用抗原之前和之后確定。然后可將多個時間點的抗體水平比較以確定抗體抑制的程度。綴合物分子類別也可表征為抗體應(yīng)答(在一些實例中為抗原特異性抗體應(yīng)答，特別是IgG應(yīng)答)的程度。如上所述，類別可以表征為(i)應(yīng)答綴合物分子而產(chǎn)生的IgG抗體與(ii)應(yīng)答單獨的抗原而產(chǎn)生的IgG抗體的比率。對這些特征和實例而言，所述比率可以是(i)由ISS-抗原綴合物分子引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體和TH2-相關(guān)抗體的總和比(ii)由抗原引發(fā)的Thl-相關(guān)抗體和Th2-相關(guān)抗體的總和；(ii)(i)由ISS-抗原綴合物分子引發(fā)的一種或多種Thl-相關(guān)抗體比(ii)由抗原引發(fā)的THl-相關(guān)抗體；(iii)(i)由ISS-抗原綴合物分子引發(fā)的一種或多種Th2-相關(guān)抗體比(ii)由抗原引發(fā)的TH2-相關(guān)抗體；Thl-相關(guān)抗體是與Thl應(yīng)答相關(guān)的抗體。例如在小鼠中，IgG2a與TH1應(yīng)答相關(guān)。在人中，IgGl和/或IgG3抗體顯示與Thl應(yīng)答相關(guān)。參閱例如Widhe等(1998)5^"d//附附""o/:47:575-581和deMartino等(1999)J/fer^vJs幼/mi/附immo/:83:160-164。相似地，Th2畫相關(guān)抗體為與Th2應(yīng)答相關(guān)的抗體。在小鼠中，IgGl與Th2應(yīng)答相關(guān)。在人中，IgG2和/或IgG4顯示與Th2應(yīng)答相關(guān)(Widhe等(1998)和deMartino等(1999))。在人和小鼠二者中，IgE均與Th2應(yīng)答相關(guān)。應(yīng)當理解對于這些特征和實例而言，可以評價任何一種或多種類型的抗體，只要相同的抗體或抗體生產(chǎn)水平與由抗原單獨引發(fā)的相比即可。一種計算該比率的方式是按照每單位質(zhì)量綴合物分子所產(chǎn)生的一種或多種目的抗體的量與每單位質(zhì)量抗原所產(chǎn)生的一種或多種相同抗體的量相比。所述綴合物分子的單位質(zhì)量可以按照綴合物分子抗原組分、綴合物分子多核苷酸組分的質(zhì)量和/或綴合物分子的質(zhì)量。例如，如果綴合物分子具有100的總分子量，其中抗原組分占80而ISS組分占20，則用于計算和比較抗體生產(chǎn)水平的單位質(zhì)量可以是100、80或20中的任意。在實施例提供的計算中，綴合物分子中抗原組分(Amba1)的質(zhì)量作為計算和比較抗原生產(chǎn)水平的基礎(chǔ)與單獨抗原進行比較。另外，計算由綴合物分子產(chǎn)生的抗體與由抗原產(chǎn)生的抗體的比率時，綴合物分子的質(zhì)量比抗原的質(zhì)量可以是或不是1:1。例如在一些實例中，由單位質(zhì)量綴合物分子產(chǎn)生的抗體與2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、40倍抗原質(zhì)量中任意所產(chǎn)生的抗體相比。例如在Amba1情況下，1Hg綴合物分子所產(chǎn)生的抗體(如通過抗原量所測量的；因此是綴合物分子中的lng抗原)與10ngAmbal所產(chǎn)生的抗體相比較。在本文所述組合物的一些實例中，含ISS多核苷酸與抗原綴合。ISS部分可以與綴合物分子的抗原部分以多種方式(包括共價和/或非共價相互作用)偶聯(lián)。各部分間的連接可以在ISS的3，或5，端，或在ISS內(nèi)部位置經(jīng)適當修飾的堿基上進行。如果抗原是肽，并含有合適的反應(yīng)性基團(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)，其可與胞嘧啶殘基的W氨基基團直接反應(yīng)。根據(jù)ISS中胞嘧啶殘基的數(shù)量和位置，可實現(xiàn)一個或多個殘基上的特異性偶聯(lián)。可選地，經(jīng)修飾的寡核苷(例如本領(lǐng)域所已知的)可以摻入ISS中的任一端或內(nèi)部位置。這些可含有被封閉的官能團，在去封閉后可與多種官能團反應(yīng)，后者可以存在于或附著于目的抗原上。當抗原為肽時，綴合物分子的該部分可以通過固相支持物化學(xué)附著于ISS的3，端。例如，ISS部分可以被添加在已預(yù)先在支持物上合成的多肽部分上。Haralambidis等(19卯a(chǎn))7V"c/"c^"Vfe及仏18:493-499和Haralambidis等(19卯b)7Vwc/"c爿"Vfe及m.18:501-505。可選地，可合成ISS,使其通過從3，端延伸的可切割接頭附著于固相支持物。將ISS從支持物上化學(xué)切割后，寡核苷酸3，端留下端巰基(Zuckermann等(1987)7V"c/e/c」"Vfo及M，15:5305-5321和Corey等(1987)5We""238:1401-1403)或寡核苷酸3，端留下端氨基(Nelson等(1989)7Vwc/e/c17:1781-1794)。經(jīng)氨基修飾的ISS與肽氛基的綴合可以如Benoit等(1987)A^wwwe幼offe6:43-72中所述進行。經(jīng)巰基修飾的ISS與肽羧基的綴合可如Sinha等(1991),185-210頁，0//gowwc/edVfc^4聽/ogMd.vl尸mc,/ca/j/^ratfd，IRLPress中所述進行。帶有附加的馬來酰亞胺的寡核苷酸與肽半胱氨酸殘基的巰基側(cè)鏈的偶聯(lián)也已^皮描述。Tung等(1991)祝oamJMg.CA柳.2:464-465。綴合物分子的肽部分可通過在其合成期間摻入寡核苦酸的氨基、巰基或氣基附著于ISS的5，端。在一些實例中，當寡核苷酸被固定在固相支持物上時，將一端上包含被保護的氨基、巰基或氣基而另一端上包含亞磷酰胺的連接基團共價附著在5，羥基上。Agrawal等(1986)iV"c/^c^"Vfei^s.14:6227-6245;Connolly(1985)7Vwc/"c及d13:4485-4502;Kremsky等(1987)7V"c/"c及"15:2891-2909;Connolly(1987)7V"c/e,c及w15:3131-3139;Bischoff等(1987)5&c&抓164:336-344;Blanks等(1988)7Vwc/e/c及"16:10283-10299和美國專利No.4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。脫保護后，氨基、巰基和^&官能團可用于將寡核苷酸與肽共價附著。Benoit等(1987)和Sinha等(1991)。ISS-抗原綴合物分子也可通過非共價相互作用形成，例如離子鍵、疏水性相互作用、氫鍵和/或范德華引力。非共價連接的綴合物分子可包括非共價相互作用，例如生物素-鏈親和素復(fù)合物。生物素基團可以附著在例如ISS經(jīng)修飾的堿基上。Roget等(1989)7V"c/e/cJ"Vfe及d17:7643-7651。鏈親和素部分摻入肽部分，能夠形成鏈親和素綴合肽與生物素化寡核苷酸之間非共價鍵合的復(fù)合物。非共價締合也可通過涉及ISS和抗原內(nèi)殘基(例如帶電氨基酸)的離子相互作用發(fā)生，或通過包含帶電殘基的接頭部分(其可與寡核苷酸和抗原二者均相互作用)發(fā)生。例如，非共價綴合可在通常帶負電荷的ISS和肽中帶正電荷的氨基酸殘基(例如多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚組氨酸殘基)之間發(fā)生。ISS和抗原之間的非共價綴合可通過分子的DNA結(jié)合基序發(fā)生，所述DNA結(jié)合基序與它們的天然配體DNA相互作用。例如，這類DNA結(jié)合基序可發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄因子和抗DNA抗體中。ISS與脂質(zhì)的連接可使用標準方法形成。這些方法包括，但不限于寡核苷酸-磷脂綴合物分子(Yanagawa等(1988)7Vwc/ac^"VfeSj;附/.&尸.19:189-192)、寡核苷酸-脂肪酸綴合物分子(Grabarek等(1990)Anal.Biochem.185:131-135和Staros等(1986)爿w"/.說oc&附.156:220-222)和寡核苷酸-固醇綴合物分子的合成。Boujrad等(1993)2Vfl汰Jcad.Sdt/5^4卯:5728-5731。寡核苷酸與寡糖的連接可使用標準的已知方法形成。這些方法包括，但不限于寡核苷酸-寡糖綴合物分子的合成，其中寡糖為免疫球蛋白的部分。O，Shannessy等(1985)/X/7/;/zW歷oc^肌7:347-355。環(huán)狀I(lǐng)SS與肽或抗原的連接可以以數(shù)種方式形成。環(huán)狀I(lǐng)SS使用重組或化學(xué)方法合成時，經(jīng)修飾的核苷是合適的。Ruth(1991),255-282頁，in0//go冊c/eoftVfes朋^Mwa/ogMW^4iVfl"i'ctf/々//wcA，IRLPress。然后可使用標準的連接技術(shù)將環(huán)狀I(lǐng)SS與抗原或其他肽連接起來。Goodchild(19卯)C&抓1:165。環(huán)狀I(lǐng)SS是被分離或使用重組或化學(xué)方法合成時，連接可通過化學(xué)激活或光激活反應(yīng)基團(例如卡賓、基團)而形成，所述反應(yīng)基團已摻入抗原或其他肽中。用于肽和其他分子與寡核苷酸附著的其他方法可見于美國專利No.5,391,723;Kessler(1992)"Nonradioactivelabelingmethodsfornucleicacids"inKricka(編)7V(Ow/so鄉(xiāng)/c/Vv6erec/r/《wes，AcademicPress;和Geoghegan等(1992)5"co"/"g.CAe附.3:138-146。逸舍綴合參為、fW試浙盒本發(fā)明還提供包含組合物的試劑盒，所述組合物包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子和如本文所述的任意一種或多種額外的組分，包括但不限于能夠?qū)⒔M合物的pH范圍維持在約6.0至約9.0的組合物，氨基酸，糖類，表面活性劑和/或其他可藥用載體。試劑盒可包括含有這類組合物的制品，其中所述組合物可以是液體或凍干形式。在一些實例中，制品包含含有綴合物分子的組合物，其中所述組合物在約2'C和約8'C的溫度包含多于約70%、多于約80%、多于約90%、多于約95%或多于約97%的非聚集體形式的綴合物分子。在一些其中制品包含含有變應(yīng)原的組合物的實例中，試劑盒可包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種或至少6種包含所述組合物的制品。