專利名稱：：預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種醫(yī)藥組組合物，且特別關(guān)于一種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物?，F(xiàn)有技術(shù)骨質(zhì)疏松癥可分為兩大類一是因女性荷爾蒙缺乏所造成的"停經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥"，此病癥好發(fā)于停經(jīng)后的女性身上；而另一類發(fā)生的原因則是由于老化而產(chǎn)生的，我們稱之為"老年型骨質(zhì)疏松癥"，此癥不論男女只要活得夠老，都可能會(huì)發(fā)生。從臨床的研究報(bào)告中可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)更年期婦女的女性荷爾蒙分泌不足時(shí)，骨頭流失的速率一年可高達(dá)百分之三至百分之五。骨頭加速流失后，就會(huì)造成骨質(zhì)疏松癥，當(dāng)骨頭結(jié)構(gòu)變的不良時(shí)，就可能在外力的作用下，造成骨折的發(fā)生。更年期后骨質(zhì)疏;^癥有一些特定好發(fā)部位，人體的骨頭可粗分為兩大部份，一個(gè)是外層較堅(jiān)硬致密的部份，我們稱為硬骨；另外骨頭中間較松軟的部份也就是一般俗稱骨髓的部位，我們稱之為松骨，更年期后骨質(zhì)疏松癥好發(fā)的部位就是所謂松骨的部份。以人體來講，不同部位骨頭所含松骨和硬骨的比例都不相同，而更年期骨質(zhì)疏松癥好發(fā)于人體中松骨為主要構(gòu)成成份的部位，其中最主要就是脊推部位，所以容易造成腰推的壓迫性骨折；另外就是長骨的終端，即四肢骨的終端部位，亦容易造成手腕部的骨折。更年期后骨質(zhì)疏松癥的婦女，易造成骨折的類型就是此二種。停經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausalosteoporosis)是老年婦女?；嫉囊环N代謝性骨病。臨床的研究報(bào)告中可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)更年期婦女的女性荷爾蒙分泌不足時(shí)，骨頭流失的速率一年可高達(dá)百分之三至百分之五，隨著人類平均壽命的延長，停經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。停經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)轉(zhuǎn)主要因停經(jīng)所致女性賀爾蒙缺乏所導(dǎo)致熟知此的技術(shù)人員骨質(zhì)大量流失(每年約下降3~6%甚至更高)。因正常時(shí)動(dòng)情激素能刺激"造骨細(xì)胞"(osteoblast)產(chǎn)生細(xì)胞介質(zhì)，一方面抑制"破骨細(xì)胞"(osteoclast)的活性，令一方面刺激"造骨細(xì)胞"以使骨質(zhì)維持平衡狀態(tài)。一旦缺乏女性激素，則骨質(zhì)大量流失，鈣離子從骨中大量釋出，壓抑了副曱狀腺濃度，引致活性維生素D合成減少，故減低了鈣離子在胃腸道熟知此的技術(shù)人員吸收，導(dǎo)致4丐離子"負(fù)平衡"，加速骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。臺(tái)灣已漸漸步入高齡化社會(huì)，由此聯(lián)想，將有更多人發(fā)生骨質(zhì)疏;^癥。停經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausalosteoporosis)是老年婦女常患的一種代謝性骨病。隨著國人平均壽命的延長，停經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)停經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療方法主要是雌激素替代療法，但長期使用有一定畐'H乍用(ColditzGA,HankinsonSE，HunterDJ.Theuseofestrogenandprogestinsandtheriskofbreastcancerinpostmenopausalwomen.NEngJMed，1995，332:1589-1593;GradyD,GebretsadikT,KelikowskeK.Hormonereplacementtherapyandendometrialcancerrisk:ameta-analysis.ObstetGynecol,1995,85:304-313),因此，目前亟需一種可用來預(yù)防^J或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥《且合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的為提供一種醫(yī)藥組合物，可用來預(yù)防及治療老人或停經(jīng)婦女的骨質(zhì)流失。為達(dá)成上述目的，本發(fā)明提供一種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，包括有效量的甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，其中各成份的重量比為甘草黑豆蛇床子鹿角=1-10:2-10:1-10:1-10。為達(dá)成上述目的，本發(fā)明另提供一種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，包括有效量的歐前胡素(imperatorin),以及藥學(xué)上可接受的栽體或賦形劑。