專利名稱：衣原體蛋白、其基因序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及高分子量的(“HMW”)衣原體蛋白，其氨基酸序列，和特異性結(jié)合HMW蛋白的抗體，包括細(xì)胞毒抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括預(yù)防和治療組合物，該組合物含有HMW蛋白，其片段，或特異性結(jié)合HMW蛋白的抗體或其部分，或編碼HMW蛋白的核苷酸序列或其片段，所述組合物包括疫苗。本發(fā)明還提供了預(yù)防，治療或緩解哺乳動(dòng)物和鳥類中衣原體感染相關(guān)疾病的方法和誘導(dǎo)針對(duì)衣原體的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明還提供了編碼HMW蛋白的分離的核苷酸序列和簡(jiǎn)并序列，含有所述序列的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括診斷方法和試劑盒。
2.背景技術(shù)衣原體是廣泛傳播的人類病原體，其導(dǎo)致如性傳播疾病，包括肺炎的呼吸系統(tǒng)疾病，新生兒結(jié)膜炎和失明等疾病。衣原體是專性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，它感染肺，結(jié)膜或生殖道的上皮層。最常見的衣原體種類包括砂眼衣原體，鸚鵡熱衣原體，貓心衣原體和肺炎衣原體。最近，新命名的衣原體種類肺炎衣原體(以前被稱為砂眼衣原體TWAR)被認(rèn)為是人類流行性肺炎的主要原因，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化也起到一定作用。
目前，已認(rèn)定了18種導(dǎo)致砂眼和一系列性傳播疾病的砂眼衣原體血清變種A，B和C血清變種常與砂眼相關(guān)，而D-K血清變種是生殖道感染最常見的病因。
在包括美國的很多發(fā)達(dá)國家，砂眼衣原體是性傳播疾病的主要病因。而美國砂眼衣原體感染的準(zhǔn)確發(fā)病率仍是未知的，最新的流行病學(xué)研究表明每年發(fā)生400萬例以上的衣原體感染，這與所估計(jì)的每年200萬例淋球菌感染形成對(duì)比。盡管衣原體感染會(huì)涉及所有種族，人種和社會(huì)經(jīng)濟(jì)群體，但其最常見于12至20歲的性活躍的年輕人中。大多數(shù)生殖泌尿器的衣原體感染在臨床上無癥狀，男性和女性長(zhǎng)期攜帶者居多。在被診斷為衣原體感染的患者中，多至25％的男性和75％的女性沒有明顯的感染體征。結(jié)果，這些無癥狀的個(gè)體構(gòu)成了大的病原體庫，可繼續(xù)地在社會(huì)中傳播病原體。
與這種良性攜帶相去甚遠(yuǎn)的是，這些感染也可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，包括尿道炎，性病淋巴肉芽腫(LGV)，宮頸炎和男性附睪炎。由宮頸管內(nèi)膜逐步往上的感染通常會(huì)引起子宮內(nèi)膜炎，盆腔炎性疾病(PID)和導(dǎo)致輸卵管閉塞并最終導(dǎo)致不育的輸卵管炎。
新生兒的砂眼衣原體感染是因圍產(chǎn)期暴露于母體受感染的宮頸而引起的。將近70％從患有衣原體性宮頸炎的母體陰道分娩的新生兒在分娩的過程中被感染。眼睛，口咽部，泌尿生殖道和直腸的粘膜是感染的主要位點(diǎn)。衣原體性的結(jié)膜炎已成為新生兒眼炎的最常見形式。約20-30％暴露的新生兒在分娩14天內(nèi)會(huì)患有包涵體結(jié)膜炎，甚至在接受了硝酸銀或抗生素軟膏預(yù)防之后也是如此。在美國，砂眼衣原體也是新生兒肺炎的病因。將近10-20％經(jīng)感染的宮頸分娩的新生兒會(huì)患有衣原體肺炎并需要一些類型的醫(yī)藥干預(yù)。
在發(fā)展中國家，砂眼衣原體的眼感染導(dǎo)致砂眼，即一種慢性濾泡性結(jié)膜炎，其反復(fù)形成瘢痕，導(dǎo)致眼瞼變形并最終失明。砂眼是可預(yù)防之失明的世界性病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，目前世界上有超過5億人，包括約1.5億兒童患有活動(dòng)性砂眼，超過600萬人被此疾病致盲。
在發(fā)達(dá)國家，與治療衣原體感染相關(guān)的花費(fèi)是驚人的。1992年，美國治療此病的年花費(fèi)估計(jì)為25-30億美元，到2000年為止，年花費(fèi)預(yù)計(jì)會(huì)超過80億美元。
對(duì)此健康危機(jī)的一個(gè)行之有效的解決辦法是有效的衣原體疫苗。幾種跡象表明開發(fā)有效的疫苗是簡(jiǎn)單易行的。
對(duì)人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究表明通過用整個(gè)衣原體免疫接種可產(chǎn)生針對(duì)砂眼衣原體的短期保護(hù)性免疫力。然而，保護(hù)作用的特征在于期限短，具有血清變種特異性，并由粘膜抗體產(chǎn)生。另外，在一些接種者中，當(dāng)這些個(gè)體被不同于免疫所用的血清變種天然感染時(shí)，病情會(huì)加重。最終闡明這種有害反應(yīng)是由遲發(fā)型超敏反應(yīng)所引起的。因此，需要開發(fā)一種基于亞單位的衣原體疫苗，該疫苗能產(chǎn)生有效但非致敏的免疫應(yīng)答。這種亞單位疫苗需要引發(fā)粘膜中和分泌型IgA抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答才有效。
迄今為止，亞單位疫苗的開發(fā)幾乎僅致力于主要外膜蛋白(MOMP)。MOMP是大小約為40KDa的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，其含有多達(dá)約60％的傳染性原體(EB)膜蛋白(Caldwell，H.D.，J.Kromhout和L.Schachter，1981，Infect.Immun.，311161-1176)。MOMP賦予細(xì)胞外EB結(jié)構(gòu)上的完整性，據(jù)認(rèn)為，當(dāng)生物在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)并且具有代謝活性時(shí)，MOMP作為膜孔蛋白樣分子起作用。除了4個(gè)表面暴露的可變區(qū)(VDI-VDIV)外，MOMP在所有18個(gè)血清變種中是高度保守的。MOMP的免疫原性高，可引發(fā)局部的中和性抗衣原體抗體。然而，此方法也存在問題。
迄今為止，已被作圖的大多數(shù)MOMP-特異性中和表位位于VD區(qū)，因此，僅產(chǎn)生血清變種特異性的抗體。將血清變種特異性的表位混合于不同的疫苗載體(如脊髓灰質(zhì)炎病毒)以產(chǎn)生廣泛交叉反應(yīng)的中和性抗體的嘗試勉強(qiáng)獲得成功(Murdin，A.D.，H.Su，D.S.Manning，M.H.Klein，M.J.Parnell和H.D.Caldwell，1993，Infect.Immun.，614406-4414；Murdin，A.D.，H.Su，M.H.Klein，H.D.Caldwell.1995，Infect.Immun.，631116-1121)。
砂眼衣原體的兩個(gè)其它主要外膜蛋白，即60KDa和12KDa的富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)以及暴露于表面的脂多糖是高度免疫原性的，但與MOMP不同的是，尚無證據(jù)表明它們可誘導(dǎo)中和性抗體(Cerrone等，1991，Infect.Immun.，5979-90)。因此，仍需要新的基于亞單位的衣原體疫苗。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供分離的和基本上純化的高分子量衣原體蛋白(“HMW蛋白”)或其片段或類似物，其中經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，HMW蛋白的表觀分子量約為105-115KDa。優(yōu)選HMW蛋白基本上具有SEQ ID NO2，15和16中任一個(gè)所示的氨基酸序列。優(yōu)選HMW蛋白的片段包括SEQ IDNO3，17和25-37。本文所用的“基本上具有......序列”指的是序列與參照序列至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％相同。優(yōu)選HMW蛋白是外膜蛋白，更優(yōu)選外膜HMW蛋白位于表面。優(yōu)選HMW蛋白具有肝素結(jié)合區(qū)域。優(yōu)選HMW蛋白具有膜孔蛋白樣區(qū)域。本發(fā)明欲包括所有的衣原體種類，但其中優(yōu)選的種類包括砂眼衣原體，鸚鵡熱衣原體，貓心衣原體和肺炎衣原體。基本上純化的HMW蛋白至少為70wt％純，優(yōu)選至少約為90％wt純，可以是其水溶液的形式。
本發(fā)明還包括重組形式的HMW蛋白或其片段或類似物，其包含在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，被表達(dá)的重組形式的HMW蛋白的表觀分子量約為105-115KDa。術(shù)語HMW-衍生的多肽包括HMW蛋白的片段；野生型HMW蛋白的變體或其片段，其含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失，插入或取代；嵌合蛋白，其含有與整個(gè)或部分HMW蛋白C-末端或N-末端或內(nèi)部區(qū)段融合的異源多肽。
本文和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“HMW蛋白”指的是天然純化的或重組純化的高分子量衣原體蛋白，其表觀分子量(經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定)約為105-115KDa。本文和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“rHMW蛋白”指的是重組的HMW蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供分離的基本上純的編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸分子。優(yōu)選所編碼的HMW蛋白含有SEQ ID NO2，15和16中任一個(gè)所示的氨基酸序列的核酸序列或其片段，尤其是SEQ IDNO3，17和25-37。本發(fā)明還包括含有SEQ ID NO1，23-24中任一個(gè)所示的DNA序列的分離核酸分子或其互補(bǔ)序列；具有SEQ ID NO4-14，18-22中任一個(gè)所示的核酸序列的HMW DNA序列片段或其互補(bǔ)序列；和在嚴(yán)緊條件下與上述任一序列雜交的核酸序列。優(yōu)選地，在嚴(yán)緊條件下雜交的核酸與上述任一序列具有約70％的序列同一性，更優(yōu)選具有約90％的序列同一性。
HMW蛋白衍生物和類似物的生產(chǎn)和用途也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在具體的實(shí)施方案中，衍生物或類似物具有功能活性，即能表現(xiàn)出一種或多種與全長(zhǎng)野生型HMW蛋白相關(guān)的功能活性。例如，具有所需免疫原性或抗原性的衍生物或類似物可被用于免疫測(cè)定法中，也可用于免疫接種等等。具體的實(shí)施方案涉及可被抗-HMW抗體結(jié)合的HMW片段。通過本領(lǐng)域已知的方法可檢測(cè)HMW衍生物或類似物是否具有所需的活性。
具體地說，通過提供功能上等同的分子的取代，增加或缺失改變HMW序列可制備HMW衍生物。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，編碼與HMW基因所編碼的序列基本上相同的氨基酸序列的其它DNA序列也可用于本發(fā)明的實(shí)踐。它們包括但不限于含有全部或部分基因的核苷酸序列，所述基因的序列通過用編碼功能等同的氨基酸殘基的不同密碼子取代而被改變，從而產(chǎn)生沉默突變。類似地，本發(fā)明的HMW衍生物包括但不限于含有HMW蛋白的全部或部分氨基酸序列作為一級(jí)氨基酸序列的衍生物，所述氨基酸序列包括經(jīng)功能等同的氨基酸殘基取代而導(dǎo)致沉默突變的經(jīng)改變序列。例如，序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可被功能上等同的，具有類似極性的另一個(gè)氨基酸取代而產(chǎn)生沉默突變。序列中的氨基酸的取代物可從氨基酸所屬類的其它成員中選擇。例如，非極性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，提供了由HMW蛋白的片段組成或含有此片段的蛋白質(zhì)，所述片段由HMW蛋白中至少6個(gè)(連續(xù)的)氨基酸組成。在其它實(shí)施方案中，片段由HMW蛋白的至少7至50個(gè)氨基酸組成。在具體的實(shí)施方案中，該片段不大于35,100或200個(gè)氨基酸。HMW的衍生物或類似物包括但不限于含有與HMW或其片段基本上同源的區(qū)域，或其編碼核酸能在嚴(yán)緊，中度嚴(yán)緊或非嚴(yán)緊的條件下與HMW編碼序列雜交的那些分子(如在不同的實(shí)施方案中，與相同長(zhǎng)度的氨基酸序列相比或與對(duì)比序列相比至少具有60％或70％或80％或90％或95％的同一性，序列對(duì)比通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序進(jìn)行)。
例如(但不限于此)，有用的計(jì)算機(jī)同源性程序包括下列基本局部序列對(duì)比檢索工具(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，分子生物學(xué)雜志，215403-410，BLAST算法；Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)，它是特制用于檢索序列相似性的啟發(fā)式檢索算法，該算法使用Karlin和Altschul 1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872264-68；1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-77的統(tǒng)計(jì)方法確定顯著性。5個(gè)特定的BLAST程序?qū)嵤┫铝腥蝿?wù)1)BLASTP程序?qū)⒂麢z索的氨基酸序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫相比較。
2)BLASTN程序?qū)⒂麢z索的核苷酸序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫相比較。
3)BLASTX程序?qū)⒂麢z索的核苷酸序列(兩條鏈)的6-讀碼框概念翻譯產(chǎn)物與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫相比較。
4)TBLASTN程序?qū)⒂麢z索的蛋白質(zhì)序列與所有6個(gè)讀碼框中翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(兩條鏈)相比較。
5)TBLASTX程序?qū)⒂麢z索的核苷酸序列的6-讀碼框翻譯產(chǎn)物與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的6-讀碼框翻譯產(chǎn)物相比較。
Smith-Waterman(數(shù)據(jù)庫歐洲生物信息學(xué)學(xué)會(huì)wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/)(Smith-Waterman，1981，分子生物學(xué)雜志，147195-197)是用于序列對(duì)比的數(shù)學(xué)上嚴(yán)密的算法。
FASTA(見Pearson等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444-2448)是與Smith-Waterman相似的啟發(fā)式算法。關(guān)于BLAST，Smith-Waterman和FASTA算法之方法和優(yōu)點(diǎn)的一般性討論，可參見Nicholas等，1998，“有關(guān)檢索序列數(shù)據(jù)庫和序列評(píng)分方法的指導(dǎo)”(www.psc.edu)和其中所提及的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的HMW衍生物和類似物可通過本領(lǐng)域熟知的多種方法制備。導(dǎo)致其產(chǎn)生的操作可在基因或蛋白質(zhì)水平上發(fā)生。例如，可通過本領(lǐng)域熟知的多種策略中的任一種來修飾克隆的HMW基因序列(Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)?？捎孟拗菩院怂醿?nèi)切酶在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)裂解序列，必要時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步的酶促修飾，分離并進(jìn)行體外連接。制備編碼HMW衍生物或類似物的基因時(shí)，應(yīng)注意確保編碼所需HMW活性的基因區(qū)域中經(jīng)修飾基因與HMW處于相同的翻譯讀碼框中，而不會(huì)被翻譯終止信號(hào)間斷。
另外，可體外或體內(nèi)突變編碼HMW的核酸序列以產(chǎn)生和/或破壞翻譯，起始和/或終止序列，或使編碼區(qū)域產(chǎn)生變異和/或形成新的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或破壞原先存在的位點(diǎn)以便于進(jìn)一步地體外修飾?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于化學(xué)誘變，體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson，C等，1978，生物化學(xué)雜志，2536551)，使用TAB接頭(Pharmacia)等。
也可在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行HMW序列的操作。本發(fā)明范圍中包括HMW蛋白片段或其它衍生物或類似物，它們?cè)诜g期間或之后通過例如已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)，蛋白酶裂解，與抗體分子或其它細(xì)胞配體的連接被糖基化，脂質(zhì)化，乙?；姿峄?，酰胺化，衍生化等，從而進(jìn)行不同修飾。可通過已知技術(shù)進(jìn)行多種化學(xué)修飾中的任一種，其包括但不限于通過溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4進(jìn)行特異性化學(xué)裂解；乙?；?，甲?；?，氧化，還原；在衣霉素的存在下進(jìn)行代謝合成等。
另外，也可化學(xué)合成HMW的類似物和衍生物。例如，可使用肽合成儀合成對(duì)應(yīng)于HMW蛋白中含有所需區(qū)域或可在體外介導(dǎo)所需活性的部分的肽。另外，必要時(shí)，可在HMW序列中導(dǎo)入非典型氨基酸或氨基酸的化學(xué)類似物作為取代或添加的氨基酸。非-典型的氨基酸包括但不限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，含氟-氨基酸，設(shè)計(jì)者氨基酸，如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸類似物。另外，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
