專利名稱：：一種用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種用以增加動(dòng)物攝食量的誘食劑，特別是關(guān)于一種用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽。
背景技術(shù)：
：養(yǎng)殖業(yè)為一固有產(chǎn)業(yè)，在全世界均扮演重要的角色，這是因?yàn)樗腿藗兊纳钕⑾⑾嚓P(guān)。養(yǎng)殖業(yè)主要的貢獻(xiàn)是為提供人們豐富多樣的食物選擇，以及優(yōu)良的蛋白質(zhì)來源。近年來，為了順應(yīng)時(shí)代的潮流，養(yǎng)殖業(yè)逐漸朝高科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展。養(yǎng)殖業(yè)中，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)占了重要的部分。習(xí)知水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的水生動(dòng)物中，除了少部分為觀賞用途外，大多數(shù)為食用用途。養(yǎng)殖業(yè)者于養(yǎng)殖時(shí)，首要關(guān)心的是如何使所養(yǎng)殖的水生動(dòng)物保持良好的健康狀態(tài)，以及如何增加其肉質(zhì)的肥美度。而想要達(dá)成此目的，首要的條件為水生動(dòng)物需要具有良好的食欲。然而，放養(yǎng)密度、環(huán)境變化及性別成熟等壓力因子都可能影響水生動(dòng)物的食欲。當(dāng)所飼養(yǎng)的水生動(dòng)物出現(xiàn)厭食的情況時(shí)，通常會(huì)造成水生動(dòng)物生長的遲緩(shiggishness)與死亡率的上升等現(xiàn)象，進(jìn)而造成養(yǎng)殖產(chǎn)量下降。以石斑魚為例，由于石斑魚肉質(zhì)細(xì)致且味道鮮美，己成為筵席上的最佳菜肴，因而受到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的喜愛。石斑魚在臺(tái)灣的養(yǎng)殖發(fā)展已有二十余年，其中以點(diǎn)帶石斑(￡^"ep/7e/ico/o/des)、馬拉巴石斑(五.w"/a6an'cw力、鞍帶石斑(￡./a"ceo/"ms)，及棕點(diǎn)石斑(￡./kscogwtofus)等魚種為養(yǎng)殖的大宗。但是，石斑魚的詞養(yǎng)相當(dāng)困難，這系因?yàn)槭唪~的攝食量不但會(huì)受到前述壓力因子的影響，而且其嘴形也較一般魚種小，并缺乏保存內(nèi)生性營養(yǎng)(endogenousnutrition)的能力，加上開始攝食的速度較慢等因素所致。故提高石斑魚的食欲為石斑魚養(yǎng)殖重要的一環(huán)。為增加水生動(dòng)物的食欲，即有人提出通過改變喂食時(shí)間來增加攝食量的方法，但此種方法對(duì)水生動(dòng)物的食欲并無太顯著的影響。另外，亦有人提出通過控制環(huán)境因子，如光照期(photoperiod)(BolUetefa/.，2001)及溫度(Talbota"/.,1999)等，來增進(jìn)水生動(dòng)物攝食量的方法。此種方法雖可提高部分水生動(dòng)物的攝食量，但控制光照期及溫度，需要特殊的設(shè)備，這會(huì)使得飼養(yǎng)的成本提高，此方式并不符合簡便經(jīng)濟(jì)的原則。習(xí)知水生動(dòng)物食欲是藉由腦部與周邊訊號(hào)的交互作用來進(jìn)行調(diào)控。腦部(特別是海馬回)會(huì)產(chǎn)生刺激食物攝取(即，促食(orexigenic))或抑制食物攝取(即，厭食(anorexigenic))的重要參與者(actors)。為此，找出水生動(dòng)物腦中刺激食物攝取的因子，藉由該因子來增加水生動(dòng)物的攝食量應(yīng)為一可行的方法。
發(fā)明內(nèi)容為解決前述習(xí)知技術(shù)的問題，本發(fā)明的目的即在于提供一種用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽，藉以提高養(yǎng)殖的動(dòng)物的攝食量，進(jìn)而增加養(yǎng)殖產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明所指出的用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽，其包含一如SEQIDNO:l所示的胺基酸序列。本發(fā)明的另一目的是為提供一種用以增加動(dòng)物攝食量的組合物，其包含一勝肽片段，以及一藥理上可接受的載物，其中該勝肽片段具有如SEQIDNO:l所示的胺基酸序列。本發(fā)明前述的動(dòng)物，可為畜產(chǎn)動(dòng)物或水生動(dòng)物，當(dāng)為畜產(chǎn)動(dòng)物時(shí)，較佳者為牛、羊、雞或豬，更佳者為雞。當(dāng)為水生動(dòng)物時(shí)，較佳者為魚類，更佳者為養(yǎng)殖魚類。在此所稱的養(yǎng)殖魚類系指可藉由人工飼養(yǎng)的魚類，較佳為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者所養(yǎng)殖的魚類。作為前述的養(yǎng)殖魚類，在此可舉出的例子，包含石斑魚(grouper)、海鱺(cobia)、鯛魚(seabream)、比目魚(halibut)、鮭魚(salmon)、鱒魚(trout)、鯰魚(catfish)、鯉魚(carp)、金魚(goldfish)、吳郭魚(tilapia)與斑馬魚(zebrafish)等，但并不僅限于此。由于本發(fā)明的勝肽為一種神經(jīng)勝肽Y(neuropeptideY，NPY)，這是一種廣泛分布于中心及周邊神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)傳遞物質(zhì)(neurotransmitter)。