為達(dá)成上述目的，本發(fā)明另提供一種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，包括有效量的香檸檬烯(bergapten)，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。圖式簡單說明第1圖顯示本發(fā)明醫(yī)藥組合物對(duì)大鼠體重的影響。第2圖顯示服用本發(fā)明醫(yī)藥組合物大鼠熟知此的技術(shù)人員骨組織切片。第3A-3B圖顯示本發(fā)明醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)細(xì)胞增殖的影響。第4圖顯示醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。第5A-5B圖顯示醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)骨細(xì)胞礦化的影響。笫6A圖顯示醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。第6B圖顯示醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)破骨細(xì)胞再吸收作用的影響。第7A圖顯示歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞存活的影響。第7B圖顯示歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞增殖的影響。第8A圖顯示歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞ALP活性的影響。第8B圖顯示歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞分泌膠原蛋白(collagen)的影響。第8C-8D圖顯示歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞礦化的影響。第9A-9B圖顯示歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP-2)基因的表達(dá)。第9C圖顯示歐前胡素、香檸檬烯及BMP拮抗劑(noggin)對(duì)骨細(xì)胞ALP活性的影響。第10A圖顯示歐前胡素對(duì)SMADs、p38及EPK蛋白磷酸化的影響。第10B圖顯示香檸檬烯對(duì)SMADs、p38及EPK蛋白磷酸化的影響。第11A-11B圖顯示p38抑制劑(SB203580)及ERK抑制劑(PD98059)對(duì)p38及EPK蛋白磷酸化的影響。第11C圖顯示p38抑制劑(SB203580)及ERK抑制劑(PD98059)對(duì)骨細(xì)胞ALP活性的影響。第11D圖顯示p38突變抹(DN-p38)及ERK突變抹(DN-ERK)對(duì)骨細(xì)胞ALP活性的影響。第12圖顯示歐前胡素及香檸檬烯進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。為了讓本發(fā)明熟知此的技術(shù)人員上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特別列舉優(yōu)選實(shí)施例，并配合所附附圖，作詳細(xì)說明如下實(shí)施方式本發(fā)明是提供一種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物。在一種實(shí)施例中，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包括甘草、黑豆、蛇床子、鹿角等，其中各成份的重量比為甘草黑豆蛇床子鹿角=1-10:2-10:1-10:1-10,優(yōu)選為2-4:4-6:1-3:1-3。且本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中亦包含蛇床子素(osthol)、歐前胡素(imperatorin)及香^N蒙歸(bergapten)。本發(fā)明醫(yī)藥組合物的制作方法為特殊的加工制程，首先，將甘草加熱以萃取液萃取，其中使用的萃取液可為水、乙醇等。再將黑豆和蛇床子以乙醇浸泡約2-40小時(shí)，優(yōu)選約10-20小時(shí)，再加熱萃取。之后，將黑豆、蛇床子萃取液與甘草萃取液合并，彼此的體積比為甘草:黑豆+蛇床子=1:2，經(jīng)減壓濃縮后得濃縮液10-100公升，將10-40公斤的鹿角粉加至濃縮液中后并干燥，將干燥物粉碎、造粒并制成劑型，即為本發(fā)明醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可用于預(yù)防及/或治療骨艱流失，其中骨質(zhì)流失包括骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)疏松性骨折。此醫(yī)藥組合物可增加個(gè)體的骨密度(BMD)、骨含量(BMC)及骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。一般而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可增加5.15°/。的骨密度、3.77%的骨含量及30.0°/。的骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性，在優(yōu)選實(shí)施中可增加10.30%的骨密度、11.32%的骨含量及68.0。/。的骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。且此醫(yī)藥組合物亦可增加個(gè)體骨組織的最大應(yīng)力(maximalload)、斷裂力量(ultimateloading),楊氏系數(shù)(young'smodulus)及斷裂強(qiáng)度(ultimatestress)。