本發(fā)明的另一目的是提供適用于轉(zhuǎn)化宿主或?qū)MW蛋白傳遞給宿主的重組表達(dá)載體，其含有SEQ ID NO1，23或24所述的核酸分子或其任何片段。優(yōu)選重組表達(dá)載體適用于轉(zhuǎn)化宿主并含有與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物。更優(yōu)選表達(dá)載體中的表達(dá)元件包括以下核酸部分，其編碼用于由宿主分泌HMW蛋白或其片段或類似物的前導(dǎo)序列，或編碼偶聯(lián)于蛋白或其片段或類似物N-或C-末端的親和區(qū)。
本發(fā)明的另一方面包括含有上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和可由轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組HMW蛋白或其片段或類似物。
本發(fā)明的另一方面涉及可被抗體制品識(shí)別的HMW蛋白，所述抗體制品特異性結(jié)合氨基酸序列為SEQ ID NO2，15-16的肽或其片段或其保守取代的類似物。
本發(fā)明的另一方面是抗原性和/或免疫原性組合物，其中組合物含有至少一種選自下列的成分a)HMW蛋白或其片段或類似物，所述蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其分子量約為105-115KDa；b)編碼HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子；c)具有SEQ ID NO1，22，23或24的序列的分離核酸分子，其互補(bǔ)序列，或在嚴(yán)緊條件下能與其雜交的核酸序列，或其片段；
d)能由含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的分離的重組HMW蛋白或其片段或類似物，所述表達(dá)載體含有b)或c)所述的核酸分子和與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物；e)含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸的重組載體；f)含有e)之載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述組合物還任選含有佐劑，和可藥用載體或稀釋劑，當(dāng)施用于宿主時(shí)，所述組合物可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
優(yōu)選的佐劑包括霍亂全毒素或亞單位，大腸桿菌熱不穩(wěn)定全毒素，其亞單位和突變形式，明礬，QS21和MPL。特別優(yōu)選明礬，LTR192G，mLT和QS21。
本發(fā)明還包括在哺乳動(dòng)物或鳥類中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的上述抗原性或免疫原性組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及針對(duì)本發(fā)明的抗原性或免疫原性組合物產(chǎn)生的抗血清，和抗血清中存在的能特異性結(jié)合HMW蛋白或其片段或類似物的抗體。優(yōu)選抗體結(jié)合具有SEQ ID NO2，15-16的氨基酸序列的HMW蛋白或其片段或其保守取代的類似物。本發(fā)明還包括特異性結(jié)合HMW蛋白或其片段或類似物的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一方面包括藥物和疫苗組合物，其含有有效量的至少一種選自下列的成分a)HMW蛋白或其片段或類似物，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，其中分離的蛋白質(zhì)的分子量約為105-115KDa；b)編碼HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子；c)具有SEQ ID NO1，22，23或24的序列的分離核酸分子，其互補(bǔ)序列，或在嚴(yán)緊條件下能與其雜交的核酸序列，或其片段；d)能由含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的分離的重組HMW蛋白或其片段或類似物，所述表達(dá)載體含有b)或c)所述的核酸分子和與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述衣原體HMW蛋白或其片段或類似物；e)含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸的重組載體；f)含有e)之載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；g)特異性結(jié)合a)，b)，c)，d)或e)之組分的抗體，
和可藥用載體或稀釋劑。優(yōu)選疫苗組合物在粘膜水平上是有效的。
本發(fā)明還包括診斷試劑，其可以包括上述任何一種或多種組分，如天然HMW蛋白，重組HMW蛋白，核酸分子，免疫原性的組合物，抗原性的組合物，抗血清，抗體，含有核酸的載體和含有載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明還包括檢測(cè)待測(cè)樣品中的衣原體或抗衣原體抗體的方法和診斷試劑盒，其中所述方法包括下列步驟a)將所述樣品與含有衣原體HMW蛋白或其片段或類似物的抗原性組合物或免疫原性組合物或其抗體接觸以形成衣原體抗原抗-衣原體抗體免疫復(fù)合物；b)檢測(cè)步驟a)中形成的所述免疫復(fù)合物的存在或測(cè)定其量以作為待測(cè)樣品中存在所述衣原體或抗衣原體抗體的指征。
檢測(cè)衣原體或其抗體的診斷試劑盒含有抗體，或含有衣原體HMW蛋白或其片段或類似物的抗原性或免疫原性組合物，用于使所述抗體或組合物與被懷疑含有抗衣原體抗體或衣原體的待測(cè)樣品接觸的容器，和用于檢測(cè)或測(cè)定所述抗原性或免疫原性組合物或所述抗體與所述待測(cè)樣品之間形成的衣原體抗原抗衣原體抗體免疫復(fù)合物的試劑。
本發(fā)明的另一方面提供了測(cè)定待測(cè)樣品中編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸的存在的方法，所述方法包括步驟a)使待測(cè)樣品與本文提供的核酸分子接觸以產(chǎn)生含有核酸分子和待測(cè)樣品中編碼HMW蛋白并能特異性地與以上核酸分子雜交的任何所述核酸分子的雙鏈體；和b)測(cè)定雙鏈體的產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了用于測(cè)定樣品中編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸的存在的診斷試劑盒及其所用的試劑，其含有a)本文提供的核酸分子；b)使核酸與待測(cè)樣品接觸以產(chǎn)生雙鏈體的容器，所述雙鏈體含有核酸分子和待測(cè)樣品中編碼HMW蛋白并能特異性地與以上核酸分子雜交的任何所述核酸分子；和c)測(cè)定雙鏈體產(chǎn)生的試劑。
本發(fā)明還包括預(yù)防，治療或緩解需要接受治療的包括哺乳動(dòng)物和鳥類的動(dòng)物的衣原體相關(guān)疾病的方法，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的藥物或疫苗組合物。優(yōu)選的疾病包括衣原體細(xì)菌感染，砂眼，結(jié)膜炎，尿道炎，性病淋巴肉芽腫(LGV)，宮頸炎，附睪炎或子宮內(nèi)膜炎，盆腔炎性疾病，輸卵管炎，輸卵管閉塞，不育，宮頸癌和動(dòng)脈硬化。優(yōu)選的疫苗或藥物組合物包括被配制供體內(nèi)施用于宿主以提供對(duì)由衣原體所致疾病的保護(hù)作用或治療所述疾病的制劑。也優(yōu)選將組合物配制成微粒，膠囊，脂質(zhì)體制劑或乳劑。
4.縮寫抗-HMW＝HMW多肽抗體或抗血清ATCC＝美國典型培養(yǎng)物保藏中心免疫-反應(yīng)＝能引發(fā)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答Kda＝千道爾頓OG ＝正辛基β-D-吡喃葡糖苷或辛基葡糖苷OMP(s)＝外膜蛋白PBS＝磷酸緩沖鹽水PAGE＝聚丙烯酰胺凝膠電泳多肽＝任何長(zhǎng)度的肽，優(yōu)選具有10個(gè)或更長(zhǎng)氨基酸殘基的多肽SDS＝十二烷基硫酸鈉SDS-PAGE＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳本文所述的核苷酸或核酸序列以下列單字母堿基符號(hào)表示A(腺嘌呤)C(胞嘧啶)G(鳥嘌呤)T(胸腺嘧啶)U(尿嘧啶)M(A或C)R(A或G)W(A或T/U)S(C或G)Y(C或T/U)K(G或T/U)V(A或C或G；非T/U)H(A或C或T/U；非G)
D(A或G或T/U；非C)B(C或G或T/U；非A)N(A或C或G或T/U)或(未知)本文所述的肽和多肽序列以下列單字母氨基酸殘基符號(hào)表示A(丙氨酸)R(精氨酸)N(天冬酰胺)D(天冬氨酸)C(半胱氨酸)Q(谷氨酰胺)E(谷氨酸)G(甘氨酸)H(組氨酸)I(異亮氨酸)L(亮氨酸)K(賴氨酸)M(甲硫氨酸)F(苯丙氨酸)P(脯氨酸)S(絲氨酸)T(蘇氨酸)W(色氨酸)Y(酪氨酸)V(纈氨酸)X(未知)參照下文的發(fā)明詳述，本發(fā)明具體實(shí)施方案的非限制性實(shí)施例和附圖可更完整地理解本發(fā)明。
5.


圖1砂眼衣原體L2原體(EB)的Western印跡分析。用含有2-巰基乙醇的標(biāo)準(zhǔn)Laemmli SDS-PAGE樣品緩沖液溶解梯度純化的EB，煮沸約3分鐘，上樣于含SDS的4-12％Tris-甘氨酸梯度凝膠上，以100V電泳。電泳之后立即于4℃，約50V下，將蛋白質(zhì)電印跡至PVDF膜上。室溫下，使用經(jīng)1/5,000稀釋的抗-rHMWP抗體(K196)將封閉的膜探測(cè)1.5小時(shí)。洗滌后，室溫下用經(jīng)1/5,000稀釋的與HRP綴合的山羊抗兔IgG抗體將膜處理1小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)的TMB底物系統(tǒng)展開印跡。在EB和RB中檢測(cè)到3條免疫反應(yīng)的帶。點(diǎn)表示約105-115KDa的HMW蛋白。
圖2編碼砂眼衣原體LGV L2HMW蛋白的開放閱讀框的共有核酸序列。
圖3砂眼衣原體LGV L2PCR開放閱讀框的HMW蛋白推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖4大腸桿菌中表達(dá)的砂眼衣原體LGV L2部分純化的重組HMW蛋白的SDS-PAGE。復(fù)染和預(yù)先染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)被用作分子量標(biāo)記。凝膠中分子量標(biāo)記的位置標(biāo)在圖的左側(cè)和右側(cè)，以一些標(biāo)記的分子量(KDa)標(biāo)線表示。詳見正文實(shí)施例10。泳道A標(biāo)記12寬范圍的分子量標(biāo)記(Novex)；肌球蛋白，200KDa；B-半乳糖苷酶，116.3KDa；磷酸化酶B，97.4KDa；牛血清白蛋白，66.3KDa。泳道B砂眼衣原體L2重組HMWP。泳道CSeeBlue預(yù)先染色的分子量標(biāo)記(Novex)；肌球蛋白，250KDa；牛血清白蛋白，98KDa；谷氨酸脫氫酶，64Kda。
圖5質(zhì)粒pAH306，pAH310，pAH312，pAH316和PCR開放閱讀框的圖譜。
圖6砂眼衣原體L2，B和F的HMW蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列。砂眼衣原體L2序列在最上面一行給出，并以成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)殘基E開始。下劃線的是潛在的真核N-糖基化序列。下劃線并括在括號(hào)中的是側(cè)翼于富含脯氨酸之區(qū)段，長(zhǎng)度適于跨越脂質(zhì)雙層的疏水螺旋區(qū)域。在B和F血清變種中鑒定的氨基酸差異被標(biāo)于L2HMWP蛋白序列的下方。
圖7使用抗-rHMWP’抗體對(duì)砂眼衣原體N11(血清變種為F)包涵體進(jìn)行間接熒光抗體染色。
A組實(shí)驗(yàn)兔K196的免疫后血清，衣原體包涵體被染成黃色。
B組實(shí)驗(yàn)兔K196的免疫前血清。
6.具體實(shí)施方式
本文和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“抗原”及其相關(guān)術(shù)語“抗原性的”指的是與抗體或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的物質(zhì)。優(yōu)選所述抗原是免疫原性的。
本文和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“免疫原性”指的是在動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物或鳥類中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，如抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。
本文和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“宿主”指的是動(dòng)物體內(nèi)或體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。
應(yīng)施用有效量的抗原性，免疫原性藥物，包括但不限于本發(fā)明的疫苗，組合物，其中“有效量”被定義為足以在受試者體內(nèi)產(chǎn)生所需的預(yù)防，治療或緩解應(yīng)答，包括但不限于免疫應(yīng)答的量。所需的量隨所用HMW蛋白，片段，核酸或衍生物的免疫原性，給藥對(duì)象的種和體重的不同而不同，但使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以確定。組合物在受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答，其產(chǎn)生抗體，包括抗-HMW蛋白抗體和調(diào)理或殺菌的抗體。在本發(fā)明優(yōu)選的非限制性的實(shí)施方案中，有效量的本發(fā)明組合物產(chǎn)生的抗體滴度比給藥前的抗體滴度至少高3倍。在本發(fā)明優(yōu)選的，具體的，非限制性的實(shí)施方案中，給宿主施用約0.01至2000μg，優(yōu)選0.1至500μg。優(yōu)選組合物另外含有佐劑。
免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物可被制成注射劑，液體溶液或乳劑。HMW蛋白可與一種或多種可藥用與HMW蛋白相容的賦型劑混合，所述賦型劑包括水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇及其混合物。
免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物可進(jìn)一步含有一種或多種輔劑，如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑或增強(qiáng)其效力的佐劑。免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物可通過注射非腸道施用，也可經(jīng)皮下或肌內(nèi)施用。
或者，可以引發(fā)粘膜表面免疫應(yīng)答的形式配制和傳遞根據(jù)本發(fā)明形成的免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物。因此，可通過例如鼻，口(胃內(nèi))，眼，鰓，陰道內(nèi)或直腸內(nèi)途徑將免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物施用于粘膜表面?；蛘?，也可使用其它給藥方式，包括栓劑和口服制劑。對(duì)栓劑而言，結(jié)合劑和載體包括例如polyalkaleneglycols或甘油三酯?？诜苿┌ǔＳ玫馁x型劑，例如藥用級(jí)的甜味劑，纖維素和碳酸鎂。這些組合物可采取溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，緩釋制劑或粉末的形式，其含有約0.001至95％的HMW蛋白。以與劑量配制相容的方式施用免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物，施用的量應(yīng)是治療有效的，保護(hù)性的或免疫原性的。
另外，免疫原性的，抗原性的藥物和疫苗組合物可與一種或多種靶向分子聯(lián)合或結(jié)合使用以傳遞至免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞，如粘膜表面。一些例子包括但不限于維生素B12，細(xì)菌毒素或其片段，單克隆抗體和其它特定的靶向脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，核酸或碳水化合物。
給藥的量取決于所治療的受試者，包括例如個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體，必要時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。給藥所需活性成分的精確的量取決于實(shí)際操作者的判斷。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定適當(dāng)?shù)膭┝糠秶浼s為0.1至1000微克HMW蛋白，其片段或類似物。初次給藥和加強(qiáng)劑量的適當(dāng)制度也是可變的，但可包括初次給藥及再次給藥。劑量也可取決于給藥途徑，并根據(jù)宿主的大小而變化。
本發(fā)明的抗原性的，免疫原性的或藥物組合物中HMW蛋白的濃度一般約為0.001至95％。僅含有一種病原體的抗原性物質(zhì)的疫苗為單價(jià)疫苗。含有幾種病原體的抗原性物質(zhì)的疫苗為聯(lián)合疫苗，它也屬于本發(fā)明。這種聯(lián)合疫苗含有例如得自多種病原體或相同病原體的不同株或多種病原體的聯(lián)合的物質(zhì)。
包括疫苗的抗原性的，免疫原性的或藥物制品可含有核苷酸載體作為免疫刺激物，所述載體含有編碼HMW蛋白的基因的至少一部分，或基因的至少一部分可直接用于免疫。
為了有效地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答(HIR)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力(CMI)，一般用佐劑乳化免疫原。如果免疫原與佐劑一起施用將會(huì)顯著改善免疫原性。佐劑通過將免疫原局部保留在給藥位點(diǎn)附近以產(chǎn)生便于將抗原緩釋至免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的儲(chǔ)存效應(yīng)而起作用。佐劑也可將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吸引至免疫原儲(chǔ)存處并刺激這種細(xì)胞引發(fā)免疫應(yīng)答。
很多佐劑是有毒的，可誘導(dǎo)肉芽腫，急性和慢性炎癥(弗氏完全佐劑，F(xiàn)CA)，細(xì)胞溶解(皂苷和Pluronic聚合物)和熱原性，關(guān)節(jié)炎和前色素層炎(LPS和MDP)。盡管FCA是出色的佐劑并廣泛用于研究中，但因其毒性而未被準(zhǔn)許用于人或獸用疫苗中。
