專利名稱：一種治療性乙肝疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種生物制劑，特別是指用于慢性乙型肝炎治療的一種治療性乙肝疫苗組合物。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎是我國(guó)常見的傳染病之一，我國(guó)屬乙型肝炎病毒(HBV)高流行區(qū)，HBV感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。2004年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心對(duì)2002年中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查的血樣檢測(cè)結(jié)果表明，我國(guó)一般人群中HBsAg的流行率高達(dá)9.09％，據(jù)此推測(cè)，我國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約1.2億人，其中慢性乙型肝炎約3000萬(wàn)例。慢性乙型肝炎給國(guó)家和個(gè)人帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，我國(guó)每年因慢性乙型肝炎直接和間接損失約9000億元人民幣。應(yīng)當(dāng)指出在慢性乙肝治療方面尚未取得突破性進(jìn)展。
肝炎治療的總體目標(biāo)是最大限度的長(zhǎng)期抑制或消除HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和阻止疾病進(jìn)展，減少和防止肝臟失代償、肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生，從而改善生活質(zhì)量和延長(zhǎng)存活時(shí)間。慢性乙型肝炎治療主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化和對(duì)癥治療。
目前我國(guó)SFDA批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物有干擾素和核苷類似物(包括拉米夫定、阿德福韋酯和恩替卡韋)，雖然這些藥物對(duì)抑制病毒復(fù)制有重要作用，但存在著不徹底性。目前公認(rèn)“正規(guī)抗病毒治療結(jié)束1年后的病毒學(xué)應(yīng)答”作為評(píng)價(jià)慢性乙型肝炎治療效果的重要標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的抗病毒藥物治療結(jié)果總體上的有效率約為30％，只有少數(shù)患者獲得對(duì)病毒的持續(xù)應(yīng)答。
慢性乙型肝炎的治療應(yīng)答的影響因素十分復(fù)雜，它涉及了患者感染HBV的年齡，感染的方式，感染HBV的異質(zhì)性(不同的基因型和血清型)，HBV的載量，HBV的復(fù)制率，HBV的變異和HBV的免疫抑制作用以及機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)特別是樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的功能水平。應(yīng)當(dāng)指出抗病毒藥物的使用是治療的重要手段。且核苷類似物的研制近年來(lái)取得了較大的進(jìn)展，但這類藥物只能抑制HBV復(fù)制，還不能在人體內(nèi)徹底的清除HBV。我們應(yīng)十分關(guān)注免疫調(diào)節(jié)劑在慢性乙肝治療中的重要作用，盡管目前還缺乏乙型肝炎特異性免疫治療方法，但應(yīng)合理的使用現(xiàn)有的免疫調(diào)節(jié)劑，努力研制開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)藥物、治療性疫苗、新的疫苗佐劑和某些細(xì)胞因子，歸根結(jié)底調(diào)動(dòng)和誘導(dǎo)機(jī)體自身的免疫清除機(jī)制是治療慢性乙型肝炎的重要途徑。
總之誘導(dǎo)和維持HBV特異性的免疫應(yīng)答，打破免疫耐受重建機(jī)體免疫機(jī)制，具有重要的治療意義，是開發(fā)持續(xù)性HBV感染的免疫調(diào)節(jié)治療的重要理論依據(jù)和途徑。免疫調(diào)節(jié)治療的重要概念是企圖在大部分HBV慢性感染患者中誘導(dǎo)維持HBV特異性的免疫應(yīng)答，而這是抗病毒藥物無(wú)法達(dá)到的目標(biāo)，在這些免疫調(diào)節(jié)治療方法的諸多選擇中，無(wú)疑乙肝治療性疫苗是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
