專利名稱：使用β葡聚糖和抗體治療癌性的方法
本申請(qǐng)是2003年9月4日遞交的申請(qǐng)?zhí)枮?3824893.X，發(fā)明名稱為“使用β葡聚糖和抗體治療癌性的方法”的分案申請(qǐng)。
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求60/408,126號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，60/408,126號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)于2002年9月4日提交，該臨時(shí)申請(qǐng)的全文在此通過(guò)引證被并入本文。
政府支持本發(fā)明全部或部分地得到了美國(guó)國(guó)家健康協(xié)會(huì)/美國(guó)國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)的RO1CA86412號(hào)撥款和美國(guó)國(guó)防部及美國(guó)陸軍BC010287號(hào)撥款的支持。美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖是一種復(fù)合糖，β-葡聚糖通?？蓮膸追N物質(zhì)衍生出來(lái)，這些物質(zhì)包括酵母、細(xì)菌、真菌和谷物。每種β-葡聚糖都有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在β-葡聚糖中葡萄糖以不同的方式連接在一起，從而使不同的β-葡聚糖具有不同的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)。舉例而言，由細(xì)菌和藻類(lèi)物質(zhì)衍生出的β(1-3)葡聚糖是線性葡聚糖，因此這種葡聚糖可用作食品增稠劑。葡聚糖的側(cè)鏈頻率被稱為置換程度或分支頻率，側(cè)鏈頻率決定著葡聚糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)和溶解性。酵母衍生出的β-葡聚糖帶有β(1-3)和β(1-6)鍵的支鏈型葡聚糖，這種結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了這種葡聚糖與巨噬細(xì)胞相結(jié)合的能力以及這種葡聚糖刺激巨噬細(xì)胞的能力。從面包酵母(釀酒酵母)中提純出來(lái)的β(1-3；1-6)葡聚糖是一種有效的抗感染免疫調(diào)節(jié)劑。
釀酒酵母的細(xì)胞壁主要由β-葡聚糖構(gòu)成，這一點(diǎn)決定著釀酒酵母細(xì)胞壁的形狀和機(jī)械強(qiáng)度。雖然酵母最常見(jiàn)的用途是用作食品級(jí)微生物，但酵母也是酵母多糖的來(lái)源，酵母多糖是一種不溶性的原提取物，它被用來(lái)刺激非特異性免疫反應(yīng)。酵母衍生出的β(1，3；1，6)葡聚糖在一定程度上是通過(guò)激活先天抗真菌免疫機(jī)制來(lái)抵御各種目標(biāo)，從而刺激免疫系統(tǒng)。面包酵母衍生出的β(1-3；1-6)葡聚糖是一種完全由β(1-3)鍵連接的糖(葡萄糖)分子組成的多糖，β(1-3)鍵連結(jié)的糖分子形成了多糖的骨架結(jié)構(gòu)，骨架結(jié)構(gòu)每隔一段便帶有通過(guò)β(1-6)鍵連接起來(lái)的β(1-3)支鏈。這種多糖被更正式地稱為聚-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-3)-β-D-吡喃葡萄糖。當(dāng)來(lái)源和分離方法不同時(shí)，葡聚糖的結(jié)構(gòu)和功能是不同的。
β-葡聚糖具有多種活性。β-葡聚糖提高非特異性免疫力和增強(qiáng)抗感染的能力與內(nèi)毒素相似。早期針對(duì)β(1，3)葡聚糖對(duì)免疫系統(tǒng)的作用主要以老鼠為研究對(duì)象。后來(lái)的研究表明，β(1，3)葡聚糖對(duì)多種其他生物種類(lèi)同樣具有很強(qiáng)的免疫刺激活性，其中的生物種類(lèi)包括蚯蚓、蝦、魚(yú)、雞、老鼠、兔子、豚鼠、羊、豬、牛和人類(lèi)。根據(jù)這些研究，β(1，3)葡聚糖是一類(lèi)在整進(jìn)化譜內(nèi)都有效的免疫刺激劑，有可能表現(xiàn)出抗真菌病原體的先天進(jìn)化免疫反應(yīng)。然而，盡管研究人員做了深入的研究調(diào)查，但就適合作為免疫刺激劑的β(1-3)葡聚糖的來(lái)源、大小和形式仍未達(dá)成共識(shí)。
正如日本醫(yī)藥文獻(xiàn)中所述的，有關(guān)β-葡聚糖潛在的抗癌活性研究已經(jīng)進(jìn)行了約30年。舉例而言，自上世經(jīng)70年代未開(kāi)始，研究人員在動(dòng)物體內(nèi)和臨床上對(duì)蘑菇多糖進(jìn)行了廣泛的研究，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的用藥時(shí)間為10天，用藥量為1毫克/公斤；臨床試驗(yàn)是針對(duì)早期及復(fù)發(fā)性惡性淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、乳癌、肺癌和胃癌進(jìn)行的。最近的報(bào)道對(duì)這項(xiàng)工作進(jìn)行了回顧，其主要內(nèi)容是有關(guān)從蘑菇中分離出來(lái)的β-葡聚糖(見(jiàn)Borchers AT.等人在《蘑菇與免疫》上發(fā)表的文章，221(4)，281(1999))。這項(xiàng)研究工作表明，從蘑菇中分離出的多糖的抗癌活性在很大程度上是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的，而T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞由β-葡聚糖所激活。從原酵母和谷物制品中分離出的β-葡聚糖也表現(xiàn)出了抗癌活性。這些研究工作所使用的是原β(1，3)葡聚糖制品，其中原β(1，3)葡聚糖制品是β(1，3)葡聚糖與其他諸如β-葡聚糖、甘露聚糖、殼多糖/脫乙酰殼多糖、β(1，4)葡聚糖、核酸、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)這些多糖物質(zhì)的混合物。β(1，3)葡聚糖在這些制品中所占的重量比通常小于50％。不同種類(lèi)的葡聚糖在誘導(dǎo)各種細(xì)胞反應(yīng)的能力以及在抗具體癌癥的活性上是不同的，尤其在細(xì)胞因子表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生方面存在著差異。人們認(rèn)為，β-葡聚糖的抗癌機(jī)理涉及到巨噬細(xì)胞的刺激以及此后炎癥介質(zhì)的釋放，比如白細(xì)胞間素-1、腫瘤環(huán)死因子以及前列腺素E2的釋放(見(jiàn)Sveinbjrnsson等人在《生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊》上發(fā)表的文章，223(3)，643(1996))。
免疫系統(tǒng)由兩個(gè)完整系統(tǒng)組成，這兩個(gè)完整系統(tǒng)是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和先天性免疫系統(tǒng)。β-葡聚糖被認(rèn)為主要是通過(guò)相對(duì)非特異性的先天免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用。先天免疫系統(tǒng)包括補(bǔ)體蛋白、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞，先天免疫系統(tǒng)可以在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用之前迅速地對(duì)感染做出反應(yīng)。人們已證明β-葡聚糖微粒和諸如蘑菇多糖以及裂殖菌多糖這樣的高分子量可溶性β-葡聚糖對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的交聯(lián)膜CR3是足夠大的，這些β-葡聚糖可觸發(fā)突發(fā)性呼吸、脫粒以及在缺乏靶細(xì)胞的情況下釋放細(xì)胞因子(見(jiàn)G.D.Ross等人在《免疫藥理學(xué)》上發(fā)表的文章，42，61(1999))。另一方面，中性可溶性β-葡聚糖并不刺激細(xì)胞因子的釋放，最可能的原因是這種β-葡聚糖對(duì)交聯(lián)膜CR3而言太小了。
與癌癥生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)微變化會(huì)導(dǎo)致表面蛋白的表達(dá)不同，這可以刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)做出微弱的反應(yīng)。表面抗原表達(dá)所出現(xiàn)的這些變化還提供了治療的靶目標(biāo)，其中的治療使用選擇性單克隆抗體或抗癌疫苗。已開(kāi)發(fā)出的單克隆抗體以在結(jié)腸癌、淋巴溜、乳腺癌以及急性白血病中表達(dá)的各種蛋白為靶目標(biāo)。腫瘤對(duì)單克隆抗體的臨床反應(yīng)的免疫基礎(chǔ)包括直接細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)免疫，其中抗體依賴型細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性和補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒性可直接殺滅腫瘤細(xì)胞。然而，人們已經(jīng)注意到，天然抗體或單克隆抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體活性的增強(qiáng)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響，其原因在于腫瘤對(duì)于補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有固有的耐受性。這種固有的耐受性會(huì)導(dǎo)致單克隆抗體或疫苗對(duì)癌癥抗原失去治療效用。單克隆抗體療法受效應(yīng)機(jī)理(即生長(zhǎng)因子受體的對(duì)抗作用、抗體依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)的限制。
使用諸如赫塞汀TM(曲妥單抗)和B細(xì)胞單克隆抗體TM(美羅華)這些人源化單克隆抗體的腫瘤免疫療法目前對(duì)于分別患有Her-2/neu+轉(zhuǎn)移性乳癌和B細(xì)胞淋瘤的患者而言是可接受的臨床療法(見(jiàn)Wang S.C.等人在《生殖系統(tǒng)腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，2821-29，2001；見(jiàn)Leyland-Jones B在《柳葉刀腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，3137-144，2002；見(jiàn)Leyland-Jones B.在《柳葉刀腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，3137-144，2002；見(jiàn)Johnson P.和M.X.Sliwkowski在《腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，63增刊117-24(2002)；見(jiàn)Johnson P.和M.Glennie在《生殖系統(tǒng)腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，303-8(2003)；見(jiàn)Plosker G.L.和D.P.Figgitt在《藥物》上發(fā)表的文章，63803-843(2003)；見(jiàn)Ross J.S.等人在《Am.臨床病理學(xué)雜志》上發(fā)表文章，119472-485(2003))?；诔晒Φ挠涗洠渌麕追N人源化單克隆抗體正在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，其中某些單克隆抗體，比如ErbituxTM(西妥昔單抗)即將獲得聯(lián)邦藥物管理局的最終批準(zhǔn)。然而，抗體療法不總是有效的，即使對(duì)于腫瘤表達(dá)為高表面密度的目標(biāo)腫瘤抗原的患者而言也是如此。被認(rèn)為引起腫瘤退化的效應(yīng)機(jī)理是可變的，效應(yīng)機(jī)理尤其包括生長(zhǎng)抑制因子活性以及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。一般不認(rèn)為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性屬于效應(yīng)機(jī)理范疇，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性在腫瘤退化中是否起到重要作用仍是一個(gè)具有爭(zhēng)議的問(wèn)題。體外研究表明，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性受補(bǔ)系統(tǒng)膜調(diào)節(jié)因子的限制，比如受CD55和CD59的限制，這些膜調(diào)節(jié)因子偶爾會(huì)在腫瘤上出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)。此外，用來(lái)對(duì)抗微生物病原體的主要補(bǔ)體介導(dǎo)效應(yīng)機(jī)理、C3受體依賴性吞噬作用以及細(xì)胞毒性脫粒完全沒(méi)有抗癌效果?；谌祟?lèi)免疫球蛋白G1的抗腫瘤單克隆抗體可以激活諸如曲妥單抗、美羅華或西妥昔單抗這樣的補(bǔ)體，使用基于人類(lèi)免疫球蛋白G1的抗腫瘤單克隆抗體，一層IC3b會(huì)沉積在可被白細(xì)胞ic3b受體CR3(Mac-1、CD11b/CD18、αMβ2-整聯(lián)蛋白)識(shí)別的腫瘤細(xì)胞上。然而，觸發(fā)CR3依賴性白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性需用CR3即與ic3b相結(jié)合又要與凝集素位點(diǎn)相結(jié)合。由于腫瘤細(xì)胞并不表達(dá)CR3激活的多糖，所以這些腫瘤細(xì)胞可避開(kāi)這種有效抵抗微生物病原體的保護(hù)機(jī)理。
人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到，免疫系統(tǒng)有效地破壞腫瘤需要多種效應(yīng)機(jī)理的協(xié)同作用。因此，一種疫苗、細(xì)胞因子或生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物不可能在眾多患者中取得成功。舉例而言，疫苗可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和/或體液抗體反應(yīng)，但每種反應(yīng)都存在缺陷?？贵w通常是無(wú)效的，因?yàn)橹T如DAF、MCP以及CD59這樣的正常宿主細(xì)胞蛋白會(huì)抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。此外，iC3b對(duì)腫瘤的調(diào)理作用并非只吸收巨噬細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞。因?yàn)槟[瘤中免疫球蛋白G濃度太低以及抗體FC片段介導(dǎo)的細(xì)胞毒性受到天然殺傷細(xì)胞對(duì)I型MHC腫瘤細(xì)胞識(shí)別作用的抑制，所以抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力被認(rèn)為是無(wú)效的。做為轉(zhuǎn)移過(guò)程的一部分，由于腫瘤通常會(huì)失去抗原表達(dá)所需的主要組織相容性復(fù)雜分子，所以使用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)免疫性也存在缺陷。因此，需要一種抗癌療法，這種抗癌療法可以克服上述提到的各種缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明與使用中性可溶性β(1，3)葡聚糖和疫苗或單克隆抗體治療腫瘤的方法相關(guān)。本文還描述了將β-葡聚糖作為腫瘤單克隆抗體療法的輔藥從而產(chǎn)生白細(xì)胞CR3依賴性殺滅腫瘤機(jī)理的方法；這種機(jī)理與所有其他效應(yīng)機(jī)理相累加。本文特別對(duì)含有可溶性β-葡聚糖和激活補(bǔ)體的腫瘤特異性抗體的組合物抗腫瘤活性進(jìn)行了說(shuō)明。在某些實(shí)施方案中，這些抗體是I亞型免疫球蛋白G或III亞型免疫球蛋白G。本文所述的可溶性葡聚糖在不激活炎性細(xì)胞因子從而造成有害影響的情況下可激活免疫系統(tǒng)。此外，本文還涉及某些方法，這些方法與單股結(jié)構(gòu)的中性可溶性葡聚糖相關(guān)，這一葡聚糖在不誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的情況下可激活先天免疫系統(tǒng)。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)囊呙邕€可在患者體內(nèi)誘導(dǎo)這些抗體或通過(guò)使用單克隆抗體或多克隆抗體而直接向患者提供這些抗體，比如通過(guò)靜脈注射單克隆抗體而直接向患者提供這些抗體。
本文還對(duì)不可溶性β(1，3)葡聚糖(全葡聚糖顆粒)的應(yīng)用進(jìn)行了說(shuō)明，其中不可溶性β(1，3)葡聚糖被用作免疫調(diào)節(jié)劑，它誘導(dǎo)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變，并增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。
抗體介導(dǎo)的殺滅腫瘤細(xì)胞機(jī)理的核心部分涉及到C3補(bǔ)體蛋白對(duì)抗體-腫瘤抗原絡(luò)合物的識(shí)別以及C3-抗體腫瘤抗原絡(luò)合物的形成。該絡(luò)合物隨后被先天免疫細(xì)胞通過(guò)CR3所識(shí)別。先天免疫細(xì)胞帶有CR3受體，并通過(guò)CR3和CR3-抗體腫瘤細(xì)胞抗原絡(luò)合物之間的特異性反應(yīng)將腫瘤細(xì)胞認(rèn)作異質(zhì)物。當(dāng)CR3與該絡(luò)合物相結(jié)合時(shí)，先天免疫細(xì)胞受到刺激，從而發(fā)揮其殺滅腫瘤的活性。在本發(fā)明中，這些先天免疫細(xì)胞還受到含有中性可溶性葡聚糖的組合物的刺激。當(dāng)中性可溶性葡聚糖在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的表面與CR3相結(jié)合后，這些細(xì)胞便處于激活狀態(tài)。中性可溶性葡聚糖-CR3相互作用對(duì)這些細(xì)胞的激活作用增強(qiáng)了這些細(xì)胞以C3-抗體-腫瘤細(xì)胞抗原絡(luò)合物為靶目標(biāo)的殺滅腫瘤活性，從而加強(qiáng)了殺滅腫瘤的能力。在某些實(shí)施方案中，這種作用具有協(xié)同效果。
本發(fā)明的一個(gè)新穎的方面是中性可溶性葡聚糖與激活補(bǔ)體的抗體抗腫瘤活性，其中的中性可溶性葡聚糖來(lái)自于任何β(1，3)葡聚糖來(lái)源。以中性可溶性葡聚糖形式存在的β葡聚糖具有的優(yōu)勢(shì)是可以容易地從任何β葡聚糖源制得高純度的β葡聚糖。將中性可溶性葡聚糖用作抗腫瘤藥劑有多個(gè)重要的方面。第一，使用高純中性可溶性葡聚糖可使葡聚糖的活性更高、副作用更少。第二，葡聚糖可以與凝集素的CR3結(jié)合區(qū)相結(jié)合，從而激活先天免疫細(xì)胞的殺滅腫瘤活性。通過(guò)使用補(bǔ)體沉積所產(chǎn)生的定向激活作用，β葡聚糖同時(shí)通過(guò)直接細(xì)胞毒性作用以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的局部補(bǔ)充免疫細(xì)胞而提高免疫系統(tǒng)清除腫瘤的能力。最后，單股結(jié)構(gòu)的中性可溶性葡聚糖可在不誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的情況下激活先天免疫系統(tǒng)。
本文對(duì)抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞的方法進(jìn)行了說(shuō)明，這些方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體使用有效治療劑量的中性可溶性葡聚糖以及至少一種激活補(bǔ)體的抗腫瘤抗體，其中葡聚糖不會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，葡聚糖和抗體可抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。
抗體可通過(guò)直接使用單克隆抗體或多克隆抗體而進(jìn)行給藥，或者由個(gè)體身體在癌癥疫苗的作用下而產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，抗體選自于曲妥單抗、美羅華、西妥昔單抗以及這些抗體的組合物。在其他實(shí)施方案中，可溶性β-葡聚糖是通過(guò)注射方式進(jìn)行給藥的，在某些實(shí)施方案中，中性可溶性葡聚糖具有單螺旋構(gòu)造、三鏈螺旋構(gòu)造或同時(shí)具有這二種構(gòu)造。
本文還對(duì)治療贅生細(xì)胞的方法進(jìn)行了說(shuō)明，該方法包括對(duì)贅生細(xì)胞使用有效治療劑量的中性可溶性葡聚糖以及以對(duì)贅生細(xì)胞具有特異性的激活補(bǔ)體抗體；其中葡聚糖并不誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子。在某些實(shí)施方案中，葡聚糖和抗體會(huì)減緩贅生細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和/或抑制贅生細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或延長(zhǎng)贅生細(xì)胞宿主的存活時(shí)間。
本文還對(duì)免疫調(diào)節(jié)的方法進(jìn)行了說(shuō)明，在這些免疫調(diào)節(jié)方法中，通過(guò)使用有效劑量的全葡聚糖顆粒而誘導(dǎo)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。在用于治療癌癥的免疫調(diào)節(jié)中，通過(guò)使用有效劑量的全葡聚糖顆粒而誘導(dǎo)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。在某些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)抗腫瘤療法的療效。
本文還對(duì)使用含有中性可溶性葡聚糖和激活補(bǔ)體的抗體的組合物制造藥物進(jìn)行了說(shuō)明，這種藥物用來(lái)治療贅生細(xì)胞，其中這一組合物將減緩贅生細(xì)胞的生長(zhǎng)，葡聚糖不會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子。
在其他實(shí)施方案中，抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞的方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體使用有效劑量的一種組合物，該組合物含有中性可溶性大麥葡聚糖和至少一種激活補(bǔ)體的抗腫瘤抗體，其中的組合物可抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。
圖示簡(jiǎn)介通過(guò)對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行更詳細(xì)說(shuō)明，人們將清楚地了解前面所述的本發(fā)明的目標(biāo)、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)以及本發(fā)明其他的目標(biāo)、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。本文所附的圖形對(duì)這些優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了圖解說(shuō)明。