因此，本發(fā)明中的勝肽片段可取自天然的動(dòng)物尤其是水生動(dòng)物體中，或以習(xí)知的化學(xué)合成法合成，也可以用習(xí)知的分子生物學(xué)方法制備?？芍?，NPY系屬于G蛋白0耦合接受器超級(jí)家族(G-protein-coupledreceptorsuperfamily)的Y接收器(Yreceptor)的調(diào)控，經(jīng)由動(dòng)物的肌肉、心臟、腎臟、眼睛及腦中的血管收縮(vasoconstriction)作用，參與該動(dòng)物的生長、繁殖、性別轉(zhuǎn)換(sexreversal)及血壓調(diào)控等過程。此外，NPY能夠影響動(dòng)物體內(nèi)的能量平衡以及生熱作用(thermogenesis)。綜上所述，習(xí)知的研究結(jié)果與公開的文獻(xiàn)中僅指出NPY和動(dòng)物體的生長、繁殖、能量平衡及生熱作用的可能的關(guān)聯(lián)性，但并未揭示NPY和動(dòng)物的食欲調(diào)控的任何相關(guān)可能性。本發(fā)明的又一目的是提供一種用以編碼如前述的用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽的核苷酸片段，其具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的又一目的是提供一種用以篩選能增加動(dòng)物攝食量的誘食劑的方法，其步驟包含(i)將該誘食劑與一飼料混合，藉以獲得一混合物；(ii)對(duì)該動(dòng)物投予該混合物；(iii)檢測該動(dòng)物體內(nèi)如SEQIDNO:1所示的勝肽片段的表現(xiàn)量；以及(iv)以該勝肽片段的表現(xiàn)量高低來判斷該誘食劑對(duì)該動(dòng)物攝食的影響?？蓱?yīng)用于本發(fā)明前述步驟(iii)中，該勝肽片段的檢測方法的種類在此并沒有特別的限制。習(xí)知技藝者可輕易的藉由任何習(xí)知的方法檢測該勝肽片段的表現(xiàn)量，例如膠體電泳、西方墨點(diǎn)法、免疫反應(yīng)法...等，但并不僅限于此；或是藉由檢測能編碼該勝肽片段的mRNA的表現(xiàn)量來判定，作為前述的mRNA的序列，例如由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列所轉(zhuǎn)錄而成的序列。前述的mRNA表現(xiàn)量的檢測法，例如北方墨點(diǎn)法，但并不僅限于此。本發(fā)明的又一目的為提供一種增加動(dòng)物攝食量的方法，其步驟包含(1)提供一誘食劑，該誘食劑包含如SEQIDNO:l所示的勝肽；(2)提供一動(dòng)物；以及(3)將該誘食劑投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。該誘食劑可進(jìn)一步包含一藥理上可接受的載物。前述的勝肽可取自天然的動(dòng)物尤其是水生動(dòng)物體中，或以眾所周知的化學(xué)合成法合成，亦可以用習(xí)知的分子生物學(xué)方法制備，方法如下(a)提供如SEQIDNO:2所示的核苷酸片段；(b)提供一表現(xiàn)載體；(c)將該核苷酸片段與該表現(xiàn)載體重組為一重組表現(xiàn)載體；(d)將該重組表現(xiàn)載體送入宿主細(xì)胞中；以及(e)使該宿主細(xì)胞表現(xiàn)該勝肽，該宿主細(xì)胞可以系酵母菌及動(dòng)物細(xì)胞，但不僅限于此。以E.coli為例，可選定E.coli系統(tǒng)的表現(xiàn)質(zhì)體后，再選定該表現(xiàn)質(zhì)體中適當(dāng)?shù)南拗泼盖形?restrictionenzymesite),以該限制酶剪切來表現(xiàn)質(zhì)體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發(fā)明的勝肽的核苷酸序列的核苷酸片段，將前述經(jīng)限制酶剪切后的表現(xiàn)質(zhì)體及核苷酸片段進(jìn)行接合反應(yīng)(ligation)。接著將含有可編碼本發(fā)明的勝肽的核苷酸序列的co//系統(tǒng)表現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)形(tmnsform)入E.coli菌體中，E.coli可為E.coliBL21TM(DE3)pLysS，轉(zhuǎn)形可用電轉(zhuǎn)形(electro-transformation)或熱休克(heatshock)等任何習(xí)知的轉(zhuǎn)形技術(shù)來進(jìn)行，轉(zhuǎn)形后用誘導(dǎo)物(inducer)誘導(dǎo)Eco//表現(xiàn)本發(fā)明的勝肽，誘導(dǎo)物可為IPTG等習(xí)知誘導(dǎo)物。以酵母菌為例，則可選定酵母菌系統(tǒng)的表現(xiàn)質(zhì)體及該表現(xiàn)質(zhì)體中適當(dāng)?shù)南拗泼盖形缓?，以該限制酶剪切該表現(xiàn)質(zhì)體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發(fā)明的勝肽的核苷酸序列的核苷酸片段，將以限制酶剪切后的表現(xiàn)質(zhì)體及核苷酸片段進(jìn)行接合反應(yīng)。接著將含有可編碼本發(fā)明的勝肽的核苷酸序列的酵母菌系統(tǒng)的表現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)形入酵母菌中，轉(zhuǎn)形可用任何習(xí)知轉(zhuǎn)形技術(shù)來進(jìn)行，例如可先去除酵母菌的細(xì)胞壁，使酵母菌形成原生質(zhì)球狀體(spheroplast)再進(jìn)行轉(zhuǎn)形，或是用堿性陰離子(如LiCl或RbCl)加上熱休克來處理酵母菌以進(jìn)行轉(zhuǎn)形，轉(zhuǎn)形后用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酵母菌表現(xiàn)本發(fā)明的勝肽，誘導(dǎo)物可為IPTG等習(xí)知誘導(dǎo)物。