我國(guó)研制的治療性乙肝疫苗尚處在臨床觀察階段聞?dòng)衩返妊兄艸BsAg-抗HBs抗體復(fù)合物疫苗、吳玉章等研制的TT830 HBc 18-27表位組成的MAP短肽疫苗，張宜俊等研制乙肝表面抗原蛋白疫苗和陳光明等研制的DNA疫苗正在進(jìn)行I/II期臨床觀察。這些不同的研制者共同的特點(diǎn)是企圖通過(guò)增加HBV結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白的表位和糖基側(cè)鏈修飾成分或改變疫苗形式，輔以不同成分佐劑等途徑研制新型治療性乙肝疫苗，希望打破免疫耐受，重建免疫應(yīng)答特別是誘導(dǎo)和維持以HBV特異性的CTL為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這些治療性乙肝疫苗的臨床療效有待于更多的和較長(zhǎng)時(shí)間的臨床觀察。
近幾年來(lái)NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的非特異性免疫機(jī)制在病毒性肝炎中的作用，特別是肝臟天然免疫學(xué)對(duì)HBV感染的影響越來(lái)越受到重視，肝臟中NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞占肝臟淋巴總數(shù)的2/3左右，如此龐大的天然免疫淋巴細(xì)胞在HBV感染及其免疫致病和治療中的作用，引起學(xué)者的高度關(guān)注。傳統(tǒng)理論認(rèn)為Th1細(xì)胞和CD8+CTL在HBV感染、免疫損傷、病毒清除中起主導(dǎo)作用。但僅占肝臟淋巴細(xì)胞總數(shù)1/3的這類T細(xì)胞能否全部承擔(dān)HBV引起的肝臟損傷和病毒清除，值得深入觀察。NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞毒作用抑制HBV的復(fù)制在實(shí)驗(yàn)室得到充分的證明，特別應(yīng)當(dāng)指出NKT細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子不但可增強(qiáng)NKT細(xì)胞自身的細(xì)胞毒作用，還可選擇性的激活其他細(xì)胞如NK細(xì)胞和T細(xì)胞。NKT表達(dá)的IFN-γ可以活化病原體特異性的Th1和CD8+CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，可見NKT細(xì)胞除自身的免疫活性外，隨后還可活化其他細(xì)胞，特別是T細(xì)胞。因此被視為是固有和獲得性免疫之間的橋梁。大量研究結(jié)果提示NKT和NK系統(tǒng)做為抗HBV感染的疫苗成分具有重大潛力，通過(guò)疫苗對(duì)NK和NKT的活化作用來(lái)激活病原體特異性和非特異性免疫應(yīng)答是一種有效而明智的選擇。綜上所述可見肝臟天然免疫細(xì)胞在機(jī)體抗HBV感染中起著重要的作用，活化肝臟天然免疫細(xì)胞特別是NKT和NK細(xì)胞可能會(huì)成為清除HBV的嶄新途徑。國(guó)外學(xué)者正在尋找和篩選NKT和NK的激活劑。Kakimi等發(fā)現(xiàn)在注射α-半乳糖酐神經(jīng)酰胺(α-GalCer)24h內(nèi)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)可檢測(cè)到IFN-γ和IFN-α/β，并且HBV復(fù)制被終止。這一現(xiàn)象與肝內(nèi)NKT細(xì)胞的迅速消失和激活的NK細(xì)胞向肝內(nèi)募集短暫相關(guān)，這一現(xiàn)象表明α-GalCer通過(guò)直接活化NKT細(xì)胞繼而激活NK細(xì)胞分泌抗病毒的細(xì)胞因子抑制HBV復(fù)制。α-GalCer可能有希望作為NK和NKT細(xì)胞激活劑用于慢性乙型肝炎的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是提供一種具有更好的治療效果的治療性乙肝疫苗組合物。
本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在重組HBsAg蛋白疫苗(HBsAg疫苗)的基礎(chǔ)上加入佐劑重組人白介素12(rhIL-12)和綠膿桿菌菌苗制劑(PA-MSHA菌苗)，可得到一種治療效果更好的治療性乙肝疫苗組合物。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，每毫升治療性乙肝疫苗組合物中，各組份在下述范圍內(nèi)均有較好的效果，其中HBsAg疫苗10～20μg、rhIL-1210～20μg、PA-MSHA菌苗9～18億和余量的水。
本發(fā)明的治療性乙肝疫苗組合物以每毫升組合物含有10μg重組HBsAg蛋白疫苗、10μg重組人白介素12、18億綠膿桿菌菌苗制劑和余量的水溶液為最佳。
本發(fā)明的治療性乙肝疫苗組合物的制備方法也非常簡(jiǎn)單，是將HBsAg疫苗、rhIL-12和PA-MSHA菌苗直接混制成，制劑為水劑。