在一些實例中，變應(yīng)原為Ambal。在一些實例中，通過RALS測量聚集。在其他實例中，制品包含含有綴合物分子的液體組合物，而在其他實例中包含含有綴合物分子的凍干組合物。又在其他實例中，制品包含含有綴合物配偶體的重構(gòu)液體組合物(即從凍干的組合物重構(gòu))。本發(fā)明的試劑盒可任逸的含有它們的使用說明書(例如本文所述任意方法的說明)和/或任何其他合適的組分。逸舍綴合參》f^蟲合游^炎^和辦務(wù)才法本發(fā)明還包括包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子的組合物的制備和使用方法。如本文所述的包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物對向需要免疫調(diào)節(jié)的個體(在上下文中為例如傳染性疾病、癌癥和/或變態(tài)反應(yīng))施用特別有用。因此，本發(fā)明提供包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子的藥物組合物。方法通常包括將如本文所述的包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子或綴合物分子群體的組合物以足以在個體中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的量施用給個體。在一些實例中，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法包括施用包含綴合物分子的組合物，從而實現(xiàn)期望的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。免疫應(yīng)答的評估已在上文描述。在一些實例中，試劑盒包含含有組合物的制品，所述組合物包含約0.1ng至約200jig范圍的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的AIC。在其他實例中，組合物包含至少約10ng、20ng、30jig、40jig、50ng、60fig、70fig、80pg、90ng或100fig和至多約110jig、120jig、130jig、140jig、150jig、160ng、170jig、180fig、l卯jig或200ng范圍的AIC。在一些實例中，組合物包含約30ng至約60jig范圍的AIC。本文提供了用于在個體中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括向個體施用包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的步驟。在一些實例中，綴合物分子包含變應(yīng)原，而在其他實例中，綴合物分子包含Amba1。又在其他實例中，綴合物分子為AIC。在一些實例中，組合物包含AIC和能夠?qū)⒔M合物的pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分，并可額外含有以下任意一種或多種1)氨基酸；2)糖類；3)表面活性劑，或4)其他可藥用載體，只要組合物的AIC結(jié)構(gòu)穩(wěn)定即可。在一些實例中，本發(fā)明提供在個體中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向個體以足以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的量施用包含本文所述任何綴合物分子或綴合物分子群體的組合物。一般地，個體需要或?qū)⑿枰@類調(diào)節(jié)是因為例如疾病狀態(tài)或處于發(fā)展疾病狀態(tài)的風險中。疾病狀態(tài)的實例包括，但不限于變態(tài)反應(yīng)、癌癥、傳染性疾病(例如病毒或細菌感染)。在一些實例中，疾病狀態(tài)為變態(tài)反應(yīng)。在一些實例中，免疫調(diào)節(jié)包括刺激(即一種或多種)Thl相關(guān)的細胞因子，例如干擾素卞在一些實例中，免疫調(diào)節(jié)包括抑制(即一種或多種)Th2相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生，例如IL-4和/或IL-5。這些參數(shù)的測量使用本領(lǐng)域標準的和上文已討論的方法。在一些實例中，產(chǎn)生一種(或多種)Thl-相關(guān)的細胞因子，而抑制抗原特異性抗體的產(chǎn)生。這些參數(shù)的測量使用本領(lǐng)域標準的和上文已討論的方法。在一個實例中，免疫調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)包括刺激(即一種或多種)Thl-相關(guān)的細月包因子例如干擾素-Y并抑制抗原特異性抗體的產(chǎn)生。關(guān)于多種綴合物分子群體抑制抗原特異性抗體產(chǎn)生(包括Thl-相關(guān)抗體產(chǎn)生以及Thl-和Th2-相關(guān)抗體產(chǎn)生的組合)的程度已在上文描述并適用于這些方法。在一些實例中，免疫調(diào)節(jié)包括抑制組胺釋放。關(guān)于多種綴合物分子群體抑制組胺釋放的程度已在上文描述并適用于這些方法。在一些實例中，抑制個體中抗體形成(優(yōu)選抗原特異性抗體形成)同時刺激Thl-相關(guān)細胞因子產(chǎn)生的方法包括向個體施用包含H類ISS-抗原綴合物分子群體的組合物，從而抑制抗體合成同時刺激Thl-相關(guān)的細胞因子。這些參數(shù)的測量使用本領(lǐng)域標準的和上文已討論的方法。在一些實例中，本發(fā)明提供治療個體變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)的方法，所述方法包括以足以改善或緩和變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)(通常通過調(diào)節(jié)針對抗原的免疫應(yīng)答)的量，施用包含本文所述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子或綴合物分子群體的任何組合物，其中抗原為變應(yīng)原。緩和可通過例如減輕一種或多種與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的癥狀來確定。本發(fā)明還提供了用于降低抗原(特別是變應(yīng)原)的變應(yīng)原性的方法，包括向有需要的個體施用包含本文所述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物，從而降低變應(yīng)原性。在一些實例中，綴合物分子為AIC。一般地，可用于具體應(yīng)用的包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的施用途徑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。施用途徑包括，但不限于血管內(nèi)(動脈或靜脈)、皮下、腹膜內(nèi)、器官內(nèi)、肌內(nèi)、口、經(jīng)粘膜、表皮、腸胃外和胃腸等。對體外或離體施用而言，化合物可在細胞和/或器官的培養(yǎng)基內(nèi)作為單次大劑量(singlebolus)、通過重復(fù)添加、通過持續(xù)輸注等形式提供。對于施用而言，組合物可以便利地以單位劑型存在，并可以通過制藥領(lǐng)域公知的任何方法制備。這類方法包括將綴合物分子或綴合物分子群體與本文所述的組分締合的步驟。為了確定綴合物分子用于任何應(yīng)用的最適濃度，可以使用常規(guī)技術(shù)。組合物可包括水性和非水性等滲無菌注射液，其可含有抑菌劑和使得組合物與目的受體的血液等滲的溶質(zhì)，只要所述組合物中綴合物分子保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定即可。如果包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物作為氣霧劑提供，可將本領(lǐng)域已知的推進劑添加至液體組合物中。上述組合物和施用方法旨在描述而非限制本發(fā)明的方法和組合物。制備多種組合物的方法和設(shè)備落入本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍，在此不做詳細描述。本發(fā)明還提供了包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的制備方法，所述方法包括本文所述的任何技術(shù)和/或步驟。因此，本文提供了包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的制備方法，所述方法包括將綴合物分子與能夠?qū)H范圍維持在約6.0至約9.0的組分組合。這類組分在本文描述。在一些實例中，包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物的制備方法還包括將綴合物分子與以下任意一個或多個以任意順序組合l)如本文所述的氨基酸；2)如本文所述的糖類；3)表面活性劑；和4)可藥用栽體，只要所述綴合物分子保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定即可。本發(fā)明還提供凍干組合物的制備方法，所述方法包括將包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的液體組合物凍干的步驟。本發(fā)明還提供了重構(gòu)組合物的制備方法，包括重構(gòu)凍干的組合物。提供以下實施例用于舉例說明而非限制本發(fā)明。根據(jù)上述描述和附圖，的。這類修飾旨在落入所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實施例實施例1:AIC-L、AIC-M或AIC-H的制備Ambal-ISS寡核苷酸綴合物(AIC)是通過純化的短豚草抗原Amba1與硫代磷酸酯免疫刺激(ISS)寡核苷酸共價連接而制備的蛋白質(zhì)-寡核苷酸綴合物。Amba1在2-8C通過提取和硫酸銨沉淀從花粉中分離。粗提取物在室溫通過兩步層析步驟加工。Amba1通過DEAE瓊脂糖快速流動陰離子交換層析隨后通過丁基瓊脂糖快速流動疏水相互作用層析純化。交聯(lián)通過雜雙官能接頭磺基琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(sSMCC)進行。sSMCC在ISS寡核苷酸和Amba1之間產(chǎn)生了穩(wěn)定的酰胺和硫醚鍵。AIC具有每摩爾Amba1約4.0摩爾ISS寡核苷酸的均值，并具有約65kDa的平均分子量。