以動(dòng)物細(xì)胞為例，可選定動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的表現(xiàn)質(zhì)體及該表現(xiàn)質(zhì)體中適當(dāng)?shù)南拗泼盖形缓螅栽撓拗泼讣羟性摫憩F(xiàn)質(zhì)體，亦以該限制酶剪切含有可編碼本發(fā)明的勝肽的核苷酸序列的核苷酸片段，將以限制酶剪切后的表現(xiàn)質(zhì)體及核苷酸片段進(jìn)行接合反應(yīng)。接著將含有可編碼本發(fā)明的勝肽的核苷酸序列的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的表現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)染入動(dòng)物細(xì)胞中，該動(dòng)物細(xì)胞可為昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)染可用任何習(xí)知轉(zhuǎn)染技術(shù)來進(jìn)行，如用微脂粒感染法(lipofection)或磷酸鈣(calciumphosphate)法來表現(xiàn)本發(fā)明中的勝肽。此外，為使本發(fā)明增加動(dòng)物攝食量的方法處理的動(dòng)物的攝食量能有效提升，前述的誘食劑可經(jīng)由口服、注射或經(jīng)鼻滴入的方式投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。口服可以通過直接口服或添加于飼料中。當(dāng)以口服方式投予時(shí)，為避免該誘食劑于通過該動(dòng)物的消化道時(shí)被消化道中的消化液所破壞，該誘食劑可進(jìn)一步藉由習(xí)知技術(shù)將其進(jìn)行微包埋處理，以增強(qiáng)其對(duì)抗消化液的能力。作為本發(fā)明前述注射方式的例子，包括靜脈注射(IV)、肌肉注射(IM)及腹腔注射(IP)等，但并不僅限于此。當(dāng)以靜脈注射方式投予至動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，為使其能發(fā)揮最大的效果，該誘食劑較佳系注入該動(dòng)物的腦部，更佳系注入該動(dòng)物的側(cè)腦室。本發(fā)明的組合物或勝肽，可促進(jìn)動(dòng)物食欲，因此可增加動(dòng)物攝食量，提升動(dòng)物的生長表現(xiàn)，并能減少飼料喂食后的殘留量。另外，本發(fā)明的組合物或勝肽還可使動(dòng)物初次開始攝食飼料的時(shí)間提早，以及縮短動(dòng)物攝食的時(shí)間。本發(fā)明將藉由下述的實(shí)施方式做進(jìn)一步的說明，下列的實(shí)例乃用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍。熟習(xí)本發(fā)明的技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許的改良與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。關(guān)于本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與精神可以藉由以下的發(fā)明詳述及附圖得到進(jìn)一步的了解。圖1A為npy在石斑魚不同組織的基因表現(xiàn)。圖1G為npy在石斑魚不同組織的基因相對(duì)于P-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)。圖2A為石斑魚在安排喂食(scheduledfeeding)下npy的基因表現(xiàn)。圖2B為石斑魚在安排喂食下npy的基因相對(duì)于3-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)。圖3A為石斑魚在限制飲食下npy的基因表現(xiàn)。圖3B為石斑魚在限制飲食下叩y的基因相對(duì)于P-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)。圖4為石斑魚在食物剝奪下腦部npy的基因相對(duì)于P-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)。圖5A為石斑魚魚苗不同階段的形態(tài)。圖5B為石斑魚魚苗不同階段叩y的基因表現(xiàn)。圖5C為石斑魚魚苗不同階段npy的基因相對(duì)于3-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)。圖6為正常的石斑魚和厭食(anorexia)的石斑魚的叩y基因相對(duì)于P-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)。圖7為投予雞NPY勝肽后雞的攝食量的變化。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明的勝肽片段的制備首先按照Chomczynski和Sacchi的方法(1987)從石斑魚(點(diǎn)帶石斑(Eco/o^^))的組織分離總(total)RNA。接下來，從10嗎總RNA合成cDNA，使用的系含有200UMolony鼠類血癌病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Molonymurineleukemiavirusreversetranscriptase)、1mMdNTP、160URNase抑帝U齊!j(inhibitor)及1.6jig隨機(jī)引子(randomprimer)的1X反轉(zhuǎn)錄緩沖液。在42'C進(jìn)行轉(zhuǎn)錄30分鐘。