理想佐劑的合乎需要的特征包括(1)無毒性；(2)能刺激長(zhǎng)期免疫應(yīng)答；(3)操作簡(jiǎn)單，且在長(zhǎng)期儲(chǔ)存中具有穩(wěn)定性。
(4)必要時(shí)能引發(fā)針對(duì)通過多種途徑給藥的抗原的CMI或HIR或CMI和HIR；(5)與其它佐劑能協(xié)同作用；(6)能選擇性地與抗原呈遞細(xì)胞(APC)群體相互作用；(7)能特異性引發(fā)適當(dāng)?shù)腡H1或TH2細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答；和(8)能選擇性增加針對(duì)抗原的適當(dāng)?shù)目贵w同種型水平(例如IgA)。
多年來，一直使用免疫刺激劑或佐劑以改善宿主針對(duì)例如疫苗的免疫應(yīng)答。如脂多糖的內(nèi)源性佐劑一般是用作疫苗的滅活或減毒細(xì)菌的組分。外源性佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑，一般使其與抗原非共價(jià)連接，配制它是為了增強(qiáng)宿主的免疫應(yīng)答。因此，增強(qiáng)針對(duì)非腸道傳遞的抗原的免疫應(yīng)答的佐劑已被鑒定。氫氧化鋁和磷酸鋁(一般總稱為明礬)被常規(guī)用作人和獸用疫苗的佐劑。明礬增加針對(duì)白喉和破傷風(fēng)類毒素的抗體應(yīng)答的效力已經(jīng)確定，明礬被用作HBsAg疫苗的佐劑。
其它外源性佐劑可包括與膜蛋白抗原復(fù)合的皂苷(免疫刺激復(fù)合物)，含礦物油的pluronic聚合物，含礦物油的分支桿菌，弗氏完全佐劑，細(xì)菌產(chǎn)物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂質(zhì)A和脂質(zhì)體。
列入本文作為參考的國際專利申請(qǐng)PCT/US95/09005描述了腸毒性大腸桿菌的熱不穗定毒素的突變形式(“mLT”)，列入本文作為參考的美國專利5,057,540描述了佐劑Qs21，列入本文作為參考的英國專利2,220,211中描述了皂苷經(jīng)HPLC純化的無毒組分3D-MPL，其中皂苷得自南美樹種Quiliaja saponaria molina的樹皮。
1989年8月8日授予Lockhoff等人的美國專利4,855,283(列入本文作為參考)教導(dǎo)了作為免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑的糖脂類似物，包括N-糖基酰胺，N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，它們的糖基都被氨基酸所取代。Lockhoff報(bào)道了單純皰疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中的N-糖磷脂和糖基甘油脂能引發(fā)強(qiáng)的免疫應(yīng)答。已由長(zhǎng)鏈烷基胺和通過異頭碳原子與糖直接相連的脂肪酸合成了一些糖脂以模擬天然脂質(zhì)殘基的功能。
授予Moloney的美國專利4,258,029(列入本文作為參考)教導(dǎo)了十八酪氨酸鹽酸化物(OTH)當(dāng)與破傷風(fēng)類毒素和用福爾馬林滅活的I，II和III型脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗復(fù)合時(shí)可用作佐劑。合成肽的脂化也被用于增加其免疫原性。
因此，根據(jù)本發(fā)明，含有HMW蛋白或其片段或其衍生物或HMW編碼核酸或其片段或其表達(dá)載體的免疫原性的，抗原性的，藥物，包括疫苗組合物可進(jìn)一步含有佐劑，例如但不限于明礬，mLT，QS21和上文所列的所有其它佐劑。優(yōu)選佐劑選自明礬，LT，3D-mPL或卡介苗(BCG)和上述物質(zhì)的突變或修飾形式，尤其是mLT和LTR192G。本發(fā)明的組合物還可進(jìn)一步含有適當(dāng)?shù)乃幬镙d體，包括但不限于鹽水，碳酸氫鹽，葡萄糖或其它水溶液。其它適當(dāng)?shù)乃幬镙d體描述于本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書Remington’s藥物科學(xué)，Mack出版公司中(其全文列入本文作為參考)。
免疫原性的，抗原性的，藥物，包括疫苗組合物可在適當(dāng)?shù)臒o毒性的藥物載體中被施用，可被包含在微膠囊中，和/或包含在緩釋的植入體中。
免疫原性的，抗原性的，藥物，包括疫苗組合物可以幾個(gè)間隔給藥以保持抗體水平，和/或與其它殺菌或抑菌方法聯(lián)合使用。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何常規(guī)方法可得到本文和權(quán)利要求書中所用的本發(fā)明“抗體”，所述方法例如但不限于“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(E.Harlow，D.Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中描述的方法(其全文列入本文作為參考)。術(shù)語“抗體”欲包括所有的抗體形式，例如但不限于多克隆，單克隆，純化的IgG，IgM，IgA及其片段，包括但不限于如Fv，單鏈Fv(scFv)，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)ab的片段(Harlow和Leon，1988，抗體，冷泉港)；單鏈抗體(美國專利4,946,778)，嵌合或人源化抗體(Morrison等人，1984，Proc.Natl Acad.Sci.USA 816851；Neuberger等人，1984，自然816851)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(見Verhoeyen和Windust，分子免疫學(xué)，第2版，B.D.Hames和D.M.Glover，IRL出版社，牛津大學(xué)出版社，1996，p283-325)等。
一般說來，用不含或含佐劑或任何能增強(qiáng)免疫原效力之藥劑的本發(fā)明HMW蛋白或其核酸序列或其致免疫的片段或其衍生物免疫動(dòng)物(可使用多種脊椎動(dòng)物，最常用的是小鼠，大鼠，豚鼠，牛，豬，倉鼠，綿羊，鳥和兔)并以規(guī)則的間隔加強(qiáng)免疫。通過任何常規(guī)的方法測(cè)定動(dòng)物血清中所需抗體的存在。所述動(dòng)物的血清或血液可用作多克隆抗體的來源。
按上文所述處理動(dòng)物也可得到單克隆抗體。當(dāng)檢測(cè)到可接受的抗體滴度時(shí)，使動(dòng)物安樂死，無菌取出脾臟以用于融合。將脾細(xì)胞與特別選擇的無限增殖的骨髓瘤細(xì)胞系混合，將混合物暴露于可促進(jìn)細(xì)胞融合的藥劑，一般是聚乙二醇等中。在這些情況下，在隨機(jī)選擇中發(fā)生融合，融合的細(xì)胞混合物與未融合的各種細(xì)胞是所得的產(chǎn)物。利用選擇培養(yǎng)基，如HAT次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷特別選擇用于融合的骨髓瘤細(xì)胞系以使融合混合物培養(yǎng)物中存在的唯一細(xì)胞是得自經(jīng)免疫供體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的雜合體。融合之后，稀釋細(xì)胞并在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。篩選培養(yǎng)物中是否存在對(duì)選定抗原具有所需特異性的抗體。通過有限稀釋克隆含有選定抗體的培養(yǎng)物直至認(rèn)為細(xì)胞培養(yǎng)物為單細(xì)胞來源。
抗原，免疫原和免疫測(cè)定法HMW蛋白或編碼該蛋白的核酸，及其片段可用作抗原或免疫原以產(chǎn)生抗HMW蛋白的抗體或用作免疫測(cè)定法中的抗原，所述免疫測(cè)定法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，放射性免疫測(cè)定法(RIA)和其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合測(cè)定法或本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)抗細(xì)菌，抗衣原體和抗HMW蛋白的抗體的方法。在ELISA測(cè)定法中，HMW蛋白被固定在選定的表面，例如能結(jié)合蛋白質(zhì)的表面，如聚苯乙烯微滴板的孔。洗滌除去不完全吸附的HMW蛋白之后，已知對(duì)檢測(cè)樣品而言為抗原中性的非特異性蛋白溶液被結(jié)合于選定表面。這可封閉固定化表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，從而降低抗血清非特異性地與表面結(jié)合所致的背景。
然后，以有助于免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的方式使固定化的表面與樣品，如待測(cè)的臨床或生物學(xué)物質(zhì)接觸，它包括用稀釋劑，如牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸緩沖鹽水(PBS)/吐溫溶液稀釋樣品。然后于約20至37℃的溫度下將樣品保溫2至4小時(shí)。保溫之后，洗滌與樣品接觸的表面以除去非免疫復(fù)合的物質(zhì)。洗滌程序包括用如PBS/吐溫或硼酸鹽緩沖液的溶液洗滌。檢測(cè)樣品與結(jié)合的HMW蛋白之間形成特異性的免疫復(fù)合物之后，洗滌，通過使免疫復(fù)合物接觸對(duì)第一抗體具有特異性的第二抗體可測(cè)定免疫復(fù)合物形成的出現(xiàn)，甚至是出現(xiàn)的量。如果檢測(cè)樣品來源于人，第二抗體是對(duì)人免疫球蛋白具有特異性的抗體，一般為IgG。
為了提供檢測(cè)工具，第二抗體可具有聯(lián)合活性，如通過與適當(dāng)?shù)纳孜锉乜僧a(chǎn)生顏色的酶活性，通過檢測(cè)顏色的產(chǎn)生即可完成檢測(cè)，通過使用例如可見的分光光度計(jì)并與適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較可進(jìn)行定量。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它任何檢測(cè)方法也包括在本發(fā)明中。
另一個(gè)實(shí)施方案包括診斷試劑盒，其含有進(jìn)行本發(fā)明所需免疫測(cè)定法必需的所有基本試劑。診斷試劑盒可以裝有必需試劑的一個(gè)或多個(gè)容器組合的商業(yè)包裝形式被提供。所述試劑盒可包括HMW蛋白或編碼該蛋白的核酸或其片段，本發(fā)明的單克隆或多克隆抗體以及幾種常規(guī)的試劑盒組分。常規(guī)的試劑盒組分對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，其公開于多種出版物中，包括“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(E.Harlow，D.Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中描述的方法(其全文列入本文作為參考)。常規(guī)的試劑盒組分可包括下列物質(zhì)，例如微滴板，維持檢測(cè)混合物之pH的緩沖液(例如但不限于Tris，HEPES等)，綴合的第二抗體，如與過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG(或針對(duì)從中得到第一抗體的動(dòng)物的任何抗IgG)等，和其它標(biāo)準(zhǔn)試劑。
核酸及其用途使用本領(lǐng)域已知的方法，如使用常規(guī)的化學(xué)方法或使用方便的寡核苷酸引物對(duì)進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和使用一組連續(xù)的寡核苷酸進(jìn)行的連接酶鏈反應(yīng)可合成本發(fā)明的核苷酸序列，所述序列包括DNA和RNA并含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的序列。所述序列也可用于從任何衣原體中鑒定和克隆HMW蛋白基因，例如可用于篩選衣原體基因組文庫或表達(dá)文庫。
編碼本發(fā)明HMW蛋白的核苷酸序列的用途在于它們能與其它蛋白質(zhì)基因的一段互補(bǔ)序列選擇性地形成雙鏈體分子。根據(jù)應(yīng)用的不同，可使用多種雜交條件得到不同的序列同一性。具體地說，提供的核酸含有與HMW蛋白基因的至少10，15，25，50，100，200或250個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列(圖2)。在具體的實(shí)施方案中，提供的核酸可在低度，中度或高度嚴(yán)緊的退火條件下與HMW蛋白核酸(如具有序列SEQ ID NO1，23或24)雜交。
為了得到高水平的選擇性，可使用相對(duì)嚴(yán)緊的條件形成雙鏈體，例如但不限于低鹽和/或高溫條件，如溫度約為50℃至70℃下使用0.02M至0.15M NaCl。對(duì)于一些應(yīng)用而言，需要較不嚴(yán)緊的雜交條件，例如但不限于在約20℃至55℃的溫度范圍內(nèi)使用0.15M至0.9M的鹽。通過加入增加量的甲酰胺可使雜交條件變得更加嚴(yán)緊以使雜合的雙鏈體不穩(wěn)定。因此，特定的雜交條件是易于操作的，一般是根據(jù)所需結(jié)果選擇的方法。一般說來，例如但不限于，在50％甲酰胺存在下的方便的雜交溫度是對(duì)于與靶片段95至100％同源的探針為42℃，90至95％同源的為37℃，70至90％同源的為32℃。
低度，中度和高度嚴(yán)緊的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并根據(jù)堿基組成和特定核酸序列的長(zhǎng)度以及得到核酸序列的特定生物體的不同而能可推測(cè)地變化。有關(guān)這種條件的指導(dǎo)，可參見例如Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，p9.47-9.57；和Ausubel等，1989，分子生物學(xué)最新方法，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，紐約(列入本文作為參考)。
在制備基因組文庫時(shí)，產(chǎn)生了DNA片段，其中一些可編碼部分或全部的衣原體HMW蛋白。可使用多種限制性酶在特定位點(diǎn)裂解DNA?；蛘?，可在錳的存在下使用DNA酶以使DNA片段化，或通過例如超聲處理物理剪切DNA。然后通過包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳，柱層析和蔗糖梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)根據(jù)大小分離DNA片段。然后將DNA片段插入適當(dāng)載體中，包括但不限于質(zhì)粒，粘粒，噬菌體λ或T4，桿粒和酵母人工染色體(YAC)(例見Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Glover，D.M.(編)，1985，DNA克隆操作方法，MRL出版有限公司，英國牛津，Vol.I，II)。通過使核酸與經(jīng)標(biāo)記的探針雜交可篩選基因組文庫(Benton和Davis，1977，科學(xué)196180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。
使用本領(lǐng)域眾所周知的最適方法，用經(jīng)標(biāo)記的對(duì)應(yīng)于HMW蛋白任何肽的氨基酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸探針篩選基因組文庫。在特定的實(shí)施方案中，篩選探針是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4的序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，篩選探針可以是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO5的序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，寡核苷酸SEQ ID NO6-9，12-14和18-21中的任一個(gè)都可用作探針。在其它實(shí)施方案中，序列SEQ ID NO1，10-11和22-24中的任一個(gè)或其任何片段，或其任何互補(bǔ)序列或其片段都可用作探針。優(yōu)選使用的任何探針為15個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。
文庫中具有編碼HMW蛋白或其片段的插入DNA的克隆會(huì)與一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并寡核苷酸探針雜交。使用本領(lǐng)域已知的方法可進(jìn)行寡核苷酸探針與基因組文庫的雜交。例如，與兩個(gè)上述寡核苷酸探針的雜交可在50℃，2×SSC，1.0％SDS中進(jìn)行，并使用相同條件洗滌。
另一方面，通過篩選衣原體表達(dá)文庫也可得到編碼部分或全部HMW蛋白或HMW衍生多肽的核苷酸序列的克隆。例如，分離衣原體DNA或由RNA產(chǎn)生的衣原體cDNA，制備隨機(jī)片段并連接至表達(dá)載體(如噬菌體，質(zhì)粒，噬?；蛘沉?中，將所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使載體中的插入序列能被該細(xì)胞表達(dá)?？墒褂枚喾N篩選試驗(yàn)選擇表達(dá)的HMW蛋白或HMW衍生多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域已知的方法將本發(fā)明的多種抗-HMW抗體用于鑒定所需克隆，例見Harlow和Lane，1988，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，附錄IV。將得自文庫的克隆或噬斑與抗體接觸以鑒定結(jié)合的克隆。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)Olsvick等，29th ICAAC，Houston，Tex.1989所述方法(列入本文作為參考)，使用DYNA珠檢測(cè)含有編碼HMW蛋白或HMW衍生多肽之DNA的克隆或噬斑。將抗-HMW抗體與甲苯磺酰化DYNA珠M280交聯(lián)，然后使用這些含抗體的珠吸附表達(dá)HMW蛋白或HMW衍生多肽的克隆或噬斑。表達(dá)HMW蛋白或HMW衍生多肽的克隆或噬斑被鑒定為與珠結(jié)合的任何克隆或噬斑。
或者，可將抗HMW抗體非特異性地固定于適當(dāng)?shù)闹С治?，如硅石或CeliteTM樹脂上。然后使用該材料吸附上述表達(dá)HMW蛋白或HMW衍生多肽的細(xì)菌菌落。
另一方面，可使用PCR擴(kuò)增由衣原體基因組DNA產(chǎn)生基本上純的編碼部分或全部HMW蛋白的DNA?？蓪?duì)應(yīng)于已知HMW蛋白序列的簡(jiǎn)并或非簡(jiǎn)并寡核苷酸引物用作引物。在特定的實(shí)施方案中，可將編碼氨基酸序列為SEQ ID NO2，3或15-17之肽或其任一部分的簡(jiǎn)并或非簡(jiǎn)并寡核苷酸用作5’引物。至于片段的例子，5’引物可由SEQ ID NO4-7，10，12，22-24中的任一核苷酸序列或其任何部分制成。為SEQ ID NO11，13或14之反向互補(bǔ)物的簡(jiǎn)并或非簡(jiǎn)并核苷酸序列可用作3’引物。
