專利名稱：：一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法。
背景技術(shù)：
：中藥作為我國國藥，近年來在政府、民營企業(yè)、新技術(shù)發(fā)展的推動下有了長足的發(fā)展。中藥現(xiàn)代化工作取得了突出的進展一批中藥材規(guī)范化種植技術(shù)得到了推廣，中藥生產(chǎn)工藝技術(shù)、裝備水平大大提高，中藥研發(fā)體系不斷完善，中藥創(chuàng)新能力顯著增強，自主開發(fā)了一批具有知識產(chǎn)權(quán)、技術(shù)含量高的中藥產(chǎn)品，標準化、規(guī)范化程度不斷提升，中藥產(chǎn)業(yè)已成為中國快速增長的產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)統(tǒng)計，2003年，全國中藥工業(yè)總產(chǎn)值已達810.26億元人民幣，比上年增長10.66%。中藥工業(yè)的凈資產(chǎn)收益率、銷售利潤率、成本費用利潤率分別達到10.93%、10.55%、11.74%,均高于醫(yī)藥工業(yè)的平均水平，顯示了很強的發(fā)展?jié)摿ΑＴ谒幬锛夹g(shù)研究中，載藥納米微粒作為近年來新型的藥物投遞載體，由于其良好的生物相容性，超微小的粒徑，良好的體內(nèi)分布而受到日益廣泛的關(guān)注。作為包載疫苗、多肽、蛋白和基因等大分子藥物的載體，載藥納米微粒不僅可以增強藥物的穩(wěn)定性，增強療效，降低毒副作用，由于其超微小的粒徑可以有效地穿越組織間隙，可通過人體的毛細血管甚至血腦屏障被細胞吸收，從而更有效地對藥物實行靶向和控制釋放。此技術(shù)在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，取得了令人矚目的成績，大大推動了醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。臨床治療上，納米技術(shù)被應(yīng)用于藥物治療和DNA治療方面，可獲得藥物靶向性、控釋作用等，并可增大藥物利用度，減小藥物毒副作用，顯著提高療效。納米載藥體系則是指溶解或分散有藥物的各種納米粒，如納米脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒、聚合物納米囊和納米球、聚合物膠束等。美國布朗大學(xué)的研究人員以聚富馬酸酐和聚丙交酯-乙交酯混合物為囊材，用相轉(zhuǎn)化法制備胰島素微囊，粒徑為96。7201rim。電鏡觀察表明，該微囊經(jīng)口服后可迅速穿過小腸上皮，在上皮細胞間，Peyer'spatch和肝臟中均能發(fā)現(xiàn)微囊。將胰島素藥物制成納米粒，再配合其他制劑技術(shù)，有可能使口服胰島素用于臨床。用來制備載藥納米微粒的材料主要分為天然高分子和合成高分子兩大類前者主要是多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等材料。后者主要有聚酯類、聚酸酐、聚酰胺類以及聚原酸酯類等。其中殼聚糖，海藻酸，聚乳酸，PLA，聚羥基乙酸，PGA，聚己內(nèi)脂等被廣泛應(yīng)用。根據(jù)生物降解塑料研究會的土壤填埋及水中浸漬試驗結(jié)果，PLACCEL-H試樣在大多數(shù)場所經(jīng)六個月后消失，一年后幾乎所有場所中的試樣均消失。這種生物降解速度，僅次于微生物合成的P朋和纖維素，在合成高分子中具有最良好的生物降解性。水溶性嵌段共聚物或接枝共聚物，同時具有親水性基團和疏水性基團，在水中溶解后自發(fā)形成高分子膠束，完成對藥物的增溶和包裹。因為具有親水性外殼和疏水性內(nèi)核，適合于攜帶不同性質(zhì)的藥物，親水性的外殼還具備"隱性"的特點。正由于這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，膠束的釋放過程緩慢，可以保持藥物的長效緩釋和靶向部位的集中釋放，膠束中親水性核部分的聚集是整個膠束形成的驅(qū)動力，這種驅(qū)動力包括疏水作用力、靜電作用力、金屬絡(luò)合力以及嵌段部分的氣鍵。