專利名稱：用于神經(jīng)細胞再生的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于神經(jīng)細胞再生的藥物。
技術(shù)背景此前，人們一直認為哺乳動物活體的視網(wǎng)膜細胞等神經(jīng)細胞是不能再生的。最近有人才艮道Muller細胞可應(yīng)答急性障礙而分裂，獲得類似前體 細胞的性質(zhì)，其中的一部分可以分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞。然而，活化的Muller 細胞的比例很低(非專利文獻1 )。Wnt是分泌型糖蛋白，它是體軸形成及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢等的器官形 成所必需的信號傳導(dǎo)因子。近年來，有報道稱其家族成員之一的Wnt3a與 造血干細胞的自我復(fù)制相關(guān)(非專利文獻2),還有報道指出在雞胚視網(wǎng)膜 中，Wnt2b與睫狀體邊緣區(qū)前體細胞的增殖及未分化狀態(tài)的維持有關(guān)(非 專利文獻3)。此外，有報道稱Wnt-6可用于治療神經(jīng)性障礙、癌癥、心血管疾病、 中風(fēng)及發(fā)育障礙(專利文獻1 )。更進一步，有報道稱Wnt-10a可用于治療 神經(jīng)性障礙等(專利文獻2)，還有人報道了增強造血干細胞/原基細胞的 增殖、分化或維持的方法(專利文獻3)。然而，Wnt參與神經(jīng)再生卻是全 然未知的。專利文獻1:特開2000-060575號7>告 專利文獻2:國際公開第99/38966號小冊子 專利文獻3:國際公開第98/06747號小冊子非專利文獻l: ProcNatlAcadSciUSA.2004 Sep 14; 101 (37): 13654-9 非專利文獻2: Nature 423,409-414(2003) 非專利文獻3: Development 130,587-598(2003)發(fā)明的公開本發(fā)明的課題是提供用于神經(jīng)細胞再生的藥物。
本發(fā)明人等為解決上述課題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt3a蛋白或 Wnt3a激活劑具有使Muller細胞增殖并誘導(dǎo)其向視網(wǎng)膜細胞分化的作用。 據(jù)此進而發(fā)現(xiàn)使用Wnt3a蛋白可以使視網(wǎng)膜細胞等神經(jīng)細胞再生，從而 完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下所述(1) 用于神經(jīng)細胞再生的藥物，其含有Wnt3a蛋白或Wnt3a激活劑。(2) (l)的藥物，其中所述神經(jīng)細胞為視網(wǎng)膜細胞。(3) (2)的藥物，其為老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性或錐體營 養(yǎng)不良的治療藥物。(4) ( 1 ) - (3)任意一項的藥物，其中Wnt3a蛋白具有序列號2的氨 基酸25-352的序列，或者在序列號2的氨基酸25-352的序列中發(fā)生了 l個 或數(shù)個氨基酸的取代、缺失、插入或增加的序列，且具有神經(jīng)細胞再生能 力。附圖的簡單說明(

圖1 )用BrdU抗體對加入對照或Wnt3a蛋白時的視網(wǎng)膜切片進行免疫染 色，圖1為顯示其結(jié)果的圖(照片)。INL表示內(nèi)核層，ONL表示視細胞層。(圖2)圖2為顯示加入對照或Wnt3a蛋白時視網(wǎng)膜中BrdU陽性細胞的比 例的直方圖。GCL (左)表示神經(jīng)節(jié)細胞層，INL (中)表示內(nèi)核層，ONL (右)表示視細胞層。(圖3 )使用谷氨酰胺合成酶(GS )抗體和BrdU抗體進行免疫染色，圖3 為顯示其結(jié)果的圖(照片)。箭頭所示為GS和BrdU均為陽性的位置。GCL 表示神經(jīng)節(jié)細胞層，INL表示內(nèi)核層，ONL表示視細胞層。(圖4)分別使用谷氨酰胺合成酶抗體和BrdU抗體，對加入糖原合成酶激 酶3(3抑制劑時的視網(wǎng)膜切片進行免疫染色，圖4為重疊顯示其結(jié)果的圖(照 片)。切片中央的明亮染色細胞為BrdU陽性細胞。本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的藥物含有Wnt3a蛋白作為有效成分。Wnt3a蛋白優(yōu)選人或小 鼠的Wnt3a蛋白，特別優(yōu)選人的Wnt3a蛋白。人的Wnt3a蛋白有例如具有