使用例如Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀和Taq聚合酶(Gene AmpTM)可進(jìn)行PCR。可以選擇合成幾個(gè)不同的簡(jiǎn)并引物以用于PCR反應(yīng)。也可以改變引發(fā)PCR反應(yīng)所用雜交條件的嚴(yán)緊性以使簡(jiǎn)并引物與衣原體DNA的相應(yīng)序列之間的核苷酸序列相似水平更高或更低。成功擴(kuò)增編碼HMW蛋白的序列的區(qū)段之后，可對(duì)該區(qū)段進(jìn)行分子克隆或測(cè)序，并將該區(qū)段用作探針以分離完整的基因組克隆。反過來，可以按上述文獻(xiàn)所述測(cè)定基因完整的核苷酸序列，分析其表達(dá)，產(chǎn)生其蛋白質(zhì)產(chǎn)物以進(jìn)行功能分析。
在臨床診斷實(shí)施方案中，本發(fā)明HMW蛋白基因的核苷酸序列可與適當(dāng)指示物，如標(biāo)記物聯(lián)合使用以檢測(cè)雜交情況。本領(lǐng)域已知多種適當(dāng)?shù)闹甘疚?，包括能提供可測(cè)信號(hào)的放射性標(biāo)記，酶標(biāo)記或其它配體，如親和素/生物素和地高辛配基標(biāo)記。在一些診斷實(shí)施方案中，可使用酶標(biāo)記，如脲酶，堿性磷酸酶或過氧化物酶替代放射性標(biāo)記。使用酶標(biāo)記時(shí)，比色指示底物是已知的，使用它們能提供人眼或分光光度計(jì)可見的信號(hào)以鑒定與含HMW蛋白基因序列的樣品的特異性雜交。
本發(fā)明HMW蛋白基因的核酸序列在溶液雜交和利用固相方法的實(shí)施方案中可用作雜交探針。在涉及固相方法的實(shí)施方案中，將得自樣品的受試DNA(或RNA)吸附或要不然粘附于選定的基質(zhì)或表面，所述樣品如臨床樣品，包括溢泌物，體液(如血清，羊水，中耳滲出物，唾液，精液，尿液，眼淚，粘液，支氣管肺泡灌洗液)或甚至是組織。然后在所需條件下使固定的單鏈核酸與選定探針進(jìn)行特異性雜交，所述探針含有本發(fā)明編碼HMW蛋白或其片段或類似物的基因的核酸序列。根據(jù)所需的特定規(guī)則，選定的條件取決于具體情況，例如，G+C含量，靶核酸的類型，核酸的來源，雜交探針的大小等。洗滌雜交表面以除去非特異性結(jié)合的探針分子之后，利用標(biāo)記物檢測(cè)或甚至定量檢測(cè)特異性雜交。優(yōu)先選擇衣原體中保守的核酸序列部分。選定的探針至少為15bp，可以為約30至90bp。
表達(dá)HMW蛋白基因可使用質(zhì)粒載體在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼HMW蛋白或其片段的基因，所述載體含有得自與宿主細(xì)胞相容之物種的復(fù)制子和控制序列。表達(dá)載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的蛋白質(zhì)編碼序列所需的所有必需元件。載體一般攜有復(fù)制位點(diǎn)以及能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，可使用含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性細(xì)胞之基因的pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。也可使用其它商購的載體，包括但不限于pZERO，pTrc99A，pUC19，pUC18，pKK223-3，pEX1，pCAL，pET，pSPUTK，pTrxFus，pFastBac，pThioHis，pTrcHis，pTrcHis2和pLEx。噬?；蚴删w必須也含有或經(jīng)修飾含有啟動(dòng)子，宿主細(xì)胞可使用該啟動(dòng)子表達(dá)其自身的蛋白質(zhì)。
另外，含有與宿主相容之復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體可用作與這些宿主相關(guān)的轉(zhuǎn)化載體。例如，可使用λGEMTM-11中的噬菌體制備用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，如大腸桿菌LE392的重組噬菌體載體。
常用于重組DNA構(gòu)建的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)和其它的微生物啟動(dòng)子，如美國專利4,952,496中所述的T7啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子的核苷酸序列的有關(guān)細(xì)節(jié)是已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將它們與基因有效連接。一般根據(jù)所需結(jié)果選擇所用的特定啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選通過重組方法制備HMW蛋白，尤其是當(dāng)分離自衣原體培養(yǎng)物的天然HMW蛋白中含有痕量毒性物質(zhì)或其它污染物時(shí)更是如此。使用在異源系統(tǒng)中重組產(chǎn)生的HMW蛋白可避免這一問題，所述蛋白可以分離物中污染物最少的方式分離自宿主。在此方面，特別合適的表達(dá)宿主包括不具有LPS因而不含內(nèi)毒素的革蘭氏陽性細(xì)菌。這種宿主包括芽孢桿菌，它們特別適用于產(chǎn)生非熱原性的rHMW蛋白及其片段或類似物。
可使用多種宿主-載體系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列，它們包括但不限于被病毒(如痘苗病毒，腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；被病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，如含有酵母載體的酵母，或被噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。適于表達(dá)HMW蛋白基因及其片段，類似物或變體的宿主包括大腸桿菌，芽孢桿菌，嗜血桿菌，真菌，酵母，如畢赤氏糖酵母，包特菌屬，或者也可使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)選宿主細(xì)胞是細(xì)菌，最優(yōu)選細(xì)菌是大腸桿菌，枯草芽孢桿菌或沙門氏菌。
載體表達(dá)元件的強(qiáng)度和特異性有所不同。根據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)，可使用多種適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任一種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)了含有HMW蛋白或HMW衍生多肽序列和宿主細(xì)胞的pre和/或pro序列的嵌合蛋白。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)了含有與例如親和純化肽融合的HMW蛋白或HMW衍生多肽序列的嵌合蛋白。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)了含有HMW蛋白或HMW衍生多肽序列和有用的免疫原性肽或蛋白質(zhì)的嵌合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所表達(dá)的HMW-衍生蛋白質(zhì)含有形成天然HMW蛋白的外表面表位或受體結(jié)合域的序列。
可使用本領(lǐng)域已知的任何將DNA片段插入載體中的方法來構(gòu)建含有嵌合基因的表達(dá)載體，所述基因由適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)和蛋白質(zhì)編碼序列組成。這些方法包括體外重組DNA和合成技術(shù)和體內(nèi)重組(基因重組)?？赏ㄟ^第二核酸序列調(diào)節(jié)編碼HMW蛋白或HMW衍生多肽的核酸序列的表達(dá)以使插入序列能在被重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)。例如，插入序列的表達(dá)可由本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件來控制。可用于控制插入序列表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域(Bernoist和Chambon，1981，自然，290304-310)，Rous肉瘤病毒之3’長(zhǎng)末端重復(fù)中所含的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980，細(xì)胞22787-797)，皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)，用于在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的金屬硫蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，自然29639-42)；用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)，tac(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)，PL或trc啟動(dòng)子(也見“重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”，Scientific American，1980，24274-94)；胭脂氨酸合成酶啟動(dòng)子區(qū)域或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子(Gardner等，1981，核酸研究，92871)和用于在植入細(xì)胞中表達(dá)的光合酶核酮糖二磷酸羧化酶啟動(dòng)子(Herrera-Estrella等，1984，自然310115-120)；酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件，如Gal4啟動(dòng)子，ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子，PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子，堿性磷酸酶啟動(dòng)子。
通過3種一般方法可鑒定含有HMW蛋白或HMW衍生多肽編碼序列的表達(dá)載體(a)核酸雜交，(b)“標(biāo)記”基因功能的存在或缺乏和(c)插入序列的表達(dá)，如與抗HMW抗體的反應(yīng)性。在第一種方法中，使用含有與插入的HMW蛋白或HMW衍生多肽編碼序列同源的序列的探針，經(jīng)核酸雜交可檢測(cè)表達(dá)載體中所插入的外源基因的存在。在第二種方法中，根據(jù)因載體中插入外源基因所致的某些“標(biāo)記”基因功能(如胸苷激酶活性，抗生素抗性，轉(zhuǎn)化表型，桿狀病毒中的包涵體形成等)的存在與否，可鑒定和選擇重組載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果HMW蛋白或HMW衍生多肽編碼序列被插入載體的標(biāo)記基因序列內(nèi)，通過標(biāo)記基因功能的喪失可鑒定含有插入物的重組體。在第三種方法中，通過檢測(cè)由重組體表達(dá)的外源基因產(chǎn)物可鑒定重組表達(dá)載體。這種試驗(yàn)可基于例如HMW蛋白或HMW衍生多肽在體外檢測(cè)系統(tǒng)中的物理或功能特性，如與HMW配體或受體的結(jié)合，或與本發(fā)明抗HMW抗體的結(jié)合，或宿主細(xì)胞凝血的能力或細(xì)胞提取物干擾衣原體凝血的能力。
一旦鑒定并分離出特定的重組DNA分子，可使用本領(lǐng)域已知的幾種方法使之增殖。一旦確定了適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)和生長(zhǎng)條件，可大量增殖和制備重組表達(dá)載體。如上文所解釋，可以使用的表達(dá)載體包括但不限于下列載體或其衍生物人或動(dòng)物病毒，如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒，如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如λ)和噬粒和粘粒DNA載體，提到的只是一些代表而已。
另外，可選擇能調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或以合乎需要的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。在某些誘導(dǎo)物的存在下，某些啟動(dòng)子可使表達(dá)水平升高；因此，可以控制經(jīng)基因工程改造的HMW蛋白或HMW衍生多肽的表達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞具有特征性的和特異性的翻譯和翻譯后加工和修飾蛋白質(zhì)的機(jī)制。可選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保能按需要修飾和加工所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)，多肽，肽，抗體和核酸可用作臨床或醫(yī)學(xué)診斷衣原體感染的試劑，也可用作有關(guān)衣原體之致病性，毒力和感染性以及宿主防御機(jī)制的科學(xué)研究的試劑。例如，本發(fā)明的DNA和RNA可用作探針以通過雜交或PCR擴(kuò)增鑒定生物樣品中衣原體的存在，DNA和RNA也可用于鑒定可能編碼與衣原體HMW蛋白相關(guān)之多肽的其它細(xì)菌。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于制備多克隆和單克隆抗體，通過親和層析可將所述抗體用于進(jìn)一步純化含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的組合物。在標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定法中也可使用蛋白質(zhì)篩選樣品中抗衣原體抗體的存在。
7.生物保藏在提交本申請(qǐng)前，根據(jù)布達(dá)佩斯條約和37CFR 1.808的規(guī)定將含有具有本文所述衣原體HMW蛋白編碼基因之開放閱讀框的基因部分的某些質(zhì)粒保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，該中心位于10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，美國。這些質(zhì)粒中所存在基因的各個(gè)部分的鑒定示于下文。
以本美國專利申請(qǐng)為基礎(chǔ)的專利被授權(quán)之后，公眾即可得到保藏材料的樣品。本文描述和要求權(quán)利的發(fā)明不受所保藏質(zhì)粒的范圍限制，因?yàn)楸２氐姆桨竷H以闡明本發(fā)明為目的。編碼與本申請(qǐng)所述相似或功能等同的蛋白質(zhì)或其片段或類似物的任何功能等同的或相似的質(zhì)粒也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
8.實(shí)施例上述內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明，下文實(shí)施例提供了更具體的描述。實(shí)施例的描述僅是為了闡明本發(fā)明，而不會(huì)限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)情況所需或更為便利時(shí)，形式的變化和等同物的替代也在考慮之列。盡管本文使用了特定的術(shù)語，但這些術(shù)語僅是為了描述而不是限制本發(fā)明。
描述部分和實(shí)施例中使用但未詳細(xì)描述的分子遺傳學(xué)，蛋白質(zhì)生物化學(xué)和免疫學(xué)的方法在科學(xué)文獻(xiàn)中已有詳盡的報(bào)道，本領(lǐng)域技術(shù)人員能熟練掌握這些方法。
8.1.實(shí)施例1分離和純化成熟的衣原體蛋白于37℃，5％CO2中，使用添加有10％無衣原體抗體的胎牛血清，葡萄糖和非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基，在標(biāo)準(zhǔn)的225cm2組織培養(yǎng)瓶或Bellco旋動(dòng)培養(yǎng)瓶(Cytodex microcarrier，Pharmacia)中培養(yǎng)McCoy細(xì)胞。砂眼衣原體L2原體(ATCC VR-902B)制備自感染的McCoy細(xì)胞的裂解物?；镜?，超聲處理被砂眼衣原體L2(LGV)感染的McCoy細(xì)胞，離心除去細(xì)胞碎片。然后離心含有衣原體原體(EB)的上清液，將含有EB的沉淀物重新懸浮于Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。加入RNA酶/DNA酶溶液，37℃保溫1小時(shí)，偶爾混合。將含有EB的溶液在Angiovist370(3，5-雙乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸melgumine和3，5-雙乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸鈉的混合物，Berlex Laboratories，Wayne，NJ)不連續(xù)的密度梯度(40％，44％和54％)上分層，超速離心以在梯度上分離EB。離心后，從44％和54％Angiovist 370層界面之間的梯度中收集EB。用磷酸緩沖鹽水洗滌EB并重新懸浮于HBSS中。
用含0.1％OGP[高離子強(qiáng)度]的HBSS連續(xù)提取純化的EB以除去外周表面蛋白，然后置于冰上。用含有0.1％OGP，10mM DTT，1mM PMSF，10mMEDTA的50mM Tris pH7.4緩沖液提取同一EB制品。透析(3500MWCO)提取物以除去去污劑和其它試劑，并通過凍干濃縮。用HBSS稀釋含蛋白質(zhì)的提取物，流經(jīng)商購的肝素-瓊脂糖凝膠柱(Hitrap Col.，Pharmacia)。將樣品上樣于肝素柱之后，通過用過量的HBSS洗滌以除去未粘附的蛋白質(zhì)。用含有2M氯化鈉的PBS分批洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。充分透析洗脫物以除去鹽，然后凍干。通過SDS-PAGE對(duì)與肝素結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行大小分級(jí)分離，通過銀染進(jìn)行觀察或通過Western印跡進(jìn)行分析。如圖1所示，檢測(cè)到以中等量存在的約105-115KDa的蛋白質(zhì)。經(jīng)測(cè)定，天然HMW蛋白的等電點(diǎn)約為5.95。
為了得到一個(gè)N末端氨基酸序列，將足夠量的HMW蛋白(≥5μg)電印跡于PVDF膜(Applied Biosystems)上，用考馬斯藍(lán)染色。從膜上釋放固定的HMW蛋白，用低水平的內(nèi)肽酶Lys-C，內(nèi)肽酶Arg-C和/或內(nèi)肽酶Glu-C原位處理之以使天然蛋白質(zhì)片段化。通過HPLC純化所得肽片段，使用ABI 430蛋白質(zhì)測(cè)序儀和標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)測(cè)序方法測(cè)定其N末端的氨基酸序列，N-末端的氨基酸序列為E-I-M-V-P-Q-G-I-Y-D-G-E-T-L-T-V-S-F-X-Y此序列被表示為SEQ ID NO3。