Amba1抗原(分子量約37,800Da)使用標準化學(xué)和層析技術(shù)從脫脂的短豚草花粉(^附A/Yw/fl中純化。純化后用N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)封閉游離的Amba1巰基。然后用s-SMCC活化被封閉的蛋白質(zhì)。在pH7.2處，Amba1氨基與s-SMCC的琥珀酰亞胺酯專一反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，得到馬來酰亞胺活化的Ambal。與Ambal活化反應(yīng)同時進行的是，用三-(2-羧乙基)氯化膦(TCEP)還原5'二硫化ISS寡核苷酸產(chǎn)生5，硫代ISS寡核苷酸。被活化的Amba1馬來酰亞胺基團與5'硫代ISS寡核香酸的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵，將Ambal與ISS共價連接并產(chǎn)生AIC。AIC通過SuperdexHR200凝膠過濾層析純化。含有免疫刺激六聚體基序5，-AACGTT的5，二疏化ISS寡核苷酸具有5，-二硫化-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，的序列。理論分子量為約7500Da。AIC-L、AIC-M和AIC-H是豚草變應(yīng)原Amba1與含ISS多核香酸5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:l)的共價綴合物分子。所有三類綴合物分子由相同的含ISS多核苦酸使用相同的在雙官能接頭制備。與Amba1綴合的寡核苷酸數(shù)量能夠區(qū)分類別。與Amba1結(jié)合的寡核苷酸量可通過測量綴合物分子的尺寸或分子量來確定。AIC-L含有每個Amba1分子2-3個寡核苷酸的均值，AIC-M為3.5到4.5的均值，AIC-H含有>5.5的均值。這三類AIC具有所述的不同生物特性。浙務(wù)和為、岸5，磁/七ZS^慕核芬^5'二硫化ISS寡核苷酸在可控多孔玻璃支持物(CPG)上使用自動化合成儀作為硫代磷酸酯合成。所需的序列使用脫三苯甲基、偶聯(lián)、氧化和加帽的標準P-氰乙基亞磷酰胺"DMToff步驟裝配。HSP過程產(chǎn)生凍干的5，-二硫化ISS寡核苷酸作為HSP釋放的主要藥物。使三羧乙基膦(TCEP)達到室溫并溶解在10mMNaP04/141mMNaCl/pH7.2中。使5，二疏化ISS寡核苷酸達到室溫，溶解在相同緩沖液中，并在40'C用TCEP溶液處理2小時。對該材料直接進行分離步驟。兩個預(yù)先裝好的脫鹽柱串聯(lián)連接，并用10mMNaP04/141mMNaCl/pH7.2緩沖液平衡。將5'二硫化ISS寡核苷酸還原混合物上樣至柱，并對5，硫代ISS寡核苷酸進行等度(isocratically)洗脫。馬^瘋亞麼承必^^附6a7^辦務(wù)和為、庠使N-乙基馬來酰亞胺(NEM)達到室溫并攪拌溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。將Amba1融化并用NEM溶液在20。C處理2小時。使磺基琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(sSMCC)達到室溫并溶解在DMSO中。經(jīng)NEM封閉的Amba1在20。C用sSMCC溶液處理2.5小時。對該材料直接進行分離步驟。兩個預(yù)先裝好的脫鹽柱串聯(lián)連接，并用10mMNaP04/141mMNaCl/pH7.2緩沖液平衡。將Amba1活化混合物上樣至柱，并對馬來酰亞胺活化的Amba1進行等度洗脫。J/C層丄、爿/CU^C-好^賴務(wù)和為、庠將4摩爾當量5'硫代ISS寡核苷酸與1摩爾當量馬來酰亞胺活化的Amba1的混合物在20°C孵育3小時，制備粗AIC-L綴合物分子。粗AIC-M和AIC-H以類似方式制備，但是分別添加7和17摩爾當量的5，硫代ISS寡核苷酸。用10mMNaPO4/141mMNaCl/pH7.2緩沖液平衡預(yù)先裝好的凝膠過濾柱，并將粗AIC-L、AIC-M或AIC-H上樣至柱。AIC用10mMNaP04/141mMNaCl/pH7.2緩沖液等度洗脫。實施例2:包含AIC組合物的穩(wěn)定性曲線設(shè)計實驗，將組合物中綴合物分子AIC(每Amba1為3至5個ISS的比率)可能的結(jié)構(gòu)改變作為pH、溫度、時間和組合物條件(例如離子強度和表面活性劑的存在)的函數(shù)測定。研究在約2n至約8"C的溫度(實時穩(wěn)定性)和升高的溫度(促進穩(wěn)定性)進行。設(shè)計實驗，以比較冷凍jJ!i存在〈-60。C、含10mM磷酸鈉、141mM氯化鈉、pH7.2(PBS)的組合物中AIC的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以及液體貯存在2-8。C、含20mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖、pH7.5(HGS)的組合物中AIC的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。所述含PBS和HGS的組合物使用完全釋放試驗分析，并使用體外組氨酸釋放試驗分析額外的特征。證明了對于貯存在2-8。C、HGS制劑中的AIC而言有至少六個月的實時穩(wěn)定性。對PBS中的AIC而言，所述AIC通過將AIC稀釋進10mM磷酸鈉、141mM氯化鈉pH7.2(PBS)的組合物中，然后無菌過濾制備，并在《60'C冷凍貯存。PBS中AIC的實時穩(wěn)定性研究表面，當貯存于〈6(TC時至少有24個月的穩(wěn)定性。選擇《60。C貯存溫度是因為促進穩(wěn)定性研究揭示在PBS中液體貯存于2-8。C時，AIC藥物產(chǎn)物隨時間發(fā)生聚集。通過尺寸排阻層析(SEC)法評估，該聚集導(dǎo)致12個月中AIC單體含量下降約30。/。。通過鼠IgG2a抗體(描述于本文)產(chǎn)生測定，至多33%的聚集體不導(dǎo)致效價降低。使用SEC方法用于表征在<-60*€和2-8。C貯存于PBS中的AIC的結(jié)果顯示在下表2和表3中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>包含AIC的液體組合物穩(wěn)定性曲線顯示帶負電荷的組分使AIC不穩(wěn)定，導(dǎo)致推測的構(gòu)象變化和聚集。PBS制劑中的磷酸鈉和氯化鈉均促成AIC的聚集。額外的穩(wěn)定性曲線導(dǎo)致開發(fā)出含有20mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5(HGS)的AIC組合物，其在2-8。C是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的液體。與PBS組合物中的AIC相比，對HGS中AIC的促進研究顯示在20-22。C的最小AIC單體喪失。對貯存于《60。C和2-8。C的AIC使用SEC方法的結(jié)果顯示在下表4和表5中。表420mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5中的30jig/mlAIC在20-22x:和2-8t:的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表510mM磷酸鈉、141mM氯化鈉、pH7.2中的30fig/mlAIC在20-22'C和2-8'C的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>對貯存于2-8°C、HGS中AIC的實時穩(wěn)定性研究證明了至少2個月的穩(wěn)定性，沒有顯著的聚集體形式。對于2-8。C貯存和23-27'C促進的AIC使用SEC方法的結(jié)果顯示在下表6和表7中。表620mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5中的30ng/mlAIC在23-27。C和2-8。C的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表720mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔗糖，pH7.5中的60jig/mlAIC在23-27'C和2-8'C的穩(wěn)定性貯存月數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實施例3:PBS或HGS中AIC的活性鼠IgG2a活性扃/gG^fl承#AIC的生物活性由在BALB/c小鼠中產(chǎn)生Amba1特異性IgG2a應(yīng)答的能力確定。用1嗎劑量的AIC以兩周間隔在來自JacksonLabs的12周齡雌性BALB/c小鼠的尾部皮內(nèi)免疫兩次(10只小鼠/組)。Amba1特異性IgG2a效價通過ELISA從第二次免疫后兩周收集的血清測定。用礴酸鹽緩沖液中1fig/ml的Amba1在4'C包被NuncMaxisorp96-孔板過夜，洗滌并封閉。將血清稀釋液上樣在平板上并在4。C孵育過夜。Amba1IgG2a抗體使用生物素化的山羊抗小鼠IgG2a綴合物分子檢測。用鏈親和素-HRP綴合物分子處理后，用3，3，，5,5，四甲基聯(lián)苯胺使平板顯影。在ELISA平板讀數(shù)器上測定A450。效價被測定為給出0.5A楊的血清稀釋液的倒數(shù)。10mM磷酸鈉、141mM氯化鈉、pH7.2中的30fig/mlAIC的IgG2a活性(效價)=112,356，而20mM組氨酸、50mM甘氨酸、210mM蔑糖(HGS),pH7.5中的30叫/mlAIC的IgG2a活性(效價)=69,705。10mM磷酸鈉、141mM氯化鈉、pH7.2中的60pg/mlAIC的IgG2a活性(效價)=64,422,而HGS中60fig/mlAIC的IgG2a活性(效價=58,057)。實施例4:PBS或HGS中AIC的變應(yīng)原性組胺釋放除了實施例3中所述的對AIC進行的測試外，還對HGS和PBS中AIC進行體外表征。具體地，使用體外組胺釋放測定測試這些組合物的變應(yīng)原性。使用體外組胺釋放測定將PBS和HGS中AIC的變應(yīng)原性與Ambal比較。在該測定中，從豚草變態(tài)反應(yīng)患者的血液中制備白細胞。這些細胞與0.0001至1.0ng/ml濃度范圍的Amba1或AIC—起孵育45分鐘。然后通過離心沉淀細胞，并通過自動化熒光儀分析上清液的組胺含量。100%組胺釋》文通過用2%HCI04裂解細胞來測定。結(jié)果顯示在表8中。結(jié)果以術(shù)語HR4。表達，其定義為誘導(dǎo)人細胞釋放40%組胺所需的樣品(Ambal或AIC,單位fig/ml)濃度。