一般而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可增加3.14%的最大應(yīng)力、5.23%的斷裂力量、7.49%的楊氏系數(shù)及15.65%的斷裂強(qiáng)度，在優(yōu)選實(shí)施中可增加10.24%的最大應(yīng)力、13.15%的斷裂力量、10.07%的楊氏系數(shù)及37.39%的斷裂強(qiáng)度。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可依實(shí)際需要制作成各種不同形式的劑型，例如錠劑、膠嚢、顆粒、粉末、液劑、或丸劑等。在另一種實(shí)施例中，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包括有效量的歐前胡素(imperatorin)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其可為口服或注射劑型，注射劑型可為肌肉注射或皮下注射。此醫(yī)藥組合物可增加個(gè)體的骨密度、骨含量及骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，一般而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可增加12.22%的骨密度、28.91%的骨含量及6.0%的骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，在優(yōu)選實(shí)施中可增加90%的骨細(xì)胞石威性磷酸酶活性。在另一種實(shí)施例中，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包括有效量的香檸檬烯(bergapten)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其可為口服或注射劑型，注射劑型可為肌肉注射或皮下注射。此醫(yī)藥組合物可增加個(gè)體的骨密度、骨含量及骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性，一般而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可增加12.22%的骨密度、33.73%的骨含量及5%的骨細(xì)^^威性磷酸酶活性，在優(yōu)選實(shí)施中可增加75%的骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。本發(fā)明中所提及的個(gè)體為動(dòng)物，包括人類或非人類的動(dòng)物，如狗、貓、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、或非人熟知此的技術(shù)人員靈長類。在一種實(shí)施例中，哺乳類動(dòng)物為人，在另一種實(shí)施例中，哺乳類動(dòng)物為嚙齒類動(dòng)物，如小鼠或大鼠。以下通過實(shí)施例以更進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例1.本發(fā)明醫(yī)藥組合物熟知此的技術(shù)人員制備本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，由甘草(購自金保安貿(mào)易有限公司)30公斤、黑豆(購自迪泰貿(mào)易有限公司)60公斤、蛇床子(購自易承貿(mào)易有限公司)10公斤、鹿角(購自迪泰貿(mào)易有限公司)8公斤組成。首先，將甘草加熱至100。C，以水萃取，取萃取液150公升。再將黑豆和蛇床子以30%的乙醇浸泡20小時(shí)，再加熱至80。C萃取，與甘草萃取液合并，彼此的體積比為甘草:黑豆+蛇床子=1:2,經(jīng)減壓濃縮得濃縮液30公升，于濃縮液中加入鹿角粉后于60。C下干燥48小時(shí)。干燥物粉碎后造粒并制成劑型。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)熟知此的技術(shù)人員步驟采用國科會(huì)國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖及研究中心，Sprague-Dawley品種、8周齡的雌性大鼠，經(jīng)飼養(yǎng)4周后，進(jìn)行切除卵巢手術(shù)。隨機(jī)分為(l)假手術(shù)組，(2)卵巢切除控制組和(3)卵巢切除給予醫(yī)藥組合物治療三組，將Sprague-Dawley大鼠用400mg/kg的三氯乙醛(trichloroacetaldehyde)麻醉，無菌操作，經(jīng)腰推旁切口進(jìn)入大鼠腹腔背側(cè)，將去卵巢控制組及卵巢切除+股立補(bǔ)組的大鼠雙側(cè)卵巢完全切除，假手術(shù)組不切卵巢，止血縫合。術(shù)后攝食和飲水如前。隔天后醫(yī)藥治療組開始經(jīng)口灌服醫(yī)藥組合物，每公斤體重每天1.2克，每天1次，假手術(shù)組和去卵巢組則灌服羧基甲基纖維素(Carboxymethylcellulose,CMC)。給藥劑量每周按體重校正1次，共哏養(yǎng)、給藥6周，6周后處死全部大鼠。3.醫(yī)藥組合物對(duì)骨長度及重量的影響上述大鼠處死后，將二側(cè)股骨(femur)及脛骨(tibia)取出儲(chǔ)存于-80。C熟知此的技術(shù)人員冰箱，且將股骨及脛骨外的肌肉與結(jié)締組織剃除，利用微量天平測(cè)量骨頭的重量，骨頭長度則是利用微量表尺測(cè)量(士0.05mm),骨量(BMD)及骨密度(BMC)是以dual-energyX-rayabsorptiometer(DEXA，XR-26;Norland,FortAtkinson,WI)測(cè)量。