專利名稱：一種犬、狐、貂用抗犬瘟熱免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療和預(yù)防犬、狐、貂犬瘟熱的免疫球蛋白，國際專利分類號為A61K39/395。
背景技術(shù)：
犬瘟熱是一種急性、傳染性極強(qiáng)的傳染病。犬科(犬、狐等)和鼬科(貂等)均感染。對犬，主要侵犯幼犬，極少見于成年犬，在沒有犬瘟熱的地區(qū)首次爆發(fā)犬瘟熱，死亡率可達(dá)90％；對水貂，犬瘟熱稱貂瘟，當(dāng)貂屬動物為傳染源時(shí)，經(jīng)3～4周即可在貂群中引起廣泛傳播，癥狀嚴(yán)重，死亡率高，有時(shí)高達(dá)80％～90％，特別是幼獸。因此，犬瘟熱是養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的傳染病。
犬、狐、貂對犬瘟熱病毒敏感。犬瘟熱康復(fù)后能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)持久的免疫力。對其預(yù)防接種，可產(chǎn)生抗犬瘟熱特異性抗體，又稱免疫球蛋白?？贵w可以與刺激它們產(chǎn)生的犬瘟熱抗原決定簇發(fā)生特異性反應(yīng)。不同種類的動物對同一病毒的不同抵抗力和敏感性是人們早已認(rèn)識的事實(shí)，馬屬動物(馬、驢、騾)對犬瘟熱病毒不易感，但在免疫原的刺激下，同樣呈現(xiàn)高度特異的免疫反應(yīng)。用馬屬動物制備犬、狐、貂用免疫球蛋白不僅生產(chǎn)量大，而且可以避免犬、狐、貂的其它病毒性傳染病通過制備過程而造成人為傳染。
給犬、狐、貂被動輸入免疫球蛋白，常可使其對犬瘟熱的感染呈現(xiàn)預(yù)防和獨(dú)特的治療作用。但必須使輸入的免疫球蛋白達(dá)到保護(hù)所需的水平。這種被動免疫是短暫的，不超過2周，因此用于緊急預(yù)防是合理的，用于早期治療是確實(shí)的，也是獨(dú)特的。
犬、狐、貂的犬瘟熱疫苗接種，仍是預(yù)防犬瘟熱的最為合理的措施。
犬瘟熱滅活疫苗，給犬、狐、貂免疫產(chǎn)生的抗體滴度下降很快，與初乳抗體相似，每10天下降50％，不論滅活苗是否加入佐劑，抗體持續(xù)期都比弱毒疫苗短得多，一般情況下滅活苗極少應(yīng)用。
犬瘟熱活疫苗，特別是用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)弱毒苗，接種后抗體滴度甚高，免疫力堅(jiān)強(qiáng)而持久。主要存在的問題是因害怕母源抗體影響，對斷奶前的仔獸不能免疫接種，如確系母源抗體在保護(hù)所需水平之上，免疫接種一定造成免疫失敗。但是如果因初乳中母體抗體低，仔獸通過初乳獲得的母源抗體達(dá)不到保護(hù)所需水平，那么仔獸就有感染犬瘟熱病毒的極大可能。又如在接種疫苗后，需經(jīng)2～3周才能產(chǎn)生免疫力，接種后4周左右，抗體滴度達(dá)到高峰。因此接種疫苗后的3～4周內(nèi)，仔獸就有感染犬瘟熱病毒的極大可能；再如犬瘟熱弱毒的最小免疫量為104TCID50，使用劑量為20個(gè)最小免疫劑量即2×105TCID50；由于犬瘟熱弱毒對可見光和溫度等較敏感，常使免疫接種的毒量不夠而使免疫失敗。加之在首次免疫后，間隔21天應(yīng)再行二次甚至三次免疫，免疫次數(shù)不夠，以致于在免疫有效期的后期，有了發(fā)生犬瘟熱的條件。
對犬、狐、貂已發(fā)犬瘟熱，用犬瘟熱活疫苗緊急接種，用麻疹弱毒疫苗緊急接種，對周圍健康犬、狐、貂的預(yù)防和對發(fā)病犬、狐、貂的治療作用不是很大。因?yàn)槿翢峄钜呙缇o急接種，在犬、狐、貂健康的情況下，2～3周才能產(chǎn)生免疫力，在2～3周前，在疫區(qū)內(nèi)發(fā)病和未發(fā)病的，均有全軍覆沒的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種對犬瘟熱有預(yù)防及治療作用的一種犬、狐、貂用抗犬瘟熱免疫球蛋白。
本發(fā)明的免疫原采用從俄羅斯引進(jìn)的犬瘟熱弱毒Rockborn株，經(jīng)犬腹腔巨噬細(xì)胞復(fù)壯，用Vero細(xì)胞增殖，每0.1ml含毒≥105TCID50，經(jīng)冷凍超速離心機(jī)差異離心濃縮每0.1ml含毒≥107.0TCID50。與弗氏完全佐劑等量(1∶1)混合為抗原；本發(fā)明采用吉林鯨象動物藥業(yè)有限公司研制的苷肽注射液(發(fā)明名稱為一種提高動物免疫功能的苷肽注射液，專利申請?zhí)枮?005 1 0016626.2)為免疫增強(qiáng)劑，5ml/支。