序列號2的氨基酸序列的蛋白；小鼠的Wnt3a蛋白有例如具有序列號4的 氨基酸序列的蛋白。本發(fā)明的藥物中所含的Wnt3a蛋白可以為全長蛋白(前 體蛋白)，優(yōu)選切除信號序列的成熟蛋白。人的Wnt3a成熟蛋白有例如具 有序列號2的氨基酸25-352的氨基酸序列的蛋白；小鼠的Wnt3a成熟蛋白 有例如具有序列號4的氨基酸25-352的氨基酸序列的蛋白。此外，可以很容易地想到，Wnt3a蛋白依據(jù)其來源的生物物種不同，會 發(fā)生氨基酸取代等序列變化。 一般認為，氨基酸被取代為具有類似性質(zhì)的 其它氨基酸(保守取代)、或者非活性必需位點的氨基酸缺失，不會影響 到神經(jīng)細胞再生能力。因此，只要保持神經(jīng)細胞再生能力，Wnt3a蛋白也可 以具有在下列氨基S吏序列中發(fā)生了 1個或數(shù)個氨基酸的取代、缺失、插入 或添加的序列序列號2或序列號4的氨基酸序列、序列號2的氨基酸25-352 的氨基酸序列、或序列號4的氨基酸25-352的氨基酸序列。而且，就"數(shù) 個"而言，優(yōu)選2-20個，更優(yōu)選2-10個，更優(yōu)選2-5個。此外，只要保持 神經(jīng)細胞再生能力，還可以使用與上述氨基酸序列具有高同源性的蛋白， 所述高同源性例如90%或卯°/。以上、更優(yōu)選95%或95%以上的同源性。Wnt3a蛋白可以由生物樣品純化、也可以化學(xué)合成，^旦優(yōu)選通過基因重 組制備。此外，也可以使用商品化的Wnt3a蛋白。通過重組獲取Wnt3a蛋白，例如可以按以下方案進行將具有序列號1 (人wnt3a基因)或序列號3 (小鼠wnt3a基因)的堿基序列的DNA導(dǎo)入 大腸桿菌、動物細胞或非人轉(zhuǎn)基因動物，表達重組蛋白，然后純化該蛋白。 而且，并非必須使用純化蛋白，在相互作用的才企測中可以使用粗才是純物或 細胞提取物。用于將上述DNA導(dǎo)入大腸桿菌的載體有例如pET載體 (Novagen Co" Ltd.)或pGEX載體(Amersham Pharmacia Co" Ltd.)等，用于將 上述DNA導(dǎo)入動物細月包的載體有例如pcDNA載體(Invitrogen Corporation) 等。Wnt3a蛋白可以用于制造神經(jīng)細胞再生用藥物。作為本發(fā)明的藥物，可 以直接使用按上述方法獲得的Wnt3a蛋白?？蛇x的，也可以將Wnt3a蛋白 與藥學(xué)可接受的載體配合而獲得本發(fā)明的藥物。這樣的載體有例如賦形劑、 穩(wěn)定劑、等滲化劑(等張化剤)、緩沖液等。本發(fā)明的藥物的劑型沒有特別限制，例如口服給藥劑型具體包括片劑、 丸劑、膠嚢劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑或混懸劑等。 非口服給藥劑型包括例如軟膏劑、乳膏、注射劑、罨劑、搽劑、栓劑、 滴眼劑、經(jīng)鼻吸收劑、經(jīng)肺吸收劑、經(jīng)皮吸收劑等。特別是，在眼科的局部給藥應(yīng)用中優(yōu)選注射劑(全身給藥、玻璃體內(nèi)給藥、視網(wǎng)膜下給藥、Tenon嚢給藥、結(jié)膜下給藥等)、經(jīng)角膜結(jié)膜劑、滴 眼劑、眼專欠膏等。液體制劑可采用公知的方法制備，例如通常將Wnt3a蛋白在溶解在注 射劑用無菌水溶液中，或者將其懸浮于提取液中，進而乳化，制成包埋于 脂質(zhì)體中的形式。制劑可通過配合等滲化劑(氯化鈉、氯化鉀、硼酸、甘 油等)或緩沖劑(硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液等)、增溶劑(表 面活性劑、環(huán)糊精類等)、穩(wěn)定劑(檸檬酸、乙二胺四乙酸、亞碌u酸鈉、 亞硫酸氫鈉等)和粘稠化劑(合成高分子、纖維素類、多元醇類等)來制 備。此外，為了穩(wěn)定Wnt3a蛋白，可以混合人血清白蛋白等其它蛋白。