且將股骨于4%福爾馬林中固定二天后，置于4。C的EDTA(10。/。)脫4丐二星期，利用酒精脫水后將股骨包埋至石蠟中估文5mm切片。利用Mayer'shematoxylin-eosin溶齊寸染色,再4吏用Image-proplus(3.0ed)軟件定量二級(jí)海纟帛骨(secondaryspongiosa)的骨量(bonevolume)。參照第1圖，去卵巢組的體重比假手術(shù)組重，且服用本發(fā)明的醫(yī)藥組合物并不會(huì)抑制大鼠體重的增加。參照第2圖，由骨組織切片中可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的醫(yī)藥組合物有防止骨質(zhì)流失的作用。其它數(shù)據(jù)如表一所示。表一、醫(yī)藥組合物對(duì)骨組織的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4.骨生物力學(xué)的分析使用materialtestingsystem(MTS-858,MTSSystemInc.,Minneapolis,MN)三點(diǎn)折斷(three-pointbendingtest)來量測(cè)骨組織生物力學(xué)。骨頭二端的距離為20mm,壓垂下降的速度為每分鐘1mm，將所得速度及壓力做回歸線及帶入下方公式后即可得到楊氏系數(shù)及斷裂強(qiáng)度。__表二、醫(yī)藥組合物對(duì)骨組織生物力學(xué)的影響_卵巢切除控制組+醫(yī)藥卵巢切除控制組卵巢切除控制組+醫(yī)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5.初代成骨細(xì)胞的培養(yǎng)取自于懷孕第18天Spraque-Dawley鼠胚胎的頂骨架(parietalbone),母鼠處死后，整個(gè)子宮取下放于無菌的培養(yǎng)亞中，由子宮取出胎鼠并將其頭顱骨(calvarium)分離出來，剪下頂骨且避免取到骨縫(suture),將骨片兩側(cè)的骨膜層去除，再將骨片切成碎片，以0.1%的膠原蛋白酶(collagenase)將骨片做每次20分鐘共5次的序列性消化，以便使細(xì)胞從骨片釋放出來。收集最后三次消化出來的細(xì)胞，混合這三次消化的細(xì)胞即為成骨細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞培養(yǎng)于a-MEM，其中含1。/。的盤尼西林-鏈霉素(penicillin-streptomycin)及10%的FBS，置于37。C含5。/。C02的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞長滿時(shí)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)只取用第一代至第五代作為實(shí)驗(yàn)材料。6.分析醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)細(xì)胞增殖的作用將上述成骨細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)JDi中，分別加入5、15、50、100pg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)醫(yī)藥組合物的濃縮物，作用48小時(shí)后，小心吸除細(xì)胞上培養(yǎng)液，依照CellProliferationELISA，BrdUkit(RocheAppliedScience)的過程來測(cè)定細(xì)胞增殖作用。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的細(xì)胞增殖率定為100°/。。結(jié)果如第3A-3B圖所示，所有的成份均可增加骨細(xì)胞的增殖。7.分析醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP〗活性的影響將上述成骨細(xì)胞分別以5、15、50、100pg/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)醫(yī)藥組合物的濃縮物處理后，加入0.2。/。NP-40將細(xì)胞溶解，溶解液經(jīng)過振蕩再離心1500xg五分鐘，利用ALPkit測(cè)量上清液中ALP的活性。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的ALP的活性定為100%。結(jié)果如第4圖所示，除了黑豆之外，其它成份均會(huì)增加骨細(xì)胞ALP的活性。8.分析醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)骨細(xì)胞礦化的影響對(duì)成骨細(xì)胞分別給予分化培養(yǎng)液(含50pg/ml的維生素C及10mM的卩:甘油磷酸酯(P-glycerophosphate))及5、15、50、100ng/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)醫(yī)藥組合物的濃縮物，培養(yǎng)液每三天更換一次，14天后細(xì)胞加入75%乙醇固定三十分鐘，再加入40mM的茜素紅(Alizarinred-S)在室溫下作用一個(gè)小時(shí)，以去除未與鈣鍵結(jié)的染劑，最后加入10。/。的氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloride)溶解，利用550nm吸光值測(cè)量骨小結(jié)含量。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的礦化程度定為100%。