接著以PCR放大(amplify)npy基因，PCR系使用含有20嗎反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.5UTaqDNA聚合酶及1嗎正反向npy引子的80plIXPCR緩沖液，正相npy引子具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，反相npy引子具有如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。PCR會(huì)在DNA溫度循環(huán)反應(yīng)器(thermalcycler)進(jìn)行，PCR步驟為在55。C緩冷配對(duì)(annealing)1分鐘30秒，在72。C延長(extension)1分鐘30秒，在94"C變性(denaturation)1分鐘。共35個(gè)循環(huán)(cycle)。PCR反應(yīng)終止后，取15^1的PCR產(chǎn)物以2M洋菜膠體(agamsegd)作電泳分析，接著進(jìn)行溴乙烯(ethidiumbromide)染色。純化的PCR產(chǎn)物會(huì)被選殖進(jìn)M13mpl8或pBluescript的Smal位置，并會(huì)以雙脫氧核醣鏈停止法(dideoxynucleotidechaintermination)定序。npy基因經(jīng)定序后得到如SEQIDNO:2所示的序列。另一方面，將純化的PCR產(chǎn)物與表現(xiàn)載體pET31b(+)分別以限制酶力wNI剪切，再將剪切后的PCR產(chǎn)物及pET31b(+)進(jìn)行接合反應(yīng)，將接合反應(yīng)后所得含有PCR產(chǎn)物的pET3lb(+)轉(zhuǎn)形至表現(xiàn)宿主co//BL21TM(DE3)pLysS中，在37。C下以200rpm振蕩培養(yǎng)，并以不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(induce)，結(jié)果以1mMIPTG誘導(dǎo)的效果最好。以12%SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)￡.co//BL21TM(DE3)pLysS所表現(xiàn)的NPY勝肽位于不可溶蛋白部分，其分子量約為26.4kDa，西方墨漬法亦證明其確為NPY勝肽。將所得不可溶蛋白部分以組胺酸親和層析法(His'Bind⑧chromatography)進(jìn)行純化，接著以溴化氰(CNBr)進(jìn)行剪切，藉此可得到純化的NPY勝肽。實(shí)施例2npymRNA在石斑魚體內(nèi)的分布依Chomczynski及Sacchi的方法(1987)分離石斑魚(點(diǎn)帶石斑)的腦、鰓、心臟、肝臟、胃、腸、腎臟、脾臟、肌肉及血液的總RNA。再以寡(dT)(oligo(dT》纖維素分離聚(A)mRNA，方法為加1體積的結(jié)合2X緩沖液(binding2Xbuffer)到100-300u1的總RNA中，在65。C加熱RNA混合物10分鐘，接著冷卻到室溫。將RNA混合物加到1ml在結(jié)合IX緩沖液中的寡(dT)纖維素，在室溫溫和搖動(dòng)15分鐘讓RNA和寡(dT)纖維素結(jié)合。接著在1,500xg離心15分鐘，離心后丟棄上清液。加500"l洗滌緩沖液(washbuffer)到寡(dT)纖維素，溫和搖動(dòng)幾秒鐘。接著在1,500xg離心2分鐘，離心后丟棄上清液。加200iU洗提緩沖液(elutionbuffer)到寡(dT)纖維素并溫和搖動(dòng)數(shù)分鐘。在1，500xg離心5分鐘，將上清液移到新的試管中。加0.1ml3M醋酸鈉及2.5體積乙醇到上清液中，加以混合并置于-2(TC整夜。在12,000xg離心15分鐘，所得沉淀物即為聚(A)mRNA。以lml70。/。乙醇洗滌沉淀物，在真空下使沉淀物干燥，并將沉淀物再懸浮于適當(dāng)體積的TE緩沖液，將懸浮液儲(chǔ)存于-7(TC。將聚(A)mRNA絞碎(mince)在10ul的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混合物(premixture)中。反轉(zhuǎn)錄混合物的最終組成為10mMTris-HCl(pH8.3)、90mMKC1、1mMMnCl2、0.2mMdNTP、1mM寡(dT)、5mM隨機(jī)六聚物引子(randomhexamerprimer)及1.25單位的r77zDNA聚合酶(DNApolymerase)(Perkin-Elmer，CA)。將反轉(zhuǎn)錄混合物樣品在IOO(TC加熱1分鐘，在7(TC培養(yǎng)15分鐘，接著在42°C5分鐘以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，加入40ul的螯合(chelating)混合物(5V。甘油、10mMTris-HCl(pH8.3)、100mMKCl、0.75乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethyleneglycol-bis(b-aminoethylether)-N-tetraaceticacid，EGTA)、0.05%Tween20、1.5mMMgCl2及0.25mM叩y的每一正向引子和反向引子)，接著進(jìn)行六十回的PCR(94。Cl分鐘，62°C2分鐘，72°C3分鐘)。PCR反應(yīng)終止后，接著進(jìn)行南方墨點(diǎn)法(Southernblot)。方法為先以1.2%洋菜膠體分析PCR產(chǎn)物，再轉(zhuǎn)印到尼龍膜(nylonmembrane)上，并以UV交連(cross-linked)。雜交(hybridization)系在55°C于雜交溶液及以DIG(digoxigenin，洋地黃毒)-l1-dUTP標(biāo)定(DIG-1l-dUTP-labeled)的叩ycDNA探針中進(jìn)行。接下來在室溫以5ml洗滌液I(washsolutionI)洗滌膜一次，在65°C以洗滌液II洗滌膜二次，并于10ml阻斷液(blockingsolution)中進(jìn)行阻斷。以阻斷液稀釋抗DIG-AP(alkalinephosphatase,堿性磷酸酶)標(biāo)定物(conjugate)至濃度74mU/ml，將阻斷后的膜在10ml此抗DIG-AP溶液反應(yīng)30分鐘，并在10ml偵測緩沖液(detectionbuffer)平衡2-5分鐘。