圖1表明的是C3調(diào)理的酵母在激活CR3時(shí)同時(shí)需要iC3b和β-葡聚糖與凝集素位點(diǎn)相結(jié)合。
圖2表明的是缺乏細(xì)菌的β-葡聚糖并不通過(guò)CR3觸發(fā)吞噬作用或脫粒作用。
圖3表明的是可溶性β-葡聚糖與CR3相結(jié)合并啟動(dòng)受體，從而觸發(fā)細(xì)菌的脫粒和解體或iC3b的腫瘤靶細(xì)胞的脫粒和解體。
圖4表明的是啟動(dòng)鼠源性中性粒細(xì)胞CR3的β-葡聚糖可使iC3b調(diào)理的乳腺腫瘤細(xì)胞在此后觸發(fā)細(xì)胞毒性。
圖5A-5D表明的是乳房腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞針對(duì)免疫球蛋白M、免疫球蛋白G或C3所做的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。圖5A是抗老鼠-免疫球蛋白G-PE/M1G-異硫氰酸熒光素的圖形。圖5B是抗MUC1-PE/抗免疫球蛋白M-異硫氰酸熒光素的圖形。圖5C是抗MUC1-PE/抗免疫球蛋白M-異硫氰酸熒光素的圖形。圖5D是抗MUC1/抗C3-異硫氰酸熒光素的圖形。
圖6表明的是新切除的原發(fā)乳腺腫瘤細(xì)胞的懸浮液中含有足夠的C3，同種基因的天然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別需要足夠的C3，其中的天然殺傷細(xì)胞帶有β-葡聚糖啟動(dòng)的CR3。
圖7表明的是β-葡聚糖對(duì)Balb/c小鼠Ptas64乳腺癌的治療結(jié)果。
圖8表明的是β-葡聚糖在治療缺乏血清C3或白細(xì)胞CR3的小鼠時(shí)失效的情況。
圖9表明的是使用β-葡聚糖可增強(qiáng)抗腫瘤單克隆抗體療法對(duì)EL-4肝淋巴瘤的療效。
圖10表明的是在治療裸小鼠體內(nèi)人類(lèi)LAN-1成神經(jīng)細(xì)胞瘤時(shí)，抗體和口服大麥β-葡聚糖所取得的協(xié)同療效。
圖11A和圖11B是靜脈注射酵母β-葡聚糖(圖11A)和口服大麥β-葡聚糖(圖11B)情況下對(duì)RMA-S淋巴瘤實(shí)施單克隆抗體療法的療效比較。
圖12表明的是在靜脈注射單克隆抗體加口服酵母β-葡聚糖顆粒的情況下Balb/c小鼠乳腺癌的治療結(jié)果。
圖13表明的是β-葡聚糖刺激天然殺傷細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α和CR3依賴性刺激天然殺傷細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α。
圖14A-圖14E表明的是對(duì)乳腺癌小鼠采用口服酵母β-葡聚糖顆粒療法可將腫瘤誘導(dǎo)的Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)化為T(mén)h1反應(yīng)。圖14A表明的是來(lái)自沒(méi)有腫瘤的小鼠的血液情況。圖14B表明的是T細(xì)胞正在生成白細(xì)胞間素-4。圖14C表明的是兩只小鼠在植入腫瘤細(xì)胞后12天的血液情況。圖14D表明的是T細(xì)胞已經(jīng)停止生成白細(xì)胞間素-4。圖14E表明的是兩只小鼠在植入腫瘤細(xì)胞并采用酵母β-葡聚糖治療2天后的血液情況。
圖15表明的是在共同使用3F8免疫球蛋白G3抗GD2神經(jīng)節(jié)苷酯單克隆抗體和β-葡聚糖時(shí)可加強(qiáng)EL-4肝淋巴瘤的退化。在如在本文“材料和方法”一節(jié)中所述的，在小鼠體內(nèi)通過(guò)注射方式植入EL-4細(xì)胞，從而使小鼠生成肝臟腫瘤，10天后用單克隆抗體和/或β-葡聚糖進(jìn)行治療。在治療兩星期后取出小鼠的肝臟并進(jìn)行稱量，然后與沒(méi)有腫瘤的小鼠肝臟進(jìn)行比較。圖15中列出了平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖16表明的是，在采用14.G2a抗GD2神經(jīng)節(jié)苷酯的免疫球蛋白G2a及β-葡聚糖共同治療后，RMA-S肝淋巴瘤小鼠的存活期得到了延長(zhǎng)。正如本文“材料和方法”一節(jié)所述的，通過(guò)注射方式向小鼠體內(nèi)注入RMA-S腫瘤細(xì)胞，從而使小鼠生成肝臟腫瘤，注射5天后對(duì)小鼠采用單克隆抗體和/或β-葡聚糖治療。治療延續(xù)3個(gè)星期，然后記錄小鼠的存活期。
圖17A-圖17C表明的是，在同時(shí)使用酵母β-葡聚糖時(shí)，乳腺腫瘤和皮下腫瘤的消退速度比單獨(dú)使用單克隆抗腫瘤抗體時(shí)有顯著的增長(zhǎng)。圖17A-圖17C表明了三種不同療法的情況。圖17A表明的是11C1抗小鼠乳房腫瘤病毒單克隆抗體與葡聚糖聯(lián)合使用對(duì)Ptas64腫瘤的治療。圖17B表明的是靜脈注射14.G2a抗GD2單克隆抗體與葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)對(duì)RMA-S-MUC1的治療。圖17C表明的是靜脈注射BCP8抗MUC1單克隆抗體與葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)對(duì)RMA-S-MUC1的治療。在植入腫瘤細(xì)胞后5-9天不要用藥，從而生成小的腫瘤體，然后進(jìn)行為期14天的免疫治療。3個(gè)星期后測(cè)定腫瘤的大小并監(jiān)測(cè)存活時(shí)間(存活期數(shù)據(jù)列于圖18A-18C中)。圖17A表明的是抗小鼠乳房腫瘤病毒的11C1免疫球蛋白G2a單獨(dú)使用以及與中性可溶性β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)對(duì)Blab/c小鼠Ptas64乳腺癌的治療情況。無(wú)論是單獨(dú)使用11C1單克隆抗體還是單獨(dú)使用中性可溶性β-葡聚糖(每天300微克)，腫瘤均出現(xiàn)了一定程度的消退，但在中性可溶性β-葡聚糖與11C1單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤的消退程度明顯好于單獨(dú)使用11C1單克隆抗體治療時(shí)的程度(p＜0.05)。在圖17B和圖17C中，C57BL/6小鼠通過(guò)皮下植入方式被植入RMA-S-MUC1腫瘤細(xì)胞，并在植入5天后使用14.G2a抗GD2神經(jīng)苷酯和/或中性可溶性β-葡聚糖(每天300微克)或抗MUC1的BCP8免疫球蛋白G2b和/或中性可溶性β-葡聚糖(每天300微克)進(jìn)行治療。無(wú)論使用其中那種單克隆抗體，在與中性可溶性β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤的消退程度都明顯好于單獨(dú)使用單克隆抗體進(jìn)行治療時(shí)腫瘤的消退程度。圖中列出了平均值和平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖18A-圖18C表明的是，在抗腫瘤單克隆抗體與可溶性β-葡聚糖聯(lián)合使用的情況下，延長(zhǎng)了接受治療小鼠的存活期。圖18A表明的是抗小鼠乳房腫瘤病毒的11C1單克隆抗體與葡聚糖聯(lián)合使用治療Ptas64腫瘤的結(jié)果。圖18B表明的是靜脈注射14.G2a抗GD2單克隆抗體聯(lián)合使用葡聚糖對(duì)RMA-S-MUC1進(jìn)行治療的結(jié)果。圖18C表明的是靜脈注射BCP8抗MUC1單克隆抗體聯(lián)合使用葡聚糖對(duì)RMA-S-MUC1進(jìn)行治療的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)構(gòu)成了圖17A-圖17C中所表明的腫瘤治療方法的存活曲線。
圖19A-圖19B表明的是中性可溶性β-葡聚糖所介導(dǎo)的增強(qiáng)瘤退化作用需要白細(xì)胞CR3，在缺乏CR3(CD11b-/-)小鼠中不能達(dá)到增強(qiáng)腫瘤消退的效果。圖19A表明的是腫瘤直徑與野生型小鼠療效之間的關(guān)系。圖19B表明的是腫瘤直徑與缺乏CR3小鼠治療之間的關(guān)系。野生型小鼠和對(duì)比小鼠通過(guò)皮下植入方式被植入RMA-S-MUC1腫瘤細(xì)胞(2×106個(gè))，對(duì)比組小鼠是缺乏CR3的C57BL/6小鼠；腫瘤細(xì)胞植入后在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)10天以上，從而使腫瘤直徑達(dá)到5-6毫米，然后進(jìn)行為期21天的免疫治療。在規(guī)定的時(shí)間對(duì)腫瘤進(jìn)行測(cè)量(圖19A-圖19B)，并對(duì)小鼠的存活期進(jìn)行監(jiān)測(cè)(圖20A-圖20B)。小鼠接受抗GD2神經(jīng)節(jié)苷酯的14.G2a單克隆抗體(每隔2天使用100微克)和/或中性可溶性β-葡聚糖(每天400微克)。單獨(dú)使用單克隆抗體治療時(shí)，缺乏CR3小鼠和野生型小鼠的腫瘤消退速度沒(méi)有差別，在缺乏CR3小鼠中沒(méi)有出現(xiàn)β-葡聚糖導(dǎo)致的單克隆體介導(dǎo)的腫瘤加速消退作用。雖然β-葡聚糖導(dǎo)致的單克隆抗體介導(dǎo)的腫瘤加速消退現(xiàn)象并不明顯，但β-葡聚糖的確顯著延長(zhǎng)了單克隆抗體個(gè)導(dǎo)的存活期(圖20A)。圖中給出了平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖20A-圖20B表明的是，中性可溶性β-葡聚糖與抗腫瘤單克隆抗體聯(lián)合治療可以延長(zhǎng)野生型小鼠的存活期(圖20A)，但不能延長(zhǎng)缺乏DR3小鼠的存活期(圖20B)。這些數(shù)據(jù)構(gòu)成了圖19A-圖19B所述治療方法所對(duì)應(yīng)的存活期曲線。
圖21A-圖21B表明的是，當(dāng)與抗腫瘤單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)，中性可溶性β-葡聚糖介導(dǎo)的腫瘤加速消退過(guò)程需要原生質(zhì)C3，在缺乏C3的小鼠體內(nèi)中性可溶性β-葡聚糖達(dá)不到加速腫瘤消退的功效。圖21A表明的是腫瘤直徑與野生型小鼠治療之間的關(guān)系。圖21B表明的是腫瘤直徑與缺乏C3小鼠治療之間的關(guān)系。缺乏C3(C3-/-)小鼠及野生型小鼠通過(guò)皮下移植方式被植入1×106個(gè)轉(zhuǎn)染了人類(lèi)MUC1(LL/2-MUC1)的路易氏肺癌細(xì)胞。在腫瘤生長(zhǎng)7天后，用抗MUC1的BCP8免疫球蛋白G2b單克隆抗體(每隔2天使用200微克)和/或中性可溶性β-葡聚糖(每天400微克)對(duì)小鼠進(jìn)行為期3周的治療。單獨(dú)使用BCP8單克隆抗體進(jìn)行治療并不能在野生型小鼠或缺乏C3的小鼠體內(nèi)造成腫瘤的明顯消退，但BCP8單克隆抗體與中性可溶性β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)，野生型小鼠體內(nèi)的腫瘤出現(xiàn)了明顯消退，但在缺乏C3的小鼠體內(nèi)沒(méi)有達(dá)到使腫瘤明顯消退的效果。圖中列出了平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖22A-圖22B表明的是可溶性β-葡聚糖與抗腫瘤單克隆抗體聯(lián)合使用所導(dǎo)致的存活期延長(zhǎng)需要C3，可溶性β-葡聚糖和抗腫瘤單克隆抗體的聯(lián)合使用并不能使缺乏C3小鼠的存活期得到延長(zhǎng)。圖22A表明的是腫瘤直徑與野生型小鼠治療之間的關(guān)系。圖22B表明的是腫瘤直徑與缺乏C3小鼠治療之間的關(guān)系。這些數(shù)據(jù)構(gòu)成了圖21A-圖21B所述腫瘤治療方案所對(duì)應(yīng)的存活期曲線。
圖23表明的是乳腺腫瘤生長(zhǎng)會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞明顯的增多。從Balb/c對(duì)比鼠或在其乳房脂肪墊內(nèi)植入1×104Ptas64腫瘤細(xì)胞的小鼠體內(nèi)收集外周血。使用“材料和方法”一節(jié)中所述的流式細(xì)胞測(cè)定儀測(cè)定白細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。在植入腫瘤細(xì)胞后8天檢測(cè)到了明顯的腫塊。在8天后，在患有腫瘤的小鼠體內(nèi)觀察到了白細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而對(duì)比小鼠體內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)量正常。圖中列出了平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖24A-圖24E表明的是，通過(guò)靜脈注射抗Gr-1的RB6-8C5單克隆抗體對(duì)小鼠進(jìn)行的治療會(huì)有選擇性地消耗粒性白細(xì)胞，但不會(huì)減少單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞。正如“材料和方法”一節(jié)所述的，首先通過(guò)腹腔注射方式向小鼠注射抗Gr-1單克隆抗體，然后在3天后進(jìn)行靜脈注射，其中靜脈注射每隔3天重復(fù)一次。使用流式細(xì)胞測(cè)定儀測(cè)定正常小鼠(左側(cè)矩形圖)血液(圖24A)、脾臟(圖24B)和骨髓(圖24B)中的粒性白細(xì)胞數(shù)量以及使用抗Gr-1治療的小鼠(右側(cè)矩形圖)體內(nèi)相應(yīng)的粒性白細(xì)胞數(shù)量。頂部的兩幅矩形圖表明，使用抗Gr-1單克隆抗體進(jìn)行治療可以有效地去除血液和脾臟中的Gr-1+粒性白細(xì)胞，但對(duì)骨髓中的Gr-1+粒性白細(xì)胞沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的影響。當(dāng)未經(jīng)治療的對(duì)比小鼠(左側(cè)矩形圖)與經(jīng)過(guò)抗Gr-1單克隆抗體治療的小鼠(右側(cè)矩形圖)相比時(shí)，在區(qū)域2(R2標(biāo)識(shí)的區(qū)域)中的單核細(xì)胞(圖24D)沒(méi)有出現(xiàn)減小。當(dāng)對(duì)比小鼠(左側(cè)矩形圖)與經(jīng)過(guò)抗GR-1治療的小鼠(右側(cè)矩形圖)進(jìn)行對(duì)比時(shí)，脾巨噬細(xì)胞的數(shù)量也沒(méi)有減少。研究人員對(duì)骨髓巨噬細(xì)胞以及脾樹(shù)突細(xì)胞和骨髓樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行了類(lèi)似的研究；同樣，沒(méi)有證據(jù)表明經(jīng)抗Gr-1治療的小鼠出現(xiàn)了上述細(xì)胞的減少(未在圖中表明)。為了對(duì)每種細(xì)胞種群進(jìn)行分析，首先用抗CD45-PerCP-Cg5.5進(jìn)行染色，并建立分析所用的細(xì)胞門(mén)類(lèi)，該細(xì)胞門(mén)類(lèi)包括所有CD45+白細(xì)胞。
圖25表明的是，中性可溶性β-葡聚糖免疫療法殺滅腫瘤的活性需要粒性白細(xì)胞的配合，這種殺滅腫瘤的活性在經(jīng)抗Gr-1單克隆抗體治療而缺乏粒性白細(xì)胞的小鼠體內(nèi)無(wú)法發(fā)揮作用。在Balb/c小鼠的脂肪墊處植入Ptas64乳房癌細(xì)胞，使癌細(xì)胞生長(zhǎng)7天，然后用免疫療法進(jìn)行治療。使用11C1免疫球蛋白G2a抗小鼠乳房腫瘤病毒單克隆抗體和/或中性可溶性β-葡聚糖(每天400微克)對(duì)小鼠進(jìn)行為期3星期的治療。正如本文“材料和方法”一節(jié)中所述的，從某些組小鼠的粒性白細(xì)胞被消耗掉了。正如在這種腫瘤模型之前所述的(圖17A項(xiàng)部圖形)，在聯(lián)合使用中性可溶性β-葡聚糖的情況下，腫瘤消退的程度明顯好于單獨(dú)使用11C1單克隆抗體時(shí)腫瘤的消退程度(P＜0.05，低下的支架符號(hào)和星號(hào))。圖中給出了平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖26A-圖26D表明的是口服大麥β-葡聚糖可導(dǎo)致腫瘤消退(圖26C)以及與腫瘤消退(圖26A)相似的存活情況(圖26D)，還表明了靜脈注射酵母β-葡聚糖情況下的存活情況(圖26B)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明以下是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明。
本發(fā)明申請(qǐng)揭示了抗腫瘤療法，在這些方法中，中性可溶性β-葡聚糖與激活補(bǔ)體的抗體聯(lián)合使用，從而達(dá)到抗腫瘤的效果，其中激活補(bǔ)體的抗體直接指向腫瘤抗原。正如本文所用的，中性可溶性葡聚糖是一種中性可溶性葡聚糖的組合物，該組合物主要由來(lái)自任何葡聚糖源的1，3葡萄糖組成。在某些實(shí)施方案中，可溶性酵母β-葡聚糖由來(lái)自酵母的β(1，3)葡聚糖和β(1，6)葡聚糖組成。在其他實(shí)施方案中，中性可溶性葡聚糖由谷物生成，并含有1，3、1，4鍵。
在某一實(shí)施方案中，該方法利用先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的活性，并提供協(xié)同效應(yīng)。這種協(xié)同效應(yīng)在一定程度上源自于抗體選擇腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞的能力，而中性可溶性葡聚糖通過(guò)利用C3沉積作用來(lái)增強(qiáng)通常較弱的體液反應(yīng)，其中C3的沉積是由抗體誘導(dǎo)的，帶有經(jīng)β-葡聚糖啟動(dòng)過(guò)的CR3的先天免疫細(xì)胞可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞。通過(guò)使用β-葡聚糖可以獲得更多的協(xié)同效應(yīng)，β-葡聚糖可特別刺激先天免疫系統(tǒng)或適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，從而充分地利用這兩個(gè)系統(tǒng)。
本發(fā)明所說(shuō)明的包括以腫瘤抗原為目標(biāo)的單克隆抗體療法和抗腫瘤疫苗可以刺激抗癌免疫活性，而高純可溶性葡聚糖可以增強(qiáng)這種抗癌免疫活性。細(xì)胞表面單克隆抗體和腫瘤疫苗刺激復(fù)合的抗腫瘤免疫反應(yīng)，這種復(fù)合免疫反應(yīng)包括非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。非特異性免疫反應(yīng)涉及先天免疫細(xì)胞因子(即補(bǔ)體系統(tǒng))和多種細(xì)胞(樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞)。以腫瘤抗原為目標(biāo)的單克隆抗體和腫瘤疫苗所激發(fā)的抗體與腫瘤細(xì)胞的表面相結(jié)合，從而產(chǎn)生直接的補(bǔ)體作用和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
抗體介導(dǎo)的殺滅腫瘤細(xì)胞這一機(jī)理的關(guān)鍵部分涉及C3補(bǔ)體蛋白對(duì)抗體-腫瘤抗原絡(luò)合物的識(shí)別以及C3-抗體-腫瘤抗原絡(luò)合物的形成。這一絡(luò)合物隨后被先天免疫細(xì)胞通過(guò)CR3而識(shí)別。先天免疫細(xì)胞帶有CR3受體，并通過(guò)CR3和C3-抗體-腫瘤細(xì)胞抗原絡(luò)合物之間的特異性相互作用而將腫瘤細(xì)胞識(shí)別為異質(zhì)體。當(dāng)CR3與該絡(luò)合物相結(jié)合時(shí)，先天免疫細(xì)胞受到刺激，從而發(fā)揮它們的殺滅腫瘤活性。在本發(fā)明中，這些先天免疫細(xì)胞還受到中性可溶性葡聚糖的刺激。當(dāng)可溶性β(1，3；1，6)葡聚糖在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的表面與CR3相結(jié)合時(shí)，這些細(xì)胞便被激活。這些細(xì)胞被β(1，3；1，6)葡聚糖與CR3間相互作用激活后可增強(qiáng)這些細(xì)胞以C3-抗體-腫瘤抗原絡(luò)合物為靶目標(biāo)的殺滅腫瘤活性，從而通過(guò)協(xié)同作用提高殺滅腫瘤的能力。
除了可以增強(qiáng)先天免疫系統(tǒng)中性可溶性葡聚糖-CR3介導(dǎo)的殺滅腫瘤活性，使用顆粒葡聚糖的β-葡聚糖療法還可以在獲得性免疫系統(tǒng)反應(yīng)中誘導(dǎo)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)變。在通常情況下，抗腫瘤的獲得性免疫反應(yīng)不能發(fā)生從Th2反應(yīng)(體液/抗體反應(yīng))向Th1反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞反應(yīng))的轉(zhuǎn)變。因此，獲得性免疫系統(tǒng)的全部力量無(wú)法用來(lái)抵御癌癥。然而，全葡聚糖顆粒在使單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞循環(huán)時(shí)可迅速地誘導(dǎo)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變由全葡聚糖顆粒對(duì)這些重要免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子外形的影響而得到證明。這種向抗腫瘤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的轉(zhuǎn)變會(huì)增強(qiáng)獲得性免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，雖然腫瘤細(xì)胞可以抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，但卻很容易遭到細(xì)胞毒性殺傷T細(xì)胞反應(yīng)的破壞。
本發(fā)明的另一方面是口服WGP具有誘導(dǎo)獲得性免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)，而全身使用中性可溶性葡聚糖可通過(guò)先天免疫細(xì)胞反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞表面單克隆抗體和/或腫瘤疫苗療法的抗腫瘤活性。雖然不為理論所限制，由于WGP和中性可溶性葡聚糖具有不同的結(jié)構(gòu)，所以這兩種物質(zhì)作用于不同的細(xì)胞群體。WGP作用于與消化道相關(guān)的淋巴組織和淋巴細(xì)胞，而中性可溶性葡聚糖作用于循環(huán)的先天免疫細(xì)胞。增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)具有協(xié)同效應(yīng)，并可顯著增強(qiáng)抗腫瘤活性。
本發(fā)明申請(qǐng)還對(duì)免疫調(diào)節(jié)方法進(jìn)行了說(shuō)明，在該免疫調(diào)節(jié)方法中，通過(guò)使用有效治療劑量的全葡聚糖顆粒來(lái)誘導(dǎo)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。雖然免疫調(diào)節(jié)可用于抗腫瘤療法之外的領(lǐng)域，但免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)抗腫瘤療法療效的能力具有特殊的意義。免疫調(diào)節(jié)方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體使用有效治療劑量的全葡聚糖顆粒，并使用以前面所述腫瘤細(xì)胞的抗原為靶目標(biāo)的抗體，其中的抗體是通過(guò)對(duì)個(gè)體使用適當(dāng)?shù)囊呙缍T導(dǎo)的，或者直接對(duì)個(gè)體使用單克隆抗體或多克隆抗體。此外，所使用的全葡聚糖可通過(guò)口服、注射或其他本領(lǐng)域已知的方式進(jìn)行給藥。葡聚糖和激活補(bǔ)體的抗體可以順序給藥、同時(shí)給藥或在不同的時(shí)間進(jìn)行給藥。