結(jié)果如第5A-5B圖所示，除了黑豆外，其它4種成份均可增加礦化作用。9.分析醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響利用針筒抽出6-8周Spraque-Dawley老鼠的骨髓，經(jīng)過一天的沉降，計(jì)算漂浮的細(xì)胞(hematopoieticcell)lx106顆于培養(yǎng)皿中，分別加入分化劑(含50ng/ml的RANKL及20ng/ml的M-CSF)以及150pig/ml的(1)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)醫(yī)藥組合物的濃縮物，每三天更換分化劑，培養(yǎng)8天后，以耐酒石酸的酸性磷酸酵素(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)染色，在顯微鏡下計(jì)算染到TRAP且細(xì)胞核多于3個(gè)的細(xì)胞。以加入0.1%DMSO做為對(duì)照組。參照第6A圖，僅有黑豆成份會(huì)少許地抑制破骨細(xì)胞的分化。10.分析醫(yī)藥組合物中各成份對(duì)破骨細(xì)胞再吸收作用的影響將五天大的紐西蘭兔處死，利用剪刀剪碎長骨且分離出骨壁上成熟的破骨細(xì)胞，將細(xì)胞收集并種于OAAS盤中，分別給予150pg/ml的(l)甘草、(2)黑豆+蛇床子、(3)蛇床子、(4)黑豆及(5)醫(yī)藥組合物的濃縮物，經(jīng)培養(yǎng)3天后，加入1N的氬氧化鈉(NaOH)將細(xì)胞溶解后清洗3次，利用數(shù)字相機(jī)在顯微鏡下取得影像，使用影像分析軟件(Image-ProPlus3.0)計(jì)算破骨細(xì)胞吸收的區(qū)域面積。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的破骨細(xì)胞再吸收率定為100%。參照第6B圖，上述5種分份均不會(huì)影響破骨細(xì)胞再吸收的作用。11.分析歐前胡素(imperatorin)及香檸檬烯(bergapten)對(duì)骨細(xì)胞存活的影將骨細(xì)胞鋪在96孔培養(yǎng)皿中，分別以0.3、1、3、10pM的歐前胡素及香檸檬烯作用48小時(shí)后，小心吸除細(xì)胞上培養(yǎng)液，加入MTT(0.5mg/ml)溶液于37。C下作用30分鐘，接著吸掉溶液，以100jal的二曱基亞楓(DMSO)來溶解細(xì)胞，最后用Bio-KineticElisaReader(BIO-TEK)于波長550nm下測(cè)定其吸光值。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)定為100%。參照第7A圖，歐前胡素及香檸檬烯均不會(huì)影響骨細(xì)胞的存活。12.分析歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞增殖的影響將上述成骨細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)皿中，分別以0.3、1、3、10nM的歐前胡素及香桿檬烯處理48小時(shí)后，小心吸除細(xì)胞上培養(yǎng)液，依照CellProliferationELISA,BrdUkit(RocheAppliedScience)的過程來測(cè)定細(xì)胞增殖作用。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的細(xì)胞增殖定為100%。參照第7B圖，歐前胡素及香檸檬烯均不會(huì)影響骨細(xì)胞的增殖。13.分析歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞ALP活性的影響將上述成骨細(xì)胞分別以0.3、1、3、10nM的歐前胡素及香檸檬烯處理后，加入0.2。/。NP-40將細(xì)胞溶解，溶解液經(jīng)過振蕩再離心1500xg五分鐘，利用ALPkit測(cè)量上清液中ALP的活性。加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的ALP的活性定為100%。結(jié)果如第8A圖所示，歐前胡素及香檸檬烯均可增加ALP的活性。14.分析歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞分泌膠原蛋白(collagen)的影響利用測(cè)量4-羥基脯胺酸(4-hydroxyproline)含量代表成骨細(xì)胞膠原蛋白合成的量。將上述成骨細(xì)胞分別以0.3、1、3、10MM的歐前胡素及香檸檬烯處理后，在細(xì)胞分化后給予6NHC1溶解細(xì)胞，將溶解液置于玻璃管中在116。C下水解16小時(shí)。將水解液真空抽干，加入等量的水溶解，在550nm波長下測(cè)量4-羥基脯胺酸(4-hydroxyproline)的含量。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的膠原蛋白的量定為100%。結(jié)果如第8B圖所示，歐前胡素及香檸檬烯均不會(huì)影響骨細(xì)胞分泌膠原蛋白的能力。15.分析歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨細(xì)胞礦化的影響成骨細(xì)胞給予分化培養(yǎng)液(含50pg/ml的維生素C及10mM的p甘油磷酸酉旨(3-glycerophosphate))，培養(yǎng)液每三天更換一次，且同時(shí)以0.3、1、3、10pM的歐前胡素及香檸檬烯處理，14天后加入75%乙醇固定三十分鐘，再加入40mM的茜素紅(Alizarinred-S)在室溫下作用一個(gè)小時(shí)，去除未與鉤鍵結(jié)的染劑，最后加入10。