本發(fā)明選擇馬、驢、騾免疫動物。3～8歲、體型大、性情溫順、健康良好者；馬傳貧、鼻疽檢疫陰性者；免疫前經(jīng)隔離飼養(yǎng)觀察健康者。
免疫程序?qū)︸R匹實(shí)施基礎(chǔ)免疫和強(qiáng)化免疫。
1、基礎(chǔ)免疫 第一次免疫為基礎(chǔ)免疫，抗原1，4ml，背部兩側(cè)4點(diǎn)皮內(nèi)注射，苷肽注射液5.0ml，臀部肌肉注射。
2、強(qiáng)化免疫 基礎(chǔ)免疫后21天，行2次強(qiáng)化免疫，每次間隔7天，第一次免疫抗原1的量為8ml，背部兩側(cè)4點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)1ml，肩部兩側(cè)淋巴結(jié)每點(diǎn)2ml；第二次免疫，犬瘟熱弱毒細(xì)胞培養(yǎng)濃縮病毒液3ml，靜脈緩慢注射。每次強(qiáng)化免疫時(shí)，臀部肌肉注射苷肽注射液5.0ml。
驗(yàn)血及放血標(biāo)準(zhǔn) 用固定病毒稀釋血清法，在最后一次免疫后14天，測免疫馬、驢、騾血清中的抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)。待中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶1024時(shí)，即可采血。
采血及血清分離 符合放血標(biāo)準(zhǔn)的馬、驢、騾，第一次采血，接15～18ml/kg體重，間隔3～5天日進(jìn)行第二次采血，二次采血量比一次采血量少300～400ml；二次采血后，免疫動物休息20天后進(jìn)行第二程強(qiáng)化免疫，依此類推。
采集的血液用加壓自然凝結(jié)法分離血清。
血清的精制血清→倍量加蒸餾水，用2mol/L鹽酸調(diào)PH至3.4～3.6，按每ml6～9單位的量加入胃蛋白酶，按總量0.2％加入甲芐，29～31℃消化2～21小時(shí)→按總量的15％加入硫酸銨，2mol/L的氫氧化鈉調(diào)PH4.5～4.7，56～58℃水浴30分鐘，冷卻至43℃以下濾過，取濾液→濾液用2mol/L氫氧化鈉液調(diào)PH至7.1～7.3，按總量20％加入硫酸銨，帆布濾過，取沉淀→沉淀加5～6倍蒸餾水溶解，按總量加入10％明礬溶液，使明礬含量為1％，用2mol/L的氫氧化鈉液，調(diào)PH7.7～7.8，靜置2～4小時(shí)使之沉淀，帆布濾過，取濾液→收集的濾液按總量的38％加入硫酸銨，帆布濾過，棄上清，沉淀壓干用透析袋分袋包裝，每袋約200～250g加少許氯仿，放置在流水槽內(nèi)48～72小時(shí)→收集袋內(nèi)血清，按總量的0.5％加入氯仿，0.85％加入氯化鈉和0.0035％加入硫柳汞，搖勻，過濾除菌。即為精制抗犬瘟熱免疫球蛋白的半成品。
半成品效價(jià)測定及分裝用固定病毒稀釋血清法，測半成品的抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)(log10SN50)SN≥2048；產(chǎn)品的規(guī)定效價(jià)SN≥1300，附加20％，因此將半成品稀釋至SN≥1600，定量分裝。
犬、狐、貂血清抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)與犬瘟熱強(qiáng)毒攻毒保護(hù)的關(guān)系；犬、狐、貂血清SN≥50，90％以上保護(hù)，SN28～40，50％以上保護(hù)；＜16不保護(hù)。
用本發(fā)明產(chǎn)品，按1ml/kg體重給犬、狐、貂注射，4h后，其血清抗犬瘟熱抗體SN≥50，可持續(xù)14天以上。因此，犬、狐、貂的預(yù)防使用劑量為1ml/kg體重，而對已發(fā)犬瘟熱的犬、狐、貂，早期治療為2ml/kg體重，病情重者或二次注射或加大注射劑量。
在犬、狐、貂的養(yǎng)殖場，發(fā)生犬瘟熱疫情時(shí)，緊急預(yù)防注射，96％以上保護(hù)；發(fā)病的隔離早期治療，90％以上治愈；門診發(fā)病犬，配合輔助治療，重者2～3次治療，治愈率約85％。