適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之所以這樣命名是因?yàn)樵撓到y(tǒng)通過(guò)對(duì)異質(zhì)體表面上存在的抗原產(chǎn)生特定的反應(yīng)而對(duì)感染進(jìn)行適應(yīng)。癌癥給免疫系統(tǒng)造成的一個(gè)困難是癌癥細(xì)胞不是真正的異質(zhì)體，癌癥細(xì)胞只是各種基因被異常激活或異常失活的天然細(xì)胞。因此，一般認(rèn)為，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)不適合于對(duì)付癌癥，取而代之的是，癌癥通常由先天免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞進(jìn)行處理。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)還可分成Th1系統(tǒng)和Th2系統(tǒng)，這兩個(gè)分系統(tǒng)是以所涉及到的兩類(lèi)T輔助細(xì)胞而命名的。這種分系統(tǒng)最初是在小鼠身上發(fā)現(xiàn)的，雖然小鼠體內(nèi)的分系統(tǒng)更簡(jiǎn)單一些，但人體內(nèi)也存在著Th1/Th2差別。Th1輔助細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子可刺激細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力，但只能刺激較弱的并且是十分短暫的抗體反應(yīng)。另一方面，Th2輔助細(xì)胞可產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可引起較強(qiáng)的抗體反應(yīng)，但導(dǎo)致的細(xì)胞免疫力卻很弱。雖然Th1和Th2代表兩種不同類(lèi)型的免疫反應(yīng)，但個(gè)體對(duì)病原體所產(chǎn)生的反應(yīng)通常包括這兩種反應(yīng)，其中一種反應(yīng)居于主要地位。令人感興趣的是，Th1反應(yīng)和Th2反應(yīng)是相互對(duì)立的，既較強(qiáng)的Th1反應(yīng)會(huì)壓制Th2反應(yīng)，反之亦然。
酵母衍生出的中性可溶性葡聚糖在一定程度上通過(guò)刺激先天抗真菌免疫機(jī)理而發(fā)揮作用，酵母衍生出的中性可溶性葡聚糖刺激先天抗真菌免疫機(jī)理殺滅細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、病毒以及癌癥等各種病原體。中性可溶性葡聚糖作用的分子機(jī)理似乎涉及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞這些免疫細(xì)胞細(xì)胞膜上的特異性β-葡聚糖受體結(jié)合位點(diǎn)。最近的研究數(shù)據(jù)表明，C3補(bǔ)體蛋白的受體CR3是β-葡聚糖的主要受體。甘露多糖、半乳聚糖、含有α(1-4)鍵的葡萄糖聚合物以及含有β(1-4)鍵的葡萄糖聚合物對(duì)這一受體沒(méi)有親和力。首先，iC3b受體CR3(也被稱為Mac-1、CD11b/CD18A或αm β2-整聯(lián)蛋白)帶有β-葡聚糖結(jié)合凝集素位點(diǎn)，該位點(diǎn)在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬酵母細(xì)胞壁的過(guò)程中發(fā)揮作用(見(jiàn)Ross G.D.等人在《免疫》雜志上發(fā)表的文章，1622281-2290(1999))。Mac-1/CR3既發(fā)揮粘著分子的作用又是補(bǔ)體iC3b片段的受體，其中粘著分子在內(nèi)皮中調(diào)節(jié)白細(xì)胞的血球滲出過(guò)程；補(bǔ)體iC3b片段對(duì)微生物產(chǎn)生吞噬/脫粒反應(yīng)。Mac-1/CR3具有許多與其他整聯(lián)蛋白相一致的功能特點(diǎn)，其中包括通過(guò)結(jié)構(gòu)變化雙向發(fā)送信號(hào)；這種結(jié)構(gòu)變化或起源于胞漿區(qū)或起源于胞外區(qū)。Mac-1/CR3的另一重要功能是其與固定糖基磷酯酰肌醇的受體有形成膜絡(luò)合物的能力，例如有與FcγRIIIB(CD16b)或Upar(CD87)形成膜絡(luò)合物的能力，這一能力使這些外膜約束的受體具有穿越細(xì)胞膜的發(fā)生信號(hào)機(jī)理，這樣可使受體對(duì)細(xì)胞骨架依賴性附著或吞噬作用和脫粒作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。許多功能似乎是依靠接近膜的凝集素位點(diǎn)，凝集素位點(diǎn)或者負(fù)責(zé)識(shí)別微生物表面的多糖或者負(fù)責(zé)識(shí)別與糖基磷酯酰肌醇相連的信號(hào)發(fā)生配體。由于Mac-1/CR3在促進(jìn)中性粒細(xì)胞的炎癥應(yīng)答方面起看重要的作用，所以與其功能相對(duì)抗的治療策略在治療自身免疫疾病和局部缺血/再灌注損傷方面很有前途。相反的是，與其凝集素位點(diǎn)相結(jié)合的可溶性β-葡聚糖對(duì)循環(huán)巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的Mac-1/CR3進(jìn)行啟動(dòng)，從而根據(jù)ic3b調(diào)理的腫瘤細(xì)胞而產(chǎn)生細(xì)胞毒性脫粒作用，否則腫瘤細(xì)胞將避開(kāi)這種細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性機(jī)理。CR3對(duì)可溶性真菌β-葡聚糖具有較高的結(jié)合親合力(5×10-8M)，并對(duì)巨噬細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞進(jìn)行啟動(dòng)，從而根據(jù)iC3b覆蓋的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性脫粒作用。在缺乏血清C3(補(bǔ)體3)或白細(xì)胞CR3的小鼠體內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)可溶性β-葡聚糖誘導(dǎo)的殺滅腫瘤反應(yīng)，這一點(diǎn)表明了腫瘤細(xì)胞上iC3b以及白細(xì)胞上的CR3對(duì)于β-葡聚糖殺滅腫瘤細(xì)胞的重要性(見(jiàn)Vetvicka V.等人在《臨床研究》上發(fā)表的文章，9850-61(1996)，見(jiàn)Yan J.V.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1633045-3052(1999))。與β-葡聚糖受體相結(jié)合的配體可導(dǎo)致補(bǔ)體被激活，并導(dǎo)致吞噬作用、溶酶體酶釋放以及前列腺素、促凝血素養(yǎng)和白細(xì)胞三烯的生成。以往技術(shù)中所述的大多數(shù)β-葡聚糖制劑刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，比如刺激白細(xì)胞間素-1和腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，白細(xì)胞間素-1和腫瘤壞死因子具有抗腫瘤活性。另一方面，中性可溶性β-葡聚糖并不刺激細(xì)胞因子的釋放，最可能的原因是中性可溶性β-葡聚糖太小以致無(wú)法與膜CR3形成交聯(lián)。
對(duì)于葡聚糖顆粒吞噬作用所涉及的葡聚糖而言，Dectin-1是β-葡聚糖的第二個(gè)膜受體。Dectin-1在巰基乙酸鹽誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞上高度表達(dá)，其活性通過(guò)β-葡聚糖與這些活化細(xì)胞的結(jié)合而主導(dǎo)著酵母吞噬作用中CR3的活性。然而，中性粒細(xì)胞和駐留型腹膜巨噬細(xì)胞所形成的酵母吞噬作用受到抗CR3物質(zhì)的阻礙，缺乏CR3(CD11b-/-)的中性料細(xì)胞或駐留型巨噬細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)酵母吞噬作用。再者，Dectin-1不被天然殺傷細(xì)胞所表達(dá)，天然殺傷細(xì)胞在經(jīng)過(guò)β-葡聚糖啟動(dòng)后使用CR3調(diào)節(jié)對(duì)iC3b調(diào)理的乳腺癌細(xì)胞的殺滅活性。因此，Dectin-1在調(diào)節(jié)β-葡聚糖活性方面似乎受到活性腹膜巨噬細(xì)胞的限制，也許還受到腸內(nèi)CR3-/-巨噬細(xì)胞的限制。
葡聚糖的來(lái)源正如本文所用的，β-葡聚糖是指葡萄糖聚合物，這一葡萄糖聚合物由細(xì)胞壁衍生出來(lái)，并含有β1，3鍵和β1，6鍵。人們已經(jīng)制備出了各種形式的β-葡聚糖顆粒和可溶性β-葡聚糖。
適用于本發(fā)明的一種具體的可溶性葡聚糖是全葡聚糖顆粒，這是一種提純的酵母細(xì)胞壁制劑。通過(guò)去除甘露聚糖蛋白的外層，并在保持葡聚糖體內(nèi)形態(tài)的同時(shí)使β-葡聚糖曝露出來(lái)可制得全葡聚糖顆粒。在某些實(shí)施方案中，全葡聚糖顆粒的直徑為1微米或大于1微米。通過(guò)使生長(zhǎng)過(guò)程中的酵母與其生長(zhǎng)介導(dǎo)分離，然后用堿對(duì)完整的酵母細(xì)胞壁進(jìn)行處理，從而去除不需的蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)，這樣制得的酵母細(xì)胞壁殘余物便是全葡聚糖顆粒。
在某些實(shí)施方案中，本文所述方法中所用的全葡聚糖顆粒是口服生物活性成分。正如本文所使用的，“生物活性”是指全葡聚糖顆粒能夠達(dá)到功效目標(biāo)。換句話說(shuō)就是，全葡聚糖顆粒含有足夠的β(1，3；1，6)葡聚糖，這些葡聚糖被派伊爾淋巴集節(jié)所吸收。葡聚糖被派伊爾淋巴集節(jié)所吸收，并被巨噬細(xì)胞吞噬和降解，然后傳送到骨髓中，降解的片段在骨髓中被釋放出來(lái)。這些降解后的片段與骨髓中的中性粒細(xì)胞相結(jié)合，并通過(guò)趨化性而遷移到抗體覆蓋的腫瘤細(xì)胞上并與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合，其中腫瘤細(xì)胞上的補(bǔ)體已經(jīng)通過(guò)iC3b在腫瘤細(xì)胞上的沉積所激活。舉例而言，全葡聚糖顆粒能夠到達(dá)腫瘤細(xì)胞，并同抗體一同作用于腫瘤細(xì)胞。在全葡聚糖的作用位點(diǎn)，葡聚糖通過(guò)與CR3受體的結(jié)合而刺激細(xì)胞，這反過(guò)來(lái)又啟動(dòng)或促進(jìn)CR3發(fā)揮功能。通過(guò)胃腸巨噬細(xì)胞將全葡聚糖顆粒輸送到骨髓中可以介導(dǎo)口服全葡聚糖的生物藥效率，胃腸巨噬細(xì)胞使全葡聚糖發(fā)生降解。降解后的顆粒然后在骨髓中發(fā)揮作用，當(dāng)中性粒細(xì)胞遷移到腫瘤細(xì)胞上并與腫瘤細(xì)胞上的iC3b相結(jié)合時(shí)，這些降解的顆粒通過(guò)激活CR3而刺激中性粒細(xì)胞。
適用于本發(fā)明的另一葡聚糖來(lái)源是微粒型葡聚糖顆粒。在本文中，微粒型葡聚糖顆粒被定義為全葡聚糖顆粒的一部分，將酵母細(xì)胞壁β(1-3；1-6)葡聚糖精細(xì)研磨到1微米左右或1微米以下便得到了微粒型葡聚糖顆粒。正如5,702,719號(hào)美國(guó)專利所述的，這種形式的β-葡聚糖被用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品和皮膚修復(fù)劑。適用于本文所述方法的其他葡聚糖包括WGPTMβ-葡聚糖和βRightTM，這兩種產(chǎn)品由明尼蘇達(dá)州的生物聚合物工程公司制造。本文下面將對(duì)這些化合物的制備以及這些化合物與抗體聯(lián)合使用來(lái)治療贅生細(xì)胞進(jìn)行說(shuō)明。
微粒型β-葡聚糖顆粒也具有增強(qiáng)使用者免疫系統(tǒng)的功能。見(jiàn)5,223,491號(hào)和5,576,015號(hào)美國(guó)專利，這兩篇專利的內(nèi)容在此通過(guò)引證被并入本文。
適用于本文所述方法的另一種形式的葡聚糖是中性可溶性葡聚糖。通過(guò)一系列酸、堿和中和處理步驟可生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)純的中性可溶性葡聚糖制劑。中性可溶性葡聚糖制劑可增強(qiáng)使用者的免疫系統(tǒng)功能，但不會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞間素-1和腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，因此中性可溶性葡聚糖制劑不會(huì)引起炎癥。見(jiàn)5,783,569號(hào)美國(guó)專利，該專利的全文在此通過(guò)引證被并入本文。
制備全葡聚糖顆粒簡(jiǎn)單而言，生產(chǎn)全葡聚糖顆粒的過(guò)程涉及不溶于堿性物質(zhì)的全葡聚糖顆粒的萃取和提純，其中的全葡聚糖顆粒由酵母細(xì)胞壁或真菌細(xì)胞壁制得。這一過(guò)程產(chǎn)生一種產(chǎn)品，這一產(chǎn)品保持著體內(nèi)葡聚糖所具有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性，這一產(chǎn)品被稱為全葡聚糖或全葡聚糖顆粒。
全葡聚糖制劑的結(jié)構(gòu)-功能特性直接取決于葡聚糖的來(lái)源，同進(jìn)還取決于最終產(chǎn)品的純度。全葡聚糖的來(lái)源可以是酵母或其他真菌或任何其他含有葡聚糖的來(lái)源，其中的葡聚糖具有本文所述的特性，在某些實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞是優(yōu)選的葡聚糖來(lái)源。本過(guò)程所用的酵母菌株可以是任何的酵母菌株，例如包括啤酒酵母菌株，delbruecrii菌株、rosei菌株、微橢圓菌株、卡爾酵母菌株、二孢酵母菌株、發(fā)酵芽胞菌株、rouxii菌株等。
一般而言，上述過(guò)程可用來(lái)將其他突變的酵母菌株與作為起始材料的其他原始菌株分離開(kāi)來(lái)。此外，可采用誘變劑來(lái)誘導(dǎo)突變，舉例而言，可使用化學(xué)誘變劑、輻射或其他脫氧核糖核酸和重組體控制手段來(lái)誘導(dǎo)突變。同樣還可以使用其他的選擇或篩分技術(shù)來(lái)制備全葡聚糖顆粒。
酵母細(xì)胞可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)加以制造。舉例而言，典型的生長(zhǎng)介質(zhì)包括葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物。通過(guò)使用將生物物質(zhì)與液體介質(zhì)相分離的常規(guī)技術(shù)可以將酵母細(xì)胞與生長(zhǎng)介質(zhì)分離開(kāi)，并對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行收集。這些方法通常使用諸如過(guò)濾或離心分離這樣的固-液分離工藝。在本工藝過(guò)程中，優(yōu)選的情況是在酵母細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行收集，從而使酵母細(xì)胞中的糖原和殼多糖含量達(dá)到最低程度。在某些實(shí)施方案中，糖原、殼多糖和蛋白質(zhì)是不良污染物，這些不良污染物會(huì)對(duì)全葡聚糖顆粒的生物學(xué)特性和流體力學(xué)特性造成不利影響。在其他實(shí)施方案中，制劑中葡聚糖的含量大于50％。在某些實(shí)施方案中，其余部分由細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和/或糖原組成。
制備全葡聚糖顆粒包括使用適當(dāng)濃度的堿性水溶液對(duì)酵母進(jìn)行處理，從而將一部分酵母溶解掉，并由此生成不溶于堿性氫氧化物的全葡聚糖顆粒，這些全葡聚糖顆粒主要含有β(1-6)鍵和β(1-3)鍵。在制備全葡聚糖顆粒過(guò)程中所使用的堿性物質(zhì)通常為堿金屬氫氧化物，比如氫氧化鈉或氫氧化鉀等。制備全葡聚糖所用的原料是從生長(zhǎng)介質(zhì)中分離出來(lái)的酵母。在酵母原料濃度較低的情況下，將氫氧化物溶液的消耗量和濃度控制在理想的范圍內(nèi)是十分困難的。酵母應(yīng)該帶有完整的未出現(xiàn)破裂的細(xì)胞壁，因?yàn)楸景l(fā)明中全葡聚糖顆粒的性質(zhì)是否理想取決于細(xì)胞壁是否完整。
酵母在氫氧化物水溶液中進(jìn)行處理，酵母細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)組分和甘露糖蛋白溶解于氫氧化物水溶液中，剩余的不溶性細(xì)胞壁物質(zhì)基本上不含蛋白質(zhì)，并含有基本上未發(fā)生改變的三維β(1-6)鍵和β(1-3)鍵矩陣的葡聚糖。在優(yōu)選的操作條件下，細(xì)胞壁中的甘露聚糖成分在這一處理步驟中溶解于氫氧化物水溶液中。細(xì)胞內(nèi)的組分發(fā)生水解并進(jìn)入到溶解相中。對(duì)酵母進(jìn)行處理的條件至少要使細(xì)胞的主要組分和細(xì)胞壁的三維結(jié)構(gòu)不被破壞。在特定環(huán)境下，基本上所有的細(xì)胞壁葡聚糖未發(fā)生改變。
在某些實(shí)施方案中，使用氫氧化物水溶液對(duì)酵母進(jìn)行浸泡的過(guò)程是在氫氧化物溶液的初始當(dāng)量濃度約在0.1～10.0的情況下進(jìn)行的。典型的氫氧化物溶液含有元素周期表中堿金屬族的氫氧在化物和堿土金屬的氫氧化物。由于比較容易得到，所以優(yōu)選的氫氧化物水溶液是氫氧化鈉水溶液和氫氧化鉀水溶液。浸泡過(guò)程約在20℃～121℃的條件下進(jìn)行，浸泡的溫度越低浸泡的時(shí)間越長(zhǎng)。當(dāng)使用氫氧化鈉水溶液時(shí)，浸泡的溫度約在80℃～100℃之間，溶液的初始當(dāng)量濃度約在0.75～1.5之間。所加入的氫氧化物是過(guò)量的，因此不必再添加氫氧化物。
在一般情況下，每升氫氧化物溶液所處理的干酵母數(shù)量約在10～500克之間。在某些實(shí)施方案中。使用氫氧化物水溶液浸泡酵母的過(guò)程是由一系列接觸步驟實(shí)現(xiàn)的。在這種情況下，諸如蛋白質(zhì)這些雜質(zhì)的殘余量要少于只使用一次浸泡的雜質(zhì)殘余量。在某些實(shí)施方案中，應(yīng)該基本上將所有的蛋白質(zhì)從細(xì)胞中除去。蛋白質(zhì)的脫除程度應(yīng)該使蛋白質(zhì)在不溶性細(xì)胞壁葡聚糖顆粒中的殘余量低于1％。在優(yōu)選條件下，還應(yīng)在pH值約在2.0～6.0之間的酸性溶液中進(jìn)行萃取處理。典型的酸性溶液包括鹽酸、使用鹽酸和醋酸鹽緩沖物調(diào)制到所需PH值的氯化鈉溶液。其他常用的酸性溶液包括硫酸溶液和含有適當(dāng)緩沖劑的乙酸溶液。在優(yōu)選條件下，萃取過(guò)程在約20℃～100℃下進(jìn)行。如果需要，經(jīng)過(guò)浸泡的葡聚糖顆?？梢栽龠M(jìn)行洗滌和萃取處理。從而減少蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的含量。在經(jīng)過(guò)處理后，可將產(chǎn)物的pH值調(diào)節(jié)到約6.0～7.8之間。
在完成了這一不會(huì)對(duì)細(xì)胞壁造成破壞的處理步驟后，萃取過(guò)程可以在更嚴(yán)格的pH值和溫度條件下進(jìn)行，而以往的處理過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞壁造成損壞。本發(fā)明中的處理過(guò)程在采用這些嚴(yán)格的萃取條件時(shí)避免了產(chǎn)品的質(zhì)量出現(xiàn)下降，本發(fā)明中的萃取過(guò)程消除了十分耗時(shí)的多級(jí)萃取步驟。
在經(jīng)過(guò)上述氫氧化物溶液處理后，全葡聚糖最終產(chǎn)物的重量約為酵母原料重量的5～30％，在優(yōu)選情況下，最終產(chǎn)物的重約為原料重量的7～15％。
不溶于氫氧化物溶液的全葡聚糖顆粒將在發(fā)明概述中進(jìn)行說(shuō)明。如果需要，全葡聚糖顆粒還可進(jìn)行進(jìn)一步的處理和/或提純。舉例而言，葡聚糖可干燥成細(xì)小的粉未(即在干燥爐中進(jìn)行干燥)，或者使用有機(jī)溶劑(比如乙醇、醚類(lèi)物質(zhì)、丙酮、甲乙酮、氯仿)進(jìn)行處理，從而除去微量雜質(zhì)或溶于有機(jī)溶劑的物質(zhì)；或者再用氫氧化物溶液進(jìn)行處理，從而除去可能存在的其他蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明工藝過(guò)程所生產(chǎn)出的全葡聚糖顆粒由純葡聚糖構(gòu)成，其中的葡聚糖基本是β(1-6)和β(1-3)鍵葡聚糖。全葡聚糖顆粒含有極少的蛋白質(zhì)的糖原雜質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，全葡聚糖顆粒的形狀為球形，直徑約在2～10微米之間，當(dāng)使用單糖分析或其他適當(dāng)?shù)姆治鰰r(shí)，全葡聚糖所含己糖的重量比約大于85％(在其他實(shí)施方案中己糖的重量比大于約60％)，蛋白質(zhì)的重量比約為1％，可檢測(cè)到的甘露聚糖的含量小于1％。使用以往技術(shù)所制得的葡聚糖所含殼多糖和糖原的數(shù)量大大高于本發(fā)明中的葡聚糖。
正如本文前面所述，第二步是采用化學(xué)處理手段對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行改性，從而改變葡聚糖的特性。除了從本文所述的那些具體酵母菌株所衍生出的全葡聚糖顆粒外，由任何酵母菌株所衍生出的全葡聚糖顆粒均可以使用。正如前面所述的，可以使用的酵母種類(lèi)很多。前面所述的處理?xiàng)l件同樣適用于從真菌中提取葡聚糖的過(guò)程。同樣，這些葡聚糖的特性也取決于它們的來(lái)源。
在第一步化學(xué)處理中，可使用酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行處理，從而減少β(1-6)鍵的數(shù)量，并由此改變所述葡聚糖的流體力學(xué)性質(zhì)，其表現(xiàn)結(jié)果是改性后葡聚糖水溶液的粘度會(huì)增加。
還可以使用酸性物類(lèi)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行處理，從而改變?chǔ)?1-6)鍵。乙酸由于其酸度適中、使用簡(jiǎn)便、毒性低、成本低及容易獲得而是一種理想的酸性材料，但其他種類(lèi)的酸也可以使用。一般而言，這些酸的酸度要適中，其酸度應(yīng)足以限制β(1-3)鍵發(fā)生水解。對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行改性處理是在一定條件下進(jìn)行的，這些條件基本上只對(duì)含β(1-6)鍵的葡聚糖發(fā)生影響。在某些實(shí)施方案中，酸處理過(guò)程是使用基本上由乙酸組成的溶液或本文所述的稀釋液(常用的稀釋液可以是有機(jī)溶劑或有機(jī)酸溶液)進(jìn)行的。處理過(guò)程的溫度約在20℃～100℃之間。在某些實(shí)施方案中，酸處理過(guò)程可將處理前全葡聚糖顆粒中重量約為3～20％左右的酸溶性物質(zhì)除去。在其他的實(shí)施方案中，所脫除的重量比約為3～4％。經(jīng)過(guò)酸處理后所形成的某些組分能夠表明全葡聚糖顆粒的流體力學(xué)性質(zhì)已發(fā)生變化，并且表明處理后的粘度有所增加。
在第二步化學(xué)處理中，使用酶或酸對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行處理，從而改變?chǔ)?1-3)鍵的數(shù)量。對(duì)于由某些酵母菌株衍生出的全葡聚糖顆粒而言，使用酶對(duì)其進(jìn)行處理會(huì)使其粘度降低，但對(duì)于其他由酵母衍生出的全葡聚糖顆粒而言，酶處理過(guò)程會(huì)使這些全葡聚糖顆粒的粘度上升。但一般而言，酶處理過(guò)程會(huì)改變葡聚糖的化學(xué)性質(zhì)和流體力學(xué)性質(zhì)。酶處理過(guò)程是使用β(1-3)葡聚糖酶對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行處理，例如使用昆布糖酶對(duì)全葡聚糖顆粒進(jìn)行處理，從而改變?chǔ)?1-3)鍵，并由此改變?nèi)暇厶撬蠎腋∫旱牧黧w力學(xué)性質(zhì)。