/c的氯化十六烷基吡吱(cetylpyridiniumchloride)溶解，利用550nm吸光值測(cè)量骨小結(jié)含量。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的骨小結(jié)的礦化定為100%。結(jié)果如第8C-8D圖所示，歐前胡素及香檸檬烯均可增加礦化作用。16.分析歐前胡素及香檸檬烯對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白O)onemorphogeneticprotein,BMP-2)基因的表達(dá)將骨細(xì)胞培養(yǎng)在6孔的培養(yǎng)皿之中，分別加入0.3、1、3、10jiM並歐前胡素及香檸檬烯處理l、3、6、12小時(shí)后，加入TRIzolreagent于室溫靜置5分鐘使細(xì)胞溶解，將細(xì)胞溶解液體收集于離心管，加入0.5ml的氯仿(chloroform)振搖成均勻的乳白色液，于室溫靜置5分鐘使溶液分層后，在4°C下以14000xg離心15分鐘，之后小心抽取上清液，加入0.25ml的異丙醇(isopropanol)并翻轉(zhuǎn)離心管使其混合，接著在4。C下以14000xg離心15分鐘后可得到沉淀析出的RNA,倒掉上清液后再以75%酒精清洗沉淀物，再于4。C下14000xg離心10分鐘，最后將RNA風(fēng)干并加入適量的DEPC(diethylpyrocarbonate)水溶解，以0026()/28()定量。RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA的過程是利用SupperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶，而定量PCR則是使用ABIPrism7卯0，而反應(yīng)的試劑都來自AppliedBiosystems公司。以甘油趁碌酸脫氬酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)為對(duì)照組，并以對(duì)照組的BMP-2mRNA的表達(dá)量定為100%。參照第9A圖，BMP-2mRNA的表達(dá)量會(huì)隨著歐前胡素及香檸檬烯的增加而增加，參照第9B圖，在固定歐前胡素及香檸檬烯的濃度下，BMP-2mRNA的表達(dá)量也會(huì)隨著時(shí)間的增加而增加。17.分析歐前胡素、香檸檬烯及BMP拮抗劑faoggin)對(duì)骨細(xì)胞ALP活性的影響將上述成骨細(xì)胞分別以(l)10joM的歐前胡素、(2)IO^iM的香檸檬烯、(3)IO^iM的歐前胡素+noggin、(4)10,的香檸檬烯+noggin及(S)lpg/ml的noggin處理48小時(shí)后，加入0.2°/。NP-40將細(xì)胞溶解，溶解液經(jīng)過振蕩再離心1500xg五分鐘，利用ALPkit測(cè)量上清液中ALP的活性。以加入0.1%的DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的ALP活性定為100%。結(jié)果如第9C圖所示，noggin可抑制由歐前胡素及香檸檬烯所促進(jìn)的ALP活性，并由實(shí)施例17-18的結(jié)果可知，歐前胡素及香檸檬烯可能是經(jīng)由增加BMP-2的量而促進(jìn)骨細(xì)胞的分化。18.分析歐前胡素及香檸檬烯對(duì)SMADs、p38及EPK蛋白磷酸化的影，將細(xì)胞培養(yǎng)在6井的培養(yǎng)亞之中分別以10(aM的歐前胡素及香檸檬烯處理1、3、6、12、24小時(shí)后，將培養(yǎng)基吸走，加入適當(dāng)?shù)娜芙饩彌_液(lysisbuffer)(含50rnMHEPES(PH7.4),150mMNaCl,4mMEDTA,lOmMNa4P207，lOOmMNaF,2mMNa3V04，1%(v/v)TritonX畫100，0.25%(w/v)氧膽酸鈉(sodiumdeoxycholate)，50rnM的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylfluoride),50fxg/mlleupeptin,和20jig/ml抑肽酶(aprotinin))，將細(xì)胞用刮灼刮下，當(dāng)完全萃取后吸至離心管，以13,000rpm離心15分鐘。將30嗎的等量蛋白質(zhì)加入5倍Laemmlibuffer,在9S。C煮5分鐘，以8%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)印至PVDFmembrane,然后加入含有4。/oBSA于室溫下1小時(shí)后，用含有0.1%Tween-20的PBS(PBST)清洗三次，加入一次抗體(分別為p-SMAD、p-ERK、P-38)在室溫反應(yīng)1小時(shí)，經(jīng)PBST清洗三次后，加入標(biāo)記山葵過氧化酶的山羊抗老鼠或山羊抗兔子的二次抗體，于室溫反應(yīng)1小時(shí)，最后以PBST清洗3次后，即用ECL試劑偵測(cè)進(jìn)行酵聯(lián)結(jié)素冷光分析。以加入a-tubuline做為對(duì)照組。參照第10圖，歐前胡素及香檸檬烯均可促進(jìn)SMADs、p38及EPK蛋白的磷酸化。19.分析p38抑制劑(SB203580)及ERK抑制劑(PD98059)對(duì)p38及EPK蛋白磷酸化的影響所有步驟與實(shí)施例17相同，僅在以歐前胡素及香檸檬烯處理前，先以10fxM的p38抑制劑(SB203580)及ERK抑制劑(PD98059)處理30分鐘。以加入未磷酸化p38或ERK做為對(duì)照組。結(jié)果如第11A-11B圖所示，p38抑制劑(SB203580)及ERK抑制劑(PD98059)均可抑制由歐前胡素及香檸檬烯所促進(jìn)的磷酸化?