本發(fā)明的關(guān)鍵是在HBsAg疫苗的基礎(chǔ)上加入佐劑rhIL-12和PA-MSHA菌苗，利用rhIL-12和PA-MSHA菌苗的協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果，下面從各組分的具體作用進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
HBsAg疫苗一定劑量的HBsAg疫苗長(zhǎng)期反復(fù)免疫可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。主要為CD4+T細(xì)胞和CD8+CTL，上調(diào)非溶細(xì)胞和溶細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)。
rhIL-12rhIL-12是在免疫網(wǎng)絡(luò)中占有核心位置的重要細(xì)胞因子。IL-12的主要產(chǎn)生者是對(duì)微生物刺激應(yīng)答的單核/巨噬細(xì)胞，抗原提呈細(xì)胞(APC)、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞。Maron認(rèn)為IL-12的產(chǎn)生經(jīng)過(guò)2個(gè)不同的刺激途徑，第一個(gè)途徑是由各種細(xì)菌、真菌、原蟲、病毒或它們的產(chǎn)物直接作用于APC，誘導(dǎo)IL-12產(chǎn)生稱作非T細(xì)胞依賴性途徑，另一個(gè)途徑是依賴APC和活化的T細(xì)胞相互作用而誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12，則稱為T細(xì)胞依賴性途徑。IL-12是由35kd的輕鏈(P35，IL-12α)和40kd的重鏈(P40，IL-12β)組成的不同基因編碼的兩條鏈的異源二聚體，由多個(gè)二硫鍵連接，相對(duì)分子量為70～75kd，等電點(diǎn)介于pH3.5～pH5.5。由于兩個(gè)亞單位是由不同的基因編碼，基因轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果表明，只有將兩個(gè)亞單位同時(shí)轉(zhuǎn)染才能獲得具有生物活性的IL-12，二個(gè)亞單位單獨(dú)存在時(shí)無(wú)生物學(xué)活性。
IL-12的生物學(xué)活性具有專一性，必須由高親和力的受體來(lái)介導(dǎo)。IL-12R由β1和β2鏈構(gòu)成，IL-12與單獨(dú)的β1或β2鏈的親合較弱，只有β1和β2共表達(dá)才能形成與IL-12具有高親和力的受體復(fù)合物。P40與IL-12Rβ2結(jié)合介導(dǎo)P35與IL-12Rβ1結(jié)合，后者發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，IL-12R存在于活化的T細(xì)胞以及靜止或活化的NK細(xì)胞。當(dāng)NK細(xì)胞、CD4+、CD8+的T細(xì)胞被活化后，其細(xì)胞表面能表達(dá)出高親和力的IL-12R。IL-12的信號(hào)通路尚不完全清楚。這一過(guò)程主要與JAK/STAT有關(guān)。最近的報(bào)告IL-12Rβ1在中央型記憶性CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+效應(yīng)型T細(xì)胞是必須的。
IL-12是在免疫網(wǎng)絡(luò)中占有十分重要地位的核心細(xì)胞因子，能使活化的T細(xì)胞增殖并增加其細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)IFN-γ的分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞發(fā)育，促使其向Th1細(xì)胞分化。IL-12是誘生CTL免疫應(yīng)答的最佳細(xì)胞因子啟動(dòng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。不但能活化先天性免疫細(xì)胞，促進(jìn)APC功能，促進(jìn)其成熟，提高抗原提呈效率。還可作為第3信號(hào)直接活化初始T細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)性T細(xì)胞。已經(jīng)證明效應(yīng)性和記憶性CD8+T細(xì)胞在缺乏同源抗原刺激下，IL-12、IL-18可促使其具有分泌IFN-γ的能力。IL-12還是維持記憶性CD4+T細(xì)胞的一種候選因子。提示IL-12在促進(jìn)記憶性細(xì)胞激活過(guò)程中起作用。特別值得指出IL-12不但協(xié)同IL-18促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖活化NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，誘生NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，而且IL-12對(duì)NKT的活化及隨后的IFN-γ分泌至關(guān)重要，NKT細(xì)胞表達(dá)豐富的IL-12受體復(fù)合物，成為IL-12作用的首要目標(biāo)。NKT對(duì)自身配體的微弱反應(yīng)被IL-12放大，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答，可見IL-12在啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答在清除HBV中的重要作用。