酶處理過(guò)程可在全葡聚糖的水溶液中進(jìn)行，其中葡聚糖的濃度約在0.1～10.0克/升之間。任何可水解的葡聚糖酶都可以使用，比如可使用昆布糖酶，這種糖酶十分有效并且十分容易獲得。培養(yǎng)期可視全葡聚糖顆粒和全葡聚糖酶的濃度而變化。在諸如乙酸這樣具有中等酸度的環(huán)境下，β(1-3)鍵具有抗水解能力。當(dāng)使用強(qiáng)酸或濃酸進(jìn)行處理時(shí)，比如使用鹽酸、硫酸或甲酸進(jìn)行處理時(shí)，β(1-3)鍵會(huì)發(fā)生水解，從而減少β(1-3)鍵的數(shù)量。酸處理過(guò)程可在全葡聚糖的水溶液中進(jìn)行，其中葡聚糖的濃度約在0.1～10.0克/升之間。酸處理的時(shí)間可視全葡聚糖顆粒的濃度和酸的濃度而變化。酸處理過(guò)程可在20℃～100℃左右的溫度下進(jìn)行。在優(yōu)選條件下，酸處理過(guò)程后所形成的組分可表明流體力學(xué)性質(zhì)的變化。
通過(guò)控制培養(yǎng)時(shí)間可以控制所生成產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)和流體力學(xué)性質(zhì)。舉例而言，可以對(duì)產(chǎn)物的粘度進(jìn)行精確的控制，從而使產(chǎn)物用于特定的用途，比如用于各種食品中。
最終產(chǎn)物的流體力學(xué)參數(shù)(K1)取決于處理時(shí)間的長(zhǎng)短，該參數(shù)由以下公式計(jì)算K1＝-0.0021(時(shí)間)+0.26其中時(shí)間的單位為分鐘并且不到1小時(shí)。
參數(shù)K1直接與產(chǎn)物的相對(duì)粘度相關(guān)(成比例)。在產(chǎn)物的水合懸浮液中，如果以厘泊為單位進(jìn)行計(jì)量時(shí)，相對(duì)粘度與實(shí)際粘度相等。
本發(fā)明提供制備葡聚糖水合漿液的工藝方法，該水合漿液具有所需的預(yù)定粘度。該漿液所含葡聚糖的濃度是所需預(yù)定粘度的函數(shù)，所需預(yù)定粘度由以下近似公式計(jì)算1/濃度＝K1×(1/log(相對(duì)粘度))+K2
其中K1＝(形狀因子)×(流體力學(xué)體積)，K2＝(流體力學(xué)體積)/(最大充填率)。
形狀因子是經(jīng)驗(yàn)值，該經(jīng)驗(yàn)值表明了在水合環(huán)境中的葡聚糖矩陣的形狀。形狀因子是葡聚糖顆粒長(zhǎng)、寬比的函數(shù)，形狀因子可通過(guò)顯微觀察的方式加以確定。流體力學(xué)體積是葡聚糖顆粒在懸浮液中所占的體積。流體力學(xué)體積是葡聚糖懸浮液的一項(xiàng)重要參數(shù)，該參數(shù)表明了葡聚糖矩陣的含水能力的高低。最大充填率可以被描述成在單位體積的懸浮液中能夠獲得的最大葡聚糖體積分率。
制備微粒型β-葡聚糖顆粒通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的傳統(tǒng)方法可從酵母細(xì)胞壁中分離出β(1，3)葡聚糖的原料。從酵母制備葡聚糖的常用方法包括堿萃取過(guò)程以及其后的酸萃取過(guò)程(見(jiàn)Hassid等人在《美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志》上發(fā)表的文章，63295-298，1941)。5,223,491號(hào)美國(guó)專利對(duì)分離高純?chǔ)?1，3)葡聚糖萃取物的改進(jìn)方法進(jìn)行了說(shuō)明，其中的β(1，3)葡聚糖不溶于水，該專利在此通過(guò)引證被并入本文。5,702,719號(hào)美國(guó)專利對(duì)制備微粒型β-葡聚糖的方法進(jìn)行了說(shuō)明，該專利的全文在此通過(guò)引證被并入本文。所制得的葡聚糖微粒的平均顆粒直徑約為1.0微米或1.0微米之下，或者平均顆粒直徑約為0.2微米或0.2微米之下。
通過(guò)機(jī)械方式可以降低β-葡聚糖顆粒的直徑，例如可采用搗碎機(jī)、微流化器或球磨機(jī)來(lái)減小β-葡聚糖顆粒的大小。舉例而言，可使用帶有鈍刀片的搗碎機(jī)來(lái)降低葡聚糖顆粒的大小，其中葡聚糖混合物在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)被搗碎，從而在不導(dǎo)致混合物出現(xiàn)過(guò)熱的情況下將顆粒研磨到所需的大小，優(yōu)選的研磨時(shí)間為幾分鐘。另外一種研磨方式是使用10毫米不銹鋼球研磨機(jī)對(duì)葡聚糖顆粒進(jìn)行研磨。當(dāng)希望制備0.2微米或更小的葡聚糖顆粒時(shí)，后一種研磨方式特別適用。
在進(jìn)行研磨之前，葡聚糖混合物最好經(jīng)過(guò)一系列的篩分，其中每個(gè)篩網(wǎng)的目數(shù)都大于前一個(gè)篩網(wǎng)的目數(shù)，最后一個(gè)篩網(wǎng)的目數(shù)約為80。對(duì)葡聚糖混合物進(jìn)行篩分的目的在于將更大更粗的葡聚糖顆粒與更小的顆粒分離開(kāi)(80目篩網(wǎng)的孔徑約為0.007英寸或0.178毫米)。分離出的較大顆粒然后按前面所述的研磨方法再進(jìn)行研磨，并使用最后一個(gè)篩網(wǎng)為80目的篩分機(jī)再次進(jìn)行篩分。篩分過(guò)程和研磨過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行，直至最終得到的顆粒可穿過(guò)80目的篩網(wǎng)。篩分出的顆粒被混合到一起，并進(jìn)行進(jìn)一步的研磨，優(yōu)選的研磨時(shí)間至少為1小時(shí)，直至達(dá)到所需的顆粒大小，優(yōu)選的顆粒直徑約為1.0微米或更小，更理想的顆粒直徑約為0.2微米或更小。在研磨過(guò)程中對(duì)葡聚糖顆粒進(jìn)行定期的采樣，并用顯微鏡上的測(cè)微計(jì)測(cè)定顆粒的大小。
可溶性葡聚糖此外，經(jīng)過(guò)加工的β(1，3；1，6)葡聚糖更多的是中性可溶性β-葡聚糖。一般而言，中性非衍生β(1，3；1，6)葡聚糖由于具有形成緊密結(jié)合的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)原纖維的能力，所以不溶于生理介質(zhì)中，其中的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)原纖維具有抗水合作用。通過(guò)一系列的酸處理、堿處理以及中和處理過(guò)程可以從全葡聚糖顆粒制備中性可溶性β-葡聚糖，通過(guò)這些處理步驟可產(chǎn)生可溶性的結(jié)構(gòu)純葡聚糖制品，該制品可保存在清洗的溶液中。制備可溶性葡聚糖的方法在本領(lǐng)域是已知的，5,322,841號(hào)美國(guó)專利對(duì)制備可溶性葡聚糖的方法進(jìn)行了說(shuō)明，該專利在此通過(guò)引證被并入本文。這一工藝方法所制備出的可溶性葡聚糖是具有分支結(jié)構(gòu)的葡萄糖聚合物，該聚合物含有β(1，3)鍵和β(1，6)鍵，其中β(1，3)鍵與β(1，6)鍵的比例取決于原微生物和所使用的具體處理?xiàng)l件?？扇苄云暇厶堑钠骄肿恿考s為5,000～500,000道爾頓。可溶性葡聚糖以多種方式增強(qiáng)其使用者的免疫系統(tǒng)功能。然而可溶性葡聚糖并不刺激諸如白細(xì)胞間素-1和腫瘤壞死因子這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此可溶性葡聚糖不會(huì)引發(fā)炎癥。有關(guān)這方面的內(nèi)容見(jiàn)5,783,569號(hào)美國(guó)專利，該專利在此通過(guò)引證被并入本文。WGP還可分解成多種組分，每種組分與先天免疫細(xì)胞上亞型受體的親和力是不同的。這些不同的結(jié)構(gòu)形式在復(fù)雜性、隨機(jī)螺旋、單螺旋、三鏈螺旋和三鏈螺旋多體上是遞增的。在某些實(shí)施方案中，三鏈螺旋結(jié)構(gòu)的分子量約為150,000?？扇苄云暇厶侵蟹肿恿扛叩臉?gòu)象異構(gòu)體并不與CR3結(jié)合，但可以被吞噬和降解成更小的片段，這些更小的片段能夠與CR3相結(jié)合。WGP具有多種生物活性，WGP可用作疫苗輔劑(見(jiàn)5,741,495號(hào)美國(guó)專利)、抗感染劑和抗腫瘤劑。每種結(jié)構(gòu)形式具有不同的活性，這些不同的活性由葡聚糖受體的不同特性表現(xiàn)出來(lái)。
制備中性可溶性葡聚糖5,322,841號(hào)美國(guó)專利對(duì)制備可溶性葡聚糖進(jìn)行了說(shuō)明，該專利的內(nèi)容在此通過(guò)引證被并入本文。簡(jiǎn)單而言，這一方法包括對(duì)WGP進(jìn)行一系列的酸、堿處理，從而產(chǎn)生可溶性葡聚糖，可溶性葡聚糖形成具有中性pH值的清潔溶液。本發(fā)明中所用的WGP可以以干燥粉未的形式存在，干燥粉未由本文前面所述的工藝過(guò)程加以制備。就本發(fā)明而言，沒(méi)有必要進(jìn)行最后的有機(jī)萃取和洗滌步驟。
在本工藝過(guò)程中，WGP懸浮于酸性溶液中，WGP所處的條件足以溶解可溶于酸性溶液中的葡聚糖部分。對(duì)大多數(shù)葡聚糖而言，當(dāng)酸性溶液的pH值約在1～5之間，溫度約在20℃～100℃之間時(shí)，該酸性溶液便足以溶解WGP中可溶于酸性溶液的部分。在優(yōu)選情況下，所使用的酸是有機(jī)酸，該有機(jī)酸能夠溶解可溶于酸性物質(zhì)的葡聚糖部分。濃度約為0.1～5m的乙酸和濃度約為50％～98％(重量/體積)的甲酸可以使用。此外，還可以使用硫酸。在優(yōu)選情況下，處理過(guò)程是在90℃下進(jìn)行的。處理時(shí)間可在1～20小時(shí)左右，處理時(shí)間的長(zhǎng)短取決于酸的濃度、溫度以及WGP的來(lái)源。舉例而言，經(jīng)過(guò)改性的葡聚糖比自然存在的葡聚糖和野生型葡聚糖帶有更多的β(1-6)支鏈，而且經(jīng)過(guò)改性的葡聚糖需要更苛刻的條件，即處理的時(shí)間更長(zhǎng)、溫度更高。這一酸處理步驟可在相似條件或不同條件下重復(fù)進(jìn)行。在本方法的某一實(shí)施方案中，所使用的改性WGP是由S.cerevisiae R4菌株衍生出來(lái)的，這一改性的WGP比自然存在的葡聚糖具有更多的β(1-6)支鏈，處理過(guò)程進(jìn)行兩次，第一次是在0.5M乙酸及90℃下進(jìn)行的，第一次處理過(guò)程的持續(xù)時(shí)間為3小時(shí)；第二次處理過(guò)程是在0.5M乙酸及90℃下進(jìn)行的，第二次處理過(guò)程的持續(xù)時(shí)間為20小時(shí)。
然后通過(guò)適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)，例如通過(guò)離心分離或過(guò)濾技術(shù)將不溶于酸性物質(zhì)的葡聚糖顆粒從溶液中分離出來(lái)。然后通過(guò)使用諸如氫氧化鈉這樣的堿性化合物將制得的漿液的pH值調(diào)節(jié)到7～14左右。然后再使?jié){液懸浮于熱堿中，其中熱堿的濃度和溫度足以溶解葡聚糖。這一步驟中所用的堿性化合物包括堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化化物，比如氫氧化鈉或氫氧化鉀，氫氧化物的濃度約在0.1～10N之間。這一步驟可在4℃～121℃左右進(jìn)行，優(yōu)選的溫度約在20℃～100℃之間。在某一實(shí)施方案中，所使用的堿性物質(zhì)是濃度為1N的氫氧化鈉溶液，其溫度約在80℃～100℃之間，處理時(shí)間約在1～2小時(shí)。所得到的混合物含有可溶性葡聚糖分子和殘留的葡聚糖顆粒，由于蛋白質(zhì)雜質(zhì)的氧化以及糖分的存在，所得到的混合物為深褐色。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)將顆粒殘留物從混合物中除去，例如通過(guò)離心分離技術(shù)和/或過(guò)濾技術(shù)將顆粒殘留物從混合物中除去。
所得到的溶液含有可溶性葡聚糖分子。可以選擇的是，可以對(duì)該溶液進(jìn)行濃縮，使其可溶性、葡聚糖滲余物濃度達(dá)到5～10倍，從而使可溶性葡聚糖的濃度約在1～5毫克/毫升。這一步驟可通過(guò)適當(dāng)?shù)臐饪s技術(shù)完成，比如使用額定分子量約在1,000～100,000道爾頓的膜進(jìn)行超濾過(guò)程來(lái)對(duì)溶液進(jìn)行濃縮。分子量約為10,000的膜尤其適用于這一步驟。
經(jīng)過(guò)該處理步驟的濃縮部分富含可溶性的且具有生物活性的葡聚糖，也被稱為PGG。為了得到藥理上可接受的溶液，葡聚糖濃縮物可進(jìn)行進(jìn)一步的提純，比如通過(guò)滲濾過(guò)程進(jìn)行提純。在某一實(shí)施方案中，滲濾過(guò)程是在使用約10個(gè)體積的堿性物質(zhì)的條件下進(jìn)行的，其中堿性物質(zhì)的濃度約在0.2～0.4N。在優(yōu)選情況下，經(jīng)過(guò)這一步驟后可溶性葡聚糖的濃度約在2～5毫克/亳升。然后使用酸性物質(zhì)將溶液的pH值調(diào)至7～9左右，比如使用鹽酸來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH值。通過(guò)使溶液與諸如二乙氨基乙基纖維素、季銨基乙基纖維素或Q-瓊脂糖這樣的帶正電荷的介質(zhì)相接觸可以除去溶液中可能存在的微量蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)對(duì)于葡聚糖產(chǎn)品的質(zhì)量是有害的，它可導(dǎo)致溶液出現(xiàn)脫色，并促進(jìn)膠體網(wǎng)絡(luò)的形成，從而限制中性葡聚糖的溶解度。在這一步驟后可獲得清潔的溶液。
高純、清潔的葡聚糖溶液可以進(jìn)行進(jìn)一步的提純，比如使用藥理上可接受的介質(zhì)(比如注射用無(wú)菌水、磷酸鹽緩沖鹽水、等張鹽水、右旋糖)進(jìn)行滲濾過(guò)程而對(duì)葡聚糖溶液進(jìn)行提純。在優(yōu)選情況下，滲濾過(guò)程所用的膜的額定分子量約為10,000道爾頓。葡聚糖溶液的最終濃度被調(diào)節(jié)在0.5～5毫克/毫升左右。根據(jù)制藥標(biāo)準(zhǔn)，該溶液通過(guò)0.22微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾而實(shí)現(xiàn)最終消毒。該過(guò)程制備出的可溶性葡聚糖制劑是無(wú)菌的、不含抗原的且基本上沒(méi)有熱原性物質(zhì)，該制劑可在室溫下長(zhǎng)期保存而不會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量下降。
激活補(bǔ)體的抗體能夠激活補(bǔ)體的抗體(包括自然存在的抗體和本領(lǐng)域已知方法所制備出的抗體)是作用于腫瘤或腫瘤抗原的抗體，這些抗體可以激活補(bǔ)體群落中的一個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體成員。換句話說(shuō)就是需要一種能夠充分激活補(bǔ)體并使iC3b沉積在腫瘤細(xì)胞上的抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體是I亞型免疫球蛋白G或III亞型免疫球蛋白G。
本發(fā)明還對(duì)可溶性葡聚糖與抗體的使用進(jìn)行了說(shuō)明，其中可溶性葡聚糖基本上可由任何來(lái)源產(chǎn)生，抗體包括感染所引發(fā)的自然抗體、疫苗所引發(fā)的抗體以及直接使用的單克隆抗體；其中單克隆抗體是療法的一個(gè)組成部分，該療法包括使用β-葡聚糖。任何具有激活補(bǔ)體特性的抗體都可被本文所述的方法用來(lái)增強(qiáng)β-葡聚糖的殺滅腫瘤活性。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可對(duì)鼠性抗體進(jìn)行升級(jí)，使用其能夠抵抗與贅生(腫瘤)細(xì)胞相關(guān)的抗原。在這一方面，腫瘤細(xì)胞表達(dá)著數(shù)量較多的各種各樣的分子受體，這些分子能夠提高自身的增殖，其中許多分子是致癌基因的產(chǎn)物。因此，人們已制備出了許多單克隆抗體，這些單克隆抗體可以抵抗諸如移動(dòng)蛋白、白細(xì)胞間素-2以及表皮生長(zhǎng)因子這些蛋白的受體。任何有選擇性地對(duì)抗原進(jìn)行跟蹤并能激活補(bǔ)體的抗體在與β-葡聚糖共同使用時(shí)都能使自身的活性得到增強(qiáng)。這些抗體包括各種類(lèi)型的抗體，比如免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E和免疫球蛋白M，還包括諸如Fab這樣的抗體片段。
正如本文所用的，“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子中具有免疫活性的部分，比如含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子中具有免疫活性的部分，其中的抗原結(jié)合位點(diǎn)專門(mén)與腫瘤抗原相結(jié)合。專門(mén)與腫瘤相結(jié)合的分子是與腫瘤多肽或腫瘤片段相結(jié)合的分子，但基本上不與生物試樣中的其他分子相結(jié)合，其中生物試樣中含有天然多肽類(lèi)物質(zhì)。免疫球蛋白分子中具有免疫活性的部分包括F(ab)和F(ab’)2片段，使用諸如胃蛋白酶這樣的酶對(duì)抗體進(jìn)行處理可產(chǎn)生F(ab)和F(ab’)2片段。正如本文所使用的，“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指抗體分子群落，這些抗體分子只含有一種抗原結(jié)合位點(diǎn)，該抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠與腫瘤靶目標(biāo)的某一特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)。因此，單克隆抗體組合物通常對(duì)本發(fā)明中的特定多肽類(lèi)物質(zhì)具有單一的結(jié)合親和力，單克隆抗體組合物與特定的多肽類(lèi)物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)。
按照本文前面所述，通過(guò)對(duì)適當(dāng)?shù)膫€(gè)體使用所需的免疫源進(jìn)行免疫接種可以制備出多克隆抗體，比如使用本發(fā)明中的多肽類(lèi)物質(zhì)或多肽類(lèi)物質(zhì)的片段作為免疫源?？贵w在一段時(shí)期內(nèi)在免疫個(gè)體中的效價(jià)可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，比如使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定發(fā)對(duì)抗體的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。如果需要，作用于多肽類(lèi)物質(zhì)的抗體分子可以從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái)(比如從血液中分離出來(lái))并采用已知的技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的提純，比如使用蛋白A色譜儀進(jìn)行提純，從而得到免疫球蛋白G。在實(shí)施免疫接種后的適當(dāng)時(shí)間，即抗體效價(jià)處于最高時(shí)，可從個(gè)體獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從這些細(xì)胞制備單克隆抗體，其中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)、人類(lèi)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人在《當(dāng)代免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，472)、EB病毒-雜交瘤技術(shù)(Cole等人所著《單克隆抗體和癌癥療法》(1985)，77-96頁(yè))或三源雜交瘤技術(shù)。(見(jiàn)Kohler和Milstein在《自然》上發(fā)表的文章，256495-497)。產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的技術(shù)(見(jiàn)Coligan等人編輯的《當(dāng)代免疫學(xué)規(guī)程》)。簡(jiǎn)單而言，無(wú)限增殖細(xì)胞系(通常是骨髓瘤細(xì)胞)與上述接受過(guò)免疫接種的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常是脾細(xì)胞)相融合，對(duì)得到的雜交瘤細(xì)胞中的上層培養(yǎng)物進(jìn)行篩分，從而識(shí)別能夠產(chǎn)生與本發(fā)明中多肽類(lèi)物質(zhì)相結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤。
為了制備能與本發(fā)明中多肽類(lèi)物質(zhì)相結(jié)合的單克隆抗體，可以使用多種眾所周知的方法使淋巴細(xì)胞與無(wú)限增殖細(xì)胞系相融合(見(jiàn)《當(dāng)代免疫學(xué)規(guī)程》、Galfre等人在《自然》是發(fā)表的文章，1977，26655052、R.H.Kenneth所著的《單克隆抗體生物分析中的新課題》，Plenum出版公司，紐約(1980)、Lerner在《耶魯生物醫(yī)藥雜志》上發(fā)表的文章，54387-402)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解，對(duì)這些方法可以進(jìn)行各種各樣的修改，修改后的方法同樣可以使用。
除了制備可分泌單克隆抗體的雜交瘤這種途徑外，能與本發(fā)明中肽類(lèi)物質(zhì)相結(jié)合的單克隆抗體可通過(guò)使用多肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)重組體組合免疫球蛋白文庫(kù)(比如抗體噬菌體展示文庫(kù))進(jìn)行篩選被識(shí)別和分離出來(lái)，通過(guò)這一篩選過(guò)程可將能與多肽類(lèi)物質(zhì)相結(jié)合的免疫球蛋白庫(kù)成員分離出來(lái)。通過(guò)商業(yè)渠道可購(gòu)得生成和篩選噬菌體展示文庫(kù)所用的器具(比如藥用重組體噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01；Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示器具，目錄號(hào)240612)。此外，在以下文獻(xiàn)可以找到特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)所用的方法和試劑5,223,409號(hào)美國(guó)專利、WO92/18619號(hào)PCT出版物、WO91/17271號(hào)PCT出版物、WO92/20791號(hào)PCT出版物、WO92/15679號(hào)PCT出版物、WO93/01288號(hào)PCT出版物、WO92/01047號(hào)PCT出版物、WO92/09690號(hào)PCT出版物、WO92/02809號(hào)PCT出版物、Fuchs等人在《生物技術(shù)》上發(fā)表的文章，91370-1372、Hay等人所著的《人類(lèi)抗體雜交瘤》，381-85、Huse等人在《科學(xué)》上發(fā)表的文章，2461275-1281、Griffiths等人在《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》上發(fā)表的文章，12725-734。
此外，重組體抗體，例如嵌合抗體和人源化單克隆抗體既含有人源部分也含有非人源部分，使用標(biāo)準(zhǔn)的重組體DNA技術(shù)可制造出重組體抗體，重組體抗體在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。使用本領(lǐng)域所知的重組體DNA技術(shù)可制備出嵌合抗體和人源化單克隆抗體。