結(jié)果顯示兩種組合物中的AIC具有相當?shù)谋唤档土说恼T導(dǎo)組胺釋放的能力，兩種組合物的HR卯范圍比Amba1高59到46倍(誘導(dǎo)組胺釋放需要59到46倍的更多AIC)。兩種組合物變應(yīng)原性均顯著地小于未綴合的Amba1。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>(HR4o)a——誘導(dǎo)40%組胺釋放所需的Amba1或AIC濃度實施例5:PBS和HGS中AIC的穩(wěn)定性研究本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性取決于溫度、鹽和pH條件。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當以液體貯存于2-8。C包含磷酸鈉和氯化鈉的組合物中時，包含抗原的綴合物分子隨時間發(fā)生聚集。不受理論束綽，認為由于綴合物分子中因ISS的存在所致的負電荷，期望包含非負電荷組分或具有中性電荷的組分或非極性組分的組合物來維持組合物中存在的綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。多種組合物中包含變應(yīng)原Amba1變應(yīng)原的綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性使用如本文所述的IF、EFRALS、HPLC-SEC、SDSPAGE表征。辨伸才法/F、EF和i^4i^才法內(nèi)源熒光(IF)測量由應(yīng)激誘導(dǎo)的構(gòu)象變化所產(chǎn)生的色氨酸環(huán)境的可能改變。雖然應(yīng)激相關(guān)的結(jié)構(gòu)改變效應(yīng)可以是非常微妙的，并通過檢測色氨酸(Trp)和/或酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)內(nèi)源熒光(IF)的可能改變來檢測，但是在在大部分綴合物分子中，極性敏感的Trp熒光在所有的內(nèi)源熒光團中占主導(dǎo)地位。當分子經(jīng)受應(yīng)激環(huán)境改變時，該依賴于極性的熒光敏感性可用于監(jiān)測構(gòu)象改變。對環(huán)境敏感的殘基對溶劑可及性、pH以及相鄰側(cè)鏈的接近性等敏感。因此純色氨酸在極性環(huán)境中具有355nm的發(fā)射最大值，在非極性環(huán)境中具有305nm的發(fā)射最大值。因此，強度比率(高/低)可提供有關(guān)外界刺激的解折疊/結(jié)構(gòu)應(yīng)答信息。另外，使用比率能夠消除由AIC濃度差異和儀器改變引起的不準確性。在IF中，比率越高，分子越是解折疊(Trp殘基與更具極性的環(huán)境接觸)。外源熒光(EF)使用外部非共價極性敏感的熒光探針如ANS(8-苯胺基-萘磺酸)，以探測綴合物分子疏水結(jié)構(gòu)域的表觀接觸(apparentexposure),并探測該參數(shù)作為多種環(huán)境應(yīng)激和條件函數(shù)的可能改變。對綴合物分子上疏水結(jié)構(gòu)域具有親和力的熒光探針可補充內(nèi)源熒光。由多種溶液應(yīng)激誘導(dǎo)的AIC或其他綴合物分子改變可導(dǎo)致這類探針結(jié)合的疏水結(jié)構(gòu)域的改變，這進而能夠影響非共價鍵結(jié)合的探針熒光的光i普特征。因此，ANS與AIC或其他綴合物分子中疏水裂口的結(jié)合可受到pH、離子強度、極性、聚集等改變的影響。無AIC時ANS熒光不依賴于pH和溫度。ANS具有在極性環(huán)境中為520nm，在非極性環(huán)境中為490nm的發(fā)射最大值。因此，520nm和4卯nm(520/490)處熒光發(fā)射比率指示所研究AIC或其他綴合物分子上疏水結(jié)構(gòu)域的表觀接觸，而較低的比率指示可供探針利用的疏水裂口增加，因此分子更加解折疊。直角光散射(RALS)可用于檢測和監(jiān)測否則將是視覺上清亮的制劑中應(yīng)激的綴合物分子締合行為中的微妙改變。綴合物分子中的構(gòu)象變化能夠?qū)е路肿娱g締合至可能排除極性水的程度。該締合行為可以是微妙的，或可以作為可溶或不溶聚集體或甚至是可見的沉淀而被容易地檢測到。RALS監(jiān)測轉(zhuǎn)換為不溶性聚集體的否則將是可溶分子的宏觀改變。在0-10的標度中(最小/最大強度的儀器標度)，IO可以表明否則將是視覺上清亮的制劑中的自身締合。使用程序可控的循環(huán)水浴將AIC樣品以2'C/分鐘從20。C加熱至卯。C。以1分鐘的間隔記錄樣品溫度以及EF或RALS和IF的數(shù)據(jù)，以確定不同應(yīng)激溫度可能的構(gòu)象改變。在使用三角形攪拌棒的錐形玻璃瓶中，快速攪動AIC樣品(300rpm，避免氣穴)。以預(yù)先確定的時間間隔記錄溶液澄清度，并取出等分式樣通過RALS評價聚集，通過SEC評價回收和聚集體的含量。尸好必錄大部分綴合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受pH影響。使用RALS、IF和EF探測AIC，得到pH轉(zhuǎn)換期間可能的由pH誘導(dǎo)的構(gòu)象改變。這通過將AIC透析至允許容易的pH轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ)緩沖液(如下文所述)中然后用HCI和NaOH滴定，同時觀察RALS來進行。另外，使用系列pH條件范圍，用IF和RALS或EF檢測產(chǎn)物穩(wěn)定性。微拼對所有的實驗，在熒光儀中相同時間記錄RALS和IF二者的數(shù)據(jù)。由于納入外部探針，所以EF測量結(jié)果在單獨的實驗中記錄。卓^農(nóng)設(shè)_￡^確定在10mM磷酸鈉、141.7mMNaCl，pH7.2(PBS)中配制30pg/mLAIC溶液。使用紫外分光光度計對該樣品進行吸光度掃描。發(fā)現(xiàn)最大吸光度的波長是258nm。然后使用激發(fā)和發(fā)射掃描研究樣品。盡管AIC在258運行(即258nm)顯示最大吸光度，但是IF激發(fā)選擇在295nm處，因為Trp的激發(fā)與Phe和Tyr的重疊。因此IF激發(fā)波長被選擇為高于最大值10nm。使用發(fā)射波長比率評價構(gòu)象變化。根據(jù)發(fā)射掃描選擇295rnn的發(fā)射波長，同時選擇產(chǎn)生最大發(fā)射值一半的波長。對于AIC而言，這些波長為323nm和363nm。RALS和EF不要求測定波長。然而，RALS要求測定電壓，并且所使用的電壓根據(jù)AIC濃度而變化。通過將激發(fā)和發(fā)射波長設(shè)定在320nm處最佳監(jiān)測RALS。外部探針ANS在380nm處激發(fā)，在490nm和520nm處觀察發(fā)射。ANS具有極性環(huán)境中520nm的發(fā)射最大值和非極性環(huán)境中49011111的最大值。因此，520nm和4卯nm(520/490)處熒光發(fā)射比率指示所研究AIC上疏水結(jié)構(gòu)域的表觀接觸，而較低的比率指示可供探針利用的疏水裂口增加。對于外源熒光測量，向樣品中添加ANS(8-苯胺基-萘璜酸)作為外部探針。為了確定追蹤AIC構(gòu)象改變所需的ANS量，將ANS滴定至400pL當前劑型的藥物樣品(30jig/mL)。通過監(jiān)測該滴定過程中的熒光強度，通過將7AL的10mM貯存液添加進400gL30pg/mL樣品中獲得的0.175mM的ANS終濃度被確定為最適用于測試。使用胍滴定測定由于構(gòu)象變化，Trp環(huán)境改變所致的最大可能IF強度改變。將樣品制備為含有0M到6M范圍的胍(在室溫孵育30分鐘)，并進行熒光發(fā)射掃描。使用295nm激發(fā)獲得掃描結(jié)果。三個比率使用最大發(fā)射波長(343)處和距離峰值+20nm和-20nm處的發(fā)射波長。這些掃描提示，在大于5M的胍濃度下AIC變性，并且由于構(gòu)象變化，存在的Trp殘基現(xiàn)在則以更高的波長發(fā)射熒光。由于323/363的比率給出胍滴定的最大比率范圍，因此選擇該比率用于研究。為了研究AIC的剪切敏感性，使用425nL的30ng/mLAIC進行初步研究。PBS緩沖液中的這些樣品使用以350rpm轉(zhuǎn)動的三角形攪拌棒在錐形玻璃瓶(每個時間點一個瓶)中快速攪動(不形成氣穴)。在預(yù)先確定的時間間隔處(O、0.5、1、2、3、4、8和24小時)，從磁力攪拌器中取出每個條件下的一個并瓦。將所有樣品保持在室溫，直至研究完成。然后記錄溶液澄清度，并通過RALS評價聚集，通過HPLC評價回收和降解。AIC似乎是中度剪切應(yīng)激敏感的。3小時時RALS顯著上升，之后沒有再觀察到RALS的上升。因此，在用于該研究的濃度處，短期剪切應(yīng)當具有最小效應(yīng)或不具有效應(yīng)。注意在更高濃度處，該敏感性會成為一個重大問題。盡管回收不一致，但是貫穿整個剪切應(yīng)激測試，非聚集體。/。證明了適中但是穩(wěn)定的下降(即聚集體％上升)。4/^5詐凝度^溶為了表征PBS中的AIC,測定分子對反復(fù)凍熔循環(huán)的敏感性。該數(shù)據(jù)也用于確定在其他分析之前應(yīng)如何貯存樣品。樣品以460嗎/mL在-80。CPBS中貯存。用30fig/mL在PBS中的1mL樣品制備五個Eppendorf管，并制備一個不冷凍的200pL樣品作為對照。所有的樣品通過將它們置于水箱盒中在-80。C緩慢冷凍。冷凍完成后將所有五個1mL等分式樣在實驗臺上熔化(室溫)。然后通過IF和RALS(同時研究)以及EF(總共800pL)分析一個等分式樣，而剩余的四個在-80。C再冷凍至少2小時。剩余的經(jīng)分析的200jiL樣品被標記，并再冷凍通過HPLC進行進一步分析。重復(fù)該過程直到五個凍熔循環(huán)已經(jīng)完成并被研究。在第一個凍熔樣品中觀查到RALS中的變異性，遂改變RALS操作，恰好在進行所有后續(xù)實驗分析之前納入一個除氣步驟。RALS數(shù)據(jù)顯示PBS中的AIC(10mM鱗酸鈉、141.7mMNaCl、pH7.2)響應(yīng)提高的溫度時不發(fā)生聚集和沉淀。重復(fù)的凍熔循環(huán)似乎不改變分子對溫度斜線上升(ramp)的應(yīng)答，因為當樣品加熱時RALS沒有提高。冷凍和熔化過程自身可能改變AIC的聚集。因此分析了RALS值。熔化后立刻研究各樣品的初始RALS,表明存在一些響應(yīng)凍熔的AIC聚集。單個凍熔循環(huán)足夠提高RALS。最大提高發(fā)生在3次凍熔后。IF測量Trp焚光。由于Trp具有極性環(huán)境中355nm、非極性環(huán)境中305nm的最大發(fā)射，因此比率越低，Trp殘基所接觸的環(huán)境越是極性的，分子越是解折疊。凍熔對AIC構(gòu)象的影響通過IF測量。