當(dāng)使用精確匹配的參數(shù)，用HMW蛋白N末端序列(20個(gè)殘基)檢索復(fù)合數(shù)據(jù)庫PDB+SwissProt+PIR+GenPept時(shí)，未發(fā)現(xiàn)精確的同源性，因此，HMW蛋白是新的衣原體蛋白。由于此蛋白質(zhì)是在應(yīng)僅釋放外膜蛋白(如0mp2)的條件下分離的，這些數(shù)據(jù)表明HMW蛋白是表面相關(guān)蛋白。
8.2.實(shí)施例2制備針對(duì)完整的衣原體EB的抗體為了鑒定HMW蛋白，針對(duì)砂眼衣原體L2的完整EB產(chǎn)生超免疫兔抗血清。用約250微克衣原體EB對(duì)每只動(dòng)物總共進(jìn)行3次免疫，每次注射(開始用完全弗氏佐劑，接著用不完全弗氏佐劑)間隔約21天。每次免疫時(shí)，將約一半的EB肌內(nèi)(i.m.)給藥，另一半結(jié)內(nèi)注射。第三次免疫后14天，肌內(nèi)給藥約100微克EB進(jìn)行第四次加強(qiáng)免疫，7至10天后，給動(dòng)物放血，經(jīng)ELISA測(cè)定，得到的滴度為1∶100,000。
8.3.實(shí)施例3測(cè)定翻譯后修飾最近，已證實(shí)幾種砂眼衣原體膜相關(guān)蛋白在翻譯后被修飾。18KDa和32KDa的富含半胱氨酸的EB蛋白為凝集素-結(jié)合蛋白，已證實(shí)它攜有特異性的糖類組成成分(Swanson，A.F.和C.C.Kuo，1990，Infect.Immun.58502-507)。放射性標(biāo)記的棕櫚酸的摻入被用于闡明約27KDa的砂眼衣原體Mip-樣蛋白是脂質(zhì)化的(Lundemose，A.G.，D.A.Rouch，C.W.Penn和J.H.Pearce，1993，細(xì)菌學(xué)雜志，1753669-3671)。Swanson等發(fā)現(xiàn)L2血清變種的MOMP含有N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺，這些糖類組成成分介導(dǎo)MOMP與Hela細(xì)胞膜的結(jié)合。
為了確定HMW蛋白是否為糖基化的，可在含氚半乳糖或葡糖胺的存在下，在McCoy細(xì)胞上培養(yǎng)EB，對(duì)EB進(jìn)行肝素親和層析，通過SDS-PAGE和放射自顯影分析肝素結(jié)合蛋白。簡(jiǎn)單地說，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(DMEM+10％FCS，每瓶35ml，10％CO2)，在T225瓶中培養(yǎng)McCoy細(xì)胞至約90％鋪滿，用足夠量的EB接種以獲得90％-100％的感染性。37℃感染3小時(shí)之后，加入環(huán)己酰亞胺(1μg/ml)以抑制宿主細(xì)胞合成蛋白質(zhì)，再將培養(yǎng)物保溫4至6小時(shí)。然后在每個(gè)瓶中加入約0.5mCi含氚半乳糖(D-[4，5-3H(N)]半乳糖，NEN)或葡糖胺(D-[1，6-3H(N)]葡糖胺，NEN)，再將培養(yǎng)物保溫30至40小時(shí)。刮擦收集細(xì)胞，通過梯度離心純化EB。通過親和層析從1.0％OGP表面提取物中分離HMW蛋白，用NaCl洗脫，通過使用14C-標(biāo)記的分子量標(biāo)記(BRL)的SDS-PAGE，然后進(jìn)行放射自顯影分析HMW蛋白。于-70℃將干燥的凝膠暴露于Kodak X-AR膠片達(dá)1至4周。
為了測(cè)定合成后的脂質(zhì)修飾，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法在McCoy細(xì)胞單層上培養(yǎng)砂眼衣原體血清變種L2。感染后約24小時(shí)，除去常規(guī)培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS)，用含有環(huán)己酰亞胺(1μg/ml)和[U-14C]棕櫚酸(0.5mCi/T225瓶，NEN)的無血清培養(yǎng)基取代之，再保溫16至24小時(shí)以使蛋白質(zhì)脂質(zhì)化。按上述制備表面EB提取物，分離肝素結(jié)合蛋白，并通過放射自顯影進(jìn)行分析。
通過用適當(dāng)?shù)奶擒彰柑幚硗暾腅B或OGP表面提取物以評(píng)估糖基化或脂質(zhì)化組成成分的功能性。除去糖類之后，對(duì)提取物進(jìn)行親和層析和SDS-PAGE以測(cè)定HMW蛋白是否保留了結(jié)合硫酸肝素的能力。
8.4.實(shí)施例4克隆HMW蛋白基因的N末端區(qū)段根據(jù)HMW蛋白的N末端氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并的寡核苷酸并合成之。然后使用這些寡核苷酸產(chǎn)生基因特異性的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物可用作雜交探針以篩選砂眼衣原體L2λZAPII DNA文庫，從中分離HMW蛋白基因。
簡(jiǎn)單地說，通過計(jì)算機(jī)分析(MacVector，IBI)從N末端和內(nèi)部氨基酸序列數(shù)據(jù)中鑒定出適當(dāng)?shù)牡秃?jiǎn)并性的肽區(qū)段，使用該區(qū)段可指導(dǎo)設(shè)計(jì)低簡(jiǎn)并性序列-特異性的寡核苷酸PCR引物套。
使用N末端一級(jí)序列作為指導(dǎo)，設(shè)計(jì)出4個(gè)簡(jiǎn)并的寡核苷酸探針，所述探針與HMW肽的前6個(gè)殘基E-I-M-V-P-Q(SEQ ID NO3的殘基1-6)互補(bǔ)并含有所有可能的核苷酸組合(總的簡(jiǎn)并性＝192個(gè)獨(dú)立序列)，將該探針用作正向擴(kuò)增引物。
SEQ ID NO45’-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3’SEQ ID NO55’-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3’SEQ ID NO65’-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3’SEQ ID NO75’-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3’另外還設(shè)計(jì)了兩個(gè)寡核苷酸探針，所述探針代表內(nèi)部5個(gè)殘基肽Y-D-G-E-T(SEQ ID NO3的殘基9-13)的反向互補(bǔ)DNA序列并含有所有可能的核苷酸組合(總的簡(jiǎn)并性＝128個(gè)獨(dú)立序列)，將該探針用作反向擴(kuò)增引物。
SEQ ID NO85’-NGT-YTC-NCC-RTC-ATA-3’SEQ ID NO95’-NGT-YTC-NCC-RTC-GTA-3’在使用0.2μmol規(guī)格的柱(三苯甲基-on，自動(dòng)裂解)和標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法的ABI 380B型DNA合成儀上合成寡核苷酸。在C-18針筒式柱(OP柱，ABI)上手工純化粗提的寡核苷酸。用分光光度計(jì)(230/260/280比例)確定純度和產(chǎn)量。
使用約0.2微克砂眼衣原體L2DNA(如果是單拷貝的話，約為3×107拷貝HMW蛋白基因)和約100pmol各種正向(N末端寡核苷酸)和反向(內(nèi)部寡核苷酸)引物，按程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)(2mM Mg2+，200umoldNTP，0.75單位AmpliTaq，終體積為50μl)。至少在開始時(shí)應(yīng)使用高于正常濃度(約20pmol/50μl)的引物進(jìn)行擴(kuò)增以補(bǔ)償引物簡(jiǎn)并性。使用標(biāo)準(zhǔn)的30輪循環(huán)，3步熱分布，即95℃30秒；60℃45秒，72℃1分鐘獲得靶序列的擴(kuò)增。使用Idaho Technologies熱循環(huán)儀在密封的50μl玻璃毛細(xì)管中進(jìn)行擴(kuò)增。為了證實(shí)擴(kuò)增反應(yīng)過程中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物特異于HMW蛋白編碼序列而不是“引物-二聚體”或其它DNA擴(kuò)增假象，使用硅膠自旋柱(QIAGEN)純化擴(kuò)增產(chǎn)物，將其克隆至PCR克隆載體pZERO(StrataGene)中，并直接進(jìn)行DNA序列分析。
使用常規(guī)的雙脫氧-終止劑測(cè)序化學(xué)和經(jīng)修飾的T7DNA聚合酶(Sequenase，USB)測(cè)定克隆的PCR產(chǎn)物的DNA序列。簡(jiǎn)單地說，通過用NaOH簡(jiǎn)單處理變性每個(gè)雙鏈質(zhì)粒模板。中和之后，使用每個(gè)變性的模板進(jìn)行4個(gè)獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)含有M13通用正向測(cè)序引物(21-聚體)，但ddNTP/dNTP終止混合物(即A，G，C或T)有所不同。通過在反應(yīng)中包括[α-35S]dATP(約50μCi/反應(yīng)，＞3000Ci/mmol，Amersham)以標(biāo)記終止產(chǎn)物。使各個(gè)延伸產(chǎn)物變性(甲酰胺，約95℃)，對(duì)其進(jìn)行高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(6％丙烯酰胺，8M尿素，TAE緩沖液，約500V，約90分鐘)。然后將測(cè)序凝膠轉(zhuǎn)移至濾紙(Whatmann 3MM)上，真空干燥，于-70℃進(jìn)行放射自顯影24至72小時(shí)。從每個(gè)凝膠上人工讀出堿基序列梯并測(cè)定共有序列。
通過PCR產(chǎn)生適于文庫篩選和/或Southern印跡的HMW蛋白-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，在擴(kuò)增過程中，在反應(yīng)混合物中加入[α-35P]dNTP(每種dNTP約50μCi，＞5000Ci/mmol，Amersham)以均勻地放射性標(biāo)記所述引物。按上述進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，不同的是使用Bellco熱循環(huán)儀在0.5ml微量離心管中進(jìn)行反應(yīng)。使用離心大小排阻層析柱(BioSpin 6柱，BioRad)從反應(yīng)混合物中除去未摻入的標(biāo)記物和擴(kuò)增引物。
通過將基因組DNA經(jīng)EcoRI部分消化而產(chǎn)生的經(jīng)大小-分級(jí)分離的≥10kbp的片段克隆至λ克隆載體λZAPII(Stratagene)中，構(gòu)建出高度豐余的砂眼衣原體血清變種L2DNA文庫(＞50,000原始克隆)。使用經(jīng)放射性標(biāo)記的HMW蛋白-特異性PCR產(chǎn)物篩選此文庫以得到攜有全部或部分HMW蛋白編碼序列的重組克隆。這些實(shí)驗(yàn)使用了標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法和方法學(xué)。通過連續(xù)進(jìn)行鋪板和雜交篩選將與這些探針雜交的所有噬菌體純化至均質(zhì)。一旦純化出反應(yīng)噬菌體，通過用適當(dāng)?shù)妮o助噬菌體，如R408或VCSM13(Stratagene)共感染宿主細(xì)胞從親代噬菌體中切除-拯救含有插入物的噬粒(pBluescript SK-衍生物)。通過劃線-鋪板于含有氨芐青霉素(100微克/ml)的LB瓊脂上并選擇單菌落以進(jìn)一步純化各個(gè)噬粒。
為了證實(shí)純化的噬粒衍生物攜有HMW蛋白序列，制備質(zhì)粒DNA，使用該DNA進(jìn)行含有HMW蛋白特異性PCR引物套的擴(kuò)增反應(yīng)。通過適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生證實(shí)HMW蛋白特異性插入物的存在。
質(zhì)粒pAH306是一個(gè)通過這些方法分離的含有HMW蛋白編碼序列的衍生物。
pAH306物理圖譜的繪制繪制pAH306中插入物的物理圖譜，使用適當(dāng)?shù)?-堿基限制性內(nèi)切核酸酶(如EcoRI，HindIII，BamHI，PstI，SmaI，KpnI等)測(cè)定HMW蛋白基因的位置，通過利用放射性標(biāo)記的N末端特異性PCR產(chǎn)物作為探針進(jìn)行Southern雜交以定位HMW蛋白編碼序列。通過使用由HMW蛋白特異性正向引物和與位于克隆載體中的T3或T7啟動(dòng)子序列互補(bǔ)的反向引物組成的引物套進(jìn)行PCR分析以測(cè)定HMW蛋白特異性序列的方向和長(zhǎng)度。
經(jīng)測(cè)定，質(zhì)粒pAH306含有單個(gè)約6.6kbp的EcoRI片段，其來源于衣原體。對(duì)pAH306的定向PCR分析闡明該衍生物編碼HMW蛋白基因約1.5kbp的N末端區(qū)域。
經(jīng)由與不對(duì)稱PCR循環(huán)測(cè)序方法學(xué)(ABI Prism Dye-TerminatorCycle Sequencing，Perkin-Elmer)聯(lián)合使用的常規(guī)的“序列-步移”得到pAH306編碼的HMW蛋白基因兩條鏈的DNA序列。使用未經(jīng)消化的質(zhì)粒DNA(約0.5μg/rxn)作為模板以及適當(dāng)?shù)腍MW蛋白特異性測(cè)序引物(約3.5pmol/rxn)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
除了模板和測(cè)序引物外，每個(gè)測(cè)序反應(yīng)(約20μl)含有4種不同的dNTP(即A，G，C和T)和4種相應(yīng)的ddNTP(即ddA，ddG，ddC和ddT)終止核苷酸；每種終止核苷酸與4種不同熒光染料中的一種綴合。通過摻入經(jīng)染料標(biāo)記的ddNTP終止核苷酸，在沿著模板的隨機(jī)位置終止單鏈測(cè)序延伸產(chǎn)物。使用微量離心大小排阻層析柱(Princeton Genetics)純化經(jīng)熒光染料標(biāo)記的終止產(chǎn)物，真空干燥，懸浮于模板重懸浮緩沖液(Perkin-Elmer)中，95℃變性約5分鐘，通過在ABI 310自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer)上進(jìn)行高分辨率的毛細(xì)管電泳以進(jìn)行分辨。
收集由各個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的DNA序列數(shù)據(jù)，使用ABI序列分析軟件(Perkin-Elmer)在PowerMAC計(jì)算機(jī)上自動(dòng)分析相對(duì)的熒光峰強(qiáng)度。在使用AutoAssembler軟件(Perkin-Elmer)合并成共有序列“行”之前，為了精確起見，可人工編輯各個(gè)經(jīng)自動(dòng)分析的DNA序列。對(duì)pAH306編碼的HMW蛋白基因區(qū)段的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序，將這些數(shù)據(jù)匯編在一起產(chǎn)生了HMW蛋白基因區(qū)段的復(fù)合序列。編碼HMW蛋白區(qū)段的序列示為SEQ IDNO10，由圖2中的核苷酸382至1979表示。pAH306的圖譜示于圖5。
使用GeneRunner和Intelligentics軟件進(jìn)行HMW蛋白的DNA和推導(dǎo)的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫分析(如一級(jí)氨基酸的同源性，親水性分布圖，N-/O-糖基化位點(diǎn)，功能/構(gòu)象域分析)，證實(shí)HMW蛋白是新的。
8.5.實(shí)施例5克隆HMW蛋白基因的C末端區(qū)段使用染色體步移分離HMW蛋白基因的C末端部分。選擇遠(yuǎn)離成熟HMW蛋白的N末端序列并靠近載體的T3啟動(dòng)子序列的約0.6kbpBamHI-EcoRI片段作為初次染色體步移的探針。簡(jiǎn)單地說，用BamHI和EcoRI完全消化pAH306，通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖溶于TAE緩沖液中)對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行大小分級(jí)分離。從凝膠中切下所需的約0.6kbpBamHI-EcoRI(B/E)帶，使用商購的硅膠微量離心層析柱和試劑(QIAGEN)純化之。
經(jīng)由利用商購試劑(Boehringer Mannheim)的隨機(jī)-引物標(biāo)記方法，用[α-dATP](＞3000Ci/mmol，Amersham)放射性標(biāo)記經(jīng)純化的0.6kbp B/E片段，使用該片段探測(cè)已用HindIII完全消化的砂眼衣原體L2基因組DNA的Southern印跡。
得自pAH306的0.6kbp B/E探針與約1.4kbp的HindIII基因組片段雜交。根據(jù)pAH306編碼的HMW蛋白基因區(qū)段中由實(shí)驗(yàn)得出的限制性圖譜，此片段編碼約0.2kbp C末端HMW蛋白序列。
隨后，使用經(jīng)放射性標(biāo)記的0.6kbp B/E片段探測(cè)中等豐余(約5,000個(gè)原始克隆)的砂眼衣原體L2文庫以鑒定含有約1.4kbp HindIII片段的克隆。簡(jiǎn)單地說，使用10倍過量的限制性內(nèi)切核酸酶HindIII(每1微克基因組DNA約10個(gè)單位，37℃，18-24小時(shí))完全消化砂眼衣原體L2基因組DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖溶于TAE緩沖液中)對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行大小分級(jí)分離。從凝膠中切下大小約為1.0kbp至2.0kbp的DNA片段，切下的瓊脂糖條含有所需的DNA片段大小，將其溶解于增溶/結(jié)合溶液(QX1，QIAGEN)中并使用商購的硅膠自旋柱(QIAGEN)純化之。然后將純化的1.0-2.0kbp基因組HindIII片段克隆至pBlueScript SK-質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒已預(yù)先被HindIII完全消化并經(jīng)牛小腸磷酸酶處理以防止載體再連接。
于25℃，使用T4DNA連接酶(約10個(gè)單位/反應(yīng))，以載體插入物摩爾比約為1∶10的比例，在約50μl的終反應(yīng)體積(50mM Tris-HCl，pH7.00；10mM NaCl；1mM ATP；0.5mM DTT)中進(jìn)行載體/插入物連接約達(dá)16至24小時(shí)。連接之后，使用等分試樣(約50ng連接的DNA)電穿孔感受態(tài)的大腸桿菌宿主，如大腸桿菌TOP10。然后將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞鋪于含約100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上以選擇攜有質(zhì)粒的克隆。通過毛細(xì)管作用將約1000個(gè)攜有質(zhì)粒的ApR轉(zhuǎn)化子直接從LB Ap100瓊脂平板上轉(zhuǎn)移至尼龍膜(HyBond N+，Amersham)上。