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了提供一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法，其特征在于，首先制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物將己內(nèi)酯、聚乙二醇及辛酸亞錫加入到封管，70。C溶化，然后封管接真空系統(tǒng)，抽真空充氮氣，至少三次，熔封封管，該封管橫放于185'C烘箱中，反應(yīng)36小時，得到固體，再在過量甲醇中沉淀，所得沉淀離心分離后，再用氯仿溶解，沉淀，得白色絮狀固體；再制備納米微粒稱取前述步驟獲得聚合物溶于丙酮制成溶液，在25。C恒溫條件下將此溶液用滴管逐滴滴入50ml雙蒸水，中速磁力攪拌；保持25。C，磁力攪拌4h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，用0.65ura的水相微孔濾膜抽濾。所使用的原料規(guī)格及來源如下己內(nèi)酯(e-Caprolactone，e-CL)，99%，Acors公司。聚乙二醇(poly-ethyleneglycol,PEG),化學(xué)純，分子量2000、4000、6000三種規(guī)格，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司。辛酸亞錫(Sn(0ct)2),華東理工大學(xué)樣品，用無水甲苯配制成約0.02g/ml溶液，置于干燥器內(nèi)備用。甲苯(Tolene)，分析純，上海菲達工貿(mào)有限公司和橋分公司。干燥處理。氯仿(Chloroform),分析純，中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司。甲醇(Methanol),分析純，上海振興化工一廠。氫化鈣(Calciumhydride),95%，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司。其他試劑如鈉、無水氯化鈣、濃硫酸等均為分析純樣品。本發(fā)明方法制備的聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒，經(jīng)試驗檢測可做為中藥載體，具有良好的緩釋性。圖1為三嵌段共聚物的GPC譜圖2為三嵌段共聚物的特征FTIR光譜譜圖3為PCL-PEO6000-PCL與PCL-PEO2000-PCL聚合物的DSC譜圖4為空白PCL-PEO-PCL和PCL-PEO-PCL載體的熒光激發(fā)光譜譜圖5為PCL-PEG6000-PCL的臨界膠束濃度；圖6為PCL-PEO-PCL納米球SEM的電鏡影像；圖7是我們所測得的標準溶液HPLC譜圖8根據(jù)圖7得到的峰面積-濃度標準曲線。具體實施例方式一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法，其特征在于，包括制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物的步驟和制備納米微粒的步驟；所述的制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物的步驟為量取一定量的己內(nèi)酯加入到封管中，再向其中加入計算量的PEG及辛酸亞錫，7(TC溶化，渦旋混合均勻，然后封管接真空系統(tǒng)，抽真空充氮氣，至少三次，抽真空l小時后，熔封封管，該封管橫放于185。C烘箱中，反應(yīng)36小時，封管中得到固體，開始時呈完全透明，取出放冷后變?yōu)槿榘咨?，所得粗產(chǎn)物溶解在氯仿中，再在過量甲醇中沉淀，以除去其中未反應(yīng)的PEG和均聚物；所得沉淀離心分離后，再用氯仿溶解，沉淀，如此純化三次，于5(TC真空千燥72小時，得白色絮狀固體；所述的制備納米微粒的步驟為準確稱取前述步驟獲得聚合物100mg,溶于丙酮制成溶液，在25nC恒溫條件下將此溶液用滴管逐滴滴入50ml雙蒸水，中速磁力攪拌；保持25。C,磁力攪拌4h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，并濃縮溶液體積至20ml，放冷，用0.65ura的水相微孔濾膜抽濾，以除去聚集體，存放于具塞試管中，放置于干燥器中。1.嵌段共聚物的表征凝膠滲透色譜(GPC)將上述純化后的樣品進行GPC表征，圖1是所得的GPC譜圖。如圖，重均分子量Mw為5.3889X104。