；钚缘挠绊憣⑸鲜龀晒羌?xì)胞分別以(l)IO^iM的SB203580、(2)lO(iM的PD98059、(3)10|iM的歐前胡素及(4)lO(iM的香4寧檬烯、(5)10pM的歐前胡素+SB203580、(6)10pM的香檸檬烯+SB203580、(7)10pM的香檸檬烯+PD98059及(8)IO一PD98059處理48小時(shí)后，加入0.2%NP-40將細(xì)胞溶解，溶解液經(jīng)過振蕩再離心1500xg五分鐘，利用ALPkit測(cè)量上清液中ALP的活性。以加入0.1Q/。DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的ALP活性定為100%。結(jié)果如第11D圖所示，p38抑制劑(SB203580)及ERK抑制劑(PD98059)均可抑制由歐前胡素及香檸檬烯所促進(jìn)的骨細(xì)胞ALP活性。性的影響所有步驟與實(shí)施例19相同，僅將部份實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞材料改為p38突變株(DN-p38，由Dr.J.Han(ScrippsResearchInstitute,SanDiego，CA)提供)及ERK突變抹(DN-ERK,由Dr.M.Cobb(South-WesternMedicalCenter,Dallas,TX)提供)，如下所示(l)DN-p38細(xì)胞抹、(2)DN-ERK細(xì)胞抹、(3)DN-p38細(xì)胞抹+1OpM的歐前胡素、(4)DN-p38細(xì)胞林+10幽的香檸檬烯、(5)DN-ERK細(xì)胞抹+10(aM的歐前胡素(6)DN-ERK細(xì)胞抹+10jxM的香檸檬烯(7)正常骨細(xì)胞+10jxM的歐前胡素(8)正常骨細(xì)胞+10pM的香檸檬烯。以0.P/。DMSO做為對(duì)照組，并以對(duì)照組的ALP活性定為100%。結(jié)果如第11D圖所示，p38突變抹(DN-p38)及ERK突變抹(DN-ERK)可抑制由歐前胡素及香檸檬烯所促進(jìn)的骨細(xì)胞ALP活性，并可由實(shí)施例18-20的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，歐前胡素及香檸檬烯是經(jīng)由SMADs、p38及EPK蛋白來增加骨細(xì)胞的作用。22.以歐前胡素及香檸檬烯進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取三周大雄性幼鼠(Sprague-Dawley)，體重范圍78至90克，以400mg/ml的單水三氯乙醛(trichloroacetaldehydemonohydrate)麻醉，將22G針頭尖端取下，針頭消毒后將其埋入脛骨接近膝蓋處，隔日，針頭外端便會(huì)被外皮覆蓋過去，利用30G針頭所做成的軟管進(jìn)行注射，每次注射量為10pl，分別給予生理食鹽水、30拜的歐前胡素或香檸檬烯，連續(xù)施打一周后，休息一周，將小鼠處死取出脛骨，去除肌肉及結(jié)締組織，使用DEXA測(cè)量BMD及BMC,完成上述過程后將脛骨利用石蠟包埋切片染色。由表三可知，歐前胡素及香檸檬烯均可增加脛骨的BMD及BMC,且第12圖切片染色結(jié)果可知，歐前胡素及香檸檬烯均可促進(jìn)骨質(zhì)的合成。表三、歐前胡素及香檸檬烯對(duì)BMD及BMC的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可增加股骨及脛骨的重量、骨密度，并在其它的生化測(cè)試中證實(shí)，其可增加ALP的活性及膠原蛋白的含量，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防^/或治療骨質(zhì)流失。雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟知此的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作些許的更動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視附上的權(quán)利要求所界定的范圍為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，包括有效量的甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，其中各成份的重量比為甘草∶黑豆∶蛇床子∶鹿角＝1-10∶2-10∶1-10∶1-10。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防A/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該各成份的重量比為甘草黑豆蛇床子鹿角=2-4:4-6:1-3:1-3。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該蛇床子包含蛇床子素(osthol)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該蛇床子包含歐前胡素(imperatorin)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該蛇床子包含香檸檬烯(bergapten)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該骨質(zhì)流失包括骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)疏松性骨折。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防;sj或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加10.3。/。