溫度上升時IF比率最初下降，提示構(gòu)象變化作為溫度的函數(shù)與之相關(guān)，導(dǎo)致增加Trp殘基與緩沖液的接觸。IF比率的提高提示在約55。C處分子發(fā)生重大的構(gòu)象改變。該構(gòu)象改變不伴隨(可在熒光儀杯中看到，或通過RALS測量)可檢測的聚集。除了通過IF研究的FTI和其他樣品之間的最大差異外，重復(fù)凍熔不影響AIC。這些數(shù)據(jù)支持通過RALS獲得的數(shù)據(jù)。外部非共價極性敏感的熒光探針ANS具有極性環(huán)境中為520nm和非極性環(huán)境中為490nm的發(fā)射最大值。因此，520/4卯的比值指示所研究AIC溶液的表觀疏水性。較高的比率指出所述分子更加疏水，較低的比率指出其正在暴露疏水結(jié)構(gòu)域用于ANS結(jié)合。由于高至約40。C時EF比率提高，分子經(jīng)歷連續(xù)構(gòu)象變化，引起暴露更少疏水結(jié)構(gòu)域。-40°C、-60匸和-85'(:的轉(zhuǎn)變反映了這些溫度處入1<:的構(gòu)象變化。熒光分析法實驗后貯存在-80'C的經(jīng)凍熔樣品被熔化，并注射進SEC-HPLC柱上。HPLC結(jié)果提示響應(yīng)重復(fù)凍熔的一些輕微降解。凝度《處研^潛論通過EF測量的分子開始暴露更多疏水殘基的溫度(Tm約40°C)略低于Trp殘基開始經(jīng)歷更具極性環(huán)境的溫度(如IF圖所示，Tm約50'C)。因此，這兩個方法互相支持，并提示AIC在40'C至50'C開始解折疊。由于溫度升高，AIC經(jīng)歷構(gòu)象改變，引起一些聚集。所有三個測定法在不同的凍熔樣品中顯示相似的曲線，提示AIC對于重復(fù)的緩慢凍熔相對穩(wěn)定。^f《yirC哞游溥瘋差舍Jv/^Mfl/謝定溶解在DMSO(二甲基亞砜)中的PyMaIN-(l-芘)馬來酰亞胺]是用于監(jiān)測分子中可能存在的游離-SH基團的外部-SH特異性探針。當PyMaI與游離的巰基反應(yīng)時，其變成熒光基團，在374nm和394nm處具有峰值熒光。向30jig/mL的AIC樣品中加入20倍摩爾過量的PyMaI,并將樣品在存在6M胍或10%SDS時孵育30分鐘以解折疊分子。數(shù)據(jù)從熒光值中減去緩沖液樣品值。數(shù)據(jù)提示天然狀態(tài)下分子中不隱藏游離的巰基，因為將天然PBS和SDS預(yù)處理的樣品比較時PyMaI熒光是完全相同的。胍似乎抑制PyMaI與AIC的反應(yīng)。由于PyMaI熒光隨時間提高，數(shù)據(jù)還提示即使在分子的天然狀態(tài)下，其可能暴露游離的巰基，這可能引起聚集。所述數(shù)據(jù)未提供游離巰基的可定量測量。經(jīng)^河和逸度，庠f現(xiàn)度對J/C^參詢對AIC研究不同的離子強度作為時間和溫度的函數(shù)，隨后進行pH研究。為了保持一致性并允許這類研究之間的比較，它們均在共同緩沖體系中進行，所述緩沖體系在文中稱為基礎(chǔ)緩沖液(BB)。BB是設(shè)計以便于容易的pH轉(zhuǎn)換的多緩沖液體系，其使用最小濃度的緩沖液降低來自緩沖液自身的穩(wěn)定性影響。一般地，如下制備10x濃度的溶液10XBB的制備化學(xué)品10x濃度g/L10x甘氨酸20mM1.50檸檬酸20mM4.20Hcpcs20mM4.76MES20mM4.26Tris20mM2.43多神庠子強^W^B^/^C的辦務(wù)為了使用，將10xBB稀釋至lx(各緩沖液組分2mM的終濃度)，加入所需組分，并按照需要調(diào)節(jié)pH。就本文中提出的離子強度研究而言，制備具有不同濃度NaCl(0mM、10mM、100mM、500mM)的BB緩沖液，并將溶液調(diào)節(jié)至pH7.2從而匹配PBS組合物。將AIC(約300ng/條件)在Slide-A-Lyzer透析盒中于具有不同NaCl濃度的BB中透析。更換三次透析緩沖液，其中第二次孵育過夜?；厥蘸髮悠废♂?，然后通過紫外分光光度計研究以測定濃度。隨后，將樣品進一步稀釋，得到30ng/mL的期望終濃度。出于生物安全性考慮，使用0.2gmPES濾器將樣品滅菌至15mL無菌管中，然后等分進l,5mL無菌冷凍管(聚丙烯，Coming產(chǎn)品目錄號430659)中。將這些樣品貯存在4X:，直到第二天早上將它們置于培養(yǎng)箱中的貯存盒中。對于穩(wěn)定性研究而言，將兩組約1.1mL的樣品置于30°C，一組置于40C。剩余的樣品組貯存在4'C，直到通過EF、IF、RALS和通過pH滴定分析樣品(見下文)。最終稀釋液之前紫外分光光度計分析的經(jīng)透析的AIC<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>遞diMJL9J^^W箅才不^庠于獲產(chǎn)時爿/C辦身如上所述制備樣品，過濾后通過紫外分光光度計監(jiān)測以驗證終濃度。它們在溫度斜線上升期間通過IF、RALS和EF研究。冷凍來自這些樣品的等分式樣，稍后通過SEC-HPLC研究。500mM條件下RALS提高，顯示當在較高溫度置于高離子強度條件下時分子形成聚集體。所有其他條件通過該測定法未顯示可檢測的聚集。為了促進AIC中的不穩(wěn)定性，本文提出的離子強度樣品也在30。C和40'C孵育7天(t》并通過RALS、IF和EF分析。冷凍來自這些樣品的等分式樣，稍后通過SEC-HPLC研究。40°C7天的孵育看起來與得自3ox:孵育的結(jié)果幾乎相同。僅有的差異是在40。C孵育的樣品在100mM和500mMNaCl條件下RALS小有提高(圖1)。這提示該較高的溫度也許揭示了RALS研究的AIC行為的微妙差異。在30'C孵育14天的相同制劑中獲得類似的結(jié)果。如圖l所示，500mMNaCl制劑顯示通過RALS測定的聚集的大幅增加。遞過/FJ^^^^有不^席子強產(chǎn)^M/c:舸浙在離子強度RALS研究中，在RALS溫度曲線中同時研究IF改變。當?shù)?高IF發(fā)射波長比率提高時，分子改變構(gòu)象，從而色氨酸(Trp)被隔離在更加疏水的環(huán)境中。較低的比率指示Trp殘基處于極性環(huán)境中，且該比率的改變與分子的解折疊相關(guān)。溫度上升時，AIC顯示出Tm約50。C的構(gòu)象變化，這對所有組合物是相同的。然而，500mMNaCl樣品顯示最大的構(gòu)象變化，其次是100mM樣品。經(jīng)IF比率判斷，含141mMNaCl的組合物顯示與100mM樣品所觀察的等同的構(gòu)象變化。這些數(shù)據(jù)提示高離子強度對AIC分子的穩(wěn)定性可能是有害的。炎^,7捧品遞i^研《Z/C^ifl定#t7樣品顯示在較低離子強度條件下，AIC分子呈現(xiàn)指示著解折疊的構(gòu)象變化(基于胍滴定)。隨著溫度上升所有的制劑顯示相同的構(gòu)象變化(IF比率在相同Tm處改變)，但是較低離子強度條件下較低的IF指示AIC的Trp殘基更多暴露于極性環(huán)境。在40°C孵育7天的樣品在提高的溫度未顯示在30°C孵育的樣品中觀察到的顯著構(gòu)象變化。然而，室溫IF比率依照與30。C樣品相同的模式。通過IF測定，500mMNaCl制劑顯示重大的構(gòu)象變化。遞過五FJ^^^^才不/^癉子現(xiàn)度^M/C賴浙離子強度樣品進行溫度斜線上升處理，并使用外源熒光研究。7天40'C孵育的結(jié)果與30。C孵育的結(jié)果相似。高離子強度組合物中EF的下降提示室溫該條件中AIC改變構(gòu)象以暴露更多的疏水結(jié)構(gòu)域。由于這些疏水結(jié)構(gòu)域彼此結(jié)合，疏水結(jié)構(gòu)域提高的暴露可導(dǎo)致提高的聚集。隨著溫度升高，高離子強度樣品經(jīng)歷更大的構(gòu)象變化。這些EF數(shù)據(jù)支持來自RALS和IF實驗的結(jié)果，并提示高離子強度不是AIC的良好條件。遞迎sEc-好尸ic^^:的不河庫f1強4哞的爿/c浙浙來自離子強度熒光分析研究的樣品被冷凍貯存在-8ox:直到通過SEC國HPLC分析。將溫度斜線提高到90C后冷卻樣品，然后轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中并貯存在-80。C直到通過SEC-HPLC分析。向未處理樣品組中加入額外的NaCl并也保持在-80'C。NaClt。用于證明高的非聚集體％。砑^:^々^。t:和^r^t:^r《^溫產(chǎn)辨4'丄并袢品在30'C與40'C孵育7天的樣品中獲得的結(jié)果相比不存在顯著差異，除500mMNaCl條件外。整體上，未進行溫度斜線上升的樣品中非聚集體％更高，溫度斜線上升后總回收百分比(通過層析峰面積測量)更低。在30。C將AIC孵育另外7天(總共14天)導(dǎo)致所有樣品的回收百分比(通過層析峰面積測量)適度下降，且100mM和500mMNaCl條件下非聚集體％下降(即聚集體％提高)。在含O.lMNaCl的BB中配制并在30。C孵育7天的AIC的層析圖顯示在圖2A-2C中215、260和280nm處。這顯示如SEC-HPLC所示的AIC降解。其展示降解產(chǎn)物的滯留時間(7、10、13、15、16、18分鐘)。所有的測定證明AIC在較高的離子強度制劑中更不穩(wěn)定。尸好#為庠子提度的涵炎對55哞v4/C時教詢在不同離子強度進行pH滴定。為了研究pH變化期間AIC的穩(wěn)定性，4吏用在不同NaCl濃度的BB中制備的AIC。將2.7mL(對于500mMNaCl為2.4mL)樣品制劑置于熒光儀杯中，并將pH探頭降低進入溶液。這允許在獲得RALS和IF數(shù)據(jù)的同時對pH進行實時測定。然后用5jiL的1NHC1或NaOH滴定樣品，導(dǎo)致約1個單位的pH變化。每次添加之后3分鐘的時間段允許pH平衡。此后記錄pH、RALS和IF值。該整個方法在2小時的時間過程中進行。對每個條件，將樣品的pH從pH7.2調(diào)節(jié)到pH3到pH11并調(diào)回pH7.2(3>11)，或從pH7.2到11到3并調(diào)回pH7.2(11->3)。低pH引起AIC在低離子強度下可逆地聚集。隨著pH降低，AIC經(jīng)歷可逆的構(gòu)象變化，其引起Trp殘基暴露于更具疏水性的環(huán)境中。在0mMNaCl處，由pH改變引起的AIC的RALS和IF改變是可逆的。在存在500MMNaCl時，隨著pH降低，AIC經(jīng)歷可逆的構(gòu)象變化，其引起Trp殘基暴露于更具疏水性的環(huán)境中。如果pH最初上升至ll,而不是首先被降低，則該效應(yīng)次顯著，盡管仍然是可逆的。在10mM和100mM處的pH滴定證明NaCl濃度效應(yīng)——其中高NaCl濃度對AIC是有害的。離子強度和PH滴定對AIC的效應(yīng):SEC-HPLC分析NaCl樣品貯存在4'C。1-2周后，這些樣品在pH滴定實驗中使用。滴定后將樣品冷凍貯存在-80。C直到用SEC-HPLC分析。高NaCl濃度(500mm)顯著降低非聚集體％(即聚集體％提高)。