為了表明本發(fā)明的概念，諸如可溶性葡聚糖這樣的β-葡聚糖可以與HerceptinTM共同使用，從而達(dá)到協(xié)同療效；HerceptinTM是Genentech公司出售的一種單克隆抗體，該抗體用來(lái)治療乳房癌。HerceptinTM是一種能夠識(shí)別her2細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，在乳房癌細(xì)胞類(lèi)型中有20％存在her2細(xì)胞表面抗原。臨床試驗(yàn)表明，HerceptinTM可以挽救生命，但同β-葡聚糖共同使用可以顯著增強(qiáng)其療效。在治療過(guò)程中共同使用可溶性葡聚糖和HerceptinTM可以使對(duì)HerceptinTM療法有響應(yīng)的婦女人數(shù)顯著增加，并使這些婦女的乳房癌得到長(zhǎng)期持續(xù)的緩解。目前，在接受HerceptinTM療法的婦女中只有15％表現(xiàn)出了長(zhǎng)期持續(xù)的緩解。
β-葡聚糖可增強(qiáng)其活性的另一種單克隆抗體是美羅華，該單克隆抗體被用來(lái)治療某一類(lèi)型的非何杰氏淋巴瘤，這是一種免疫系統(tǒng)癌癥。美羅華可有效在治療患有輕度B細(xì)胞非何杰氏淋巴瘤的患者，這類(lèi)患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的治療方法沒(méi)有反應(yīng)。B細(xì)胞非何杰氏淋巴瘤的破壞目標(biāo)是已經(jīng)發(fā)生變換的白細(xì)胞(B細(xì)胞)，從而導(dǎo)致癌癥的生長(zhǎng)。美羅華是經(jīng)過(guò)基因改造的鼠源性抗體，該抗體既含有人源性組分又含有鼠源性組分，在對(duì)166名患有早期輕度或生長(zhǎng)緩慢的非何杰氏淋巴瘤患者的臨床研究中，接受美羅華治療的患者中有48％患者的腫瘤至少減退了一半，另有6％患者的腫瘤完全消退了。β-葡聚糖被認(rèn)為可以明顯增強(qiáng)這一療法的療效，β-葡聚糖可以促進(jìn)抗體標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的滅亡。
劑型及使用可溶性葡聚糖和激活補(bǔ)體的抗體可順序給藥、同時(shí)給藥或分次給藥。此外，給藥的次序可以互換，抗體可以是自然存在的抗體。
適用于本發(fā)明的口服劑型包括膠囊、凝膠劑、扁膠囊、片劑、泡騰粉劑、泡騰片劑、非泡騰粉劑、非泡騰片劑、粉劑或顆粒劑、水合溶液、水合懸浮液、非水合溶液、非水合懸浮液、水包油乳液或油包水乳液。本發(fā)明中的化合物還可以以大丸劑、藥糖劑或膏劑形式存在。
一般而言，這些劑型是通過(guò)活性成分與液相載體或細(xì)微的固相載體或同時(shí)與固、液相載體均勻混合后再進(jìn)行必要的成形加工而制得的。藥物載體是根據(jù)所選的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥方法而選定的。每種載體在與制劑中其他成分相兼容的方面上必須是“可接受的”，而且載體絕對(duì)不能對(duì)個(gè)體造成傷害。載體可以是固相載體或液相載體，具體的載體類(lèi)型一般根據(jù)所選用的給藥類(lèi)型而定。具體適用的固相載體包括乳糖、蔗糖、凝膠、瓊脂和整裝粉劑。具體適用的液相載體包括水、藥理上可接受的脂肪和油類(lèi)物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)或其他有機(jī)溶劑、其中包括酯類(lèi)物質(zhì)、乳液、糖漿或酏劑、懸浮液、溶液和/或懸浮液、由非泡騰顆粒再造的溶液和/或懸浮液以及由泡騰顆粒再造的泡騰制劑。這些液相載體可含有適用的溶劑、防腐劑、乳化劑、懸浮劑、稀釋劑、甜味劑、增稠劑和熔化劑。優(yōu)選的載體為食用油，比如玉米或蕓苔油。聚乙烯醇也是比較理想的載體。
口服給藥所用的劑型可含有無(wú)毒的、藥理上可接受的惰性載體，比如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇、山梨醇、環(huán)糊精、環(huán)糊精衍生物等。
膠囊和片劑易于制造并易于吞咽或咀嚼。片劑可含有適當(dāng)?shù)妮d體、粘合劑、潤(rùn)滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑、引流或熔化劑。片劑可通過(guò)壓制或模制而制成，可以選擇的是，片劑可與一種或多種輔劑制在一起。壓制的片劑可通過(guò)將自由流體形式(比如粉未、顆粒)的活性成分?jǐn)D壓成形而制得?？梢赃x擇的是，自由流動(dòng)形式的活性成分可以與粘合劑(比如凝膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(比如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素)、表面活性劑或分散劑混合在一起。適用的粘合劑包括淀粉、凝膠、諸如葡萄糖或β-乳糖這樣的天然糖類(lèi)物質(zhì)、玉米甜味劑、諸如阿拉伯膠、西黃芪樹(shù)膠或海藻酸鈉這樣的天然膠質(zhì)和合成膠質(zhì)、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、蠟質(zhì)物質(zhì)等?？梢杂糜谄瑒┑臐?rùn)滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤(rùn)土、黃胞膠等。模壓成形的片劑可通過(guò)在適當(dāng)?shù)臋C(jī)械中將惰性稀釋液濕潤(rùn)的活性成分粉未壓模成形而制得。
可以選擇的是，片劑還可以加上包衣和標(biāo)記，并可以制成緩慢釋放活性成分的劑型或受控釋放活性成分的劑型。此外，還可以在片劑上加上腸溶包衣，從而在胃部以外的消化道中釋放藥物成分。
藥理上可接受的具體載體和制備本發(fā)明中口服劑型所用的賦形劑在3,903,297號(hào)美國(guó)專利中有所說(shuō)明，該專利于1975年9月2日被授予Robert，該專利在此通過(guò)引證被并入本文。下列文獻(xiàn)對(duì)制造本發(fā)明藥劑所用的技術(shù)和材料進(jìn)行了說(shuō)明《7Modem Pharmaceutics》的第9、10章(Banker和Rhodes編輯，1979)、Lieberman等人所著的《藥劑形式片劑》(1981)以及Ansel所著的《藥劑形式導(dǎo)論》(第2版，1976)。
適合全身給藥的劑型包括水合劑型和非水合劑型，這些劑型與給藥對(duì)象的血液具有相同的張力，適合全身給藥的劑型還包括水合無(wú)菌懸浮液和非水合無(wú)菌懸浮液，這些懸浮液包括的懸浮系統(tǒng)可使懸浮液中的化合物以血液成分為目標(biāo)或以一個(gè)或多個(gè)器官為目標(biāo)。這些制劑可存放在單劑量或多劑量密封容器中，比如存放于安瓿瓶或玻璃瓶中。從無(wú)菌粉未、顆粒以及前面所述的片劑可以制備出現(xiàn)用的注射溶液和懸浮液。全身給藥劑型和靜脈注射劑還可以包括礦物質(zhì)和其他物質(zhì)，從而使這些劑型與注射類(lèi)型或所選的釋藥系統(tǒng)相適應(yīng)。
本文所引述的所有文獻(xiàn)在些通過(guò)引證被并入本文?，F(xiàn)在將通過(guò)下面的實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，這些實(shí)例并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實(shí)例CR3在β-葡聚糖的抗腫瘤活性中發(fā)揮著非常重要的作用。通過(guò)對(duì)iC3b調(diào)理過(guò)的酵母的中性粒細(xì)胞吞噬作用機(jī)理進(jìn)行研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CR3的作用在于介導(dǎo)對(duì)β-葡聚糖的反應(yīng)。當(dāng)iC3b附著在某一表面上時(shí)，它可以被血清蛋白剪切下來(lái)，從而形成更小的iC3b片段。當(dāng)iC3b處于“失活”狀態(tài)時(shí)，iC3b不能形成攻擊膜的絡(luò)合物，但iC3b仍然附著在表面上，此時(shí)iC3b的作用是吸引中粒性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，這兩種細(xì)胞可以吞噬可破壞被標(biāo)記(“調(diào)理過(guò)的”)細(xì)胞。在中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面存在著補(bǔ)體受體(CR3)，該補(bǔ)體受體與iC3b相結(jié)合。圖1表明了酵母被免疫系統(tǒng)消滅的過(guò)程。
刺激CR3依賴性吞噬作用或脫粒作用需要CR3內(nèi)兩個(gè)不同的位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生連接作用；一個(gè)位點(diǎn)專門(mén)與iC3b相連，另一個(gè)位點(diǎn)專門(mén)與酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖相連。正如圖2所示的，由于酵母在細(xì)胞表面上缺乏能與CR3相結(jié)合的β-葡聚糖，所以經(jīng)過(guò)iC3b調(diào)理過(guò)的酵母菌通過(guò)CR3與中性粒細(xì)胞相結(jié)合，但不會(huì)刺激吞噬作用或脫粒作用。然而，正如圖3所示的，所加入的β-葡聚糖可以與CR3的凝集素位點(diǎn)相結(jié)合，從而激活帶有受體的免疫細(xì)胞，并由此觸發(fā)外源性物質(zhì)的脫粒作用或吞噬作用。甘露聚糖中富含可溶性的由酵母多聚衍生出的多糖，β-葡聚糖與CR3具有較高的親和力，β-葡聚糖誘導(dǎo)受體的啟動(dòng)。
圖4表明的是在iC3b調(diào)理過(guò)的乳房癌細(xì)胞觸發(fā)細(xì)胞毒性過(guò)程中β-葡聚糖對(duì)鼠源性中性粒細(xì)胞CR3的誘導(dǎo)作用。當(dāng)使用正常的中性粒細(xì)胞時(shí)，加入β-葡聚糖會(huì)產(chǎn)生針對(duì)iC3b調(diào)理過(guò)的乳房腫瘤細(xì)胞較高的細(xì)胞毒性。然而，當(dāng)加入CD11b(鼠源性CR3的等效物)的抗體時(shí)，受體與iC3b相結(jié)合的能力受到了干擾，所以這種細(xì)胞毒性便消失了。在圖4右側(cè)表明的是，即使當(dāng)使用β-葡聚糖進(jìn)行刺激時(shí)，缺乏CD-11b小鼠的中性粒細(xì)胞也不能介導(dǎo)iC3b調(diào)理過(guò)小鼠的細(xì)胞毒性，這再次表明了該受體的重要性。正如所預(yù)料的，加入抗CD11b抗體對(duì)缺乏CD11b的中性粒細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響。
圖5表明的是腫瘤細(xì)胞被免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3所包裹。這一點(diǎn)十分有意義，因?yàn)樗砻鬟m應(yīng)性免疫系統(tǒng)對(duì)這些腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了微弱的反應(yīng)，并且當(dāng)這種現(xiàn)象可用來(lái)觸發(fā)細(xì)胞毒性反應(yīng)時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)可得到抑制或消除。流式細(xì)胞儀被用來(lái)區(qū)分乳房腫瘤細(xì)胞和正常的乳房表皮細(xì)胞，并表明大多數(shù)腫瘤細(xì)胞帶有免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3。研究人員對(duì)取自兩個(gè)患者的新鮮腫瘤的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行了分析。圖5表明的是從一位患者身上取下的腫瘤所得到的結(jié)果。通過(guò)使用生物素化抗粘蛋白-維生素H單克隆抗體BrE-3進(jìn)行染色來(lái)區(qū)分惡性細(xì)胞和正常的乳房表皮細(xì)胞。通過(guò)使用與異硫氰酸熒光素相連的抗體進(jìn)行雙重染色來(lái)確定MUC1呈陽(yáng)性的惡性細(xì)胞上存在免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3。正如可以看到的，大多數(shù)MUC1陽(yáng)性細(xì)胞帶有免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3。只有很少部分MUC1陽(yáng)性細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生C3調(diào)理作用。在MUC1陰性細(xì)胞上幾乎沒(méi)有出現(xiàn)C3或免疫球蛋白染色，這代表著正常乳房表皮細(xì)胞。
在本發(fā)明中，不同形式的β-葡聚糖對(duì)免疫系統(tǒng)具有不同的協(xié)同效應(yīng)。免疫細(xì)胞通過(guò)CR3對(duì)可溶性β-葡聚糖和顆粒型β-葡聚糖作出響應(yīng)。然而，對(duì)于這兩種不同形式的β-葡聚糖而言，這種響應(yīng)也是不同的。CR3在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和某些T細(xì)胞中表達(dá)?？扇苄驭?葡聚糖(比如可溶性葡聚糖)與CR3相結(jié)合并按某種方式啟動(dòng)iC3b受體，在這種方式下，β-葡聚糖能夠啟動(dòng)白細(xì)胞來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞或被CR3靶配體iC3b所包圍的微生物。另一方面，顆粒型β-葡聚糖(比如全葡聚糖顆粒)也可與CR3相結(jié)合，刺激中性細(xì)胞的脫粒作用并刺激巨噬細(xì)胞分泌幾種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子會(huì)促進(jìn)Th1型T細(xì)胞反應(yīng)并促進(jìn)對(duì)腫瘤或微生物的長(zhǎng)期免疫力。顆粒型β-葡聚糖還可在體外和體內(nèi)啟動(dòng)CR3，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
天然殺傷細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，天然殺傷細(xì)胞通過(guò)Fas配體或通過(guò)形成MAC絡(luò)合物并插入誘導(dǎo)脫噬作用的酶來(lái)刺激脫噬作用，從而殺死腫瘤細(xì)胞。天然殺傷細(xì)胞通過(guò)瞄準(zhǔn)由于腫瘤作用或病毒作用而失去MHC蛋白的細(xì)胞而恢復(fù)巨噬細(xì)胞的活性。對(duì)于天然細(xì)胞的CR3依賴型細(xì)胞毒性而言，還需要與目標(biāo)細(xì)胞相結(jié)合的CR3。圖6表明的是對(duì)從12個(gè)患者身上新取下的腫瘤進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果，通過(guò)這些試驗(yàn)確定腫瘤細(xì)胞是否帶有足夠數(shù)量的C3，其中帶有可溶性酵母多糖啟動(dòng)過(guò)的CR3的天然殺傷細(xì)胞在識(shí)別腫瘤細(xì)胞和產(chǎn)生細(xì)胞毒性時(shí)需要足夠數(shù)量的C3。使用鉻51對(duì)新鮮的有活性的腫瘤細(xì)胞懸浮液進(jìn)行示蹤，并對(duì)該懸浮液受天然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響程度進(jìn)行測(cè)試，其中的天然殺傷細(xì)胞是從正常的不相關(guān)的個(gè)體身體上取得的，并在37℃下經(jīng)過(guò)4小時(shí)的培養(yǎng)。在可溶性酵母多糖中加入β-葡聚糖可有力地加強(qiáng)天然殺傷細(xì)胞的活性。雖然在未被激活的天然殺傷細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，但使用2.0微克/毫升的可溶性酵母多糖對(duì)天然殺傷細(xì)胞進(jìn)行處理可使天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性從32％上升到了54％。隨腫瘤細(xì)胞一同被取下的正常乳房表皮細(xì)胞的存在可能會(huì)阻止細(xì)胞毒性達(dá)到較高的水平，其中正常的乳房表皮細(xì)胞是C3陰性細(xì)胞。
圖7表明的是β-葡聚糖療法的療效，該圖表明了β-葡聚糖療法對(duì)Balb/c小鼠的Ptas64乳腺癌進(jìn)行治療的結(jié)果。在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中可溶性酵母多糖m(β-甘露多糖中富含的可溶性酵母多糖)被用作β-葡聚糖的來(lái)源。Ptas64乳腺癌被植入到Balb/c小鼠體內(nèi)。在6次實(shí)驗(yàn)中，每次實(shí)驗(yàn)室用兩組小鼠，每組由6只小鼠組成。在每次實(shí)驗(yàn)中，每天通過(guò)腹膜內(nèi)注射或靜脈注射方式對(duì)兩組小鼠使用200微克的可溶性酵母多糖(可溶性酵母多糖m)。由6只小鼠組成的對(duì)照組每天通過(guò)靜脈注射方式接受磷酸鹽緩沖鹽水。使用可溶性酵母多糖m對(duì)30只小鼠進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，然后再使用不含LPS的可溶性酵母多糖m對(duì)另外90只小鼠進(jìn)行三次同樣的實(shí)驗(yàn)。在每次實(shí)驗(yàn)后測(cè)定治療組小鼠的平均腫瘤重量，并與對(duì)照組小鼠的平均腫瘤重量進(jìn)行比較。圖7中的每根棒圖代表的是每個(gè)治療組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。正如可以看到的，對(duì)于腹膜內(nèi)注射β-葡聚糖和靜脈注射β-葡聚糖的情況而言，腫瘤重量分別急劇減少到了原重量的4％和10％。此外，在使用不含LPS的可溶性酵母多糖m所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，由于LPS的原因沒(méi)有出現(xiàn)腫瘤消退現(xiàn)象，LPS是一種眾所周知的免疫促進(jìn)劑。
圖8表明的是β-葡聚糖療法既需要腫瘤細(xì)胞上帶有C3同時(shí)也需要白細(xì)胞帶有CR3。使用植入MMT乳腺癌細(xì)胞并缺乏C3的129/J小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)β-葡聚糖療法需要C3。在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，在12只正常(C3+/+)的129/J小鼠和12只缺乏C3的129/J小鼠體內(nèi)植入MMT乳腺癌細(xì)胞系，在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了可察覺(jué)到的癌腫后對(duì)小鼠進(jìn)行治療，每組小鼠由6只小鼠組成，一組小鼠通過(guò)每天靜脈注射磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行治療，另一組小鼠通過(guò)每天靜脈注射β-葡聚糖進(jìn)行治療。使用同樣的方法對(duì)植入Ptas64乳腺腫瘤細(xì)胞的正常(CD+/+)小鼠和乏CD3(沒(méi)有CD//b，CD//b-/-)的Balb/c小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。正如圖中所示的，β-葡聚糖療法可使正常129/J小鼠體內(nèi)的腫瘤減少79％，這與正常Blab/c小鼠的結(jié)果是相似的。對(duì)腫瘤進(jìn)行的流式細(xì)跑測(cè)定表明，在80％以上的腫瘤細(xì)跑上沉積有大量的C3。相比之下，在缺乏C3的129/J小鼠中腫瘤沒(méi)有出現(xiàn)明顯的減小，腫瘤細(xì)胞上沒(méi)有C3。腫瘤細(xì)胞上存在的免疫球蛋白G的相對(duì)數(shù)量在正常小鼠和缺乏C3的小鼠間并無(wú)差別，通過(guò)染色測(cè)試可以證實(shí)這一點(diǎn)。
下一步是要證明β-葡聚糖可用來(lái)增強(qiáng)單克隆療法的療效。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖9中表明，該圖表明了β-葡聚糖可以增強(qiáng)抗腫瘤的單克隆抗體對(duì)肝臟EL-4淋巴瘤的療效。之所以測(cè)試EL-4淋巴瘤對(duì)β-葡聚糖療法的響應(yīng)是因?yàn)檫@種腫瘤與其他腫瘤不同，該同系基因型宿主(C57BL/6)并不表達(dá)天然抗體，其他的天然抗體使用C3調(diào)理腫瘤細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)靜脈注射方式向小鼠體內(nèi)注入EL-4細(xì)胞，這是導(dǎo)致肝臟發(fā)生同質(zhì)蛻變的已知方法。在注入EL-4細(xì)胞10天后，每天通過(guò)靜脈注射方式對(duì)小鼠使用β-葡聚糖、抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂(EL-4細(xì)胞的主要腫瘤抗原)的3F8單克隆抗體或β-葡聚糖加3F8單克隆抗體。3F8單克隆抗體是免疫球蛋白G3，該抗體是強(qiáng)力的補(bǔ)體激活劑，該抗體還調(diào)節(jié)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。正如其他實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明的，單獨(dú)使用3F8就可使EL-4肝臟腫瘤得到明顯的退化(減小73.5％)。正如所預(yù)料的，由于腫瘤細(xì)胞帶有很少iC3b或沒(méi)有iC3b，所以單獨(dú)使用β-葡聚糖幾乎沒(méi)有效果。然而，同單獨(dú)使用3F8相比，聯(lián)合使用β-葡聚糖和3F8可使肝臟腫瘤出現(xiàn)更顯著的消退。
圖10表明的是大麥產(chǎn)生的β-葡聚糖(大麥通常產(chǎn)生(1，3)，(1，4)-β-D-葡聚糖)也可以增強(qiáng)單克隆抗體的抗腫瘤活性。通過(guò)皮下異種嫁接方式在無(wú)胸腺Balb/c小鼠體內(nèi)植入成神經(jīng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞。每5只小鼠組成一組，在植入腫瘤細(xì)胞2周后當(dāng)腫瘤的直徑達(dá)到0.7～0.8厘米時(shí)開(kāi)始進(jìn)行治療。在使用β-葡聚糖進(jìn)行治療的小組中，每天口服400微克的β-葡聚糖，治療期為21～29天。單克隆抗體(3F8)通過(guò)靜脈注射方式給藥，用藥量為每周2次，每次200微克。從治療的第一天開(kāi)始測(cè)量腫瘤的大小。所測(cè)得的最大直徑被表達(dá)為第零天腫瘤直徑的百分?jǐn)?shù)。正如可以看到的，無(wú)論是單獨(dú)使用β-葡聚糖還是單獨(dú)使用單克隆抗體都沒(méi)有取得較大的效果。然而，當(dāng)β-葡聚糖和單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)得到了明顯的抑制。
表1.蔗糖和中性粒細(xì)胞被異硫氰酸熒光素示蹤多糖熒光染色的CR3特性
表1所表明的是各種來(lái)源的β-葡聚糖的蔗糖特異性，同時(shí)還表明了流式細(xì)胞測(cè)定儀對(duì)各種純?chǔ)?葡聚糖-異硫氰酸熒光素制劑的測(cè)定結(jié)果。右旋糖酐-異硫氰酸熒光素和α-甘露多糖-異硫氰酸熒光素沒(méi)有出現(xiàn)特異性染色。即使每種多糖-異硫氰酸熒光素制劑所產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞染色強(qiáng)度比可溶性酵母多糖-異硫氰酸熒光素的染色強(qiáng)度低，每種多糖-異硫氰酸熒光素的熒光性也同樣受到過(guò)量未蹤同源β-葡聚糖、未示蹤的可溶性酵母多糖或抗CR3的抑制。對(duì)達(dá)到最大染色程度所需的多糖濃度進(jìn)行的比較表明，由于可溶性酵母多糖或MPβ-葡聚糖(從分子探針得到的可溶性β-葡聚糖)中任何一個(gè)達(dá)到飽和狀態(tài)需要濃度為2微克/毫升的己糖，所以可溶性酵母多糖和MPβ-葡聚糖具有最強(qiáng)的親和力。由于異硫氰酸熒光素與多糖的摩爾比有可能發(fā)生變化，并且不容易通過(guò)計(jì)算得到，所以單獨(dú)多糖-異硫氰酸熒光素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度值無(wú)法進(jìn)行比較。