分子量符合設(shè)計要求(設(shè)計重均分子量5萬)，且多分散性也較好，證明聚合方法是成功可行的。而GPC譜圖上只有一個單峰，并沒有測到其他的峰，說明純化方法是可行的，純化過程較完全。未聚合的己內(nèi)酯單體，聚乙二醇分子和一些分子量較小的均聚物雜質(zhì)己被完全除去，得到了純凈、單一的聚合物。傅立葉變換紅外光譜FTIR為證明所得的聚合物是我們所預(yù)期的二組分嵌段聚合物，我們用紅外光譜對聚合物的結(jié)構(gòu)進行了表征。圖2是所得聚合物的傅立葉變換紅外譜圖。如圖，在1730cm—'處有一個峰，該峰為O0的振動特征峰，對照實驗，易知，該羰基為己內(nèi)酯的羰基，證明在聚合物中有己內(nèi)酯片斷。在28003000cnf'的峰顯然是由飽和的C-H振動引起的，2944cnf'的峰表明有聚己內(nèi)酯片斷，而2866cnT1的吸收峰則顯示聚乙二醇片斷。此外，由文獻可知，l羅固cm—1復(fù)雜區(qū)域為C-O伸縮振動與C-H面外搖擺吸收的綜合效果，而1093cnf'處的峰為聚乙二醇醚鍵的特征吸收。。綜合以上數(shù)據(jù)和實驗情況，可以肯定，在所合成的聚合物中，一定具有聚己內(nèi)酯片斷和聚乙二醇片斷。差熱分析DSC我們還對該聚合物進行了差熱分析。如圖3所示，該譜圖的兩條譜線分別為PCL-PE02000-PCL和PCL-PE06000-PCL的差熱分析譜線，顯示的峰為聚合物的熔點峰。明顯有，前者的熔點比后者低3.3。C左右，根據(jù)文獻得知，PEO組分對該嵌段聚合物的結(jié)晶行為和熱性能有重大影響。因此可以考慮通過調(diào)節(jié)鏈段的長短使共聚物處于不同的釋放的環(huán)境。PCL-PEO-PCL納米粒子的表征熒光法測定納米球臨界膠束濃度CMC如上所述制備納米球的方法，制備聚合物濃度為lg/L的納米粒子乳液。以此乳液為母液，稀釋后配制成從0.00005g/L到lg/L不同納米粒子濃度的溶液。向每瓶中加一定量芘，使每瓶中芘濃度相同，將芘進入PCL-PEG-PCL納米球中靜置24小時后，用FLS-920熒光分析儀測定其臨界膠束濃度。熒光探針的技術(shù)可被用來研究微膠束在溶液中的性質(zhì)。圖4是芘在不同濃度PCL-PEG6000-PCL聚合物納米微粒乳液中的熒光激發(fā)光譜，從該圖中可知，聚合物濃度改變不僅會引起激發(fā)強度的變化，還會使激發(fā)峰發(fā)生位移。當PCL-PEG-PCL濃度很低的時候，聚合物并不能形成納米微粒，只有當聚合物的濃度增大到一定值后，其疏水成分才會聚集起來，形成納米微粒的核，而親水成分同時形成殼，此時的聚合物濃度即臨界膠束濃度。圖5反映了芘I咖/,咖的值和PCL-PEG-PCL濃度的關(guān)系。顯然有，在較低濃度時，I338/IM5值幾乎沒有什么變化，當PCL-PEG-PCL的濃度增加到一定值后，I瀏/I咖的數(shù)值急劇增加，然后又到達一個平臺。如圖5中所示的兩條直線的交點即曲線的拐點，它代表的濃度即是PCL-PEG6000-PCL的臨界膠束濃度。由數(shù)據(jù)可以讀得，該體系的臨界膠束濃度約在0.008g/L,雖然不是非常低，但仍在可接受范圍內(nèi)，納米球比較穩(wěn)定，進入體內(nèi)后也不易崩潰，發(fā)生突釋使人體中毒。表1納米載體球的CMC值統(tǒng)計樣本PEG容量％CMCg/LPCL-PEG6000-PCL18.30.008PCL-PEG2000-PCL4.00.002表l列出了不同PCL-PEG-PCL聚合物的CMC。從表中可以看出，CMC隨聚合物中疏水組分的增加而減小，說明疏水成分的增加有利于形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米微粒。這些結(jié)果和文獻報道的結(jié)論是一致的。SEM測定納米球形態(tài)和動態(tài)光散射DLS表征結(jié)果儀器XL-30ESENPhilip圖6所示為掃描電鏡所得的兩張照片，如圖中所示，納米粒子呈圓整的球形，這也進一步證明了本發(fā)明產(chǎn)品是值得信任的。表2樣品PCL-PE02000-PCLPCL-PE06000-PCL性能粒徑(nm)多分散性粒徑(nm)多分散性空白202.30.08177.30.27載藥203.10.12183.30.26如表2中所示，納米粒載藥前后粒徑有些許變化，但都在理想的納米藥物粒徑范圍內(nèi)。對此可以解釋為隨CL在嵌段聚合物中的含量減少，納米粒子的粒徑也減?。