當pH首先升至11然后降至3時，100MMNaCl樣品顯示輕微的非聚集體％降低。將pH調(diào)節(jié)至3然后調(diào)節(jié)至ll對于100mMNaCl組合物而言不降低非聚集體％。在注射至HPLC前，相對于對照樣品計算熔化和制備的單體回收。500mMNaCl處單體回收被降低。在這些500MM樣品中，在約10分鐘的滯留時間處出現(xiàn)新峰，其不如本報告中存在的任何其他HPLC層析圖中的大。該峰對500mMNaCl樣品而言顯著地提高了表觀總回收百分比。這些數(shù)據(jù)支持熒光儀數(shù)據(jù)，所述熒光儀數(shù)據(jù)提示高NaCl濃度使AIC不穩(wěn)定。PH作為時間和溫度的函數(shù)對BB中AIC的影響對最初的pH研究而言，在從pH3到pH11的pH范圍制備一系列BB緩沖液(OmMNaCl)。在4'C將AIC(約150jig/制劑在pH7的BB中稀釋至75ng/mL)在Slide-A-Lyzer透析盒中于不同pH的BB中透析，使用新鮮熔化的AIC材料。透析緩沖液更換三次，第三次緩沖液更換后透析過夜?；厥蘸笸ㄟ^紫外分光光度計研究樣品以確定濃度，然后稀釋產(chǎn)生30Hg/mL的期望終濃度。出于生物安全性考慮；使用0.2jiraPES濾器將樣品滅菌至15mL無菌管中，然后等分進1.5mL無菌冷凍管(聚丙烯，Coming產(chǎn)品目錄號430659)中。將這些樣品置于濕度可控培養(yǎng)箱中的貯存盒中。將三組約1.0mL的樣品置于30X:條件，一組置于40"C。剩余的樣品組貯存在4X:直到通過EF、IF，RALS分析所有的樣品。剩余的材料冷凍，隨后進行HPLC分析。使用任何樣品之前，測定AIC濃度。這些結(jié)果總結(jié)在表9中。使用280nra處的吸光度測量AIC濃度。透析進BB后AIC回收的結(jié)果用t。樣品濃度表示。PH3、pH4和pH5樣品具有異常高的讀數(shù)(如通過回收百分比所指示的)，因此基于來自其他樣品結(jié)果的體積進行稀釋。注意所有的回收率大于100%。這很可能是由于AIC測定未經(jīng)樣品稀釋進行的事實。因此，紫外分光光度計讀數(shù)均高于1,其中準確度和線性度降低。這也可影響稀釋計算，導(dǎo)致變化更大的濃度。表9pH樣品基于t0-t14AIC的A280的AIC濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>女PBS對照-10mM砩酸鈉、141.7mMNaCl,pH7.2也使用A260測定AIC濃度，結(jié)果與在A280處獲得的結(jié)果相似但不相同。穩(wěn)定性孵育不顯著改變濃度(與t。值相比)。遞i^/MLS"羞W不/^/;jy力/C冉浙對pH研究而言，在溫度在30分鐘內(nèi)從20'C斜線上升到90。C期間，使用RALS監(jiān)測pH樣品。為了促進分子的不穩(wěn)定性并區(qū)分不同制劑的穩(wěn)定性，在30。C和40。C將AIC孵育7天和14天(t7和t")。在不同pH的BB中制備的樣品在溫度曲線中通過RALS研究。在t0處僅低pH制劑(pH3和pH4)顯示與其他樣品不同。通過RALS測量，這兩種制劑顯示大量聚集。所有的樣品在進行溫度斜線上升之前是清亮的。到達卯。C后，僅pH3樣品成為混濁的。其余的仍然清亮。將在不同pH值的BB中制備的樣品在30。C孵育7天后，再次在溫度曲線中予以研究。根據(jù)RALS，在30"C孵育7天后，低pH(3-5)誘導(dǎo)AIC聚集，所述聚集通過RALS讀數(shù)判斷。在40。C孵育7天后，極端pH(3-4，和10-11)處的制劑顯示更小的穩(wěn)定性，導(dǎo)致聚集體的形成。漸增的溫度誘導(dǎo)低pH(pH4)下額外聚集體的形成，但是在高pH(pH10和pH11)下解聚AIC。在pH6和pH9之間的pH下，溫度對聚集沒有明顯的影響。在30'C孵育14天導(dǎo)致在pH4下聚集的增加。所有其他制劑與t。和b數(shù)據(jù)相似。RALS值也提供有關(guān)不同pH下AIC穩(wěn)定性的信息。酸性pH(3-5)導(dǎo)致聚集增加，在30X:或40。C孵育隨時間推移所述聚集增加。在堿性pHUO和ll)下，僅在40。C的孵育導(dǎo)致聚集。遞迎/F盟謝不^7/;^#J/C#府在30°C和40'C孵育之前和之后，在溫度斜線上升中也使用IF研究pH樣品。PH3的制劑顯示更高的IF比率。所有制劑呈現(xiàn)溫度轉(zhuǎn)換，較低pH樣品的Tm較低。這些結(jié)果指出低PH引起AIC構(gòu)象的重大變化，因為在pH3-pH6整體IF比率顯著更高。PH3呈現(xiàn)甚至更高的IF比率。30。C時，孵育在1.55開始并隨溫度曲線穩(wěn)定提高，在90。C約2.3時結(jié)束。在pH7及以上時，高溫度分子不顯示構(gòu)象變化。40。C孵育后，pH3和pH4均超出(高)曲線的整個長度。最初的IF比率證實了通過溫度曲線獲得的結(jié)果。這些結(jié)果指示低pH引起AIC構(gòu)象的重大變化，因為在pH3-pH6時整體IF比率顯著更高。遞過五Ff^不^7/;好辦浙在溫度斜線上升期間以及30。C長期孵育后，也使用EF研究pH樣品。t。和t7樣品均在下文提供。除pH3外，在14天的穩(wěn)定性研究期間，酸性樣品顯示EF比率的顯著降低，提示在這些pH制劑中分子暴露更多的疏水結(jié)構(gòu)域。這支持t。和t7先前的結(jié)果。見圖3。EF比率越低，暴露越多的疏水區(qū)供外部探針ANS結(jié)合。數(shù)據(jù)提示pH3到pH6的制劑誘導(dǎo)顯著的構(gòu)象變化，導(dǎo)致增加的疏水性，這可引起聚集。這些數(shù)據(jù)受到RALS數(shù)據(jù)和pH滴定數(shù)據(jù)的支持。長期孵育后pH3處EF比率的提高可能是分子完全降解的結(jié)果。if過5^G^/^C^f^:含不^凝Y濕W爿/C賴W將制備用于pH研究的樣品冷凍貯存在-80。C直到通過HPLC分析。參閱圖4A-4C。在堿性pH(pH7到pH11)處非聚集體。/。和單體回收率(MRc)更高。MRct。是0時間處的單體回收率。在30。C孵育7天導(dǎo)致與40。C孵育相比更高的非聚集體。/。和回收百分比。在40X:孵育將AIC降解至下述程度其中觀察到pH3-5處分子的完全喪失和pH大于5處降低的回收百分比。除pH8外，在30。C孵育14天引起所有樣品非聚集體％降低(即聚集增加)。對pH5、pH10和pHll樣品而言，與孵育7天相比，在30"C孵育14天具有顯著的效應(yīng)。與30C的7天孵育效應(yīng)相比，對pH6到pH9的樣品僅存在適中的效應(yīng)。根據(jù)穩(wěn)定性研究中AIC在低pH下的完全破壞，AIC顯示在pH7-9處具有最大的穩(wěn)定性。如本文所述的測定法RALS、IF、EF和SEC-HPLC已顯示是AIC穩(wěn)定性的良好指標，并且預(yù)計為任何綴合物分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的良好指標。根據(jù)上述實驗的結(jié)果，依照以下參數(shù)設(shè)計組合物，所述組合物提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的綴合物分子。研究應(yīng)被設(shè)計為監(jiān)測pK值為7至9的測試組分。不使用鹽(離子強度研究的確提示低濃度對調(diào)節(jié)最終制劑中滲透性是可行的，因為10mMNaCl不顯著影響分子的穩(wěn)定性)。表10、11和12根據(jù)用于評價組分的決策矩陣的制備而繪制，所述組分通過RALS、EF、IF和HPLC-SEC測試。在多種組合物中時間和溫度對AIC的效應(yīng)通過熒光測定法分析，結(jié)果以兩種方式之一通過定性和比較分析予以評分。在一些研究中，根據(jù)每個測定法在每個時間點上所做的判斷，將組合物從最佳到最差編號(例如1到10,1是最佳)。每個測定法就起始值、急劇溫度斜線上升方面的變化以及40。C孵育隨時間的變化(t。(0時間)相對于t7(7天)、t14(14天)和t28(28天)；較小的改變給出較高的分值)進行評分。然后將數(shù)字轉(zhuǎn)化為從0到100的分值，100為最佳。其他研究使用來自每個測定法的精確值，而不是對組合物的排序。所有這些分值被平均，并報告在表IO、11、12中。HPLC結(jié)果通過將每個孵育時間點(即0、7天、14天和28天)精確的非聚集體。/。和回收率值數(shù)學(xué)地擴展在0-100的范圍來評分。來自所有三個波長的結(jié)果^L平均用于評分。t7、t"和t28HPLC數(shù)據(jù)單獨評價，從而給予這些數(shù)據(jù)更大的權(quán)重。對AIC的熱應(yīng)激研究指示40'C可用于促進結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究，因為在該溫度AIC比其約50'C至約60。C的熱解折疊轉(zhuǎn)換低10°C(如通過IF和EF研究所評價的)。RALS實驗證明AIC在約75'C至約80'C聚集和沉淀。適用于對其他綴合物分子進行促進結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究的溫度可通過測量待分析綴合物分子的熱解折疊轉(zhuǎn)換溫度來測定，并將研究溫度維持在低于所述解折疊轉(zhuǎn)化溫度10。C的溫度。這類測定可通過技術(shù)人員已知方法以及本文公開的IF和EF方法進行。AIC的IF和EF使用或不使用急劇溫度斜線上升(30分鐘，從20。C到90。C)研究。來自pH研究的結(jié)果證明AIC在高于pH6.0的制劑中顯著地更加穩(wěn)定。根據(jù)這些結(jié)果，著手研究含不同組分的組合物，所述不同組分具有從pH6.0到pH8.0的pKa值。結(jié)果顯示在表10中。對表10的結(jié)果，如下制備組分。通過將145嗎AIC針對表10中所列的每種組合物透析來制備樣品。將每種組合物的pH調(diào)節(jié)至期望值，并使用0.2pmNalgene濾器過濾。透析在4CSlide-A-Lyzer透析盒中進行，同時在300mL燒杯中以60rpm攪拌，更換透析緩沖液3次。無菌緩沖液被等分并貯存在4"C，在AIC測定中用作對照并用于注射在HPLC中?？紤]到生物安全性，透析后使用0.2nmPES濾器將樣品過濾滅菌，并等分在4個無菌冷凍管中。三組每種組合物配制為30jig/mL，并置于40'C培養(yǎng)箱內(nèi)。一組立即用于to研究。對照組合物為pH7.2的20mM磷酸氬二鈉(JTBaker);苯甲酸鹽(Ben)為20mM苯曱酸鈉(Sigma);檸檬酸鹽(Cit)為20mM檸檬酸鈉(JTBaker);組氨酸(His)為20mM(Sigma);磷酸鹽(Phos)為20mM磷酸氫二鈉(JTBaker),而琥珀酸鹽(Sue)為20mM琥珀酸(Sue)，均為所示的pH值。