以上的骨密度(BMD)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防^/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加11.3%以上的骨含量(BMC)。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加90%以上的骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防^/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨組織10.2。/。以上的最大應(yīng)力(maximalload)。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防A/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨組織13.2。/。以上的斷裂力量(uMmateloading)。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防^/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨組織10.1Q/o以上的楊氏系數(shù)(young，smodulus)。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防^/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨組織34.8。/。以上的斷裂強(qiáng)度(ultimatestress)。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防^/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物的型態(tài)選自:錠劑、膠嚢、顆粒、粉末、液劑或丸劑。15.—種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，包括有效量的歐前胡素(imperatorin);以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該骨質(zhì)流失包括骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)疏松性骨折。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加95.0。/。以上的骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨細(xì)胞102.0%以上的膠原蛋白含量。19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨細(xì)胞110.0%以上的礦化能力。20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加12.2。/。以上的骨密度(BMD)。21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加28.9。/。以上的骨含量(BMC)。22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物包括口服或注射劑型。23.—種預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，包括有效量的香檸檬烯(bergapten);以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該骨質(zhì)流失包括骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)疏松性骨折。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加80.0%以上的骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨細(xì)胞100.0%以上的膠原蛋白含量。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加骨細(xì)胞105.0%以上的礦化能力。28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加12.2。/。以上的骨密度(BMD)。29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物增加33.7。/o以上的骨含量(BMC)。30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其中該醫(yī)藥組合物包括口服或注射劑型。31.—種預(yù)防及或治療骨質(zhì)流失的醫(yī)藥組合物，其由下述重量配比的原料制成，所述原料為甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，其中各成份的重量比為甘草黑豆蛇床子鹿角為1-10:2-10:1-10:1-10。全文摘要本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，包括有效量的甘草、黑豆、蛇床子及鹿角，且該醫(yī)藥組合物可預(yù)防及/或治療骨質(zhì)流失。文檔編號(hào)A61K36/185GK101164557SQ20061013559公開日2008年4月23日申請(qǐng)日期2006年10月18日優(yōu)先權(quán)日2006年10月18日發(fā)明者張金鳴,符文美,簡美英,陳兆祥申請(qǐng)人:科達(dá)制藥股份有限公司