當(dāng)將本發(fā)明的藥物制成滴眼藥時，視需要可以使用等滲化劑(氯化鈉、 濃甘油等)、緩沖劑(磷酸鈉、醋酸鈉等)、表面活性劑(聚氧乙烯失水 山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油等)、 穩(wěn)定劑(檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸鈉等)、防腐劑(苯扎氯銨、對羥基笨 曱酸酯等)等，其pH值應(yīng)該在眼科制劑允許的范圍內(nèi)，優(yōu)選的范圍為4-8。Wnt3a蛋白具有使視網(wǎng)膜細胞等神經(jīng)細胞再生的效果，因而適于廣泛用 作引起神經(jīng)變性、神經(jīng)功能障礙的疾病的治療藥物。神經(jīng)細胞的再生可以 以促進前體細胞向神經(jīng)細胞分化的能力(例如加入前體細胞時各種神經(jīng)細 胞特異性標(biāo)記基因的表達量等)為指標(biāo)來確認。例如，視網(wǎng)膜細胞再生效 果(分化促進效果)可以通過考察Muller細胞分裂的增加或使用視紫紅質(zhì) 抗體等染色考察視網(wǎng)膜細胞的增加來確認。與未處理時相比，本發(fā)明的藥 物中所含的Wnt3a蛋白優(yōu)選使Muller細胞的分裂增加10%或以上，更優(yōu)選 增加50%或以上。當(dāng)以視網(wǎng)膜細胞的再生為目的應(yīng)用本發(fā)明的藥物時，針對導(dǎo)致視網(wǎng)膜 變性、視覺功能障礙的眼科疾病，其適于用作改善視覺功能的治療藥物。 導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性、視覺功能障礙的眼科疾病具體包括由炎癥或外傷引起的 疾病，除此之外還包括由青光眼(原發(fā)性青光眼、繼發(fā)性青光眼)、視網(wǎng) 膜血管阻塞癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、缺血性視神經(jīng)病變、黃斑變性、視網(wǎng) 膜色素變性、Leber's遺傳性視神經(jīng)病變、小口氏(Oguchi，s )病、視網(wǎng)膜血
管樣條紋癥、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、Eales病、缺血性眼綜合征、視網(wǎng)膜微動 脈瘤(網(wǎng)膜細動脈瘤)或者高血壓、腎病或血液病引起的視網(wǎng)膜病、視網(wǎng) 膜營養(yǎng)不良、黃斑營養(yǎng)不良、黃斑水肺、變性視網(wǎng)膜劈裂癥、錐體營養(yǎng)不 良等。本發(fā)明的藥物的給藥可以釆用全身給藥或局部給藥的方式進行，有效 給藥量及給藥次數(shù)因給藥劑型、給藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的 疾病、癥狀或嚴(yán)重程度而異，通常針對成年人每人給藥0.001-100mg、優(yōu)選 0.01-10mg， 一次或分婆t次給藥。增強Wnt3a活性的化合物或者活化Wnt3a轉(zhuǎn)錄的化合物(這些稱作 Wnt3a激活劑)可以用作神經(jīng)細胞再生藥物的有效成分。Wnt3a激活劑包括 一種糖原合成酶激酶3卩(GSK-3(3 )抑制劑，已知其與Wnt3a的信號通路相 關(guān)(EMBO J. 2005 Apr 20; 24(8): 1571-83.) 。 GSK-3卩抑制劑可以是公知的 GSK-3(3抑制劑，也可以是以GSK-3P活性為指標(biāo)篩選獲得的化合物。具有 神經(jīng)細胞再生能力的GSK鄰抑制劑有例如AR-A014418 (J. Biol" Chem., Vol.278，No. 46, p45937-45945, 2003)。同樣可以使用這些化合物的生理上可 接受的鹽、水合物或溶劑化物，還可以使用這些化合物的類似物。以GSK-3卩 抑制劑為有效成分的藥物可采用常規(guī)方法進行制劑，其適用癥包括如上所 述的疾病。實施例以下通過實施例，對本發(fā)明做更為具體的說明。但本發(fā)明不受這些實 施例的限制。/人6周齡的成年DA大鼠(獲自Shimizu Laboratory Supplies Co., Ltd. (Kyoto))取除去色素上皮的視網(wǎng)膜，在Millicell小室式濾器(chamber filter) 上進行視網(wǎng)膜器官培養(yǎng)。