PA-MSHA菌苗制劑綠膿桿菌PA-MSHA學(xué)名是銅綠假單胞菌，屬革蘭氏染色陰性細(xì)菌，是一種條件致病菌。綠膿桿菌可以產(chǎn)生多種與毒力有關(guān)的物質(zhì)，例如內(nèi)毒素、外毒素A、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶等。1980年本間遜發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌的死菌體具有免疫調(diào)節(jié)作用，死菌體注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)可以激發(fā)體液和細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)干擾素生產(chǎn)，但由于菌體毒性大，免疫應(yīng)答低，未能臨床應(yīng)用。1981年Gitboa-Garber發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌染色體上有形成甘露糖敏感血凝菌毛的功能基因，但不能將甘露糖敏感血凝蛋白分泌到菌體外，也不能在菌體表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。我國(guó)學(xué)者建立了綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，其主要特征主要為在菌體周圍有許多細(xì)而剛直的菌毛。甘露糖敏感血凝試驗(yàn)呈強(qiáng)陽(yáng)性。其成分包括DNA分子、RNA分子、蛋白質(zhì)、脂類分子等，其特點(diǎn)為該菌株毒性低，免疫作用強(qiáng)，具有廣譜特性?？杉せ詈驼{(diào)節(jié)體液及細(xì)胞免疫。
關(guān)于PA-MSHA菌苗免疫調(diào)節(jié)的機(jī)理。已經(jīng)證明綠膿桿菌鞭毛蛋白作為一種外源性的配體，(表達(dá)TLR-2、TLR-5和TLR-11配體)，能特異性的被Toll樣受體所識(shí)別。免疫系統(tǒng)多種細(xì)胞可以表達(dá)TLRs如DC、巨噬細(xì)胞等通過(guò)分子模式的識(shí)別，啟動(dòng)十分復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化初始T細(xì)胞和NK細(xì)胞，觸發(fā)并激活固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。
Carm等研究工作表明人的T細(xì)胞可以表達(dá)大部分TLRs的mRNA編碼，提示綠膿桿菌鞭毛蛋白可能直接作用于T細(xì)胞，促使其活化。另外近來(lái)的研究還表明TLRs的配體(如綠膿桿菌鞭毛蛋白)可以直接激活效應(yīng)性記憶性T細(xì)胞。這二個(gè)作用的綜合結(jié)果提示PA-MSHA菌苗可能上調(diào)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的免疫功能，促進(jìn)IFN-γ的合成和分泌。我們的實(shí)驗(yàn)室工作表明PA-MSHA菌苗協(xié)同rhIL-12可以在體外誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生大量IFN-γ，經(jīng)多色流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在早期(大約作用后5小時(shí))IFN-γ的主要產(chǎn)生者為NK細(xì)胞，在后期(大約48小時(shí))IFN-γ的主要產(chǎn)生者為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。
已知NK細(xì)胞表達(dá)TLR3、TLR7和TLR8，而鞭毛蛋白表達(dá)TLR2、TLR5和TLR11的配體。似可排除鞭毛蛋白通過(guò)TLR的識(shí)別系統(tǒng)直接活化NK細(xì)胞，但我們應(yīng)用PA-MSHA菌苗包括了是普通I型菌毛與綠膿桿菌全身菌毛及菌體結(jié)合在一起的綜合性抗原物質(zhì)，成分復(fù)雜，尚不能完全排除含有TLR3、TLR7和TLR8的配體。我們的實(shí)驗(yàn)表明在應(yīng)用rhIL-12和PA-MSHA菌苗在體外誘導(dǎo)PBMCs分泌IFN-γ的試驗(yàn)，證明在作用5小時(shí)后即出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，作用時(shí)間短暫，提示PA-MSHA菌苗可能并非必須通過(guò)APC介導(dǎo)途徑。