轉(zhuǎn)移之后，于37℃再次保溫平板以再生活菌落供進(jìn)一步操作。裂解轉(zhuǎn)移至膜的菌落，用變性的SDS/NaOH溶液處理菌落印跡以釋放DNA。使用Tris緩沖的NaCl溶液中和和穩(wěn)定裂解物。通過UV照射使釋放的DNA固定于膜上。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法和方法學(xué)探測(cè)含有經(jīng)放射性標(biāo)記的0.6kbp B/E片段的菌落印跡并鑒定攜有所需的約1.4kbp HindIII片段的重組衍生物。
質(zhì)粒pAH310是一個(gè)通過此方法分離的衍生物，HMW蛋白的編碼區(qū)段由圖2的核苷酸994-2401表示。
單獨(dú)和聯(lián)合使用HindIII和EcoRI對(duì)純化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性分析并對(duì)該DNA進(jìn)行DNA序列分析，兩者的結(jié)果證實(shí)pAH310編碼預(yù)期的約1.4kbp HindIII片段。這些分析也證實(shí)了約1.4kbp的插入物由pAH306上存在的相同的約1.2kbp HindIII-EcoRI片段和唯一的編碼C末端HMW蛋白特異性DNA的約0.2kbp EcoRI-HindIII片段組成。
選擇約0.2kbp EcoRI-HindIII(E/H)片段作為第二次染色體步移的探針。簡(jiǎn)單地說，用EcoRI和HindIII完全消化pAH310，通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖溶于TAE緩沖液中)對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行大小分級(jí)分離。從凝膠中切下所需的約0.2kbp(E/H)帶，純化，用[α-p32]dATP放射性標(biāo)記，將其用作探針以鑒定原始的砂眼衣原體L2λZAPII基因組文庫中編碼HMW蛋白基因C末端區(qū)段的克隆。
質(zhì)粒pAH316是一個(gè)通過此方法分離的衍生物，對(duì)pAH316的限制性分析闡明此衍生物含有約4.5kbp的砂眼衣原體L2插入物，其由大小約為2.5kbp和2.0kbp的兩個(gè)EcoRI片段組成。使用約0.2kbp(E/H)片段作為探針進(jìn)行Southern雜交分析，將此序列定位于pAH316的約2.5kbp EcoRI片段中。利用純化的pAH316質(zhì)粒DNA作為模板和特異于約0.2kbp(E/H)片段和T3和T7載體序列的擴(kuò)增引物套進(jìn)行定向PCR分析，結(jié)果表明pAH316編碼HMW蛋白基因C末端區(qū)段。HMW蛋白的編碼區(qū)段由圖2的核苷酸1974至3420表示，示于SEQ ID NO11。
8.6.實(shí)施例6產(chǎn)生截短的HMW重組蛋白將HMW蛋白N末端的那一半作為約1.5kbp的片段PCR克隆至商購的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB(Invitrogen)中。此反應(yīng)中所用的正向引物被稱為140FXHO(57-聚體)，示于SEQ ID NO18，其含有與成熟HMW蛋白的前10個(gè)N末端殘基互補(bǔ)的序列。除了HMW蛋白編碼序列外，此正向引物也攜有唯一的XhoI限制性位點(diǎn)，該位點(diǎn)理想地位于成熟HMW蛋白第一個(gè)殘基(Glu/E)的上游，從而能與載體質(zhì)粒上編碼的(His)6親和純化區(qū)域適當(dāng)?shù)厝诤?，此正向引物中還攜有5’末端6堿基G/C夾子(供有效擴(kuò)增)和12堿基內(nèi)部間隔序列(供有效的內(nèi)切核酸酶識(shí)別和消化)。
SEQ ID NO185’-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGC-TCG-AGA-GAA-ATT-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-GAT-3’SEQ ID NO195’-CGC-TCT-AGA-ACT-AGT-GGA-TC-3’將商購的反向測(cè)序引物SK(20聚體，StrataGene)，SEQ ID NO19用作此反應(yīng)中的反向擴(kuò)增引物，SK與pAH306中EcoRI位點(diǎn)下游的噬粒序列互補(bǔ)。為了提高HMW蛋白ORF產(chǎn)物(約1.5kbp)的產(chǎn)量，使用由作為主要擴(kuò)增聚合酶的T.thermophilus DNA聚合酶(AdvantagePolymerase)和少量可提供額外的5’-3’校正活性的第二高保真性熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(CloneTech)組成的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在反應(yīng)混合物中加入抗-Tth DNA聚合酶抗體以提供自動(dòng)的“熱-起始”條件，該條件可促使＞2kbp的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。使用商購的堿/SDS系統(tǒng)(QIAGEN)和硅膠自旋柱(QIAGEN)純化質(zhì)粒DNA，所述DNA被用于進(jìn)行這些擴(kuò)增反應(yīng)(約0.2ng/反應(yīng))。
使用硅膠自旋柱從未摻入的引物中純化約1.5kbp的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用過量的XhoI和EcoRI(約10單位/1微克DNA)完全消化該引物。然后將經(jīng)純化和消化的N末端截短的HMW蛋白ORF克隆至已用XhoI和EcoRI消化的商購表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB中(5∶1，插入物載體比例)。然后使用連接反應(yīng)的等分試樣電轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主(如TOP10)。
制備隨機(jī)挑選的氨芐青霉素-抗性轉(zhuǎn)化子的少量DNA，用XhoI，EcoRI或XhoI+EcoRI完全消化，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查約1.5kbp的截短HMW蛋白ORF插入物的存在和方向。制備經(jīng)測(cè)定攜有約1.5kbpXhoI/EcoRI插入物的克隆的少量DNA，將其用于不對(duì)稱PCR DNA測(cè)序反應(yīng)以證實(shí)HMW蛋白片段和表達(dá)載體的(His)6親和純化區(qū)域之間形成的連接的保真性。質(zhì)粒pJJ36-J是一個(gè)通過此方法分離的重組衍生物，由圖2的核苷酸446至1977表示。HMW蛋白的截短片段的推導(dǎo)氨基酸序列由圖3的氨基酸29至532表示，其示于SEQ ID NO17。
8.7.實(shí)施例7測(cè)定其它衣原體中的存在進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)分析以確定HMW基因是否存在于幾個(gè)臨床上認(rèn)識(shí)的砂眼衣原體株以及其它衣原體，如肺炎衣原體中。砂眼衣原體株為得自ATCC(Rockville，MD)的凍干儲(chǔ)存物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將其用于感染McCoy細(xì)胞次鋪滿的單層(約80％)。在Sorvall RT6000B離心機(jī)中離心感染的單層細(xì)胞(約1,300rpm，25℃，30分鐘)和/或在感染時(shí)用葡聚糖硫酸酯(約50μg/ml)處理以增強(qiáng)低感染性生物變種(非-LGV)與宿主細(xì)胞最初的結(jié)合，從而增加最終的EB產(chǎn)量。大約48小時(shí)之后，刮擦收集感染的單層細(xì)胞，超聲破碎宿主細(xì)胞以釋放原體(EB)。使用Denamur等，微生物遺傳學(xué)雜志，1372525-2530(1991)(列入本文作為參考)所述的蛋白酶K/Nonidet P40法從各株純化的EB(約107-108)中提取總DNA，并通過苯酚/氯仿提取和鹽沉淀進(jìn)一步純化之。純化的肺炎衣原體(AR-139)基因組DNA購自Advanced Biotechnologies公司。
為了測(cè)定這些衣原體株中HMW蛋白基因的存在，使用衣原體總DNA作為模板和下文所列的HMW蛋白區(qū)段特異性寡核苷酸引物(21聚體)套進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)SEQ ID NO205’-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-3’SEQ ID NO215’-GGT-CCC-CCA-TCA-GCG-GGA-G-3’簡(jiǎn)單地說，使用約15μl砂眼衣原體DNA粗提取物(約10μl商購的肺炎衣原體DNA)和各約20pmol SEQ ID NO20和21所示的正向和反向HMW蛋白特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)(2mM Mg2+，100μmoldNTP，0.75單位AmpliTaq聚合酶，終體積50μl)。使用32輪循環(huán)，3步熱分布，即95℃30秒；60℃30秒，72℃1分鐘獲得小靶序列(≤2kbp)的擴(kuò)增。除使用MAb-滅活的Tth/Yent DNA聚合酶組合(Advantage PCR，Clontech)，使用的72℃延伸時(shí)間為所需PCR產(chǎn)物大小加上2分鐘(即所需PCR產(chǎn)物＝6kbp，延伸時(shí)間＝8分鐘)外，以與上相同的方法使用粗DNA提取物進(jìn)行ORF-克隆和測(cè)序所用的較長(zhǎng)靶序列的擴(kuò)增。
在ABI 2400熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer)中，使用0.2ml薄壁聚丙烯微量離心管進(jìn)行常規(guī)的和長(zhǎng)距離的PCR。熱循環(huán)之后，分析反應(yīng)的等分試樣(約20μl)，通過標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖溶于TAE緩沖液)和溴化乙錠染色鑒定PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明HMW蛋白在臨床相關(guān)的血清變種中是高度保守的；HMW基因存在于所有受試衣原體樣品株中，包括血清變種B，Ba，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K，L1，L2和MoPn，也存在于肺炎衣原體中。
8.8.實(shí)施例8測(cè)定序列變異為了確定不同衣原體株中DNA和氨基酸序列變異的水平，從砂眼衣原體B血清變種(代表砂眼組生物)和砂眼衣原體F血清變種(代表低感染性的STD生物變種)中PCR克隆HMW蛋白基因，并與HMW蛋白共有的砂眼衣原體L2序列相比較。
簡(jiǎn)單地說，使用LD-PCR由含有成熟HMW蛋白完整編碼序列的砂眼衣原體B和F基因組DNA產(chǎn)生約6kbp HMW蛋白特異性DNA片段。這些LD-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件如實(shí)施例6所述。這些反應(yīng)中所用的反向擴(kuò)增引物(p316Kpn-RC，56聚體)示于SEQ ID NO13，其與位于推定HMW蛋白終止密碼子下游約3kbp處的序列互補(bǔ)。作為克隆所需的約6kbp擴(kuò)增產(chǎn)物的輔助工具，衣原體序列5’端的單個(gè)KpnI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)被設(shè)計(jì)到p316Kpn-RC引物中。這些反應(yīng)中所用的正向擴(kuò)增引物(p306Kpn-F，56聚體)示于SEQ ID NO12，其含有與特異于成熟HMW蛋白前10個(gè)氨基酸殘基(30個(gè)核苷酸)以及特異于KpnI位點(diǎn)的5’序列互補(bǔ)的序列。設(shè)計(jì)p306Kpn-F以使當(dāng)約6kbp的擴(kuò)增產(chǎn)物被插入大腸桿菌表達(dá)載體pTrcHisB(ClonTech)的KpnI位點(diǎn)時(shí)，編碼成熟HMW蛋白N末端的序列在框內(nèi)與該載體高度有效的trc啟動(dòng)子下游所編碼的六-His親和區(qū)域連接。
SEQ ID NO125’-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCG-AAA-TTA-TGG-TTC-CTC-AAG-GAA-TTT-ACG-AT-3’SEQ ID NO135’-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCC-TAA-GAA-GAA-GGC-ATG-CCG-TGC-TAG-CGG-AG-3’使用硅膠自旋柱(QIAGEN)純化約6kbp的HMW蛋白產(chǎn)物，使用10倍過量的KpnI(每1微克純化片段約10單位，37℃)對(duì)片段進(jìn)行兩輪8至10小時(shí)的KpnI消化循環(huán)。第二次消化之后，使用QIAGEN自旋柱除去殘留的限制性酶活性，將約6kbp KpnI HMW蛋白片段克隆至預(yù)先經(jīng)KpnI完全消化并經(jīng)牛小腸磷酸酶處理以防止載體再連接的pTrcHisB質(zhì)粒中。
于25℃，使用T4 DNA連接酶(約10單位/反應(yīng))，以載體插入物摩爾比約為1∶5的比例，在約50μl終反應(yīng)體積(50mM Tris-HCl，pH7.00；10mM NaCl；1mM ATP；0.5mM DTT)中進(jìn)行載體/插入物連接約2小時(shí)。連接之后，使用等分試樣(約50ng連接的DNA)電穿孔感受態(tài)的大腸桿菌宿主，如大腸桿菌TOP10。然后將經(jīng)電轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于含約100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上以選擇攜有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。37℃保溫約18至24小時(shí)之后出現(xiàn)氨芐青霉素抗性(ApR)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選這些轉(zhuǎn)化子，將它們重新劃線于相同的選擇培養(yǎng)基上以進(jìn)行純化。
使用得自各個(gè)原始轉(zhuǎn)化子的純化的ApR單菌落接種約5ml LB肉湯，在37℃保溫?fù)u床中中度通氣培養(yǎng)過夜(約200rpm)。離心收集肉湯培養(yǎng)物中的細(xì)胞，使用該細(xì)胞制備少量質(zhì)粒DNA。提取質(zhì)粒時(shí)使用商購試劑(QIAGEN Plasmid Mini試劑盒)。通過在瓊脂糖凝膠(0.8％瓊脂糖溶于TAE緩沖液)中電泳未經(jīng)消化的質(zhì)粒DNA并鑒定比載體質(zhì)粒大的衍生物可以鑒定出攜有插入物的質(zhì)粒衍生物。含有插入物的衍生物被證實(shí)，單獨(dú)或聯(lián)合使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶(KpnI，EcoRI，HindIII，BamHI等)確定HMW蛋白插入物相對(duì)于載體序列的方向。
經(jīng)由實(shí)施例4中所述的與不對(duì)稱染料-終止劑PCR循環(huán)測(cè)序方法學(xué)(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing，Perkin-Elmer)聯(lián)合使用的“序列-步移”得到砂眼衣原體B和F HMW蛋白基因兩條鏈的DNA序列。用小量制備的質(zhì)粒DNA和各個(gè)HMW蛋白序列特異性引物進(jìn)行反應(yīng)，所述引物曾用于測(cè)定L2型衣原體株的HMW蛋白基因序列。
使用ABI 310測(cè)序儀收集DNA序列數(shù)據(jù)，按實(shí)施例4所述在PowerMAC計(jì)算機(jī)上用適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析這些數(shù)據(jù)。在使用AutoAssembler軟件(Perkin-Elmer)合并成共有序列“行”之前，為了精確起見，可人工編輯各個(gè)經(jīng)自動(dòng)分析的DNA序列。對(duì)砂眼衣原體B和F血清變種的HMW蛋白基因的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序，將這些數(shù)據(jù)匯編在一起產(chǎn)生了砂眼衣原體B和F HMW蛋白基因的復(fù)合共有序列。這些序列示為SEQ ID NO15和16，L2，F(xiàn)和B衣原體株的序列比較示于圖6。
8.9.實(shí)施例9產(chǎn)生重組蛋白為了產(chǎn)生足夠量的重組HMW蛋白供免疫原性和動(dòng)物保護(hù)研究，將HMW基因PCR克隆至適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中。在基于大腸桿菌的系統(tǒng)中產(chǎn)生了大量rHMW蛋白，它們是含有N末端(His)6親和純化區(qū)域的嵌合融合蛋白。按實(shí)施例5所述，從砂眼衣原體L2基因組中以單個(gè)KpnI片段的形式PCR克隆完整的HMW蛋白開放閱讀框(ORF)，并以適當(dāng)?shù)姆较蛟谡_的閱讀框內(nèi)與高表達(dá)質(zhì)粒載體pTrcHisB(CloneTech)上編碼的(His)6親和純化區(qū)域融合。
(His)6親和純化區(qū)域是高表達(dá)基因座的一部分，所述基因座由高度有效的tac啟動(dòng)子(可被IPTG誘導(dǎo))和緊接(His)6親和純化區(qū)域上游的共有的Shine和Delgarno核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)組成。砂眼衣原體LGVL2，砂眼衣原體B和砂眼衣原體F的HMW蛋白基因被PCR克隆成約3.0kbp的片段。這些反應(yīng)中所用的正向引物(56聚體)被稱為p306Kpn-F，其含有與成熟HMW蛋白前10個(gè)N末端氨基酸殘基互補(bǔ)的序列，示于SEQ ID NO12。除了HMW蛋白編碼序列外，該正向引物還攜有唯一的KpnI限制性位點(diǎn)，該位點(diǎn)理想地位于成熟HMW蛋白第一個(gè)殘基(Glu)的上游，從而能與載體質(zhì)粒上編碼的(His)6親和純化區(qū)域適當(dāng)?shù)厝诤?，此正向引物中還攜有5’末端6堿基G/C夾子(供有效擴(kuò)增)和12堿基內(nèi)部間隔序列(供有效的內(nèi)切核酸酶識(shí)別和消化)。反向PCR引物被稱為p313Kpn-3RC，其含有與位于HMW蛋白終止密碼子下游約0.2kbp處的砂眼衣原體序列反向互補(bǔ)的序列，示于SEQ ID NO14。至于p306Kpn-F，反向引物還含有位于砂眼衣原體序列5’端的KpnI限制性位點(diǎn)，6堿基的G/C夾子和12堿基的內(nèi)部間隔序列。