表IO選擇用于維持AICpH條件的組分的矩陣<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>Key:Deg=形成的降解產(chǎn)物；10mm褲酸鈉，141.7mMNaCl，pH7.2結(jié)果如上所示。根據(jù)決策矩陣表，選擇pH7.5的組氨酸；pH8.0的組氨酸；pH7.5、pH8.0、pH7.0的磷酸鹽以及pH7.0和pH6.5的組氨酸用于組合物。在一些實例中，pH7.5的組氨酸用于包含綴合物的組合物中。評價了多種氨基酸穩(wěn)定劑對AIC的影響。下文所選擇的組是根據(jù)它們在許可藥物產(chǎn)品中作為可注射腸胃外藥劑的用途來選擇的。包含待測試氨基酸的組合物被配制為用20mM組氨酸和50mM氨基酸透析，并將pH調(diào)節(jié)至7.5。使用0.2fimNalgene濾器過濾組合物。作為對照，酉i制5mM、20mM和50mM僅含組氨酸的組合物。所有測試氨基酸得自Sigma。氨基酸的結(jié)果顯示在表11中。表ll用于選擇AIC氨基酸穩(wěn)定劑的矩陣<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>六種M酸被選擇用于開發(fā)組合物。被選擇的六種氨基酸具有相似的穩(wěn)定效應(yīng)。它們是5mM組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸。對組合研究而言，甘氨酸是首要選擇的氨基酸。為了研究能夠潛在地穩(wěn)定AIC的其他組分，研究了多種糖類和表面活性劑。如果從事凍千開發(fā)，則這些組分可用作填充劑。下文所列研究評價作為穩(wěn)定劑的10種糖類和4種表面活性劑。它們根據(jù)其作為可注射腸胃外藥劑的用途而,支選擇用于研究。所有的組合物使用20mM組氨酸，pH7.5,用表12所列組分制備。作為對照，使用pH7.2的20mM磷酸氬二鈉中的AIC，且組合物含有20mM組氨酸。3。/。果糖(Fru)(Sigma);3%葡萄糖(GIu)(Sigma);3。/。乳糖(Lac)(Sigma);3。/。麥芽糖(Mal)(Fru、Glu、Lac和Mal都是凍干和液體制劑中參與梅拉德(Maillard)反應(yīng)的還原糖)；3%甘露糖(Man)(Sigma);3Vo甘露醇(Mtol)(Sigma);3。/o山梨糖醇(Sor)(Sigma);3%蔗糖(Suc)(Sigma);3。/。海藻糖(Tre)(Sigma);30/o木糖醇(Xyl)(Sigma);0.1%PEG3350(P3350或P3)(Sigma);0.1%PEG4000(P4000或P4)(Mallinckrodt);0.1%吐溫20(T20)(JTBaker)以及0.1%吐溫80(T80)(JTBaker)0表12用于選擇AIC的糖類或表面活性劑組分的矩陣<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>*單體％**總回》|欠率從該研究選擇的四種組分為乳糖、蔗糖和甘露糖和麥芽糖。然而，盡管蔗糖顯示最好的整體得分，但是它對40'C孵育具有弱應(yīng)答(通過t28的AIC非聚集體％評價)。蔗糖和山梨糖醇的穩(wěn)定性孵育效應(yīng)使用128的HPLC-SEC評價。結(jié)果證明與山梨糖醇制劑相比，在260nm和280nm處含蔗糖的組合物具有更大的降解產(chǎn)物。因為乳糖和麥芽糖是還原糖，而甘露糖在14和128具有弱HPLC結(jié)果，所以組合研究集中于蔗糖和山梨糖醇。實施例6:組合組合物研究制備用于組合研究的組合物研究1為了研究組合經(jīng)鑒定為AIC優(yōu)良穩(wěn)定劑(即有助于綴合物分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性)的組分的效應(yīng)，下文的研究評價了含有組合的組合物，所述組合包括2種緩沖液、2種氨基酸和2種糖類。除糖類從14天研究的數(shù)據(jù)中選擇外，根據(jù)得自28天穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)選擇這些組分用于研究。設(shè)計組合物以筒化單一組分改變之間的比較，同時減少評價所需組合物的數(shù)量。組合物使用所示組合和本文所述方法用表13中所列組分制備(pH7.5)。一組立刻用于to研究。表13具有組合組分的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>*單體％**總回》|史率根據(jù)表14的結(jié)果，選擇組合物3、4、6和8(均具有相似結(jié)果)。組合物1和2是對照組合物，不具有足夠被選擇為最終組合物的滲透性。通過比較多種組合物，得出以下結(jié)論提高的甘氨酸濃度和降低的蔗糖濃度(組合物4-6)引起穩(wěn)定性降低。納入甘露糖(組合物9)代替蔗糖(組合物4)得到的組合物導(dǎo)致穩(wěn)定性相當?shù)叵陆怠Ｌ砑赢惲涟彼?組合物IO)和減少蔗糖(組合物4)濃度導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。磷酸鹽緩沖的組合物(11-14)整體上不如組氨酸緩沖的組合物表現(xiàn)好。然而，單獨考慮HPLC數(shù)據(jù)時，磷酸鹽緩沖的組合物幾乎與組氨酸緩沖的組合物表現(xiàn)同樣好。含5mM(組合物8)和20mM(組合物6)組氨酸的組合物之間幾乎未觀察到差異，但是50mM組氨酸(組合物7)引起穩(wěn)定性顯著降低。研究2制備用于組合研究2的組合物為了進一步研究組合經(jīng)鑒定為優(yōu)良穩(wěn)定劑的組分的效應(yīng)，此處所示研究評價了含有1種緩沖液、2種氨基酸和3種糖類作為穩(wěn)定劑的組合物。根據(jù)得自28天穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)選擇它們用于研究。設(shè)計組合物以探索山梨糖醇的用途，因為來自28天AIC孵育的數(shù)據(jù)指示山梨糖醇比蔗糖更好地穩(wěn)定AIC。使用表15所列組分制備組合物。每種組合物的pH被調(diào)節(jié)至7.5，然后如本文所述制備每種組合物。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>*經(jīng)測量的實際滲透性透析和過濾后(t。)以及40"C孵育7天、14天和29天后的AIC濃度和回收率使用280nm處的吸光度測定。使用RALS、IF、EF和SEC-HPLC通過本文所述方法進一步分析組合物。為了選擇組合物，構(gòu)建決策矩陣表一一表16。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>選擇組合物3、7、9和10。這四種均具有相似的結(jié)果。通過比較多種組合物，得出以下結(jié)論。選擇使用組合物IO。提高的山梨糖醇濃度提高穩(wěn)定性，如組合物2相對于3以及組合物6相對于7所證明的那樣。用甘氨酸(組合物7)代替亮氨酸(組合物9)引起輕微的穩(wěn)定性降低。組合物3含有山梨糖醇，不含甘氨酸或亮氨酸，證明與使用山梨糖醇與甘氨酸或亮氨酸組合的組合物相比，是更好的穩(wěn)定劑。含有組氨酸而不是磷酸鹽的組合物根據(jù)它們的整體得分(組合物5和6)顯示更高的穩(wěn)定性，盡管當只考慮HPLC數(shù)據(jù)時，磷酸鹽組合山梨糖醇幾乎與含組氨酸和山梨糖醇的組合物一樣好地穩(wěn)定AIC(組合物3相對于5)。研究3:組分組合制備用于組合研究3的組合物回顧上述2個組合研究后，準備組合研究，比較甘氨酸、脯氨酸和亮氨酸與3%山梨糖醇和20mM組氨酸的相互作用。另外，由于AIC穩(wěn)定性可能不需要糖類，研究多種鹽作為AIC組合物中的等滲調(diào)節(jié)劑。在先前的離子強度研究中，NaCl作為模式化合物被使用。盡管數(shù)據(jù)顯示無穩(wěn)定劑時，更高的離子強度對AIC是有害的，但是該組合物重復(fù)是在存在組氨酸作為穩(wěn)定劑時，使用不同鹽或等滲調(diào)節(jié)劑進行的。使用所示組合用表17所列組分制備組合物。各組合物的pH調(diào)節(jié)為7.5，并如本文所述制備組合物。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>820mM一140mM---299920mM115mM-2921020mM---115mM-3011120mM-一-一155mM4131220mM--■--21PBS對照480*在t。處測量的實際滲透性**組合物制備中存在錯誤。組合物應(yīng)當為57mMNaCl。使用280nm處的吸光度測定透析和過濾后(tfl)以及40'C孵育7、14和28天后的AIC濃度和回收率。使用本文所述方法通過RALS、IF、EF和SEC-HPLC進一步分析組合物。表18提供用于選擇組合物組合的矩陣。表18用于選擇組合物的矩陣t7tl4t28RALSIFEF旨RcMPRcMPRcAvg.PBS478749576433330149.1176916899959781996887.5289914799849578937385.0385914699939891958588.64859047訓(xùn)9710098988290.25879255979695978297卯.46258742255302845.17839050677175.588790417677645670.897789475943301656.8108589386538462559.3118190444349221155.0128190579990968787.9從組合研究中選擇五種組合物1、3、4、5、12。所述組合物均具有相似結(jié)果。通過比較多種組合物得出以下結(jié)論。與早先的AIC在有鹽時不穩(wěn)定(組合物6-ll)的觀察一致，鹽不能用作等滲調(diào)節(jié)劑。與上輪組合物相比，在該輪組合物中組合物l得分更好，但是其不具有足夠的滲透性。與不含亮氨酸或脯氨酸的組合物(組合物1)相比，含有亮氨酸或脯氨酸與組氨酸和山梨糖醇的組合物(組合物3和4)提供更好的穩(wěn)定性。就穩(wěn)定性而言，與山梨糖醇組合時亮氨酸和脯氨酸是比甘氨酸更好的組分(組合物3和4相對于2)，但是無山梨糖醇(組合物5)時甘氨酸是比組合物3或4更好的穩(wěn)定劑。研究4回顧3個組合研究后，準備最終的組合研究，用于研究能夠維持所需pH的組分的效應(yīng)。由于在20mM組氨酸pH7.5中含有270mM甘氨酸的組合物在先前的研究中表現(xiàn)良好，所以研究了表19中概述的組合物。使用所示組合用表19中所列組分制備組合物。各組合物的組分調(diào)節(jié)至7.5，并才艮據(jù)本文所述方法制備組合物。表19具有組合組分的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>制備組合物，從而可以確認組氨酸相對于磷酸鹽的使用。使用280nm處的吸光度測定透析和過濾后(tQ)所有時間點的AIC濃度，并顯示在表20中。