NK細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒效應(yīng)這種功能的發(fā)揮主要依賴NK細(xì)胞能夠表達(dá)多種能有MHC或非MHC類配體結(jié)合的受體。但NK細(xì)胞的受體具有多樣性，十分復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)有數(shù)十種之多，分屬抑制性受體和活化性受體。在活化性受體中，NKG2D是一類非常重要的非MHC型活化性受體，在識(shí)別不同配體時(shí)使用一種誘導(dǎo)適應(yīng)機(jī)制(inducedfit mechanism)，這種機(jī)制可使受體分子可以容忍配體的高度變異性，因此具有高親和力。NK細(xì)胞通過(guò)NKG2D啟動(dòng)活化信號(hào)，當(dāng)病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞由于受到環(huán)境改變而表達(dá)NKG2D配體時(shí)，接著被NK識(shí)別而被激活。PA-MSHA菌苗是否會(huì)做為NKG2D的配體而激活NK細(xì)胞，這種可能性是存在的。還應(yīng)指出NKG2D在許多免疫效應(yīng)細(xì)胞上有所表達(dá)，包括NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD8+αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞，這些細(xì)胞都在肝臟中含量豐富，激活這些細(xì)胞在抗HBV感染中作用可能十分重要。
綜上所述由HBsAg疫苗及佐劑rhIL-12和PA-MSHA菌苗組成的治療性乙肝疫苗組合物中，HBsAg疫苗為在rhIL-12的輔助下通過(guò)第1信號(hào)和第3信號(hào)的介導(dǎo)，或作為第2次進(jìn)入免疫系統(tǒng)的相同抗原誘導(dǎo)HBV特異性的CD4+和CD8+CTL產(chǎn)生IFN-γ啟動(dòng)非溶細(xì)胞或溶細(xì)胞機(jī)制抑制或清除HBV的復(fù)制，而rhIL-12可以直接活化NKT細(xì)胞，已知肝臟內(nèi)富含NKT細(xì)胞，約占肝內(nèi)淋巴細(xì)胞總數(shù)的30％細(xì)胞，活化后的NKT細(xì)胞通過(guò)穿孔素、顆粒酶、Fas及其配體能直接殺傷被HBV感染的細(xì)胞，其次NKT通過(guò)分泌的細(xì)胞因子特別是IFN-γ進(jìn)一步抑制或清除HBV，并激活肝臟內(nèi)的NK細(xì)胞，并導(dǎo)致NK細(xì)胞大量分泌IFN-γ而發(fā)揮抗HBV的作用，還應(yīng)指出活化后的NKT細(xì)胞通過(guò)上調(diào)CD40L的表達(dá)，調(diào)整了CD40-CD40L相互作用對(duì)DC的活化，從而促進(jìn)DC開始分泌IL-12。IL-12進(jìn)一步活化NKT激發(fā)新一輪的IFN-γ分泌。而鞭毛蛋白作為TLR2、TLR5、TLR11的配體，通過(guò)APC的介導(dǎo)活化NK細(xì)胞，(NK細(xì)胞含有TLR7、TLR8和TLR3受體，尚未發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR5、TLR11受體)。NK細(xì)胞在肝臟淋巴細(xì)胞中的比例約為30％(而在外周血淋巴細(xì)胞中只占2％)，NK細(xì)胞在體內(nèi)針對(duì)病毒感染細(xì)胞的作用不需要特殊抗原的刺激?；罨蟮腘K細(xì)胞迅速發(fā)生免疫反應(yīng)可在數(shù)小時(shí)或一天內(nèi)達(dá)到高峰，NK細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞毒反應(yīng)直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞同時(shí)分泌大量細(xì)胞因子，如TNF-α、TNF-γ、IL-3、GM-MSF、M-CSF等。對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因鼠的研究表明NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的活化可以終止HBV復(fù)制。