視網(wǎng)膜器官培養(yǎng)按照Methods 2002; 28: 387-395和 Brain Res 2002; 954: 286-293記載的方法進行。培養(yǎng)基使用50% Minimum Essential Medium + HEPES (Invitrogen Corporation) / 25% Hank's溶液 (Invitrogen Corporation) / 25%滅活馬血清/ 200 L-谷氨酰胺/ 5.75 mg/ml 葡萄糖。每日向培養(yǎng)基中添加Wnt3a (100 ng/ml; R&D Systems)和BrdU (5 ng/ml; SIGMA)，于4日后制作冷凍標(biāo)本，使用BrdU抗體進行免疫染色，考察BrdU
陽性分裂細胞的有無。結(jié)果如圖1所示。與未加入Wnt3a的對照相比，加入Wnt3a時，在視 網(wǎng)膜內(nèi)核層(INL)可以觀察到許多BrdU陽性分裂細胞(圖1 )。圖2顯 示了分裂細胞比例的計算結(jié)果。由此可知，加入Wnt3a導(dǎo)致INL中的分裂 細胞數(shù)急劇增加。利用免疫染色進行考察可知，這些分裂細胞中的大部分 被鑒定為谷氨酰胺合成酶陽性的Muller細胞(圖3)。由這些結(jié)果可知， Wnt3a可以促進Muller細胞的分裂。進一步，加入Wnt3a培養(yǎng)4日后，更換培養(yǎng)基，在無Wnt3a的狀態(tài)繼 續(xù)培養(yǎng)1周后， 一部分分裂細胞表達視紫紅質(zhì)(其是視細胞標(biāo)記物)，這這里顯示了促進向視網(wǎng)膜細胞分化的效果，但提示對于其它神經(jīng)細胞 同樣具有分化促進效果。由此可以設(shè)想，Wnt3a對于種類廣泛的神經(jīng)細胞均 具有再生效果。此外，向視網(wǎng)膜器官培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加糖原合成酶激酶3P(GSK-3P) 抑制劑AR畫A014418(J. Biol" Chem., Vol.278， No. 46, p45937-45945, 2003)， 考察了其效果。如圖4所示，將BrdU與5 (iMAR-A014418—起加入培養(yǎng)4 天后，BrdU陽性細胞數(shù)增加。而在未加入AR-A014418的對照中，BrdU陽 性細胞數(shù)很少。這個結(jié)果提示，與Wnt3a蛋白一樣，GSK-3(3抑制劑也可能 成為用于視網(wǎng)膜細胞等神經(jīng)細胞再生的藥物。工業(yè)實用性借助本發(fā)明的藥物，可以促進神經(jīng)細胞的再生，從而治療神經(jīng)變性疾 病、神經(jīng)功能障礙等。特別地，對于視網(wǎng)膜色素變性等視細胞不可逆變性 的疾病，可以通過活化內(nèi)源性干細胞使視網(wǎng)膜的視細胞再生來加以治療。
權(quán)利要求
1.用于神經(jīng)細胞再生的藥物，其含有Wnt3a蛋白或Wnt3a激活劑。
2. 權(quán)利要求l的藥物，其中所述神經(jīng)細胞是視網(wǎng)膜細胞。
3. 權(quán)利要求2的藥物，其為視網(wǎng)膜色素變性、老年性黃斑變性、或錐 體營養(yǎng)不良的治療藥物。
4. 權(quán)利要求1 -3任一項的藥物，其中Wnt3a蛋白具有序列號2的氨 基酸25-352的序列或者在序列號2的氨基酸25-352的序列中發(fā)生了 1個或 數(shù)個氨基酸的取代、缺失、插入或添加的序列，且具有神經(jīng)細胞再生能力。
全文摘要
將序列號2等表示的Wnt3a蛋白用作神經(jīng)細胞再生藥物的有效成分、特別是用作可用于治療、老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、錐體營養(yǎng)不良等的視網(wǎng)膜再生用藥物的有效成分。
文檔編號A61P27/00GK101128212SQ20068000638
公開日2008年2月20日 申請日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日
發(fā)明者萬代道子, 大音壯太郎, 小坂田文隆, 高橋政代 申請人:國立大學(xué)法人京都大學(xué)