煌瑫r，隨PEO在聚合物中的含量增大，單個納米粒子之間會出現(xiàn)聚集，形成了該系統(tǒng)中的大粒徑部分。所以，PCL-PE06000-PCL納米粒子的粒徑分布會大于PCL-PE02000-PCL載體。配制5個不同濃度的冬凌草甲素標準溶液，用HP1100高效液相色譜儀得到其檢測器響應(yīng)強度對流出時間圖，計算此圖中每一曲線的冬凌草甲素峰面積，再將該峰面積對對應(yīng)的濃度作圖，得一標準曲線。稱取一定量凍干后的載藥納米粒，溶出后得到一冬凌草甲素溶液，取一定量用同樣的方法，得到該稀釋溶液的檢測器響應(yīng)強度對流出時間圖，計算得此曲線的冬凌草甲素峰面積，在標準曲線上找到對應(yīng)的濃度，即該溶液的藥物濃度。根據(jù)公式(l)、(2):繊-^^",(1)以濃度乘以全部溶液體積，可知取出納米粒中所載藥物的質(zhì)量。將此質(zhì)量比上總的納米粒質(zhì)量，即得納米粒子的載藥量。而將此質(zhì)量比上藥物投料質(zhì)量，即得藥物包封率。仍然用高效液相色譜法測定凍干納米粒中所包裹藥物的量，采用標準曲線法來定量。圖7、圖8分別是我們所測得的標準溶液HPLC譜圖和根據(jù)此圖得到的峰面積-濃度標準曲線。稱取一定量凍干后的載藥納米粒子溶于丙酮，所得溶液稀釋到標準曲線所在的范圍，測其HPLC譜圖。用計算得的峰面積在標準曲線上找到對應(yīng)的濃度，乘以溶液體積，得到溶質(zhì)質(zhì)量，再利用公式l、2進行計算用上述方法分別對PCL-PE02000-PCL及PCL-PE06000-PCL載體進行了冬凌草甲素載藥實驗，各項結(jié)果列表如表3，顯示了較高的裝載藥物的能力，說明此共聚物膠束用作藥物的載體是可行的。表3不同鏈段長短的載體在藥兩及包封率<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明中的實施例僅用于對本發(fā)明進行說明，并不構(gòu)成對權(quán)利要求范圍的限制，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以想到的其他實質(zhì)上等同的替代，均在本發(fā)明保護范圍。權(quán)利要求1.一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法，其特征在于，首先制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物將己內(nèi)酯、聚乙二醇及辛酸亞錫加入到封管，70℃溶化，然后封管接真空系統(tǒng)，抽真空充氮氣，至少三次，熔封封管，該封管橫放于185℃烘箱中，反應(yīng)36小時，得到固體，再在過量甲醇中沉淀，所得沉淀離心分離后，再用氯仿溶解，沉淀，得白色絮狀固體；再制備納米微粒稱取前述步驟獲得聚合物溶于丙酮制成溶液，在25℃恒溫條件下將此溶液用滴管逐滴滴入50ml雙蒸水，中速磁力攪拌；保持25℃，磁力攪拌4h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，用0.65um的水相微孔濾膜抽濾。全文摘要本發(fā)明公開了一種制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物納米載藥微粒的方法，其特征在于，首先制備聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三元嵌段共聚物將己內(nèi)酯、聚乙二醇及辛酸亞錫加入到封管，70℃溶化，然后封管接真空系統(tǒng)，抽真空充氮氣，至少三次，熔封封管，該封管橫放于185℃烘箱中，反應(yīng)36小時，得到固體，再在過量甲醇中沉淀，所得沉淀離心分離后，再用氯仿溶解，沉淀，得白色絮狀固體；再制備納米微粒稱取前述步驟獲得聚合物溶于丙酮制成溶液，在25℃恒溫條件下將此溶液用滴管逐滴滴入50ml雙蒸水，中速磁力攪拌；保持25℃，磁力攪拌4h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，用0.65um的水相微孔濾膜抽濾。文檔編號A61K47/34GK101195030SQ20061011907公開日2008年6月11日申請日期2006年12月4日優(yōu)先權(quán)日2006年12月4日發(fā)明者楊邵申請人:華東師范大學(xué)第二附屬中學(xué)