由此可見以rhIL-12和PA-MASH菌苗為佐劑的治療性乙肝疫苗，即可啟動(dòng)固有免疫(NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞)又可激活獲得性免疫(HBV特異性的CD4+和CD8+CTL)，也就是rhIL-12和PA-MSHA菌苗做為橋梁溝通非特異性免疫和HBV特異性細(xì)胞免疫，可以活化多個(gè)免疫靶點(diǎn)如NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC和T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞)，提示這個(gè)疫苗對(duì)打破HBV免疫耐受，重建細(xì)胞免疫功能，對(duì)抑制和清除HBV將產(chǎn)生良好效果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例本發(fā)明實(shí)施方案中HBsAg疫苗由大連漢信生物制品有限公司提供，PA-MSHA菌苗來(lái)自海南微克西生物藥業(yè)有限公司。
rhIL-12由本發(fā)明的發(fā)明人自行研制，由于IL-12是一個(gè)由P40和P35兩個(gè)亞單位通過(guò)多對(duì)二硫鍵組成的異源性二聚蛋白編碼P35和P40亞單位的基因位于不同的染色體上。P35亞單位不能單獨(dú)分泌到細(xì)胞外，而P40亞單位可單獨(dú)分泌到細(xì)胞外。因此在同一細(xì)胞內(nèi)平衡表達(dá)二個(gè)亞單位是表達(dá)具有生物活性的IL-12的關(guān)鍵，因此構(gòu)建的CHO細(xì)胞株必須使IL-12的兩個(gè)亞單位平衡表達(dá)。為此我們將P40cDNA和P35cDNA分別插入二個(gè)表達(dá)效率不同的載體，然后共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，這樣可使IL-12的兩個(gè)不同亞單位的表達(dá)基本平衡。此外通過(guò)載體上的擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)一步提高P35亞單位的表達(dá)水平。這樣就使得P40和P35的平衡表達(dá)進(jìn)一步加強(qiáng)。構(gòu)建成功表達(dá)IL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-SFM-III進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞株已傳至30多代，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且蛋白表達(dá)穩(wěn)定，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量及活性，靜止培養(yǎng)平均濃度為4μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為10μg/ml，IL-12活性測(cè)定表明具有良好的IFN-γ誘生能力。
rhIL-12的純化基本方法是將培養(yǎng)液的上清進(jìn)行離心處理，去除細(xì)胞及其碎片，再進(jìn)行超濾濃縮經(jīng)陽(yáng)離子層析、陰離子層析，最后通過(guò)分子篩獲得純化的rhIL-12，高效液相層析法檢測(cè)表明純度已接近98％。
以下是本治療性乙肝疫苗組合物的初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。
1.應(yīng)用ELISA方法觀察治療性乙肝疫苗組合物對(duì)健康人和慢性乙肝各期病人PBMC產(chǎn)生IFN-γ的影響試劑盒(Human IFN-gamma ELISA set)為BD biosciences公司產(chǎn)品，按說(shuō)明操作。簡(jiǎn)要流程如下取健康人和慢性乙肝各期病人外周血5ml，肝素抗凝，使用上海華精公司生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離液按常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用含10％胎牛血清(GIBCO公司生產(chǎn))的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司生產(chǎn))配成2×106個(gè)/ml的懸液。在業(yè)經(jīng)IFNγ單抗包被和阻斷劑封閉的96孔微孔板小孔中，每孔取100ul細(xì)胞懸液入96孔培養(yǎng)板，再加100ulRPMI-1640(10％FCS，室溫)稀釋好的刺激物，并設(shè)不加刺激物的陰性對(duì)照孔，同一樣品均設(shè)復(fù)孔，置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB牌CO2培養(yǎng)箱)中孵育42～48h后，在無(wú)菌條件收集細(xì)胞上清液做ELISA INF-γ定量測(cè)定。采用HumanIFN-gamma ELISA set測(cè)定試劑盒(BD biosciences公司產(chǎn)品)，按常規(guī)ELISA檢測(cè)方法操作。經(jīng)過(guò)包被抗體，4℃過(guò)夜，加樣，加二抗等步驟，顯色后使用MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)450nm測(cè)定各孔O.D值，計(jì)算獲得結(jié)果。