為了提高HMW蛋白ORF產(chǎn)物(約3,500bp)的產(chǎn)量，使用由作為主要擴(kuò)增聚合酶的T.thermophilus DNA聚合酶和少量可提供額外的5’-3’校正活性的第二高保真性熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(AdvantagePolymerase，CloneTech)組成的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在反應(yīng)混合物中加入抗-Tth DNA聚合酶抗體以提供自動(dòng)的“熱-起始”條件，該條件可促使＞2kbp的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。
按上文實(shí)施例所述，從EB中分離多種砂眼衣原體株的基因組DNA，并使用所述DNA進(jìn)行這些反應(yīng)。擴(kuò)增之后，使用商購的硅膠自旋柱(QIAGEN)和試劑(QIAGEN)從過量引物中純化所需反應(yīng)產(chǎn)物，并用過量的KpnI(約10單位/1微克DNA)完全消化該產(chǎn)物。然后將經(jīng)純化和消化的KpnI HMW蛋白ORF克隆至已用KpnI消化的表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB中(5∶1，插入物載體比例)。然后使用連接反應(yīng)的等分試樣電轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主(如TOP10)。
制備隨機(jī)挑選的氨芐青霉素-抗性轉(zhuǎn)化子的少量DNA，用KpnI，HindIII或KpnI+HindIII完全消化，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢查約3.2kbp的HMW蛋白ORF插入物的存在和方向。按上文實(shí)施例所述，使用小量制備的DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR DNA測(cè)序反應(yīng)以證實(shí)HMW蛋白片段和載體的(His)6親和純化區(qū)域之間形成的連接的保真性。質(zhì)粒pAH342是一個(gè)通過此方法分離的衍生物，其含有砂眼衣原體L2的HMW蛋白基因ORF并由圖2的核苷酸446至3421表示。
在含有100微克/ml Ap的2X-YT肉湯中將重組體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(約0.5 O.D.600)并用IPTG(終濃度為1mM)誘導(dǎo)4至5小時(shí)以激活載體trc啟動(dòng)子引發(fā)的轉(zhuǎn)錄。離心收集細(xì)胞，使用弗氏壓碎器通過裂解制備粗細(xì)胞裂解物。
或者使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)rHMW蛋白。這里，按與pTrcHisB基本上相同的方式，將砂眼衣原體L2和砂眼衣原體F的HMW蛋白ORF作為約3kbp的PCR產(chǎn)物PCR-克隆至預(yù)先用KpnI完全消化并用CIP處理以使載體再連接最小化的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體(如pFastBacHTb)中。然后通過使用商購的桿粒系統(tǒng)(Bac-to-Bac，Gibco)進(jìn)行位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座將此次克隆反應(yīng)中產(chǎn)生的HMW蛋白表達(dá)元件(即桿狀病毒多角體啟動(dòng)子，N末端(His)6親和純化區(qū)域，HMW蛋白基因ORF)轉(zhuǎn)移至桿狀病毒基因組中。
簡(jiǎn)單地說，使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化和選擇方法學(xué)，用HMW蛋白桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有桿粒(雜合的桿狀病毒-質(zhì)粒復(fù)制子)的感受態(tài)大腸桿菌DH10bac(Gibco)細(xì)胞(慶大霉素抗性)。使用標(biāo)準(zhǔn)的IPTG/X-Gal藍(lán)-白選擇鑒定出HMW蛋白表達(dá)元件已由表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)座至位于桿粒復(fù)制子中的lacZ基因內(nèi)適當(dāng)受體位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子。
隨機(jī)挑選白色的GmR轉(zhuǎn)化子并重新劃線以進(jìn)行純化。通過Ish-Horowitz，N.A.R.92989-2993(1981)(列入本文作為參考)的方法由肉湯培養(yǎng)物制備桿粒DNA，使用該DNA轉(zhuǎn)染草地夜蛾9細(xì)胞。噬斑純化之后，使用重組HMW蛋白桿狀病毒感染大量夜蛾懸浮培養(yǎng)物。使用酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生糖基化形式的HMW蛋白。
8.10.實(shí)施例10純化重組蛋白使用標(biāo)準(zhǔn)的制備性固定化金屬親和層析(IMAC)法將重組HMW蛋白純化至均質(zhì)。簡(jiǎn)單地說，于37℃，在51發(fā)酵罐(New Brunswick)中的Luria肉湯中，中度通氣培養(yǎng)攜有含HMW蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(約0.5O.D.600)，并用IPTG(終濃度為1mM)誘導(dǎo)4至5小時(shí)。收集細(xì)胞團(tuán)塊，用PBS洗滌并儲(chǔ)存于-20℃。通過機(jī)械振動(dòng)將凍干細(xì)胞團(tuán)塊的等分試樣(濕重約為9至10g)懸浮于約120mlD-PBS中，穿過弗氏壓碎器(2×，14,000psi，4℃)以裂解細(xì)胞。然后通過高速離心(約10,000×g，4℃，30分鐘)從rHMW蛋白包涵體中除去可溶性的蛋白質(zhì)。
按上述通過混勻和離心將含有rHMW蛋白的不溶性沉淀物懸浮于約20ml冰冷的D-PBS中。通過懸浮于含有6M鹽酸胍的磷酸鈉緩沖液(0.1M，pH7.0)中以變性經(jīng)洗滌的rHMW蛋白包涵體，并將包涵體上樣于通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備自Fast-Flow螯合Sepharose(Pharmacia)并因Ni2+或Zn2+離子而帶電的Ni2+-親和柱(1.5cm×25cm，床體積約為15ml)。通過用約5至10倍柱體積的含有8M尿素的磷酸鈉緩沖液(0.1M，pH7.0)洗滌柱可除去未結(jié)合的物質(zhì)。
使用pH4.0磷酸鈉/8M尿素緩沖液(約20ml)洗脫利用N末端(His)6親和純化區(qū)域與親和樹脂結(jié)合的重組HMW蛋白。通過加入1.0M Tris-HCl(約2.5ml，pH7.5)中和洗脫物，對(duì)含有SDS(0.5％)的TE緩沖液透析以除去尿素。使用Centricon-30離心濃縮器(Amicon，30,000MWCO)濃縮透析物，與1/5體積含有1mM 2-巰基乙醇(Lammeli)的5×SDS凝膠樣品緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘。
將樣品上樣于Tris/甘氨酸制備性丙烯酰胺凝膠(4％濃縮膠，12％分離膠，30∶0.8丙烯酰胺∶bis溶液，厚度3mm)。與rHMW蛋白樣品一起平行電泳預(yù)染的分子量標(biāo)準(zhǔn)(SeeBlue，Novex)以在凝膠上鑒定大小組分。切下含有分子量約為50至70Kdal的蛋白質(zhì)的凝膠帶，按廠商說明，使用Elu-Trap裝置和膜(S&S)電洗脫蛋白質(zhì)。透析經(jīng)電洗脫的蛋白質(zhì)以除去SDS。使用Micro-BCA系統(tǒng)(Pierce)，以BSA為濃度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度。如圖4所示，使用常規(guī)的SDS-PAGE和商購的銀染試劑(Silver Stain Plus，Novex)測(cè)定rHMW蛋白的純度。
經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，分離的成熟rHMW的表現(xiàn)分子量約為105至115Kda。
8.11.實(shí)施例11制備HMW蛋白的抗體通過用純化的HMW蛋白或其片段免疫兔產(chǎn)生針對(duì)HMW蛋白的多價(jià)抗血清。用約250微克HMW蛋白或其片段對(duì)每只動(dòng)物總共進(jìn)行3次免疫，每次注射(開始用完全弗氏佐劑，接著用不完全弗氏佐劑)間隔約21天。每次免疫時(shí)，將約一半的藥劑肌內(nèi)(i.m.)給藥，另一半結(jié)內(nèi)注射。第三次免疫后14天，肌內(nèi)給藥約100微克HMW蛋白進(jìn)行第四次加強(qiáng)免疫，7至10天后，給動(dòng)物放血，使用純化的HMW蛋白(1.0微克/孔)或砂眼衣原體L2EB(完整的粗蛋白提取物)作為捕獲配體，經(jīng)ELISA測(cè)定抗-HMW蛋白滴度。使用純化的rHMW截短蛋白觀察到免疫原特異性的IgG ELISA滴度為1/320,000，使用EB或RB觀察到上述滴度為1/2500。
用PBS連續(xù)稀釋抗血清，并通過ELISA檢測(cè)雙份稀釋樣品。在這些試驗(yàn)中，使用經(jīng)1/1000稀釋的山羊HRP-綴合的抗兔抗體作為第二報(bào)道抗體。滴度被表示為顯示出陽性ELISA反應(yīng)的最大稀釋度，即O.D.450值＞高于平均陰性對(duì)照值2SD(預(yù)先采血的兔血清)。然后使用超免疫的抗血清探測(cè)粗EB或RB提取物以及1.0％OGP EB提取物制品的Western印跡以測(cè)定其它砂眼衣原體血清變種和其它衣原體是否表達(dá)HMW蛋白。檢測(cè)了砂眼衣原體血清變種B，Ba，D，F(xiàn)，G，I，J，K，L1，L2，L3，MoPn和肺炎衣原體，發(fā)現(xiàn)它們具有表觀分子量為105至115Kda的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可與針對(duì)HMW蛋白產(chǎn)生的抗血清反應(yīng)。
8.12.實(shí)施例12表面定位通過間接熒光抗體(IFA)檢查HMW蛋白在不同衣原體株和衍生物上的表面定位。使用超免疫的抗HMW蛋白作為第一抗體，通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行IFA。通過下列方法，用砂眼衣原體血清變種L2，B和F，肺炎衣原體或鸚鵡熱衣原體之一的完整EB感染Hak細(xì)胞。
在24孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的12mm平蓋玻片上，于DMEM培養(yǎng)基中將McCoy或Hak細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿，然后用約5×104包涵體形成單位(IFU)的砂眼衣原體N11株(血清變種F)離心接種。保溫24小時(shí)之后，除去培養(yǎng)基，用甲醇將感染細(xì)胞固定10分鐘。然后用PBS(1×)洗滌固定的單層以除去固定劑，用＞300μl已用PBS 1/100稀釋的抗-60Kdal截短的HMWP兔抗體洗去覆蓋層。與第一抗體保溫1小時(shí)之后，用PBS小心洗滌細(xì)胞，再與1/200稀釋的與FITC綴合的小鼠抗兔IgG抗體保溫約30分鐘。使用含有0.0091％Evans Blue作為復(fù)染劑的PBS溶液稀釋第二抗體以肉眼觀察單層。用PBS洗滌細(xì)胞2次以除去第二抗體，從培養(yǎng)板內(nèi)取出蓋玻片，使用熒光固定介質(zhì)將其固定在顯微鏡載玻片上。
平行處理單獨(dú)用預(yù)先采血的兔抗體或與FITC-綴合的第二抗體染色的相同細(xì)胞樣品，將其用作抗體特異性(陰性)對(duì)照。用裝配有plan-neoflur物鏡的Zeiss Axioskop光學(xué)顯微鏡，以1000倍的放大倍數(shù)檢查復(fù)染的樣品。使用砂眼衣原體N11(血清變種為F)的結(jié)果示于圖7。結(jié)果表明與對(duì)照相比，被HMW蛋白抗體染色的樣品的熒光增強(qiáng)證實(shí)了HMW蛋白位于表面。另外，被HMW蛋白抗體染色樣品的熒光顯示出與L2，B和MoPn血清變種或肺炎衣原體表面定位的HMW蛋白的結(jié)合。
9.實(shí)施例體外中和模型使用體外中和模型已證實(shí)保護(hù)性的抗血清抑制多種組織培養(yǎng)細(xì)胞系的衣原體感染(中和)。動(dòng)物模型也是檢測(cè)疫苗效力所必需的，小型動(dòng)物(非靈長(zhǎng)類)和靈長(zhǎng)類模型是臨床評(píng)價(jià)所必需的。已使用豚鼠研究由豚鼠包涵體結(jié)膜炎致病原(GPIC)鸚鵡熱衣原體引起的實(shí)驗(yàn)性眼和生殖器感染。
小鼠提供了一致的、可再現(xiàn)的由人生殖道分離物引起的生殖道感染模型。此小鼠模型是普遍被接受的預(yù)臨床試驗(yàn)，使用該模型將MOMP作為亞單位疫苗評(píng)價(jià)。另一個(gè)模型是砂眼感染的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，其中分泌型IgA的誘導(dǎo)是保護(hù)作用的基本組成成分。使用上述普遍被接受的體外中和和動(dòng)物模型系統(tǒng)可測(cè)定新亞單位抗原候選物生成疫苗的能力。
動(dòng)物保護(hù)作用研究的初步試驗(yàn)是評(píng)價(jià)超免疫抗HMW抗體體外阻斷多種砂眼衣原體血清變種(如L2，B，F(xiàn))感染性的能力。盡管使用McCoy細(xì)胞增殖衣原體，這些細(xì)胞也允許經(jīng)由Fc受體進(jìn)行抗體-介導(dǎo)的攝取。因此，為了評(píng)價(jià)抗HMW抗體對(duì)感染性的抑制作用，將未顯示出Fc受體的Hak細(xì)胞用于這些分析。
于37℃，5％CO2中，在24孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞至次鋪滿單層(約90％鋪滿＝1×105個(gè)細(xì)胞/ml)。用蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸鹽(SPG)緩沖液將抗-HMW-抗體稀釋至100μg/ml(總蛋白質(zhì))，然后用SPG緩沖液進(jìn)行連續(xù)稀釋。用SPG緩沖液將預(yù)滴定衣原體的凍干等分試樣稀釋至約2×104IFU/ml。將EB與稀釋的抗HMW抗體預(yù)混合至約10-20IFU/μl，于30℃在搖動(dòng)的平臺(tái)上保溫30分鐘。
用HBSS洗滌制備的Hak細(xì)胞，然后與抗HMW抗體/衣原體EB混合物保溫(每種抗體3份，EB為500IFU/ml)。37℃下將培養(yǎng)板保溫2小時(shí)，然后除去種子培養(yǎng)物，用HBSS將培養(yǎng)板洗滌3次。加入含有1μg/ml環(huán)己酰亞胺的組織培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2中，將培養(yǎng)板保溫約24至36小時(shí)以生成包涵體。保溫之后，除去培養(yǎng)基，用PBS將細(xì)胞單層洗滌3次。用甲醇將培養(yǎng)板固定20分鐘并重新用PBS洗滌。
通過與抗衣原體LPS抗體(約按1∶500稀釋，ViroStat)保溫來染色細(xì)胞以觀察包涵體，用PBS將細(xì)胞洗滌3次，37℃與FITC-綴合的山羊第二抗體保溫30分鐘。洗滌蓋玻片，風(fēng)干，在玻璃蓋玻片上用甘油固定之。在Zeiss熒光顯微鏡下，計(jì)數(shù)貫穿蓋玻片中線的5個(gè)區(qū)域內(nèi)的包涵體。結(jié)果被表示為與異源抗體對(duì)照(兔預(yù)先采血的血清)相比含包涵體細(xì)胞減少的百分比。
10.實(shí)施例疫苗效力(輸卵管炎和能育小鼠模型)10.1.方法10.1.1.免疫和攻擊使用Tuffrey鼠不育模型評(píng)價(jià)rHMWP保護(hù)動(dòng)物免受砂眼衣原體誘導(dǎo)的輸卵管炎和不孕癥的效力。此評(píng)價(jià)中使用了3組，各為17只的雌性C3H HeOuJ小鼠(約6周齡，Jackson Labs)。在第0，2和3周，鼻內(nèi)施用約20微升疫苗制劑以免疫17只動(dòng)物的試驗(yàn)組，所述制劑含有約10至12微克經(jīng)凝膠純化的rHMWP和約5微克作為佐劑的mLT(SmithKline Beecham)。在免疫之前，使用由溶于68％無熱原之PBS的16％Ketaject和16％Xylaject組成的麻醉劑混合物使小鼠鎮(zhèn)靜(每只動(dòng)物腹膜內(nèi)注射100微升)。使已服用鎮(zhèn)靜劑的小鼠背朝下，使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室移液管施用疫苗制劑；每只鼻孔約滴10微升疫苗溶液，兩次滴加之間等待5至10分鐘。
類似地，用僅含有5微克mLT(即僅用佐劑，無抗原)的制劑免疫2組，各為17只的雌性小鼠。隨后用砂眼衣原體攻擊其中一組(假免疫，感染的)并用作陰性能育對(duì)照，而另一組未被攻擊(假免疫，假感染)，將其用作陽性能育對(duì)照。
第4周，給所有動(dòng)物施用單一腹膜內(nèi)劑量的孕酮(2.5mg，溶于無熱原的PBS，DepoPro-vera，Upjohn)以穩(wěn)定子宮上皮細(xì)胞。第5周，通過兩側(cè)對(duì)稱地在子宮內(nèi)接種溶于100微升蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸鹽(SPG)緩沖液中的約5×105IFU(包涵體形成單位)的砂眼衣原體NI1(血清變種F)，以感染被rHMWP免疫的動(dòng)物和陰性對(duì)照組中的動(dòng)物。為了模擬其他兩組經(jīng)受的生殖道手術(shù)，陽性對(duì)照動(dòng)物雙側(cè)接種100μl不含砂眼衣原體的McCoy細(xì)胞提取物。第7周，通過CO2窒息處死每組5-7只動(dòng)物，取出完整的生殖道(上生殖道和下生殖道)用于組織病理學(xué)分析。第9周，各組中剩余的雌性動(dòng)物與8-10周齡雄性C3H小鼠共同籠養(yǎng)2個(gè)月的繁殖期，以評(píng)價(jià)生殖力(每籠1只雄性動(dòng)物2只雌性動(dòng)物，組內(nèi)雄性動(dòng)物每周輪換，不同實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物不混雜)。通過觸診和定期稱重確定每一組合內(nèi)動(dòng)物何時(shí)懷孕。用于估計(jì)各組生殖力的參數(shù)為F，交配期內(nèi)至少產(chǎn)仔一次的小鼠數(shù)除以該研究組內(nèi)小鼠總數(shù)；M，新生小鼠數(shù)(出生時(shí)死亡或存活)除以交配期內(nèi)該組所產(chǎn)幼仔數(shù)；N，新生小鼠數(shù)(出生時(shí)死亡或存活)除以該組小鼠總數(shù)。
10.1.2.組織病理學(xué)生殖道在Bouin固定劑中處理不少于24小時(shí)，在50％、70％和100％甲醇中逐步脫水，在甲苯中浸泡，石蠟包埋或直接包埋于OCO化合物(Tissue-TEK，Miles)中，然后在液氮中速凍。組織切片(約6μm)用蘇木精和依紅染色(Bouin固定樣品脫石蠟之后)。輸卵管和卵巢中的炎癥變化如下分級(jí)0，沒有明顯炎癥反應(yīng)；1，少數(shù)單核細(xì)胞浸潤輸卵管卵周空間或粘膜下層；2，同1但程度更嚴(yán)重；3，同2但輸卵管粘膜下層增厚，輸卵管腔內(nèi)有炎癥細(xì)胞；4，同3但程度更嚴(yán)重。子宮頸/陰道內(nèi)炎癥根據(jù)觀察到的上皮內(nèi)浸潤水平計(jì)分。