本發(fā)明的積極效果1、安全性好 生產(chǎn)免疫球蛋白的精制工藝中，用胃蛋白酶消化血清；調(diào)PH4.5～4.7，56～58℃水浴30分鐘，可以消除異種血清對犬、狐、貂可能的過敏反應(yīng)(過敏反應(yīng)很少發(fā)生)，可以對犬、狐、貂敏感病毒可能污染的有效滅活(外原病毒污染檢驗(yàn)為陰性)從根本上保證了產(chǎn)品的安全性。用5倍使用劑量(5ml/kg)給犬、狐、貂的幼獸肌肉或皮下注射，觀察兩周均無不良反應(yīng)。
2、抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)高 將犬瘟熱弱毒(每0.1ml含毒105TCID50)，經(jīng)差異離心法濃縮100倍，加佐劑(福氏完全佐劑)，配合免疫增強(qiáng)劑(苷肽注射液)，按最佳途徑(皮內(nèi)、淋巴結(jié)、靜脈)和劑量，經(jīng)1次基礎(chǔ)免疫和兩次強(qiáng)化免疫，而使馬、驢、騾的血清抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)≥1024，接近用犬做為免疫動物制備免疫球蛋白的水平。精制工藝又確保中間品抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)≥2048。較好解決了用馬制備抗犬瘟熱免疫球蛋白效價(jià)不高的問題。
3、使用劑量的準(zhǔn)確性 犬、狐、貂血清中的抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)≥50時(shí)，用犬瘟熱強(qiáng)毒攻擊，90％以上保護(hù)；產(chǎn)品的抗犬瘟熱中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)為≥1024；用1ml/kg體重的產(chǎn)品給犬、狐、貂肌注，4h后，血清抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)≥50。而且持續(xù)14天以上。
4、臨床試用效果好 在發(fā)生犬瘟熱的養(yǎng)犬場(3個(gè)，犬300只)，養(yǎng)貂場(5個(gè)，貂3萬只)養(yǎng)狐場(1個(gè)，狐貍600只)，對發(fā)病的隔離早期治愈率90％，其余均緊急預(yù)防接種，96％以上獲保護(hù)。在小動物醫(yī)院就診治療犬瘟熱病犬，由于達(dá)不到早期治療，所以在輔助治療及二次(有的三次)注射后，治愈率為85％左右?？傊谷翢崦庖咔虻鞍讓θ翢岬木o急預(yù)防和治療是有特效的。
5、保存運(yùn)輸方便 本品是用免疫馬、驢、騾的血清提取的免疫球蛋白，呈無色透明液體，在4℃條件下，抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)SN從1600降為1300的時(shí)間為1年，即4℃保存期為1年，運(yùn)輸也比較方便。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明免疫原是采用從俄羅斯引進(jìn)的犬瘟熱弱毒Rockborn株，經(jīng)犬腹腔巨噬細(xì)胞復(fù)壯，用Vero細(xì)胞增殖，每0.1ml含毒≥105TCID50，經(jīng)冷凍超速離心機(jī)差異離心濃縮每0.1ml含毒≥107.0TCID50。與弗氏完全完全佐劑等量(1∶1)混合為抗原；本發(fā)明采用吉林鯨象動物藥業(yè)有限公司研制的苷肽注射液為免疫增強(qiáng)劑，5ml/支。
免疫程序本發(fā)明選擇馬、驢、騾免疫動物。3～8歲、體型大、性情溫順、健康良好者；馬傳貧、鼻疽檢疫陰性者；免疫前經(jīng)隔離飼養(yǎng)觀察健康者。
對馬匹實(shí)施基礎(chǔ)免疫和強(qiáng)化免疫。
1、基礎(chǔ)免疫 第一次免疫為基礎(chǔ)免疫，抗原1，4ml，背部兩側(cè)4點(diǎn)皮內(nèi)注射，苷肽注射液5.0ml，臀部肌肉注射。
2、強(qiáng)化免疫 基礎(chǔ)免疫后21天，行2次強(qiáng)化免疫，每次間隔7天，第一次免疫抗原1的量為8ml，背部兩側(cè)4點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)1ml，肩部兩側(cè)淋巴結(jié)每點(diǎn)2ml；第二次免疫，犬瘟熱弱毒細(xì)胞培養(yǎng)濃縮病毒液3ml，靜脈緩慢注射。每次強(qiáng)化免疫時(shí)，臀部肌肉注射苷肽注射液5.0ml。