最后進(jìn)行呈色反應(yīng)(coloringreaction),將膜置于10ml新鮮制備的顏色-受質(zhì)溶液(color-substratesolution)中，并在黑暗中封于一盒內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，以加入50ml的水來終止呈色反應(yīng)。南方墨點(diǎn)法的結(jié)果(圖1A)可見到npymRNA在石斑魚腦部有顯著的表現(xiàn)。將該結(jié)果以STORMTM系統(tǒng)定量，且和用對(duì)P-肌動(dòng)蛋白(P-actin)專一的探針獲得的量做比較。每一組織的平均值被用來測定npy:3-肌動(dòng)蛋白的訊號(hào)比值(pX).05)。統(tǒng)計(jì)值以ANOVA(變異數(shù)分析)系統(tǒng)計(jì)算。相對(duì)npymRNA的量以6次SE的平均來表現(xiàn)。數(shù)據(jù)經(jīng)單因子變異數(shù)(one-wayANOVA)分析，接著進(jìn)行Student-Newman-Keuls多重比較(multiple-comparisons)試驗(yàn)。P=0.05被認(rèn)為是顯著的。圖lB為npy在石斑魚不同組織的基因相對(duì)于P-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)，當(dāng)中可見到npymRNA在腦、鰓、肝臟及胃中都有表現(xiàn)，特別是腦中的表現(xiàn)量特別高，因此，可知NPY主要表現(xiàn)于腦部，必要時(shí)可從腦部進(jìn)行分離。實(shí)施例3石斑魚在安排喂食(scheduledfeeding)下n。y基因表現(xiàn)本實(shí)施例共有七個(gè)實(shí)驗(yàn)群組，每一群組包含10-12只己適應(yīng)65公升水族箱的石斑魚(點(diǎn)帶石斑)。所有的魚每天在安排的時(shí)間(下午3點(diǎn))被喂食體重2%的飼料。在實(shí)驗(yàn)日，石斑魚群組在安排的喂食時(shí)間前2小時(shí)、l小時(shí)、0小時(shí)(即安排的喂食時(shí)間)被犧牲，或在安排的喂食時(shí)間后15分鐘、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)被犧牲。以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)npymRNA的量進(jìn)行偵測以及統(tǒng)計(jì)分析。圖2A為石斑魚在安排喂食(scheduledfeeding)下npy的基因表現(xiàn)，當(dāng)中可見到石斑魚腦中npymRNA的量在安排的喂食時(shí)間(Oh)最高。圖2B為石斑魚在安排喂食下npy的基因相對(duì)于3-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)，可看到在石斑魚腦中，安排的喂食時(shí)間前兩小時(shí)(-2h)，npymRNA的量顯著較安排的喂食時(shí)間前1小時(shí)(lh)、安排的喂食時(shí)間(Oh)及安排的喂食時(shí)間后15分鐘(+(X25h)低，且可見至lj,在安排的喂食時(shí)間(0h)的前，隨安排的喂食時(shí)間的接近，npymRNA的量逐漸上升，在安排的喂食時(shí)間(Oh)達(dá)到最高，安排的喂食時(shí)間(Oh)后就開始下降。從本實(shí)施例可看到，npy基因的表現(xiàn)和禁食(fasting)間具有交互作用，npy基因表現(xiàn)量在禁食時(shí)上升，而在喂食后下降。由此可知，npy基因的表現(xiàn)和食欲有關(guān)，食欲上升時(shí)npy的基因表現(xiàn)量上升；食欲下降時(shí)npy的基因表現(xiàn)量下降。實(shí)施例4限制飲食增加石斑魚npy基因表現(xiàn)本實(shí)施例共有三個(gè)實(shí)驗(yàn)群組，每一群組包含12只已適應(yīng)65公升水族箱的石斑魚(點(diǎn)帶石斑)。一群組喂食正常體重2%的飼料，另外兩個(gè)群組分別喂食體重1%和0.5%的飼料，共喂食7天。7天后魚被犧牲且其腦組織被收集。以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)npymRNA的量進(jìn)行偵測以及統(tǒng)計(jì)分析。圖3A為石斑魚在限制飲食下npy的基因表現(xiàn)，當(dāng)中可見到當(dāng)飼料量從20/。體重(控制組)降到1%體重及0.5%體重時(shí)，石斑魚腦部npymRNA的量顯著上升。而經(jīng)P-肌動(dòng)蛋白校正后，在圖3B可看到更顯著的結(jié)果。由此可知，石斑魚營養(yǎng)的不足會(huì)活化npy在石斑魚腦部的表現(xiàn)，再次推知npy基因的表現(xiàn)和石斑魚的食欲具有相關(guān)性，石斑魚食欲增加時(shí)叩y基因的表現(xiàn)亦增加。實(shí)施例5食物剝奪增加石斑魚npy基因表現(xiàn)本實(shí)施例的每一實(shí)驗(yàn)群組包含12只已適應(yīng)65公升水族箱的石斑魚(點(diǎn)帶石斑)?？刂平M的魚喂食正常體重2%的飼料(0小時(shí))，剩下的群組分別食物剝奪24、48、72、96、120及144小時(shí)。所有群組均在食物剝奪期間的最后被犧牲以取得腦組織。以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)npymRNA的量進(jìn)行偵測以及統(tǒng)計(jì)分析。圖4為石斑魚在食物剝奪下腦部npy的基因相對(duì)于3-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)，當(dāng)中可見到和正常喂食的石斑魚比較，食物剝奪24小時(shí)并未顯著改變npymRNA的量，然而，食物剝奪48、72、96、120及144小時(shí)則造成npymRNA的量顯著改變，特別是在食物剝奪72小時(shí)的時(shí)候叩ymRNA的量上升了將近兩倍。