試驗(yàn)采血，健康人10人，慢性乙肝免疫耐受期25人，慢性乙肝免疫清除期18人，非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期22人。試驗(yàn)分為空白對(duì)照，抗-CD3對(duì)照(0.2μg/ml)，HBsAg疫苗(0.1，0.5，1μg/ml)，rhIL-12(0.1，1，2ng/ml)，PA-MSHA菌苗(1∶1000，1∶100，1∶10)，HBsAg疫苗(0.1μg/ml)+PA-MSHA菌苗(1∶1000)+rhIL-12(0.1ng/ml)，HBsAg(0.5ug/ml)+PA-MSHA菌苗(1∶100)+IL-12(1ng/ml)，HBsAg(1ug/ml)+PA-MSHA菌苗(1∶10)+rhIL-12(2ng/ml)。
不同刺激源對(duì)正常人及慢性乙肝患者PBMC誘生IFN-γ的結(jié)果見表1。結(jié)果表明，單獨(dú)HBsAg疫苗誘生IFN-γ的能力小于PA-MSHA菌苗和rhIL-12(P＜0.01)。單獨(dú)rhIL-12誘生IFN-γ的能力大于HBsAg疫苗和PA-MSHA菌苗(P＜0.01)。HBsAg疫苗+PA-MSHA菌苗+rhIL-12誘生IFN-γ的能力明顯大于任一種藥物單獨(dú)使用或兩種藥物相加數(shù)值(P＜0.01)。正常人和不同發(fā)展時(shí)期慢性乙肝患者對(duì)上述不同刺激源的單獨(dú)或聯(lián)合使用誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN-γ之間無(wú)明顯差異(P＞0.01)。
表1不同刺激原對(duì)健康人及慢性乙肝患者PBMCs誘生IFN-γ的結(jié)果


2.應(yīng)用4色FCM檢測(cè)治療性乙肝疫苗組合物對(duì)5名慢性乙肝患者外周血中IFN-γ+CD4+細(xì)胞、IFN-γ+CD8+細(xì)胞和IFN-γ+NK細(xì)胞頻率的影響。
全血培養(yǎng)，對(duì)照組加入HBsAg(2μg/ml)刺激，疫苗組加入HBsAg疫苗(2μg/ml)、rhIL-12(1ng/ml)和PA-MSHA菌苗(1∶10)刺激，6小時(shí)后用免疫熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，F(xiàn)CM檢測(cè)IFN-γ+CD4+的T細(xì)胞、IFN-γ+CD8+T細(xì)胞和IFN-γ+NK細(xì)胞，結(jié)果IFN-γ+CD4+對(duì)照組占總T的4.42±2.3％，疫苗組占14.7±3.3％；IFN-γ+CD8+對(duì)照組占總T的5.62±2.3％，疫苗組占13.8±4.9％；IFN-γ+NK細(xì)胞占NK總數(shù)對(duì)照組為5.96±3.3％，疫苗組占35.7±3.2％。顯示乙肝疫苗組合物能促進(jìn)CD4+的T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，特別是NK細(xì)胞分泌IFN-γ，明顯高于單獨(dú)使用HBsAg疫苗組。
權(quán)利要求
1.一種治療性乙肝疫苗組合物，其特征是每毫升組合物中含有10～20μg重組HBsAg蛋白疫苗、10～20μg重組人白介素12、9～18億綠膿桿菌菌苗制劑和余量的水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性乙肝疫苗組合物，其特征是每毫升組合物中含有10μg重組HBsAg蛋白疫苗、10μg重組人白介素12、18億綠膿桿菌菌苗制劑和余量的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療性乙肝疫苗組合物，屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，所述的組合物每毫升含有10～20μg重組HBsAg蛋白疫苗、10～20μg重組人白介素12、9～18億綠膿桿菌菌苗制劑和余量的水溶液。本發(fā)明的組合物可以活化多個(gè)免疫靶點(diǎn)如NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC和T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞)，對(duì)打破HBV免疫耐受，重建細(xì)胞免疫功能，對(duì)抑制和清除HBV將產(chǎn)生良好效果。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1966078SQ20061012343
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者張宜俊, 邱向南, 夏書奇, 楊聯(lián)勇, 曾振飛, 葉倩君, 趙峰, 王添章, 曾水娣, 郭凱璇, 王翠玲 申請(qǐng)人:張宜俊, 邱向南, 潘敬東, 張志翔