驗(yàn)血及放血標(biāo)準(zhǔn) 用固定病毒稀釋血清法，在最后一次免疫后14天，測免疫馬、驢、騾血清中的抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)。待中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶1024時(shí)，即可采血。
采血及血清分離 符合放血標(biāo)準(zhǔn)的馬、驢、騾，第一次采血，接15～18ml/kg體重，間隔3～5天日進(jìn)行第二次采血，二次采血量比一次采血量少300～400ml；二次采血后，免疫動物休息20天后進(jìn)行第二程強(qiáng)化免疫，依此類推。
采集的血液用加壓自然凝結(jié)法分離血清。
血清的精制血清→倍量加蒸餾水，用2mol/L鹽酸調(diào)PH至3.4～3.6，按每ml6～9單位的量加入胃蛋白酶，按總量0.2％加入甲芐，29～31℃消化2～21小時(shí)→按總量的15％加入硫酸銨，2mol/L的氫氧化鈉調(diào)PH4.5～4.7，56～58℃水浴30分鐘，冷卻至43℃以下濾過，取濾液→濾液用2mol/L氫氧化鈉液調(diào)PH至7.1～7.3，按總量20％加入硫酸銨，帆布濾過，取沉淀→沉淀加5～6倍蒸餾水溶解，按總量加入10％明礬溶液，使明礬含量為1％，用2mol/L的氫氧化鈉液，調(diào)PH7.7～7.8，靜置2～4小時(shí)使之沉淀，帆布濾過，取濾液→收集的濾液按總量的38％加入硫酸銨，帆布濾過，棄上清，沉淀壓干用透析袋分袋包裝，每袋約200～250g加少許氯仿，放置在流水槽內(nèi)48～72小時(shí)→收集袋內(nèi)血清，按總量的0.5％加入氯仿，0.85％加入氯化鈉和0.0035％加入硫柳汞，搖勻，過濾除菌。即為精制抗犬瘟熱免疫球蛋白的半成品。
半成品效價(jià)測定及分裝 用固定病毒稀釋血清法，測半成品的抗犬瘟熱中和抗體效價(jià)(log10SN50)SN≥2048；產(chǎn)品的規(guī)定效價(jià)SN≥1300，附加20％，因此將半成品稀釋至SN≥1600，定量分裝。
權(quán)利要求
1.一種犬、狐、貂用抗犬瘟熱免疫球蛋白，其特征是免疫原是采用從俄羅斯引進(jìn)的犬瘟熱弱毒Rockborn株；免疫佐劑采用弗氏完全佐劑；采用吉林鯨象動物藥業(yè)有限公司研制的苷肽注射液為免疫增強(qiáng)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種犬、狐、貂用抗犬瘟熱免疫球蛋白，其特征是免疫原犬瘟熱弱毒Rockborn株與免疫佐劑弗氏完全佐劑混合的體積比為1∶1；所述的免疫增強(qiáng)劑苷肽注射液，5ml/支。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種犬、狐、貂用抗犬瘟熱免疫球蛋白，其特征是犬瘟熱弱毒Rockborn株，經(jīng)犬腹腔巨噬細(xì)胞復(fù)壯，用Vero細(xì)胞增殖，每0.1ml含毒≥105TCID50，經(jīng)冷凍超速離心機(jī)差異離心濃縮每0.1ml含毒≥107.0TCID50。
全文摘要
一種犬、狐、貂用抗犬瘟熱免疫球蛋白，采用犬瘟熱弱毒Rockborn株細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)濃縮后以1∶1的體積比加入完全弗氏完全佐劑作為免疫原；其特點(diǎn)是基礎(chǔ)免疫用皮內(nèi)注射法，加強(qiáng)免疫用皮內(nèi)注射結(jié)合靜脈注射和淋巴結(jié)內(nèi)注射，可以有效地提高抗體效價(jià)，每次免疫均使用苷肽注射液作為免疫增強(qiáng)劑，以提高抗體效價(jià)；本發(fā)明的制備方法是按照中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(2000年版)規(guī)定的方法對制備的高免免疫球蛋白進(jìn)行加工；本發(fā)明的產(chǎn)品具有特異性強(qiáng)、安全性好、抗體效價(jià)高、不會產(chǎn)生藥物殘留、保存和使用方便、臨床應(yīng)用效果好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/12GK1958068SQ20061013163
公開日2007年5月9日 申請日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者張中洋 申請人:張中洋