對(duì)可溶性酵母多糖-異硫氰酸熒光素染色程度抑制50％所需β-葡聚糖濃度進(jìn)行比較可以得出CR3對(duì)可溶性酵母多糖的親和力比β-葡聚糖對(duì)可溶性酵母多糖的親和力高。中性粒細(xì)胞在4℃和不同濃度的β-葡聚糖(可溶性酵母多糖、昆布多糖、MPβ-葡聚糖、大麥β-葡聚糖和蘑菇多糖)、α-甘露多糖或右旋糖酐條件下培養(yǎng)15分鐘，然后加入1.0毫克/毫升的可溶性酵母多糖-異硫氰酸熒光素進(jìn)行染色，然后再在4℃下培養(yǎng)15分鐘。然后對(duì)抑制百分?jǐn)?shù)和多糖濃度進(jìn)行比較。雖然將可溶性酵母多糖-異硫氰酸熒光素染色程度抑制50％需要0.2微克/毫升的己糖，但未示蹤的β-葡聚糖要將可溶性酵母多糖-異硫氰酸熒光素染色程度抑制50％需要5毫克/毫升的己糖(MPβ-葡聚糖或昆布多糖)到75微克/毫升的己糖(蘑菇多糖)。當(dāng)對(duì)相同的未示蹤多糖抑制昆布多糖β-葡聚糖-異硫氰酸熒光素染色進(jìn)行測(cè)試時(shí)可以得到相似的結(jié)果。在兩個(gè)試驗(yàn)中抑制活性的排位的是可溶性酵母多糖＞昆布多糖＞MPβ-葡聚糖。然而，CMβ-葡聚糖(從酵母得到的羧甲基β-葡聚糖)、大麥β-葡聚糖和蘑菇多糖抑制昆布多糖-異硫氰酸熒光素染色的效率高于其抑制可溶性酵母多糖-異硫氰酸熒光素染色的效率?？傊?，這些結(jié)果表明大麥β-葡聚糖對(duì)CR3的親和力相對(duì)低于可溶性酵母MPβ-葡聚糖或可溶性酵母多糖對(duì)CR3的親和力。
正如表1所示的，大麥β-葡聚糖對(duì)CR3的親和力低于酵母β-葡聚糖對(duì)CR3的親和力。圖11表明了酵母β-葡聚糖和大麥β-葡聚糖在單獨(dú)使用時(shí)和與抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)這兩種β-葡聚糖抗腫瘤效果的比較結(jié)果，其中GD2神經(jīng)節(jié)苷脂是RMA-S淋巴瘤表達(dá)的腫瘤抗原?？扇苄云暇厶堑挠盟巹┝繛?0毫克/公斤，大麥β-葡聚糖的用藥劑量為60毫克/公斤。結(jié)果表明，單獨(dú)使用可溶性葡聚糖比單獨(dú)使用大麥β-葡聚糖更有效。可溶性葡聚糖的單位重量效率明顯更高。當(dāng)與單克降抗體聯(lián)合使用時(shí)，可溶性葡聚糖還能更快地抑制腫瘤，可溶性葡聚糖比大麥β-葡聚糖早5天使腫瘤的直徑減小到2毫米。對(duì)使用抗GD2單克隆抗體和可溶性葡聚糖β-葡聚糖進(jìn)行治療的小鼠進(jìn)行目測(cè)觀察還可發(fā)現(xiàn)在接受B5非特異性單克隆抗體治療的對(duì)比小鼠間存在著較大的差別。雖然對(duì)比小鼠長(zhǎng)出了大的致死性腫瘤，但使用可溶性葡聚糖和單克隆抗體治療的小鼠只有很小的腫瘤，或者未出現(xiàn)腫瘤，其中50％的小鼠可以長(zhǎng)期存活。綜合來(lái)看，這些結(jié)果表明可溶性葡聚糖比大麥β-葡聚糖具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
然后使用靜脈注射單克隆抗體和口服各種濃度的全葡聚糖顆?；蛲ㄟ^(guò)靜脈注射單克隆抗體和靜脈注射可溶性葡聚糖對(duì)患乳腺癌的Blab/c小鼠進(jìn)行治療，從而確定這兩種組合給藥方式在體內(nèi)產(chǎn)生的相對(duì)活性，圖12表明了治療結(jié)果。從圖12中可以看出，無(wú)論是采用口服給藥方式還是采用靜脈注射給藥方式，可溶性葡聚糖和全葡聚糖顆粒都有效?？扇苄云暇厶呛腿暇厶穷w粒的效力大致相似，相對(duì)于其他全葡聚糖顆粒劑量而言，口服400微克全葡聚糖顆粒達(dá)到的活性最高。對(duì)小鼠的目測(cè)觀察也證實(shí)了這些結(jié)果。在接受單克隆11C1靜脈注射的對(duì)比小鼠中，腫瘤的直徑約為9毫米。在接受單克隆抗體11C1靜脈注射和可溶性葡聚糖靜脈注射的5只小鼠中，有4只小鼠沒(méi)有出現(xiàn)可見(jiàn)的腫瘤。在接受單克隆抗體11C1靜脈注射外加每天口服200微克全葡聚糖顆粒的小鼠中，腫瘤大小只是對(duì)照小鼠腫瘤大小的20％，5只小鼠中有2只小鼠幾乎沒(méi)有可見(jiàn)的腫瘤。
天然殺傷細(xì)胞在調(diào)節(jié)宿主抵抗力方面的作用包括直接殺滅腫瘤細(xì)胞和分泌諸如腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ這樣的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以潛在地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及補(bǔ)充殺滅腫瘤的巨噬細(xì)胞。雖然通過(guò)激活CR3可以調(diào)節(jié)天然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤的直接殺滅毒性，但其他的研究表明激活CR3也可觸發(fā)細(xì)胞因子的分泌。為證實(shí)這一點(diǎn)，研究人員進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，圖13表明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖13表明了β-葡聚糖對(duì)天然殺傷細(xì)胞分泌腫瘤細(xì)胞壞死因子-α的CR3依賴性刺激。人類(lèi)天然殺傷細(xì)胞或者使用顆粒狀酵母β-葡聚糖或使用可溶性CR3結(jié)合多糖在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)。然后使用聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行了分析。顆粒狀酵母β-葡聚糖(2微克/毫升)和灰樹(shù)花多糖(由多葉奇果菌產(chǎn)生的500Kda可溶性β-葡聚糖，2微克/毫升)能夠與表面CR3分子上的凝集素位點(diǎn)相結(jié)合和形成交聯(lián)，從而激活細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞間素-6(未在圖中表明)。相比之下，小的(20KDa)可溶性酵母β-葡聚糖(MPβ-葡聚糖，2.0微克/毫升)和可溶性酵母多糖(含有β-低甘露聚糖和/或β-葡聚糖的可溶性酵母多糖制劑，2.0微克/毫升)只與單個(gè)的CR3分子相結(jié)合，在缺乏靶細(xì)胞的情況下不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的因子的釋放。與天然殺傷細(xì)胞CR3依賴型細(xì)胞毒性一樣，小β-葡聚糖與CR3的結(jié)合可導(dǎo)致受體的啟動(dòng)，受體的啟動(dòng)是此后釋放細(xì)胞因子所需的條件，與iC3b調(diào)理過(guò)的靶細(xì)胞(使用iC3b-“+EC3b”調(diào)理過(guò)的羊體紅細(xì)胞)形成配位連接可觸發(fā)細(xì)胞因子的釋放。EC3bi靶細(xì)胞在缺乏多糖啟動(dòng)作用的情況下不會(huì)觸發(fā)天然殺傷細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。在多糖啟動(dòng)CR3之后，與iC3b靶細(xì)胞形成配位連接可誘導(dǎo)天然殺傷細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ干擾素-α和白細(xì)胞間素-6。加入濃度為5毫克/毫升的抗CD11b單克隆抗體可阻止天然殺傷細(xì)胞分泌這四種細(xì)胞因子?？笴R3可阻止β-葡聚糖與CR3的結(jié)合，并可阻止經(jīng)過(guò)啟動(dòng)的CR3與EC3bi靶細(xì)胞上的iC3b結(jié)合。
圖3表明了這些結(jié)果，天然細(xì)胞分泌細(xì)胞因子與CR3被激活而產(chǎn)生細(xì)胞毒性是同步發(fā)生的。顆粒型β-葡聚糖可強(qiáng)力觸發(fā)CR3依賴型中性細(xì)胞過(guò)氧化物的爆發(fā)，顆粒型β-葡聚糖同樣會(huì)觸發(fā)天然殺傷細(xì)胞釋放出CR3依賴型細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的分泌不是與CR3的初始啟動(dòng)過(guò)程同時(shí)發(fā)生的，CR3的初始啟動(dòng)過(guò)程是與小型可溶性β-葡聚糖與CR3結(jié)合的過(guò)程同時(shí)進(jìn)行的，在經(jīng)過(guò)β-葡聚糖啟動(dòng)的CR3與iC3b調(diào)理過(guò)的靶細(xì)胞形成交聯(lián)接連所觸發(fā)的CR3激活步驟后，天然殺傷細(xì)胞才分泌細(xì)胞因子。使用EC3bi在介質(zhì)中單獨(dú)培養(yǎng)天然殺傷細(xì)胞并不會(huì)刺激天然殺傷細(xì)胞溶解EC3bi，也不會(huì)觸發(fā)天然殺傷細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。然而，在使用可溶性(或顆粒型)β-葡聚糖啟動(dòng)天然殺傷細(xì)胞的CR3后加入EC3bi，使用聯(lián)免疫吸附測(cè)定法可檢測(cè)到分泌出的腫瘤壞死因子-α、干擾素-α、干擾素-γ和白細(xì)胞間素-6。分泌這些細(xì)胞因子依賴于CR3，因?yàn)楫?dāng)同時(shí)加入靶目標(biāo)EC3bi和CD121b單克隆抗體時(shí)，細(xì)胞因子的分泌會(huì)遭到抑制。
這一數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明了β-葡聚糖在癌癥免疫療法中的成功應(yīng)用。除了當(dāng)經(jīng)過(guò)β-葡聚糖啟動(dòng)過(guò)的天然殺傷細(xì)胞進(jìn)入到iC3b調(diào)理過(guò)的腫瘤細(xì)胞中時(shí)可觸發(fā)細(xì)胞毒性外，這種由iC3b調(diào)理過(guò)的腫瘤細(xì)胞所刺激產(chǎn)生的局部細(xì)胞毒性還伴隨細(xì)胞因子的分泌，但細(xì)胞因子的分泌是局部的，并不是全身性的。這種腫瘤內(nèi)細(xì)胞因子的局部分泌還有助于β-葡聚糖促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞抗源的識(shí)別。雖然不為理論所限制，但這可以解釋使用可溶性葡聚糖和全葡聚糖顆粒所產(chǎn)生的協(xié)同作用，可溶性葡聚糖和全葡聚糖顆?？梢源碳げ煌拿庖呒?xì)胞行為。正如本文前面所述的，形成交聯(lián)以及隨后的細(xì)胞因子分泌需要較大的β-葡聚糖，但較小的β-葡聚糖能夠更有效地通過(guò)CR3結(jié)合來(lái)刺激細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。正如本發(fā)明中的情況一樣，當(dāng)兩種不同的系統(tǒng)受到作用時(shí)，通?？色@得協(xié)同效果，但當(dāng)兩種藥劑作用于同一系統(tǒng)時(shí)，這種累加效果更加普遍。
本發(fā)明的另一重量方面是口服β(1，3)葡聚糖能夠誘導(dǎo)獲得性免疫系統(tǒng)反應(yīng)中Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)變，其中口服β(1，3)葡聚糖使用的是全葡聚糖顆粒。圖14表明了這種轉(zhuǎn)變，該圖表明了患乳腺癌小鼠口服全葡聚糖顆粒時(shí)，腫瘤誘導(dǎo)的Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)變成了Th1反應(yīng)。Th1和Th2變型輔助細(xì)胞在受到刺激時(shí)可釋放出不同的細(xì)胞因子。其中Th1分泌出白細(xì)胞間素-2、干擾素-γ和腫瘤壞死因子；Th2分泌出白細(xì)胞間素-4、白細(xì)胞間素-5和白細(xì)胞間素-10。白細(xì)胞間素-2是Th1細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，而白細(xì)胞間素-4是Th2細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。圖14的第1部分表明的是，在未受到腫瘤細(xì)胞激活時(shí)處于自然狀態(tài)的細(xì)胞。熒光染色可以證實(shí)缺乏CD4+的T細(xì)胞，但這些T細(xì)胞帶有細(xì)胞質(zhì)白細(xì)胞間素-4。然后在小鼠體內(nèi)植入乳腺癌細(xì)胞，并在植入癌細(xì)胞后12天采集小鼠的血樣。這些小鼠的血樣表明小鼠的血液中存在制造白細(xì)胞間素-4的T細(xì)胞，這表明小鼠體內(nèi)存在著Th2免疫反應(yīng)。然后通過(guò)口服全葡聚糖顆粒方式對(duì)小鼠進(jìn)行治療，并在治療2天后再次采集血樣。再次采集的血樣表明白細(xì)胞間素-4已經(jīng)消失，這表明Th2免疫反應(yīng)已轉(zhuǎn)變成Th1免疫反應(yīng)。Th1反應(yīng)是抗腫瘤反應(yīng)，Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變可加強(qiáng)獲得性免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞可以抵御補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，但很容易受到細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞T細(xì)胞反應(yīng)的破壞。
實(shí)例2材料和方法抗體和其他試劑Hiroshi Fugi博士(紐約州Buffalo，Roswell Park癌癥研究院分子免疫學(xué)分部)慷慨地提供了產(chǎn)生雜交瘤的抗小鼠乳房腫瘤病毒11C1免疫球蛋白G2a(見(jiàn)Raychaudhuri S.等人在《免疫學(xué)》雜志上發(fā)表的文章，1371743-1749(1986))。Nai-Kong V.Cheung博士(紐約Sloan-Dettering癌癥中心)慷慨提供了3F8免疫球蛋白G3抗GD神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體(見(jiàn)Saito M.、Yu R.K和Cheung N-K.V.在《生物化學(xué)生物物理研究通訊》上發(fā)表的文章)，該單克隆抗體經(jīng)過(guò)提純處理并存在于無(wú)菌的檸檬酸鹽緩沖鹽水中。Ralph A.Reisfeld博士(加州Scripps臨床研究院)慷慨提供了高純14.G2a免疫球蛋白G2a抗GD2單克隆抗體(見(jiàn)HankJ.A.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，505234-5239，1990，見(jiàn)Uttenreuthetr-Fischer M.和M.Huang等人在《癌癥免疫療法》上發(fā)表的文章，4129-36，1995)以及雜交瘤。Ian F.C.McKenzie(澳大利亞Austin研究院)提供了產(chǎn)生免疫球蛋白G2b抗人類(lèi)MUC1單克隆抗體的BCP8雜交瘤(見(jiàn)Xing P.X.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，522310-2317(1992))。Emil Umanue博士(華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院)提供了產(chǎn)生鼠源性抗鼠類(lèi)粒性白細(xì)胞單克隆抗體RB6-8C5(LY-6G-抗GR-1)(見(jiàn)Hestdal K.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，14722-28，(1991))。分泌鼠源性免疫球蛋白G2a單克隆抗體的B5雜交瘤從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)中獲得。其中鼠源性免疫球蛋白G2a單克隆抗體對(duì)人類(lèi)的高分子量黑色瘤抗原具有特異性。分離出的免疫球蛋白G在小鼠腫瘤療法中被用作“非特異性”單克隆抗體對(duì)照物。每種雜交瘤在1～2％的FCS和BD雜交瘤介質(zhì)中生長(zhǎng)，然后在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，從而生成富含單克隆抗體的培養(yǎng)后介質(zhì)，隨后按硫酸銨沉淀、單-Q快速蛋白液相色譜法和單-S快速蛋白液相色譜法這一順序?qū)慰寺】贵w進(jìn)行提純。提純后的單克隆抗體通過(guò)超濾過(guò)程進(jìn)行消毒，并使用Triton X-114(見(jiàn)Aida Y.和Pabst M.J.等人在《免疫方法》上發(fā)表的文章，132191-195(1990))進(jìn)行萃取而去除可察覺(jué)到的LPS。
羊源性抗鼠體抗體免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和異硫氰酸熒光素示蹤的C3從ICN Biomedicals/Cappell購(gòu)買(mǎi)，這些物質(zhì)被用于使用流式細(xì)胞測(cè)定儀對(duì)免疫球蛋白和經(jīng)過(guò)C3調(diào)理過(guò)的腫瘤細(xì)胞懸浮液的分析?？故篌wCD45-PerCP-Cy5.5、抗鼠體CD80-異硫氰酸熒光素、抗Gr-1-PE、抗鼠體CD11-異硫氰酸熒光素以及正確示蹤的同類(lèi)型對(duì)照物從BD Biosciences Phamingen購(gòu)買(mǎi)。鼠源性抗鼠體F4/80-異硫氰酸熒光素及其同類(lèi)型對(duì)照物從Calrag實(shí)驗(yàn)室獲得。
治療所用的β-葡聚糖可溶性β-葡聚糖制劑被稱為“可溶性酵母多糖”，其大小約在6KD，可溶性酵母多糖由酵母多糖經(jīng)過(guò)甲酸萃取以及前面所述的單-Q快速蛋白液相色譜法而生成(見(jiàn)Xia Y.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1622281-2290(1999))；見(jiàn)Thornton B.P.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1561235-1246(1996)。可溶性酵母多糖被用于本文附圖所示的腫瘤免疫療法中。在其他治療方法中，可溶性β-葡聚糖被稱為NSGTMβ-葡聚糖(中性可溶性葡聚糖)，其大小約在10KD，該葡聚糖是從明尼蘇達(dá)州的生物聚合物工程公司獲得的?？扇苄云暇厶鞘怯擅姘湍秆苌鰜?lái)的，可溶性葡聚糖來(lái)自于Alpha Beta技術(shù)公司幾年前生產(chǎn)出的一批原料，該可溶性葡聚糖與Alpha Beta技術(shù)公司大約7年前通過(guò)分子探針公司銷(xiāo)售的可溶性酵母β-葡聚糖相似。以前的出版物(Vetvicka V.等人在《臨床研究》上發(fā)表的文章，9850-61，XiaY.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1622281-2290(1999)，Thornton B.P.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1561235-1246(1996))對(duì)后一種葡聚糖在毒殺iC3b調(diào)理過(guò)的腫瘤細(xì)胞過(guò)程中與人源性CR3和鼠源性CR3的結(jié)合能力以及啟動(dòng)人源性CR3和鼠源性CR3的能力進(jìn)行了說(shuō)明。
小鼠和腫瘤模型正常的Balb/c和C57BL/6小鼠購(gòu)自于Jackson實(shí)驗(yàn)室或NCI-Frederick公司。缺乏C3的雜種小鼠(C3+/-)購(gòu)自于Jackson實(shí)驗(yàn)室，這些小鼠被用來(lái)建立繁殖種群，從該種群中衍生出缺乏C3的純種小鼠(C3+/-)以及它們的野生型(C3+/+)C57BL/6同胞。缺乏CR3(CD11b-/-)的C57BL/6小鼠(見(jiàn)Coxon A.和Rieu等人在《免疫》上發(fā)表的文章，5553-666，(1996)及其野生型(CD11b+/+)C57BL/6同胞仔的繁殖種群是從TanyaMayadas-Norton博士(波士頓Brigham婦女醫(yī)院和Harnard醫(yī)學(xué)校)獲得的。通過(guò)分別使用定量半徑免疫擴(kuò)散法對(duì)血清C3進(jìn)行分析以及使用免疫熒光染色法和流式細(xì)胞測(cè)定儀對(duì)血液中性粒細(xì)胞CD11b的表達(dá)進(jìn)行分析來(lái)證實(shí)C3-/-和CR3-/-的表型及其同胞小鼠。
Blab/c乳腺癌被稱為Ptas64(或64PT)，這種癌細(xì)胞是從Wei-Zen Wei博士(底特律Karmonos癌癥中心和Wayne州立大學(xué))獲得的。該腫瘤細(xì)胞系表達(dá)小鼠乳房腫瘤病毒(鼠源性乳腺腫瘤病毒)膜抗原，使用11C1單克隆抗體可檢測(cè)到這種膜抗原。以前的研究表明，正常Blab/C小鼠血清中含有自然存在的抗體，這些抗體能與Ptas64發(fā)生反應(yīng)，這些抗體通過(guò)免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和C3來(lái)調(diào)理腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)；以前的研究還表明，靜脈注射11C1單克隆抗體可提高細(xì)胞表面對(duì)免疫球蛋白G和C3的吸收量(見(jiàn)Yan J.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1633045-3052(1990))。在每組由6～8只小鼠組成的四組小鼠的乳腺脂肪墊內(nèi)，通過(guò)皮下注射方式植入1.0×106個(gè)腫瘤細(xì)胞，并使腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)7～10天。當(dāng)使用測(cè)徑器測(cè)得腫瘤的平均長(zhǎng)度和寬度達(dá)到3～4毫米時(shí)開(kāi)始對(duì)小鼠進(jìn)行治療。這四組小鼠包括1)接受磷酸鹽緩沖鹽水靜脈注射和非特異性單克隆抗體靜脈注射的對(duì)比組；2)每隔2天靜脈注射100微升11C1單克隆抗體鹽水溶液的小鼠組；3)每天靜脈注射100微升β-葡聚糖(可溶性葡聚糖，3毫克/毫升)的小鼠組；4)每隔2天靜脈注射11C1單克隆抗體同時(shí)每天注射β-葡聚糖的小鼠組。每隔2天對(duì)腫瘤的大小進(jìn)行一次測(cè)量，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到15毫米時(shí)殺死小鼠。
高度表達(dá)膜GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的C57BL/6淋巴瘤EL-4由Nai-Kong V.Cheung博士提供。通過(guò)靜脈注射方式向正常的C57BL/6小鼠體內(nèi)植入3×105個(gè)EL-4細(xì)胞，從而使小鼠長(zhǎng)出肝臟腫瘤(見(jiàn)Zhang H.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，582844-2849(1998))。10天后，由6只小鼠構(gòu)成一組的四組小鼠通過(guò)靜脈注射方式接受100微升的a)磷酸鹽緩沖鹽水(對(duì)比組)，b)可溶性酵母多糖β-葡聚糖(4毫克/毫升)，每天一次，c)抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的3F8單克隆抗體(2毫克/毫升)，每隔2天注射一次，d)每天注射β-葡聚糖并每隔2天注射一次3F8單克隆抗體。在治療2星期后，取出接受治療小鼠的肝臟并對(duì)其進(jìn)行稱重，然后與正常的未患腫瘤的小鼠肝臟進(jìn)行比較。用患有腫瘤小鼠的肝臟重量減去正常小鼠的肝臟重量(1.0克)可以得出肝臟腫瘤的凈重量。使用C57BL/6淋巴瘤RMA-S進(jìn)行類(lèi)似的肝臟腫瘤模型實(shí)驗(yàn)，淋巴瘤RMA-S同樣表達(dá)GD2神經(jīng)節(jié)苷脂，但在I型MHC(由匹斯堡癌癥研究院的Olivera J.Finn博士提供)聯(lián)合抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂(100微克，每隔2天靜脈注射一次)的14.G2a單克隆抗體的肽加載方面存在著缺陷。小鼠同樣也被分成四組，在靜脈注射3×105個(gè)RMA-S腫瘤細(xì)胞5天后開(kāi)始使用以下方式進(jìn)行治療1)靜脈注射磷酸鹽緩沖鹽水(對(duì)比組)；2)靜脈注射β-葡聚糖(第天400微克)；3)14.G2a單克隆抗體；4)可溶性葡聚糖β-葡聚糖和14.G2a單克隆抗體。治療持續(xù)3個(gè)星期，然后對(duì)小鼠的存活期進(jìn)行長(zhǎng)期觀察。