本實(shí)施例中，食物剝奪造成石斑魚腦部和時(shí)間相關(guān)，且相當(dāng)顯著的npymRNA量的上升。可知食物剝奪活化了腦部npy基因的表現(xiàn)及可能的蛋白質(zhì)合成。又一次證明了NPY的表現(xiàn)和石斑魚的食欲間的相關(guān)性，石斑魚食欲上升時(shí)npy基因表現(xiàn)亦上升。實(shí)施例6石斑魚魚苗攝食增加npy基因表現(xiàn)以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)npymRNA的量進(jìn)行偵測，并以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)npymRNA的量及食物攝取進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖5A為石斑魚魚苗不同階段的形態(tài)，當(dāng)中Ll為孵化期(hatchingstage);L2為專性內(nèi)生攝食(obligateendogenousfeeding)時(shí)(即卵黃吸收(yolkabsorption)),其時(shí)嘴被口咽膜(oropharyngealmembrane)覆蓋；L3為開口期(openmouthstage),其時(shí)口咽膜被破壞。孵化后的石斑魚(點(diǎn)帶石斑)幼魚(post-hatchinglarvae)以半定量RT-PCR分析其npy基因表現(xiàn)(圖5B)，再以3-肌動(dòng)蛋白校正(圖5C)，指出在Ll及L2npy基因表現(xiàn)較低。而npy基因表現(xiàn)量在L3時(shí)顯著較高，且幼魚的后很快就開始攝食?？梢妌py基因表現(xiàn)和石斑魚攝食間具有正相關(guān)性。實(shí)施例7厭食(anorexia)的石斑魚n。y基因表現(xiàn)下降以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)npymRNA的量進(jìn)行偵測以及統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)施例中取得具有臨床厭食癥狀的石斑魚(點(diǎn)帶石斑)，該些石斑魚顯示出生長緩慢、攝食不足、遲緩(sluggishness)、厭食(anorexia)、高死亡率(highmortaiity)及身體形狀改變等現(xiàn)象。這些具有臨床厭食癥狀的石斑魚，其npymRNA的量下降了兩倍(請(qǐng)參閱圖6)。由本實(shí)施例可知石斑魚食欲下降時(shí)，其npymRNA表現(xiàn)量亦下降，因此可推知npymRNA表現(xiàn)量上升時(shí)，石斑魚的食欲亦上升。實(shí)施例8在石斑魚側(cè)腦室注射NPY勝肽增加石斑魚的攝食量以化學(xué)合成法合成NPY勝肽。依照Narnaware等人(1999)的描述，石斑魚(點(diǎn)帶石斑)在側(cè)腦室注射(intracerebroventricularinjection)后隨即回到試驗(yàn)水族箱中，在2-5分鐘內(nèi)會(huì)從麻醉恢復(fù)。為了正確測量每只魚所消耗的食物量，攝食基值在側(cè)腦室注射前30分鐘被記錄。給予體重2%的詞料的石斑魚正常會(huì)在30分鐘內(nèi)消耗飼料的50-75%。在實(shí)驗(yàn)日，控制組的魚或不處理，或側(cè)腦室注射鹽水溶液(salinesolution)。進(jìn)行側(cè)腦室注射15分鐘后，體重2%的飼料被加入槽中。在預(yù)備(preliminary)試驗(yàn)中，注射NPY的魚在30分鐘的觀察期被觀察到消耗了體重的2%飼料，因此，在整個(gè)攝食實(shí)驗(yàn)中均維持消耗體重的2%飼料。在飼料進(jìn)入槽后立刻開始觀察攝食行為。依照Volkoff等人所描述的(1999)，攝食行為被定義為"完全(complete)"和"不完全(incomplete)攝食行為"。完全的攝食行為定義為魚接近飼料并消耗它。不完全的攝食行為定義為魚接近飼料并以閉著的嘴碰或撞它，或?qū)暳蠑z入口中接著吐出。完全及不完全的攝食行為均在給予伺料30分鐘內(nèi)被記錄。每一條魚消耗的食物被轉(zhuǎn)換為30分鐘內(nèi)濕體重(wetbodyweight)所消耗的食物毫克數(shù)，用飼料的平均重量來計(jì)算。每日在注射前3小時(shí)給予詞料，以確保石斑魚在攝食試驗(yàn)時(shí)是飽足的。注射前，石斑魚在含有魚保安(tricainemethanesulphonate)(MS222,1:10，000)的水中被麻醉，在失去平衡后，石斑魚隨即在下午3點(diǎn)到3點(diǎn)半的間被注射。注射合成的石斑魚NPY(5-10ng/體重)后，食物攝取在下午3點(diǎn)到3點(diǎn)半的間，側(cè)腦室注射20分鐘后被測量。以和實(shí)施例2相同的方法對(duì)完全攝食及不完全攝食進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在下午3點(diǎn)到3點(diǎn)半，比較單一側(cè)腦室注射石斑魚NPY(5-10ng/體重)和注射鹽水的石斑魚，可見到兩者在食物攝取上顯著的差異。腦部側(cè)腦室注射石斑魚NPY顯示以和劑量相關(guān)的方式刺激石斑魚攝食。和注射鹽水的群組比較，注射5ng/體重的NPY會(huì)增加近兩倍的食物攝取。本發(fā)明中，注射鹽水和未注射的控制組在食物攝取上沒有差異。本實(shí)施例直接證明了腦中NPY的增加，的確會(huì)增加石斑魚食物攝取的增加。實(shí)施例9對(duì)NPY勝肽進(jìn)行微包埋處理本發(fā)明中微包埋處理包括了溶媒揮發(fā)法(solventevaporation)以及褐藻酸鈉乳化法(sodiumalginate),溶媒揮發(fā)法系以一修飾過的溶煤揮發(fā)技術(shù)，將聚合微粒球(polymericmicrosphere)和NPY勝肽以三種不同比例一同膠囊化(co-encapsulate)。