表20具有組合組分的組合物A，處AIC的AIC濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>未獲得t28的蛋白質(zhì)濃度。使用本文所述方法通過RALS、IF、EF和SEC-HPLC進一步分析組合物。RAL測量的結(jié)果顯示在圖5中。為了從該研究中選擇組合物，構(gòu)建決策矩陣表(表21)。表21用于選擇AIC的組合3組分的矩陣<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>通過比較多種組合物，得出以下結(jié)論。含組氨酸的組合物(l和3)與含磷酸鹽(2)的組合物相比，提供更好的穩(wěn)定性。具有低組氨酸濃度和高甘氨酸濃度的組合物(組合物3)與具有高組氨酸濃度和低甘氨酸濃度的組合物(組合物1)相比提供更好的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)提示在無NaCl時AIC最為穩(wěn)定。對AIC而言，最佳pH為7.5(范圍7-9)。AIC基本上不是剪切敏感性的。高于40。C的溫度產(chǎn)生降解的AIC。溫度和pH應(yīng)激均產(chǎn)生不溶的和聚集的物質(zhì)。用于維持AIC組合物pH的最佳組分為pH7.5的組氨酸，然后是pH8.0的組氨酸以及pH7.5和pH8.0的磷酸鹽。穩(wěn)定的AIC組合物最適宜的氨基酸為單獨的5mM組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸?？傮w上，用于穩(wěn)定的AIC組合物的最佳糖類為乳糖、蔗糖以及甘露糖和麥芽糖。麥芽糖和乳糖是還原糖。僅考慮HPLC結(jié)果時，山梨糖醇和葡萄糖提供超過所有糖類(除還原糖外)的改善的穩(wěn)定性。在一些實例中，可使用以下組合物用于在約2。C至約8。C結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的AIC液體組合物5mM組氨酸、285mM甘氨酸；20mM組氨酸、270mM甘氨酸；和20mM組氨酸、50mM甘氨酸和3.8。/。山梨糖醇。已經(jīng)通過直接描述并通過實施例詳述本發(fā)明。本發(fā)明的等同方案和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，并涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.包含結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物，其中綴合物分子包含綴合物配偶體和含免疫刺激序列(ISS)的多核苷酸，且其中組合物還包含能夠?qū)⒔M合物pH范圍維持在約6.0至約9.0的組分。2.權(quán)利要求1的組合物，其中根據(jù)直角光散射(RALS)測量，組合物在約2。C至約8'C的溫度包含多于約70%的非聚集體形式的所述綴合物分子。3.權(quán)利要求l的組合物，其中能夠維持pH的組分從由非極性組分和非負電荷組分組成的組中選擇。4.權(quán)利要求l的組合物，其中能維持pH的組分為組氨酸。5.外又利要求4的組合物，其中組氨酸以約1mM至約50mM的濃度存在于組合物中。6.外又利要求4的組合物，其中組氨酸以約5mM至約20mM的濃度存在于組合物中。7.4又利要求1的組合物，其中能維持pH的組分為磷酸鹽。8.權(quán)利要求7的組合物，其中磷酸鹽以約5mM至約50mM的濃度存在于組合物中。9.權(quán)利要求7的組合物，其中磷酸鹽以約20mM至約50mM的濃度存在于組合物中10.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物的pH范圍約7.0至約8.0。11.權(quán)利要求l的組合物，其中組合物的pH范圍約7.5至約8.0。12.權(quán)利要求1的組合物，其中ISS包含六聚體基序AACGTT。13.權(quán)利要求1的組合物，其中ISS包含基序GACGCTCC;GACGTCCC;GACGTTCC;GACGCCCC;AGCGTTCQAGCGCTCC;AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTCCC;AACGCCCC.，AACGTTCC;AACGCTCC;GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;GACGCTCG;GACGTCCG;GACGCCCG;GACGTTCG;AGCGCTCG;AGCGTTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;AACGTCCG;AACGCCCGAACGTTCG;AACGCTCG;GGCGTTCG;GGCGCTCG;GGCGTCCGGGCGCCCGGACGCT;GACGTC;GACGTT;GACGCC;GACGCUGACGUC;GACGUU;GACGUT;GACGTU;AGCGTT;AGCGCTAGCGTC;AGCGCC;AGCGUU;AGCGCU;AGCGUC;AGCGUTAGCGTU;AACGTC;AACGCC;AACGTT;AACGCT;AACGUCAACGUU;AACGCU;AACGUT;AACGTU;GGCGTT;GGCGCTGGCGTC;GGCGCC;GGCGUU;GGCGCU;GGCGUC;GGCGUT或GGCGTU。14.權(quán)利要求1的組合物，其中ISS包含序列5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3,(SEQIDNO:1);5，-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:2);5，-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3，(SEQIDNO:3);5，畫TGACTGTGAACGTTCCAGATGA國3，(SEQIDNO:4);5，-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3，(SEQIDNO:5);5，TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3，(SEQIDNO:6);5，TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3，(SEQIDNO:7);或5，-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3，(SEQIDNO:8)，其中B為5-溴胞嘧-定。15.權(quán)利要求12的組合物，其中ISS包含5,-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，。16.權(quán)利要求l的組合物，其中綴合物配偶體為抗原。17.權(quán)利要求16的組合物，其中抗原為變應(yīng)原。18.權(quán)利要求16的組合物，其中變應(yīng)原從由甲殼動物變應(yīng)原、昆蟲變應(yīng)原、哺乳動物變應(yīng)原、軟體動物變應(yīng)原、植物變應(yīng)原和真菌變應(yīng)原組成的組中選擇。19.權(quán)利要求18的組合物，其中變應(yīng)原為植物變應(yīng)原豚草抗原Amba20.權(quán)利要求1的組合物，還包含從由組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸組成的組中選擇的氨基酸。21.權(quán)利要求20的組合物，其中氨基酸為甘氨酸。22.權(quán)利要求21的組合物，其中甘氨酸以約230mM至約285mM的濃度存在于組合物中。23.權(quán)利要求l的組合物，還包含從由乳糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、山梨糖醇和葡萄糖組成的組中選擇的糖類。24.權(quán)利要求23的組合物，其中糖類為蔗糖。25.權(quán)利要求24的組合物，其中蔗糖以約1%至10%的濃度存在于組合物中。26.權(quán)利要求23的組合物，其中糖類為山梨糖醇。27.權(quán)利要求26的組合物，其中山梨糖醇以約3%至約5%的濃度存在于組合物中。28.組合物，包含綴合物分子、約1mM至約50mM濃度范圍的組氨酸和約50mM至約300mM濃度范圍的甘氨酸，其中所述組合物具有約6.0至約9.0的pH范圍。29.權(quán)利要求28的組合物30.權(quán)利要求28的組合物糖。31.權(quán)利要求28的組合物范圍。32.權(quán)利要求28的組合物范圍約7.0至約8.0。33.權(quán)利要求28的組合物pH范圍約7.0至約8.0。34.權(quán)利要求28的組合物，包含20mM組氨酸、50mM甘氨酸和3.8。/。山梨糖醇，pH范圍約7.0至約8.0。35.權(quán)利要求28的組合物，包含20mM組氨酸、50mM甘氨酸和210，還包含約1%至10%范圍的山梨糖醇。，還包含約200mM至約250mM濃度的蔗，其中所述組合物具有約7.0至約8.0的pH，包含5mM組氨酸和285mM甘氨酸，pH，包含20mM組氨酸和270mM甘氨酸，mM蔗糖，pH范圍約7.0至約8.0。36.權(quán)利要求28的組合物，其中綴合物配偶體為變應(yīng)原。37.權(quán)利要求36的組合物，其中變應(yīng)原為植物變應(yīng)原。38.權(quán)利要求37的組合物，其中植物變應(yīng)原為豚草抗原Ambal。39.凍干組合物，通過在合適的條件下凍干權(quán)利要求23的組合物產(chǎn)生。40.凍干組合物，其包含權(quán)利要求29或30的組合物。全文摘要本發(fā)明提供了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子在大約2℃至8℃的溫度結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在一些實例中，綴合物分子包含抗原，如變應(yīng)原。在一些實例中，綴合物分子包含豚草抗原Amba1。本發(fā)明提供了制備和使用此類組合物的方法。本文提供了用于在個體中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括施用包含本文所述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定綴合物分子的組合物。文檔編號A61K39/35GK101171033SQ200680015107公開日2008年4月30日申請日期2006年3月3日優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日發(fā)明者R·羅德里格斯,S·F·塔克申請人:戴納瓦克斯技術(shù)公司