轉(zhuǎn)染了人類(lèi)MUC1的RMA-S腫瘤細(xì)胞也由Finn博士提供，通過(guò)皮下植入方式在C57BL/6小鼠的乳房脂肪墊內(nèi)或脂肪墊附近植入1×106個(gè)RMA-S腫瘤細(xì)胞。在植入腫瘤細(xì)胞后8-10天，小鼠的體內(nèi)出現(xiàn)了3～4毫米的腫瘤，此時(shí)使用14.2a抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體或BCP8抗MUC1單克隆抗體在聯(lián)合使用可溶性β-葡聚糖或不聯(lián)合使用可溶性β-葡聚糖的情況下對(duì)四組小鼠進(jìn)行治療。四組小鼠的治療方式如下a)每隔2天通過(guò)靜脈注射方式對(duì)對(duì)比組小鼠使用200微克的B5非特異性單克隆抗體，b)每天靜脈注射400微克的可溶性葡聚糖β-葡聚糖，c)每隔2天靜脈注射100微克的14.G2a抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體或200微克的BCP8抗MUC1單克隆抗體，d)聯(lián)合使用單克隆抗體和β-葡聚糖進(jìn)行治療。治療持續(xù)2星期或3星期，然后按前面所述的過(guò)程測(cè)量腫瘤，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到15毫米時(shí)殺死小鼠。對(duì)沒(méi)有腫瘤的小鼠進(jìn)行為期90～120天的生存期觀察。
由C57BL/6小鼠衍生出來(lái)的路易氏肺癌細(xì)胞(LL/2、CRL-1642)是從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)中獲得的。使該肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有人類(lèi)MUC1 CDNA的質(zhì)粒，該質(zhì)粒由Olivera Finn博士提供。LL/2細(xì)胞系均勻表達(dá)高表面強(qiáng)度的MUC1，通過(guò)對(duì)BCP8-異硫氰酸熒光素單克隆抗體染色的細(xì)胞進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分類(lèi)而對(duì)LL/2細(xì)胞系進(jìn)行選擇。通過(guò)使該細(xì)胞系兩次通過(guò)皮下方式經(jīng)過(guò)C57BL/6小鼠而對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。被選用的腫瘤細(xì)胞系既在表面上高度表達(dá)MUC1，同時(shí)又能夠在植入5×105個(gè)腫瘤細(xì)胞的情況下在C57BL/6小鼠的皮下產(chǎn)生腫瘤。在植入腫瘤細(xì)胞7天后，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到1～2毫米時(shí)開(kāi)始對(duì)患皮下腫瘤的小鼠進(jìn)行治療。使用以下方式對(duì)四組缺乏C3的小鼠或它們的野生型同胞小鼠進(jìn)行治療；其中每組由6只小鼠組成a)每隔2天靜脈注射磷酸鹽緩沖鹽水(對(duì)比組)，b)每天靜脈注射400微克可溶性葡聚糖β-葡聚糖，c)每隔2天靜脈注射200微克BCP8抗MUC1單克隆抗體，d)聯(lián)合使用BCP8抗MUC1單克隆抗體和可溶性葡聚糖β-葡聚糖進(jìn)行治療。治療過(guò)程持續(xù)3個(gè)星期，其中每隔2天對(duì)腫瘤直徑進(jìn)行一次測(cè)量，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到15毫米時(shí)殺死小鼠。對(duì)沒(méi)有腫瘤的小鼠做為期90天的長(zhǎng)期生存觀察。
對(duì)患乳腺腫瘤小鼠的白細(xì)胞增多現(xiàn)象進(jìn)行分析選擇12只Balb/c小鼠，這12只小鼠分成兩組，每組有6只小鼠，在其中一組小鼠的乳腺脂肪墊中植入1×106個(gè)Ptas64乳腺癌細(xì)胞，然后對(duì)兩組小鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較。在植入癌細(xì)胞8天后小鼠體內(nèi)出現(xiàn)腫瘤時(shí)，每隔一天收集小鼠的外周血進(jìn)行分析。根據(jù)制造廠提供的使用說(shuō)明使用BD Tru-Count管(BD生物科學(xué)公司生產(chǎn))對(duì)白細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，50微升的全血在Tru-Count管中被染色，管中含有已知數(shù)量的珠球，珠球帶有1.0微升的PerCP-Cg5.5共軛鼠源性抗鼠體CD45單克隆抗體。在冰上保持20分鐘后，通過(guò)加入450微升熒光激活細(xì)胞分類(lèi)溶解溶液(BD生物科學(xué)公司生產(chǎn))使白細(xì)胞溶解，然后立即用BD熒光激活細(xì)胞分類(lèi)掃描儀進(jìn)行分析。在獲取數(shù)據(jù)過(guò)程中，建立FL-3的閾值，在這一閾值的限制下，掃描儀只對(duì)珠球和CD45+細(xì)胞進(jìn)行分析。白細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量由以下公式計(jì)算
對(duì)缺乏粒性白細(xì)胞小鼠的腫瘤進(jìn)行治療使用前面所述的方法對(duì)Balb/c小鼠體內(nèi)的Ptas64乳腺腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中接受治療的小鼠缺乏粒性白細(xì)胞，治療過(guò)程包括使用鼠源性抗鼠體粒性白細(xì)胞單克隆抗體RB6-8C5進(jìn)行治療，這種單克隆抗體也被稱為抗Gr-1(見(jiàn)Wipke B.T.和Allen P.M.在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1671601-1608(2001))。為了防止缺乏粒性白細(xì)胞的小鼠出現(xiàn)感染，所有接受治療的小鼠均放置在層流通風(fēng)櫥中，并在小鼠的飲用水中加入抗生素四環(huán)素(每升水中加入500毫克四環(huán)素和50克蔗糖)。由于有效的腫瘤退化需要血清補(bǔ)體以iC3b對(duì)腫瘤進(jìn)行調(diào)理，所以研究人員進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究從而確定慢性粒性白細(xì)胞缺乏癥的癥狀。在對(duì)腫瘤開(kāi)始進(jìn)行治療前，實(shí)驗(yàn)研究為血清補(bǔ)體功能的恢復(fù)留出了時(shí)間。在使用11C1單克隆抗體和可溶性葡聚糖β-葡聚糖進(jìn)行治療之前3天，通過(guò)腹膜內(nèi)注射方式給小鼠注入300微克的RB6-8C5單克隆抗體。在粒性白細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)缺乏后，每隔3天再以RB6-8C5單克隆抗體和11C1單克隆抗體混合物的形式通過(guò)靜脈注射方式向小鼠體內(nèi)注射300微克的RB6-8C5，這樣兩種單克隆抗體可同時(shí)通過(guò)一次注射而進(jìn)入到小鼠體內(nèi)。對(duì)取自RB6-8C5治療小鼠的血清進(jìn)行測(cè)試表明，到第3天時(shí)補(bǔ)體的活性已恢復(fù)到正常水平，而Wright-Giemsa染色的外周血涂片表明實(shí)際上沒(méi)有剩余的中性粒細(xì)胞或嗜曙紅細(xì)胞。連續(xù)靜脈注射RB6-8C5并不能明顯影響血清補(bǔ)體的水平，因?yàn)榱Ｐ园准?xì)胞的數(shù)量太低以致不需要消耗大量的補(bǔ)體來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。使用抗C3-異硫氰酸熒光素染色法和流式細(xì)胞測(cè)定儀可以測(cè)定補(bǔ)體在體內(nèi)通過(guò)C3對(duì)11C1調(diào)理過(guò)的Ptas64腫瘤細(xì)胞的調(diào)理能力，對(duì)接受RB6-8C5治療小鼠的血清所進(jìn)行的試驗(yàn)并沒(méi)有證據(jù)表明在治療腫瘤過(guò)程中出現(xiàn)了補(bǔ)體缺乏。為了證實(shí)RB6-8C5只消耗表面高濃度表達(dá)的Gr-1粒性白細(xì)胞，而不是消耗表面低濃度表達(dá)Gr-1的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，研究人員還對(duì)接受RB6-8C5治療的小鼠進(jìn)行了額外試驗(yàn)，從而核實(shí)在骨髓、脾臟和外周血中是否存在這些其他類(lèi)型的骨髓細(xì)胞以及這些骨髓細(xì)胞的數(shù)量。使用流式細(xì)胞測(cè)定儀和抗Gr-1-PE及抗CD80-異硫氰酸熒光素雙重染色法在血樣中識(shí)別到了單核細(xì)胞，使用Gr-1-PE和T4/80-異硫氰酸熒光素識(shí)別到了巨噬細(xì)胞，使用抗Gr-1-PE和抗CD11C-異硫氰酸熒光素識(shí)別到了樹(shù)突細(xì)胞。
根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖以及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析腫瘤治療的全部數(shù)據(jù)被輸入Prism3.0(加州圣選哥圖板軟件公司的軟件)，從而生成腫瘤退化或小鼠存活的圖形。然后在Prism3.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，從而確定不同數(shù)據(jù)組的重要性。
結(jié)果使用β-葡聚糖進(jìn)行治療需要抗腫瘤抗體以前的研究表明，β-葡聚糖要取得療效需要天生存在的抗腫瘤抗體，天然存在抗體的作用是用iC3b瞄準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞。人們以前假定EL-4淋巴瘤能夠抵抗β-葡聚糖療法(見(jiàn)Takahashi K.等人在《藥理學(xué)》上發(fā)表的文章，11472-478，1988，見(jiàn)Kano Y.等人在《生物療法》上發(fā)表的文章，9241-247(1996))，因?yàn)閬?lái)自同源的C57BL/6宿主的血清中缺乏可檢測(cè)到的可與EL-4反應(yīng)的天然抗體。當(dāng)通過(guò)靜脈注射方式植入到小鼠體內(nèi)時(shí)，EL-4細(xì)胞在小鼠體內(nèi)形成肝臟瘤(圖15)。在植入EL-4細(xì)胞2星期后所進(jìn)行的肝臟瘤細(xì)胞分析表明，小鼠體內(nèi)沒(méi)有或極少有流式細(xì)胞測(cè)定儀可檢測(cè)到的免疫球蛋白M、免疫球蛋白G或C3表面染色(數(shù)據(jù)未在圖中表明)。單獨(dú)使用靜脈注射β-葡聚糖對(duì)小鼠進(jìn)行治療只能使肝臟腫瘤的凈重減少25.6％。EL-4細(xì)胞在表面表達(dá)密度高的GD2神經(jīng)節(jié)苷脂，GD2神經(jīng)節(jié)苷脂是免疫球蛋白G3單克隆抗體3F8的靶目標(biāo)，免疫球蛋白G3單克隆抗體3F8既可以激活補(bǔ)體也能夠明顯調(diào)節(jié)抗體依賴型細(xì)胞毒性(見(jiàn)Zhang H.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，582844-2849(1998))。由于腫瘤較小以及較早地使用了單克隆抗體(在植入腫瘤后3天內(nèi)使用單克隆抗體)，所以3F8療法完全消滅了肝臟腫瘤(見(jiàn)Zhang H.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，582844-2849(1998))。然而，當(dāng)在植入腫瘤細(xì)胞10天后用3F8進(jìn)行為期2周的治療時(shí)，腫瘤沒(méi)有被完全消滅，腫瘤的凈重減少了73.5％(圖15)。使用流式細(xì)胞測(cè)定儀對(duì)3F8治療的小鼠腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的分析表明，免疫球蛋白G和C3存在著大量的染色(未在圖中表明)。最后，與未經(jīng)治療的對(duì)比組相比，同時(shí)靜脈注射3F8和β-葡聚糖使腫瘤的重量減少94.3％，同只接受3F8單克隆抗體治療的小鼠相比，同時(shí)使用3F8單克隆抗體和β-葡聚糖治療的小鼠的腫瘤重量減少了76.5％。
對(duì)類(lèi)似的肝臟腫瘤小鼠模型進(jìn)行無(wú)腫瘤存活期觀察，該肝臟腫瘤小鼠模型集RMA-S淋巴瘤、C57BL/6同源宿主和14.G2a抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的免疫球蛋白G2a單克隆抗體于一體。與EL-4細(xì)胞不同，RMA-S腫瘤在I型MHC中加載肽的能力方面存在著缺陷，因此RMA-S腫瘤細(xì)胞可防止自身被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識(shí)別和殺滅。單獨(dú)使用β-葡聚糖不能取得治療效果，但單獨(dú)使用14.G2a進(jìn)行治療可以延長(zhǎng)存活期。然而，14.G2a和β-葡聚糖聯(lián)合作用不僅能夠延長(zhǎng)小鼠的存活期，而且可使25％的小鼠長(zhǎng)期存活。
β-葡聚糖和單克隆抗體聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)腫瘤的退化以及明顯延長(zhǎng)存活期使用2種類(lèi)型的小鼠模型對(duì)3種單克隆抗體進(jìn)行了檢測(cè)，一種模型是患有Ptas64乳腺癌的同源Balb/c小鼠，另一種模型是在皮下植入了RMA-S淋巴瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠，其中的RMA-S淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染了人類(lèi)的MUC1。Ptas64潛在感染了小鼠乳房腫瘤病毒，并表達(dá)可被11C1免疫球蛋白G2a單克隆抗體檢測(cè)到的膜表面小鼠乳房腫瘤病毒腫瘤抗原。試驗(yàn)研究表明，在手術(shù)切除腫瘤以及使用流式細(xì)胞測(cè)定儀進(jìn)行分析(未在圖中表明)后，每隔3天靜脈注射200微克的11C1可使免疫球蛋白G和C3最大程度地包裹住單個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞。RMA-S-MUC1細(xì)胞在表面表達(dá)高密度的GD2神經(jīng)節(jié)苷酯，但RMA-S-MUC1對(duì)補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性的抵抗性高于EL-4細(xì)胞(未在圖中表明)。使用14.G2a進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究表明，在每隔3天使用100微克單克隆抗體的情況下，皮下腫瘤細(xì)胞吸收免疫球蛋白G和C3的數(shù)量達(dá)到最大。RMA-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染人類(lèi)MUC1還可使該腫瘤細(xì)胞成為BCP8免疫球蛋白G2b抗MUC1的靶目標(biāo)。每隔3天使用200微克的BCP8可使免疫球蛋白G和C3最大程度地包裹皮下腫瘤(未在圖中表明)。
無(wú)論是對(duì)于Ptas64還是RMA-S腫瘤細(xì)胞，同源的Balb/c和C57BL/6小鼠的血清中都含有可測(cè)量到的天然抗腫瘤抗體，這些抗體使用免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和C3對(duì)體內(nèi)的腫瘤實(shí)體進(jìn)行調(diào)理。因此，正如所預(yù)料的，當(dāng)單獨(dú)使用β-葡聚糖對(duì)患有Ptas64或RMA-S腫瘤的小鼠進(jìn)行治療時(shí)，腫瘤出現(xiàn)了一定程度的退化(圖17)。同樣，這3種單克隆抗體都能促使腫瘤細(xì)胞退化，其中14.G2a最為有效，這或許是因?yàn)镽MA-S細(xì)胞具有的GD2抗原密度較高。當(dāng)RMA-S-MUC1細(xì)胞被BCP8作為靶目標(biāo)而不是被14.G2a作為靶目標(biāo)時(shí)，MUC1抗原的較低表達(dá)被認(rèn)為是造成腫瘤退化程度較低的原因。值得注意的是，在這3種腫瘤模型中聯(lián)合使用β-葡聚糖可使腫瘤比單獨(dú)使用單克隆抗體時(shí)取得更明顯的退化(圖17)。在為期2周的治療結(jié)束時(shí)，對(duì)沒(méi)有腫瘤的小鼠進(jìn)行為期4個(gè)月的存活期觀察(圖18)。盡管患Ptas64腫瘤小鼠的存活期得到了延長(zhǎng)，但所有的小鼠在60天內(nèi)死于腫瘤。對(duì)這些小鼠的腫瘤所進(jìn)行的分析表明，許多腫瘤細(xì)胞不再與11C1單克隆抗體反應(yīng)，并且在體內(nèi)不再是iC3b的靶目標(biāo)。在另一系列的實(shí)驗(yàn)中，Ptas64腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠乳房腫瘤病毒抗原高表達(dá)進(jìn)行分類(lèi)，在4個(gè)星期內(nèi)這一表達(dá)高達(dá)3倍，從而產(chǎn)生比母細(xì)胞(未在圖中表明)更高表達(dá)小鼠乳房腫瘤病毒的變種細(xì)胞系。對(duì)于這些高度表達(dá)小鼠乳房腫瘤病毒腫瘤抗原的細(xì)胞而言，聯(lián)合使用11C1單克隆抗體和β-葡聚糖可使40％小鼠的存活期超過(guò)90天(未在圖中表明)。
當(dāng)單獨(dú)使用14.G2a抗GD2神經(jīng)苷脂單克隆抗體或聯(lián)合使用該抗體和β-葡聚糖對(duì)RMA-S-MUC1腫瘤進(jìn)行治療時(shí)，單獨(dú)使用單克隆抗體治療的小鼠中有60％存活下來(lái)，而使用單克隆抗體和β-葡聚糖進(jìn)行治療的小鼠中，有80％的小鼠存活下來(lái)(差別并不明顯)。對(duì)該模型所進(jìn)行的治療之所以取得了更好的療效可能是因?yàn)镚D2抗原的表達(dá)高并且表達(dá)穩(wěn)定。當(dāng)同樣的腫瘤細(xì)胞是BCP8抗MUC1單克隆抗體的靶細(xì)胞時(shí)，這種單克隆抗體對(duì)小鼠的存活率沒(méi)有作用，但當(dāng)這種單克隆抗體與β-葡聚糖共同使用時(shí)，小鼠表現(xiàn)出了可比的20％的存活率。對(duì)取自這些小鼠的腫瘤細(xì)胞所進(jìn)行的檢驗(yàn)表明，25％以下的腫瘤細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)MUC1，這表明由于帶有MUC1的腫瘤細(xì)胞已被這種療法有選擇性地殺滅了，所以可能出現(xiàn)了腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象。在植入腫瘤細(xì)胞之前，使用熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)對(duì)RMA-S-MUC1細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，選擇能夠均勻表達(dá)MUC1的細(xì)胞用于腫瘤植入。
β-葡聚糖的輔助功能需要白細(xì)胞CR3和血清C3以前的研究表明，在缺乏CR3的Balb/c小鼠和缺乏C3的129/J小鼠中單獨(dú)使用β-葡聚糖并不能過(guò)到使腫瘤發(fā)生退化的功效。當(dāng)前的研究分別對(duì)缺乏CR3或缺乏C3且皮下帶有RMA-S-MUC1或LL/2-MUC1腫瘤的小鼠進(jìn)行了檢驗(yàn)。對(duì)于帶有RMA-S-MUC1腫瘤的野生型小鼠而言，單獨(dú)使用單克隆抗體或單獨(dú)使用β-葡聚糖所導(dǎo)致的腫瘤退化程度是可比的，當(dāng)單克隆抗體和β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤的退化會(huì)得到加強(qiáng)(圖19)。雖然使用β-葡聚糖并不能明顯加強(qiáng)單克隆抗體所介導(dǎo)的腫瘤退化，但單克隆和β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)會(huì)明顯行長(zhǎng)存活期，在聯(lián)合使用單克隆抗體和β-葡聚糖進(jìn)行治療的小鼠中，有40％的小鼠沒(méi)有腫瘤細(xì)胞(圖20)。相比這下，單獨(dú)使用單克隆抗體進(jìn)行治療和單獨(dú)β-葡聚糖進(jìn)行治療的小鼠中沒(méi)有小鼠存活下來(lái)。最后，在缺乏CR3的小鼠中，單獨(dú)使用β-葡聚糖進(jìn)行治療不能使腫瘤消退，雖然單獨(dú)用單克隆抗體不能使腫瘤發(fā)生較大的消退，但單克隆抗體和β-葡聚糖聯(lián)合使用也不能使單克隆抗體引發(fā)的腫瘤消退得到加強(qiáng)，而且缺乏CR3的小鼠在接受治療后沒(méi)有出現(xiàn)長(zhǎng)期存活的小鼠。
所研究的另一腫瘤模型是缺乏C3的野生型C57BL/6小鼠。在這種小鼠的體內(nèi)通過(guò)皮下植入方式植入轉(zhuǎn)染了人類(lèi)MUC1(LL/2-MUC1)的路易氏肺癌細(xì)胞，使用BCP8抗MUC1單克隆抗體或聯(lián)合使用該抗體和β-葡聚糖進(jìn)行治療。在野生型小鼠中，單獨(dú)使用BCP8單克隆抗體不會(huì)使腫瘤消退，但BCP8單克隆抗體和β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)會(huì)使腫瘤出現(xiàn)明顯的消退(P＜0.05，圖21)。單獨(dú)使用β-葡聚糖進(jìn)行治療之所以使腫瘤只出現(xiàn)了較小的退化可能是因?yàn)樘烊淮嬖诘目筁L/2腫瘤細(xì)胞的抗體較少。同樣，β-葡聚糖療法或單克隆抗體與β-葡聚糖聯(lián)合療法在存活期方面要優(yōu)于單獨(dú)使用單克隆抗體的療法(圖22)。相比之下，無(wú)論是單獨(dú)使用還是聯(lián)合使用單克隆抗體療法和β-葡聚糖療法，都不能使缺乏C3的小鼠的存活情況得到改善。
β-葡聚糖介導(dǎo)的腫瘤退化依賴于粒性白細(xì)胞以前的體外研究表明，人類(lèi)和鼠類(lèi)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞都可以實(shí)現(xiàn)β-葡聚糖介導(dǎo)的CR3依賴型細(xì)胞毒性，該細(xì)胞毒性對(duì)iC3b調(diào)理的腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用。然而，在鼠類(lèi)腫瘤模型中，識(shí)別這一響應(yīng)所需的特異性效應(yīng)細(xì)胞所做的嘗試沒(méi)有取得成功。補(bǔ)充白細(xì)胞所涉及的一個(gè)機(jī)理可能是位于腫瘤位點(diǎn)上補(bǔ)體的激活，這一激活過(guò)程是由抗腫瘤抗體所介異的，在大多數(shù)腫瘤模型中，補(bǔ)體的激活被認(rèn)為是通過(guò)自然存在的抗體所實(shí)現(xiàn)的，即便在使用磷酸鹽緩沖鹽水治療的對(duì)比組中也是同樣的情況。實(shí)際上，患Ptas64乳腺癌小鼠的外周血中粒性白細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)了顯著的增長(zhǎng)，這種增長(zhǎng)與單克隆抗體療法和/或β-葡聚糖療法無(wú)關(guān)(圖23)。補(bǔ)體的激活會(huì)釋放出C3a和C5a，C3a和C5a的功能是補(bǔ)充嗜曙細(xì)胞、肥大細(xì)胞(C3a的功能)、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(C5a的功能)。因此，在使用磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行治療的對(duì)照組小鼠中也會(huì)取得相似的補(bǔ)充情況，但只有在接受β-葡聚糖治療的腫瘤中經(jīng)過(guò)CR3啟動(dòng)的白細(xì)胞能夠殺滅iC3b調(diào)理過(guò)的腫瘤細(xì)胞。