將卵白蛋白(ovalbumin)做為致孑L齊U(pore-formingagent)使NPY勝肽在體內(nèi)得以釋放出來，卵白蛋白并可用來穩(wěn)定NPY勝肽使其活性延長。前述的褐藻酸鈉乳化法，系將4重量％的NPY勝肽和20重量％的油混合，超音波振蕩IO秒以使NPY勝肽均勻的分散在油里，再加入20重量％的褐藻酸鈉水溶液及2.5重量％的乳化劑(膽鹽)，超音波振蕩以形成水包油乳化液(oil-in-wateremulsion),該水包油乳化液中含有直徑15um的散布NPY勝肽的油滴。再加入2.5。/。硫酸鋁(Al2(S04)3)水溶液至100重量％以硬化褐藻酸鈉，最后進(jìn)行冷凍干燥即完成微包埋處理。實(shí)施例10投予雞NPY勝肽增加雞的攝食量將一日年齡大的雄肉雞飼養(yǎng)于無窗的房間，溫度固定在2sr并持續(xù)給予光照，雞可自由攝取市售初級(jí)飼料(starterdiet)及水。將雞分為四組，其中一組為注射組、二組為喂食組及一組為經(jīng)鼻滴入組。注射組中，雞在第一天以微注射器(microsyringe)對(duì)雞靜脈注射10ug/10y1的NPY勝肽；喂食組中系將實(shí)施例9的經(jīng)微包埋處理的NPY勝肽以370或740ppm的比例混合于雞飼料中，并讓雞在兩星期內(nèi)自由攝食該飼料；經(jīng)鼻滴入組中則系在第一天從雞的鼻子滴入10ug/10iU的NPY勝肽。兩個(gè)星期中每天測量食物攝取的情形，其系藉由測量預(yù)稱重的雞，其飼料消失的情形。雞的體重系由一準(zhǔn)確度土lmg的電子數(shù)字秤來測量。由測量結(jié)果可知，以喂食的方式給予NPY勝肽，增加了雞20%的食物攝取量，結(jié)果請(qǐng)參閱圖7。由此可見，NPY勝肽不僅在水生動(dòng)物可增加其食物攝取，對(duì)于畜產(chǎn)動(dòng)物，也確實(shí)有增加其食物攝取的功能。實(shí)施例11NPY在不同動(dòng)物的序列比對(duì)將具有如SEQIDNO:1所示序列的NPY勝肽和海鱺(cobia)做比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者序列完全相同。亦將具有如SEQIDNO:1所示序列的NPY勝肽和其它動(dòng)物，包括比目魚(halibut)、鱒魚(trout)、鯰魚(catfish)、鯉魚(carp)、金魚(goldfish)及斑馬魚(zebrafish)、雞(chicken)、牛(cow)、羊(sheep)等的NPY，進(jìn)行序列比對(duì)。從表一中可以看到，SEQIDNO:1所示序列的NPY勝肽，其序列和所有進(jìn)行比對(duì)的動(dòng)物的NPY都具有很高的相似性(similarity)。憑此推論可知，本發(fā)明的勝肽亦應(yīng)能促進(jìn)其它物種的動(dòng)物的攝食量。由上述說明及實(shí)施例可知，在安排喂食、限制飲食及食物剝奪下石斑魚NPY的基因表現(xiàn)，及石斑魚魚苗不同階段的NPY基因表現(xiàn)，還有厭食(anorexia)的石斑魚的NPY基因表現(xiàn)，均證實(shí)NPY的基因表現(xiàn)和石斑魚的食欲成正相關(guān)，npymRNA表現(xiàn)量上升時(shí)，石斑魚的食欲亦上升。在石斑魚側(cè)腦室注射NPY對(duì)攝食的影響更直接證明當(dāng)NPY勝肽的量增加時(shí)，確實(shí)會(huì)增加石斑魚的攝食量，增加的攝食量可達(dá)原本的兩倍的多。投予雞NPY勝肽時(shí)，也可增加雞的攝食量。此外，NPY在不同動(dòng)物的序列比對(duì)證實(shí)了本發(fā)明的勝肽和所試驗(yàn)的動(dòng)物均具有高度相似性，因此，本發(fā)明所提供的勝肽，確實(shí)具有促進(jìn)動(dòng)物攝食的功能。藉由以上較佳具體實(shí)施例的詳述，希望能更加清楚描述本發(fā)明的特征與精神，而并非以上述所揭露的較佳具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明的范疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排于本發(fā)明所欲申請(qǐng)的專利范圍的范疇內(nèi)。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>序列表<110〉吳金洌陸振岡〈120〉一種用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽〈160〉4<170>Patentlnversion3.3<2L0>1<211〉36〈212>PRT<213>點(diǎn)帶石斑(Epi卿heluscoioides)<400>1TyrProValLysProGluAsnProGlyAspAspAlaProAlaGluAsp151015LeuAlaLysTyrTyrSerAlaLeuArgHisTyrlieAsnLeulieThr202530ArgGinArgTyr35〈210>2<2U>108<212>DNA<213>點(diǎn)帶石斑(Epin印heluscoioides)<400>2tacccggtgaaaccgg3gaaccctggggatgacgccccggcggaggacctggccaagtac60tactcagccctgagacactacattaacctcat;cacaagacagaggtat108<210>3<211>21<212>腿〈213〉點(diǎn)帶石斑(Epin印heluscoioides)<400>3gcgcaaatctccctctcatcc21〈210〉4<211>21〈212〉DNA〈213>點(diǎn)帶石斑(Epin印heluscoioides)<400>4tgccctcctccactttactgt2權(quán)利要求1.一種用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽，該勝肽具有如SEQIDNO1所示的勝肽序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的勝肽，其中該動(dòng)物為畜產(chǎn)動(dòng)物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的勝肽，其中該畜產(chǎn)動(dòng)物選自牛、羊、雞以及豬所組成的群組。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的勝肽，其中該畜產(chǎn)動(dòng)物為雞。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的勝肽，其中該動(dòng)物為水生動(dòng)物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的勝肽，其中該水生動(dòng)物為魚類。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的勝肽，其中該魚類為養(yǎng)殖魚類。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的勝肽，其中該養(yǎng)殖魚類選自石斑魚、海鱺、鯛魚、比目魚、鮭魚、鱒魚、鯰魚、鯉魚、金魚、吳郭魚以及斑馬魚所組成的群組。9.一種用以增加動(dòng)物攝食量的組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所示的勝肽序列，以及一藥理上可接受的載物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中該動(dòng)物為畜產(chǎn)動(dòng)物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中該畜產(chǎn)動(dòng)物系選自牛、羊、雞以及豬所組成的群組。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的組合物，其中該畜產(chǎn)動(dòng)物為雞。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中該動(dòng)物為水生動(dòng)物。14.根據(jù)權(quán)利要求13所的的組合物，其中該水生動(dòng)物為魚類。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中該魚類為養(yǎng)殖魚類。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中該養(yǎng)殖魚類選自石斑魚、海鱺、鯛魚、比目魚、鮭魚、鱒魚、鯰魚、鯉魚、金魚、吳郭魚以及斑馬魚所組成的群組。17.—種用以篩選能增加動(dòng)物攝食量的誘食劑的方法，步驟包含(i)將該誘食劑與一詞料混合，藉以獲得一混合物；(ii)對(duì)該動(dòng)物投予該混合物；(iii)檢測該動(dòng)物體內(nèi)根據(jù)權(quán)利要求l所示的勝肽片段的表現(xiàn)量；以及(iv)以該勝肽片段的表現(xiàn)量高低來判斷該誘食劑對(duì)該動(dòng)物攝食的影響。18.—種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的勝肽的核苷酸片段，其包含如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。19.一種增加動(dòng)物攝食量的方法，其步驟包含(1)提供一誘食劑，該誘食劑包含根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)所示的勝肽；(2)提供一動(dòng)物；以及(3)將該誘食劑投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，該誘食劑進(jìn)一步包含一藥理上可接受的載物。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該誘食劑是以口服的方法投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該誘食劑經(jīng)過微包埋處理。23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該誘食劑是以注射的方法投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該誘食劑是以靜脈注射的方法投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該誘食劑是以靜脈注射的方法投予至該動(dòng)物的腦部。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中該腦部系為側(cè)腦室。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該誘食劑是以肌肉注射的方法投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該誘食劑是以腹腔注射的方法投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。29.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該誘食劑是以經(jīng)鼻滴入的方法投予至該動(dòng)物的體內(nèi)。全文摘要本發(fā)明關(guān)于一種用以增加動(dòng)物攝食量的勝肽，該勝肽具有如SEQIDNO1所示的勝肽序列。本發(fā)明的勝肽可用以有效增加動(dòng)物的食欲，以提升其攝食量，藉以促進(jìn)該動(dòng)物生長，使該動(dòng)物的肉質(zhì)更為肥美，并增加養(yǎng)殖的產(chǎn)量。文檔編號(hào)A61K38/17GK101113171SQ20061010390公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年7月26日優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日發(fā)明者吳金洌,宋嘉軒,陸振岡申請(qǐng)人:吳金洌;陸振岡