由于在Ptas64腫瘤細(xì)胞(接受治療的或沒(méi)有接受治療的)中存在的主要白細(xì)胞類(lèi)型是粒性白細(xì)胞，因此假定經(jīng)β-葡聚糖啟動(dòng)過(guò)的CR3+粒性白細(xì)胞在單克隆抗體外加β-葡聚糖介導(dǎo)的殺滅腫瘤活性方面起主導(dǎo)作用。以前有報(bào)道稱，使用抗Ly6G(抗Gr-1)單克隆抗體治療腫瘤會(huì)有選擇性地消耗粒性白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞)，但對(duì)其他類(lèi)型的白細(xì)胞沒(méi)有影響或影響極小(見(jiàn)Wipke B.T.和Allen P.M.在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1671601-1608(2001))。然而，已知的是，Gr-1抗原在包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞在內(nèi)的所有的骨髓細(xì)胞種群中表達(dá)的水平都較低。因此，表明此項(xiàng)研究中所用的方法對(duì)粒性白細(xì)胞具有選擇性以及這種療法并不會(huì)耗盡單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞是很重要的。使用流式細(xì)胞測(cè)定儀對(duì)血液中的白細(xì)胞以及脾白細(xì)胞的檢測(cè)證實(shí)，外周血中的粒性白細(xì)胞幾乎被消耗殆盡(圖24A和24B)。然而，抗Gr-1單克隆抗體對(duì)骨髓中Gr-1高粒性白細(xì)胞種群幾乎沒(méi)有影響。這些細(xì)胞被假定為一離開(kāi)骨髓就會(huì)被殺死。使用流式細(xì)胞測(cè)定儀對(duì)外周血的檢測(cè)表明Gr-1低CD80+單核細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)消耗，而所有Gr-1高CD80-中性粒細(xì)胞都消失了(圖24D)。對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行的測(cè)試表明，Gr-1低CD80+巨噬細(xì)胞(圖24E)或Gr-1低CD80+樹(shù)突細(xì)胞(未在圖中表明)沒(méi)有出現(xiàn)可檢測(cè)到的消耗。同樣，骨髓中的巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞也沒(méi)有出現(xiàn)消耗(未在圖中表明)。
為了確定粒性白細(xì)胞在這種腫瘤免疫療法中所起的作用，按前面所述的方式對(duì)患有Ptas64乳腺癌的Balb/c小鼠使用單克隆抗體和β-葡聚糖療法，但這些小鼠要么未被治愈，要么被抗Gr-1單克隆抗體耗盡了粒性白細(xì)胞。為了避免在抗Gr-1單克隆抗體殺滅抗體依賴型粒性白細(xì)胞的高峰期出現(xiàn)補(bǔ)體的耗盡，在開(kāi)始使用單克隆抗體加β-葡聚糖進(jìn)行治療前3天先使用腹膜內(nèi)注射抗Gr-1對(duì)小鼠進(jìn)行治療，然后在靜脈注射11C1單克隆抗體的同時(shí)靜脈注射抗Gr-1單克隆抗體。通過(guò)使用抗鼠體C3-異硫氰酸熒光素染色法和流式細(xì)胞測(cè)定儀確定小鼠的小血清試樣在體內(nèi)通過(guò)C3對(duì)11C1調(diào)理過(guò)的Ptas64腫瘤細(xì)胞的調(diào)理能力，通過(guò)確定這一能力可以在單克隆抗體加β-葡聚糖療法的開(kāi)始階段及治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)血清補(bǔ)體的濃度。沒(méi)有證據(jù)表明在抗GR-1治療中補(bǔ)體出現(xiàn)缺乏(未在圖中表明)。粒性白細(xì)胞的缺乏不僅會(huì)完全中止單克隆抗體和β-葡聚糖所介導(dǎo)的腫瘤退化，而且在測(cè)量腫瘤的最后一周內(nèi)，缺乏粒性白細(xì)胞小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于使用磷酸鹽緩沖鹽水治療的對(duì)比組小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)速度(圖25)。因此，在單克隆抗體加β-葡聚糖介導(dǎo)的療法中，粒性白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和/或嗜曙紅細(xì)胞)在促進(jìn)腫瘤退化的過(guò)程中起著必不可少的作用。
討論這一研究表明，如果與β-葡聚糖聯(lián)合使用，抗腫瘤的單克隆抗體所介導(dǎo)的腫瘤退化和存活狀況會(huì)得到顯著的加強(qiáng)。β-葡聚糖增強(qiáng)抗腫瘤單克隆抗體活性的能力需要單克隆抗體激活補(bǔ)體以及沉積在腫瘤細(xì)胞上，從而使腫瘤細(xì)胞被CR3+粒性白細(xì)胞所識(shí)別。
以前的報(bào)道表明，β-葡聚糖通過(guò)自然存在的抗腫瘤抗體而發(fā)揮單一療法的作用，其中的抗體使iC3b沉積在腫瘤細(xì)胞上，這種療法對(duì)于天然抗腫瘤抗體濃度較低的年輕小鼠的療效更差。這一療法對(duì)患有遺傳性嚴(yán)重綜合免疫缺陷癥(既沒(méi)有B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，并且無(wú)法產(chǎn)生天然抗體)的小鼠沒(méi)有療效，但通過(guò)靜脈注射從正常小鼠血清中分離出的天然抗體可對(duì)這一治療方法進(jìn)行彌補(bǔ)。然而，即使在成年的野生型小鼠中，當(dāng)腫瘤失去自然存在的抗體所識(shí)別的抗原以致于腫瘤細(xì)胞不再成為iC3b的靶細(xì)胞時(shí)也會(huì)出現(xiàn)腫瘤逃逸現(xiàn)象。
在以前的研究中，β-葡聚糖介導(dǎo)的免疫療法的療效被認(rèn)為可通過(guò)聯(lián)合使用抗腫瘤單克隆抗體而得到加強(qiáng)，其中的抗腫瘤單克隆抗體對(duì)高表達(dá)的和穩(wěn)定的腫瘤抗原具有特異性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可證實(shí)這些單克隆抗體需要激活補(bǔ)體，這些實(shí)驗(yàn)表明β-葡聚糖不能加強(qiáng)缺乏C3小鼠體內(nèi)單克隆抗體所介導(dǎo)的腫瘤的退化，也不能改善缺乏C3小鼠的存活情況。其他的實(shí)驗(yàn)也表明，β-葡聚糖對(duì)不能激活補(bǔ)體的抗腫瘤單克隆抗體缺乏增強(qiáng)作用(見(jiàn)Cheung N.K.和Modak在《癌癥臨床研究》上發(fā)表的文章，81217-1223(2002))。因此，β-葡聚糖不能增強(qiáng)某些人源化單克隆抗體的治療活性，其中這些人源化單克隆抗體是通過(guò)不激活補(bǔ)體的方式進(jìn)行處理的。大多數(shù)含有人類(lèi)免疫球蛋白G1 Fc區(qū)域的人源化單克隆抗體可以激活補(bǔ)體，比如赫塞汀TM、美羅華TM和ErbituTM這些人源化單克隆抗體可激活補(bǔ)體(見(jiàn)Spiridon C.I.等人在《癌癥臨床研究》上發(fā)表的文章，81720-1730(2002)，見(jiàn)Idusogie E.E.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1644178-4184(2000)見(jiàn)Cragg M.S.等人在《血液》上發(fā)表的文章，1011045-1052(2003)，見(jiàn)Herbst R.S.和Hong W.K.在《生殖腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，2918-30(2002))。除美羅華外，補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性并不代表這些單克隆抗體殺滅腫瘤活性的主要機(jī)理，β-葡聚糖也不能改變補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性的效力。取而代之的是，β-葡聚糖的作用是啟動(dòng)粒性白細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞，其中的腫瘤細(xì)胞是單克隆抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體激活的靶目標(biāo)，補(bǔ)體由腫瘤細(xì)胞表面所結(jié)合的iC3b所激活。
研究人員對(duì)EL-4淋巴瘤進(jìn)行了檢測(cè)，因?yàn)橐郧坝袌?bào)道稱該淋巴瘤對(duì)蘑菇衍生出的β-葡聚糖具有抵抗性(見(jiàn)Takahashi K.等人在《Pharmacobiodyn》上發(fā)表的文章，11472-478，1988)。這種抵抗力被認(rèn)為是由于在同源C57BL/6宿主的血清中缺乏天然抗腫瘤抗體所導(dǎo)致的(見(jiàn)Yan J.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1633045-3052(1999))。據(jù)報(bào)道，3F8免疫球蛋白G3抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂療法可有效地保護(hù)小鼠不受靜脈注射EL-4腫瘤細(xì)胞的影響，但這種保護(hù)作用只有在靜脈注射EL-4腫瘤細(xì)胞后3天內(nèi)使用這種單克隆抗體的條件下才有效(見(jiàn)Zhang H.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，582844-2849，(1998))。與大多數(shù)小鼠腫瘤不同，EL-4對(duì)3F8單克隆抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性和抗體依賴細(xì)胞毒性十分敏感。然而，在靜脈注射腫瘤細(xì)胞后10天開(kāi)始使用3F8進(jìn)行治療時(shí)，所形成的腫瘤在使用3F8單克隆抗體的治療下小鼠只存活了2星期。正如所預(yù)料的，單獨(dú)使用β-葡聚糖進(jìn)行治療對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，其原因在于缺乏天然的抗腫瘤抗體，所以腫瘤細(xì)胞不是iC3b的靶目標(biāo)。然而，對(duì)小鼠使用3F8單克隆抗體以及β-葡聚糖可使腫瘤的退化程度明顯高于單獨(dú)使用3F8單克隆抗體所導(dǎo)致的腫瘤退化程度。
在細(xì)胞表面高度表達(dá)GD2神經(jīng)節(jié)苷脂腫瘤抗原和靜脈注射腫瘤細(xì)胞后肝臟腫瘤的形成方面，RMA-S淋巴瘤與EL-4是相似的。然而，雖然RMA-S和EL-4對(duì)抗體依賴性細(xì)胞毒性具有相似的敏感程度，但RMA-S卻能完全抵抗補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。RMA-S與EL-4的不同之處還在于正常C57BL/6小鼠血清中含有RMA-S的天然抗體，這種天然抗體通過(guò)體內(nèi)的免疫球蛋白G和C3調(diào)理腫瘤的生長(zhǎng)，不同之處還在于RMA-S在加載I型MHC的肽方面存在著缺陷，因此可以避免腫瘤細(xì)胞被CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞所識(shí)別。
即使是在注射腫瘤細(xì)胞5天后開(kāi)始治療，靜脈注射RMA-S產(chǎn)生的肝臟腫瘤只能使小鼠在單克隆抗體治療下存活2星期。雖然使用單克隆抗體進(jìn)行的單一療法的確可以改善小鼠的存活情況，但只有在β-葡聚糖和單克隆抗體聯(lián)合使用的情況下才能使小鼠在沒(méi)有腫瘤的狀態(tài)下長(zhǎng)期存活。
β-葡聚糖和抗腫瘤單克隆抗體的聯(lián)合使用能夠明顯加強(qiáng)Balb/c或C57BL/6小鼠體內(nèi)另外4種腫瘤模型的退化。這一療治要成功地使小鼠長(zhǎng)期存活還要依靠腫瘤抗原的密度和穩(wěn)定性。腫瘤逃逸的特點(diǎn)是失去了腫瘤抗原，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺乏和自身結(jié)合的iC3b，而經(jīng)過(guò)β-葡聚糖啟動(dòng)的CR3識(shí)別腫瘤細(xì)胞需要這些已經(jīng)結(jié)合iC3b。當(dāng)GD2腫瘤抗原是14.G2a單克隆抗體的靶目標(biāo)時(shí)，PMA-S-MUC1腫瘤模型中有80％得以長(zhǎng)期存活，但當(dāng)MUC1是BCP8單克隆抗體的靶目標(biāo)時(shí)，長(zhǎng)期存活率只有20％。對(duì)逃過(guò)BCP8和β-葡聚糖聯(lián)合療法的腫瘤所進(jìn)行的檢查表明，25％以下的腫瘤細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)MUC1并帶有膜iC3b。這對(duì)于瞄準(zhǔn)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞上的MUC1而言并不構(gòu)成一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)镸UC1通常是過(guò)量表達(dá)的，并且是穩(wěn)定的。特別令人感興趣的是，抗MUC1單克隆抗體單一療法對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)速度以及帶有轉(zhuǎn)染路易氏骯癌MUC1的小鼠的存活期沒(méi)有影響，然而當(dāng)BCP8與β-葡聚糖聯(lián)合使用時(shí)，該療法可以使腫瘤明顯地退化，并使患腫瘤的小鼠長(zhǎng)期存活(圖21和圖22)。
以前有關(guān)使用β-葡聚糖但不同時(shí)使用單克隆抗體療法導(dǎo)致腫瘤退化的研究報(bào)告表明，β-葡聚糖所介導(dǎo)的腫瘤退化需要Balb/c腫瘤模型中存在CR3，129/J腫瘤模型中存在血清C3(見(jiàn)Yan J.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1633045-3052(1999))。該研究證實(shí)，在針對(duì)腫瘤退化和長(zhǎng)期無(wú)腫瘤存活進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，在β-葡聚糖強(qiáng)化單克隆抗體對(duì)C57BL/6小鼠的療效方面CR3和C3具有相似的作用。
除CR3外，還有報(bào)道稱存在一種特殊類(lèi)型的巨噬細(xì)胞β-葡聚糖受體，這種受體被稱為Dectin-1(見(jiàn)Brown G.D.等人在《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)》上發(fā)表的文章，196407-412(2002))。Dectin-1可在巰基乙酸鹽誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞上被高度地表達(dá)，而在駐留型腹膜巨噬細(xì)胞或粒性白細(xì)胞上Dectin的數(shù)量更少，在天然殺傷細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Dectin-1(見(jiàn)Taylor P.R.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1693876-3882(2002))。當(dāng)前的研究并不排除Dectin-1的功能，但當(dāng)前的研究表明粒性白細(xì)胞CR3是絕對(duì)需要的。不缺乏CR3的野生型粒性白細(xì)胞可以與β-葡聚糖相結(jié)合，這表明在鼠源性粒性白細(xì)胞上CR3是可溶性單鏈β-葡聚糖的主要受體(見(jiàn)Xia Y.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1622281-2290(1999))。CR3不僅對(duì)粒性白細(xì)胞識(shí)別可溶性β-葡聚糖是需要的，而且對(duì)觸發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性也是需要的，其中的腫瘤被CR3目標(biāo)配體iC3b所包裹。
以前進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，可溶性β-葡聚糖能夠啟動(dòng)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的CR3，從而產(chǎn)生對(duì)iC3b包裹的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性(Vetvicka V.等人在《臨床研究》上發(fā)表的文章，9850-61，1996；見(jiàn)Vetvicka V.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，159599-605(1997))。當(dāng)前的研究表明，粒性白細(xì)胞在β-葡聚糖介導(dǎo)的體內(nèi)腫瘤退化過(guò)程中發(fā)揮著基礎(chǔ)作用。粒性白細(xì)胞由腫瘤補(bǔ)充，與單克隆抗體和β-葡聚糖療法無(wú)關(guān)，這也許是因?yàn)槟[瘤內(nèi)補(bǔ)體被天然抗體所激活，補(bǔ)體的激活會(huì)釋放出強(qiáng)力的趨化因子C5a。對(duì)腫瘤細(xì)胞懸浮液所進(jìn)行的流式細(xì)胞測(cè)定分析表明，Gr-1+粒性白細(xì)胞是腫瘤內(nèi)主要的CR3+白細(xì)胞類(lèi)型，抗Gr-1單克隆抗體對(duì)粒性白細(xì)胞的消耗證明粒性白細(xì)胞在β-葡聚糖介導(dǎo)的腫瘤退化過(guò)程中起著主要的作用。
一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)是，粒性白細(xì)胞在腫瘤退化過(guò)程中所發(fā)揮的作用似乎與單克隆抗體和β-葡聚糖療法無(wú)關(guān)。在缺乏粒性白細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯快于腫瘤在未接受治療的對(duì)比組小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度。鑒于患有腫瘤且未接受治療的小鼠體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量增多，這些補(bǔ)充的粒性白細(xì)胞似乎有能力通過(guò)C3受體加強(qiáng)抗體依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性來(lái)殺滅經(jīng)天然抗體和iC3b調(diào)理過(guò)的腫瘤細(xì)胞，因?yàn)槟承┨烊豢鼓[瘤抗體是免疫球蛋白G(見(jiàn)Yan J.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1633045-3052(1999))。
總之，本研究表明，同時(shí)使用可溶性葡聚糖β-葡聚糖可以顯著增強(qiáng)抗腫瘤抗體(比如單克隆抗體)的療效。此外，初步的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)可溶性葡聚糖與產(chǎn)生抗腫瘤抗體的腫瘤疫苗聯(lián)合使用時(shí)，β-葡聚糖同樣可以增強(qiáng)腫瘤的退化(見(jiàn)G.D.Ross未公開(kāi)的觀察結(jié)果)?？扇苄云暇厶堑墓δ苁茄a(bǔ)充殺滅腫瘤細(xì)胞的粒性白細(xì)胞，這一補(bǔ)充過(guò)程是通過(guò)CR3對(duì)與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合的iC3b的識(shí)別而觸發(fā)的。這是一種新型的抗腫瘤單克隆抗體療法的效應(yīng)機(jī)理，這種機(jī)理可與所有其他單克隆抗體介導(dǎo)的腫瘤退化機(jī)理形成累加效應(yīng)。正如使用BCP8抗MUC1單克隆抗體治療LL/2-MUC1腫瘤所表明的，即使在單獨(dú)使用單克隆抗體對(duì)腫瘤沒(méi)有實(shí)際療效的情況下，β-葡聚糖也能使腫瘤出現(xiàn)明顯的退化，并可使腫瘤宿主長(zhǎng)期存活。以前所報(bào)道的可溶性葡聚糖在癌癥患者中出現(xiàn)的活性不一致情況被認(rèn)為可能是由于存在不同的天然抗體或誘導(dǎo)出的抗腫瘤抗體所導(dǎo)致的。當(dāng)前的研究表明，如果與單克隆抗體聯(lián)合使用時(shí)可溶性葡聚糖可產(chǎn)生更一致的殺滅腫瘤反應(yīng)。由于與可溶性葡聚糖有關(guān)的副作用很少出現(xiàn)，所以在腫瘤抗體療法中使用β-葡聚糖是一種有益的做法。
實(shí)例3口服大麥β-葡聚糖所導(dǎo)致的腫瘤退化和存活情況改善與靜脈注射β-葡聚糖的情況相似。正如在以上“材料和方法”一節(jié)中所述的，在C57BL/6小鼠的皮下植入RMA-S-MUC1腫瘤細(xì)胞，植入5天后有腫瘤形成，此時(shí)通過(guò)單獨(dú)靜脈注射抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的14.G2a單克隆抗體進(jìn)行治療，或在同時(shí)靜脈注射可溶性酵母β-葡聚糖或口服大麥β-葡聚糖的條件下進(jìn)行治療。圖26表明了治療結(jié)果。圖26表明了平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
雖然本發(fā)明是結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案而進(jìn)行具體說(shuō)明的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不脫離本文所附權(quán)利要求所限本發(fā)明范圍的前提下，可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改。
權(quán)利要求
1.全葡聚糖顆粒在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用，其中全葡聚糖顆?？梢l(fā)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。
2.全葡聚糖顆粒在制備通過(guò)免疫調(diào)節(jié)治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中全葡聚糖顆粒可引發(fā)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。
3.如權(quán)利要求2中所述的應(yīng)用，其中免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)抗腫瘤療法的療效。
4.如權(quán)利要求3中所述的應(yīng)用，其中抗腫瘤療法包括對(duì)需要治療的個(gè)體使用有效治療劑量的中性可溶性葡聚糖以及能夠激活補(bǔ)體的抗體，該抗體以所述腫瘤細(xì)胞的抗原為靶目標(biāo)；其中抗體通過(guò)服用適當(dāng)?shù)囊呙纾蛘咄ㄟ^(guò)直接使用單克隆抗體或多克隆抗體而被引入。
5.一種免疫調(diào)節(jié)藥物，其中包括治療有效量的全葡聚糖顆粒，其中全葡聚糖顆粒可引發(fā)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。
6.一種免疫調(diào)節(jié)治療癌癥的藥物，其中包括治療有效量全葡聚糖顆粒，其中全葡聚糖顆?？梢l(fā)Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。
全文摘要
本文涉及使用中性可溶性葡聚糖和單克隆抗體治療癌癥的方法。中性可溶性β(1，3；1，6)葡聚糖通過(guò)與C3補(bǔ)體蛋白受體CR3相結(jié)合而加強(qiáng)先天免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤的活性。葡聚糖并不會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子。本文還涉及將全葡聚糖顆粒用作免疫調(diào)節(jié)劑的方法，其中全葡聚糖誘導(dǎo)Th2應(yīng)答向Th1應(yīng)答轉(zhuǎn)變，從而使細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗癌應(yīng)答更加強(qiáng)烈。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1939335SQ200610136269
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月4日
發(fā)明者戈登·D·羅斯 申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)