10.1.3.確定rHMWP特異性體液應(yīng)答免疫和攻擊期間通過眶后采血定期收集血樣，離心制備血清。用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)移液器向陰道內(nèi)反復(fù)注射50μl無菌PBS并立即回收溶液收集陰道分泌物。進(jìn)行2到3次注射/回收循環(huán)。
通過ELISA定量抗體(Ab)應(yīng)答按照8.11節(jié)所述進(jìn)行。確定抗體水平的微量ELISA板(Maxisorb，NUNC)在4℃每孔用大約0.5-1.0μg凝膠純化的rHMWP包被過夜，rHMWP溶于10mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)，用含有0.1％Tween-20的PBS(洗滌緩沖液)洗滌，用含有3％BSA的PBS溶液在37℃封閉大約1小時(shí)。為確定抗原特異性血清IgG水平，實(shí)驗(yàn)血清用含有0.5％BSA的洗滌緩沖液系列稀釋，試樣(100μl)在抗原包被的孔中37℃溫育約2小時(shí)。然后洗滌微量板，用偶聯(lián)有辣根過氧化酶的羊抗小鼠IgG第二抗體(Sigma)在37℃溫育大約1小時(shí)。HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠IgA第二抗體用來檢測(cè)陰道分泌物中存在的rHMWP特異性IgA。在與合適的第二抗體溫育后，洗滌微量板，與TMB底物(Sigma)在室溫下溫育約20到30分鐘。加入2M硫酸終止反應(yīng)，在Molecular Devices SpectroMax微量板讀數(shù)儀上于450納米測(cè)定吸收值。滴度為450納米時(shí)光密度為1的樣品稀釋度的倒數(shù)。
10.1.4.確定rHMWP特異性細(xì)胞應(yīng)答每組6只雌性C3H HeOuJ小鼠(Jackson Labs)的幾組動(dòng)物分別給予鎮(zhèn)靜劑，在0、2和3周如10.1.3.節(jié)所述通過鼻內(nèi)給予rHMWP+mLT疫苗進(jìn)行免疫接種。在第4周和第5周，分別于孕酮處理和尿道內(nèi)攻擊之前，取每組3只動(dòng)物通過CO2窒息處死，無菌取出脾臟，使用常規(guī)方法制成單細(xì)胞懸液。分別分析來自免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞。陽性對(duì)照組(假免疫和假感染)和陰性對(duì)照組(假免疫、感染)脾細(xì)胞合并，測(cè)試再次刺激。
為測(cè)試脾細(xì)胞增殖，在5毫升RPMI 1640 Glutamax I中碾磨脾臟(5到10轉(zhuǎn))，上述溶液中添加有10％胎牛血清、25mM HEPES、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、1mm丙酮酸鈉、非必需氨基酸和50μM 2-巰基乙醇(Gibco-BRL)?；罴?xì)胞通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，在同一培養(yǎng)基中稀釋至密度為1.0-2.0×106細(xì)胞/ml(Falocn 2063聚丙烯管)。在圓底96孔培養(yǎng)板(Nunclon，Nunc)上建立3組重復(fù)培養(yǎng)物，每孔是200μl中的大約5×105應(yīng)答細(xì)胞。細(xì)胞用1.0μg/ml rHMWP刺激(抗原特異性增殖)，或用4μg/ml伴刀豆球蛋白A(Boerhinger Mannheim)刺激作為陽性刺激對(duì)照，未刺激細(xì)胞培養(yǎng)物作為細(xì)胞激活的陰性對(duì)照。在37℃5％CO2中溫育72-96小時(shí)后，每孔中細(xì)胞用1.0μCi3H-胸苷(Amersham)脈沖標(biāo)記大約18小時(shí)。脈沖處理過的細(xì)胞使用Tomtec細(xì)胞收獲儀(MkIII)收獲在玻璃纖維片上，在3道Wallac 1450 Trilux液閃計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)β發(fā)射。樣品(單獨(dú)的或合并的)的刺激指數(shù)(SI)定義為3孔抗原或ConA刺激T細(xì)胞的胸苷吸收平均值除以3孔未刺激細(xì)胞的吸收平均值。確定抗原特異性(rHMWP特異性)和ConA特異性增殖的SI。
10.2.結(jié)果10.2.1.異型攻擊后對(duì)小鼠生殖力的影響用rHMWP合并mLT進(jìn)行粘膜免疫可以對(duì)由人衣原體臨床分離株(NI1，血清變種F)引起的不育提供保護(hù)，證據(jù)如表1所示。用rHMWP免疫的動(dòng)物的生殖率(70％，即組內(nèi)可育雌性動(dòng)物數(shù)/組內(nèi)動(dòng)物總數(shù))較陰性對(duì)照組(30％，假免疫、感染)顯著為高。類似地，與陰性對(duì)照組相比，rHMWP免疫組產(chǎn)出更多的后代，組生殖力更大(后代分別為51和24，生殖力得分為5.1±4.7和2.4±4.6)。從組間來看，用rHMWP疫苗免疫的動(dòng)物與假感染陽性對(duì)照組動(dòng)物(80％生殖率，后代總數(shù)為56，生殖力4.9±2.7)的生殖率、后代總數(shù)和生殖力得分相當(dāng)。
本實(shí)驗(yàn)中對(duì)砂眼衣原體引起的不育的保護(hù)也證實(shí)了rHMWP對(duì)抗砂眼衣原體疾病提供跨生物變種和跨血清變種保護(hù)的用途。本實(shí)驗(yàn)中使用的重組HMWP抗原克隆自屬于砂眼衣原體性病淋巴肉芽腫(LGV)組的菌株(菌株L2)，該菌株引起全身性以及更多見為眼和生殖道的局部粘膜感染。這些實(shí)驗(yàn)中使用的砂眼衣原體攻擊生物NI1菌株是屬于砂眼生物變種的F血清變種的生物，它們引起多種泌尿生殖道感染。
表1.大約2個(gè)繁殖周期后生殖力評(píng)估
1.每組幼仔平均數(shù)2.Fisher精確測(cè)定，單側(cè)，95％置信區(qū)間p值相對(duì)陰性對(duì)照給出3.Student t測(cè)定，不成對(duì)，Gausian分布，95％置信區(qū)間p值相對(duì)陰性對(duì)照給出10.2.2.對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響rHMWP特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)激活使用常規(guī)脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)。當(dāng)脾細(xì)胞在第4周(孕酮處理之前)(表2)和第5周(激素處理后約7天，但在尿道內(nèi)攻擊之前)(表3)測(cè)試時(shí)，來自rHMWP免疫動(dòng)物的所有樣品形成強(qiáng)抗原特異性增殖免疫應(yīng)答。rHMWP免疫動(dòng)物孕酮處理前的抗原特異性刺激指數(shù)(SI)等于或大于用ConA進(jìn)行促有絲分裂獲得的SI(抗原和ConA刺激的平均值獲自3只rHMWP免疫動(dòng)物，分別為26.2和18.4)。獲自假免疫動(dòng)物或未免疫動(dòng)物(即未接觸過rHMWP抗原或mLT的動(dòng)物)的脾細(xì)胞對(duì)rHMWP物質(zhì)的體外再次刺激無應(yīng)答，因此確立了免疫動(dòng)物中觀察到的增殖應(yīng)答的特異性。孕酮處理不影響rHMWP免疫動(dòng)物中觀察到的抗原特異性增殖應(yīng)答。激素處理后獲得的脾細(xì)胞的抗原特異性SI大于促有絲分裂刺激獲得的SI(抗原和ConA刺激的平均值獲自3只rHMWP免疫動(dòng)物，分別為92.4和37.8)。來自假免疫或未免疫動(dòng)物的樣品未顯示任何抗原特異性增殖應(yīng)答。
表2.激素處理前rHMWP特異性細(xì)胞增殖
表3.激素處理后rHMWP特異性細(xì)胞增殖
10.2.3.對(duì)體液免疫應(yīng)答的影響為了證實(shí)用全長(zhǎng)rHMWP免疫產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，在第5周攻擊之前(即第3次免疫后大約2周)收集的血清的IgG滴度通過ELISA測(cè)定。如表4所示，用3劑大約10-12μg rHMWP免疫C3H小鼠在所有動(dòng)物中產(chǎn)生可檢測(cè)水平的抗rHMWP IgG。同時(shí)從這些動(dòng)物收集陰道分泌物，測(cè)定抗rHMWP粘膜IgA。在3只動(dòng)物中檢測(cè)到了抗原特異性陰道IgA(表4)。
表4.rHMWP特異性體液應(yīng)答
11.實(shí)施例PJJ701的構(gòu)建含有全長(zhǎng)衣原體L2HMWP基因的質(zhì)粒通過選擇性除去pAH306(見8.4節(jié))中HMWP N末端上游的EcoRI位點(diǎn)而構(gòu)建。這通過用XhoI完全消化pAH306，然后重新連接質(zhì)粒形成pAH306-XhoΔ-1而完成。含有剩余的HMWP C末端、來自pAH316(8.5節(jié))的大約2.5Kbp EcoRI片段從制備性凝膠中分離，凝膠中已加載有pAH316的EcoRI完全消化產(chǎn)物。含有合適的約2.5Kbp片段的瓊脂糖凝膠膠條切出，用NaI緩沖液溶解，通過羥基磷灰石自旋柱層析(QiaGen)從剩余的瓊脂糖純化。純化的C末端HMWP EcoRI片段連接至pAH306-XhoΔ-1的單一EcoRI位點(diǎn)，它位于HMWP N末端編碼序列的3′末端，使用T4DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法。大腸桿菌Top10細(xì)胞用pAH306-Xho -1試樣(EcoRI消化和磷酸酶處理的載體)和2.5Kbp EcoRI C末端片段連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，重組子在含100μg/ml氨芐青霉素的2X-YT瓊脂上選擇。氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑出。質(zhì)粒DNA使用QiaGen小量制備質(zhì)粒DNA分離系統(tǒng)從單個(gè)ApR轉(zhuǎn)化子中分離，通過常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色篩選大于pAH306-XhoΔ-1的質(zhì)粒。攜帶2.5Kbp HMWP片段的pAH306-XhoΔ-1衍生物定向合適就可以表達(dá)全長(zhǎng)HMWP，使用EcoRI和/或XhoI限制性分析鑒定之。質(zhì)粒pAH374是該試驗(yàn)中分離的一個(gè)衍生物。
基于PCR的定點(diǎn)誘變方法(Quik-Change定點(diǎn)誘變系統(tǒng)，Stratagene)用來實(shí)現(xiàn)所需DNA改變，即在pAH374的HMWP編碼序列中除去NdeI位點(diǎn)。誘變PCR引物140-Nde-FX和14-NdeRCX長(zhǎng)度為41個(gè)堿基，互補(bǔ)于含有NdeI位點(diǎn)的序列，將其設(shè)計(jì)成消除NdeI識(shí)別位點(diǎn)但不改變相應(yīng)蛋白編碼序列。用來除去pAH374中NdeI位點(diǎn)的兩個(gè)PCR誘變引物序列如下。
140-Nde-FX(SEQ ID NO38)5′-GGG TTT GGG AAT CAG CAC ATG AAA ACC TCA TAT ACA TTT GC-3′140-Nde-RCX(SEQ ID NO39)5′-GCA AAT GTA TAT GAG GTT TTC ATG TGC TGA TTC CCA AAC CC-3′Pfu DNA聚合酶(Stratagene)誘變和DpnI消化以切割任何未改變的pAH374親本質(zhì)粒之后，突變的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌XL1-Blue。攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在含100μg/ml氨芐青霉素的2X-YT瓊脂上選擇。抗生素抗性轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑出，篩選大小同pAH374的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子中分離的質(zhì)粒通過EcoRI限制性內(nèi)切酶消化確認(rèn)。這些質(zhì)粒中缺少NdeI位點(diǎn)通過NdeI消化確定。為了確證HMWP NdeI位點(diǎn)的丟失并確保誘變過程中該區(qū)域中沒有不希望的DNA序列改變，使用位于NdeI位點(diǎn)上游的序列特異性測(cè)序引物對(duì)誘變質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析。質(zhì)粒pAH374-NdeΔ-1是從該試驗(yàn)中分離的一個(gè)質(zhì)粒。
質(zhì)粒pAH374-NdeΔ-1中缺少內(nèi)部NdeI位點(diǎn)、編碼砂眼衣原體L2HMWP的DNA片段通過PCR擴(kuò)增，使用質(zhì)粒pAH374-NdeΔ-1(約50ng)和引物306-Nde-Met1和312H6Xba1。引物306NdeMet1被設(shè)計(jì)成包含中央NdeI位點(diǎn)，以便定向克隆至pMG81。306NdeMet1中的NdeI位點(diǎn)與HMWP信號(hào)序列的ATG起始密碼子重疊，其5′側(cè)翼是20個(gè)堿基的G/C夾子，3′側(cè)翼是與HMWP信號(hào)序列的前15個(gè)殘基互補(bǔ)的序列。引物312H6Xba1被設(shè)計(jì)成包含與HMWP C末端互補(bǔ)的序列，其后是限定6組氨酸親和純化結(jié)構(gòu)域的(CAT)6基序。該引物也含有2個(gè)UAA終止密碼子，1個(gè)XbaI識(shí)別序列，在引物的3′末端是20個(gè)堿基的G/C夾子。306NdeMet1和312H6Xba1 PCR引物的序列如下。
306NdeMet1(SEQ ID NO40)5′-AAG GGC CCA ATT ACG CAG ACA TAT GGA AAC GTC TTT CCA TAA GTTCTT TCT TTC A-3′312H6Xba1(SEQ ID NO41)5′-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGT CTA GAT TAT TAA TGA TGA TGA TGATGA TGG AAC CGG ACT CTA CTT CCT GCA CTC AAA CC-3′8.4.節(jié)所述PCR擴(kuò)增條件用來產(chǎn)生NdeI-XbaI HMWP基因盒。擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物使用羥基磷灰石自旋柱(QiaGen)純化，用大約10倍過量的NdeI和Xba I 37℃消化過夜，在片段末端產(chǎn)生所需的“突出端”。消化的片段使用自旋柱再次純化，大約250納克連接到大約50納克pMG81質(zhì)粒DNA上，該質(zhì)粒DNA事先已用NdeI和Xba I完全消化，隨后，用CIP處理以防止載體再連接。一份連接反應(yīng)產(chǎn)物試樣用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌AR58菌株，該菌株已經(jīng)通過Lederberg和Cohen法處理變成感受態(tài)。轉(zhuǎn)化子在含有40μg/ml硫酸卡那霉素的2X-YT瓊脂上選擇。由于pMG81上溫度可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在30℃生長(zhǎng)。卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑出，篩選較pMG81大3.0Kbp的質(zhì)粒。含有插入片段的pMG81衍生物通過使用NdeI，XbaI，EcoRI和NcoI限制性內(nèi)切酶分析證實(shí)。質(zhì)粒pJJ701是該操作中分離的一個(gè)質(zhì)粒。
12.實(shí)施例16從AR58(PJJ701)產(chǎn)生全長(zhǎng)rHMWP1毫升含有質(zhì)粒pJJ701的大腸桿菌菌株AR58的凍存原種接種大約100毫升含有40μg/ml卡那霉素的2X-YT肉湯，30℃生長(zhǎng)過夜，以制備發(fā)酵種子培養(yǎng)物。大約20毫升過夜種子培養(yǎng)物用來接種NewBrunswick Bioflow 3000發(fā)酵罐，發(fā)酵罐中裝有大約2升含有40μg/ml卡那霉素的2X-YT肉湯。AR58(PJJ701)培養(yǎng)物在30℃充分通氣生長(zhǎng)，直至OD625值為0.5-0.6。通過提高發(fā)酵培養(yǎng)物溫度至大約39到42℃誘導(dǎo)rHMWP表達(dá)。在較高溫度下溫育持續(xù)大約4-5個(gè)小時(shí)。
在誘導(dǎo)期末，某些細(xì)胞顯示典型的重組蛋白包函體，使用HeraeusContifuge 28RS離心機(jī)通過連續(xù)流動(dòng)離心收集大腸桿菌培養(yǎng)物。離心后，從離心管上刮下細(xì)胞沉淀，-70℃保存待用。
大約15gm AR58(pJJ701)凍存細(xì)胞沉淀在大約40毫升冰冷的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)中渦旋攪拌并碾磨。懸浮后，加入溶菌酶(雞蛋白，Sigma)和DnaseI(牛胰腺，Sigma)至終濃度分別為1.0mg/ml和0.01mg/ml，混合物在冰上溫育30到45分鐘。細(xì)胞連續(xù)兩次通過預(yù)冷的(大約4℃)SLM Aminco弗氏壓力室(大約14Kpsi，1”內(nèi)徑)以破碎之。在Sprvall SS34轉(zhuǎn)頭中以大約20000×g離心45分鐘分離含有rHMWP的不溶物質(zhì)(沉淀)。該離心獲得的上清液棄去，沉淀形式的不溶組分在-20℃下儲(chǔ)存。
為選擇性提取污染的蛋白并除去內(nèi)毒素，含有rHMWP的不溶性沉淀在冰上融化，用10毫升含有2.0％Triton X-100的PBS緩沖液洗滌兩次。在室溫下洗滌，通過常規(guī)玻璃組織碾磨機(jī)渦旋攪拌和勻漿獲得含有rHMWP的膠質(zhì)沉淀懸液。通過在Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭中大約10000×g離心20分鐘(室溫)洗滌獲得含有rHMWP的不溶物質(zhì)。不溶物質(zhì)用10毫升含有2.0M氯化鈉的4.0M尿素溶液洗滌2次(同樣渦旋攪拌和勻漿)。洗滌過的rHMWP物質(zhì)同上離心回收。不溶性rHMWP組分用含有1.0％Zwittergent 3-14(Sigma)的PBS溶液再洗2次。
最后一次洗滌后離心回收的rHMWP沉淀在含有4M尿素的標(biāo)準(zhǔn)Laemelli SDS-PAGE樣品緩沖液中于室溫溶解2小時(shí)。溶解的rHMWP通過電泳大小分離成大約110Kdal的單一蛋白帶，使用標(biāo)準(zhǔn)14cm×20cm×3mm聚丙烯酰胺(36∶1，丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)Tris/甘氨酸/SDS制備性凝膠。使用每孔大約500μl的5孔制備梳形成的4％聚丙烯酰胺濃縮膠在分離膠以上聚合。電泳在BioRad Protean單元中使用常規(guī)Tris/甘氨酸/SDS電泳緩沖液(BioRad)大約22℃進(jìn)行約12小時(shí)(約80到85伏特，恒定電壓)。預(yù)先染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)物(SeeBlue，Novex)上樣于平行泳道中，用來測(cè)量蛋白種類分離的程度和效果。電泳后，拆開凝膠夾層，從與分子量標(biāo)準(zhǔn)物相鄰的rHMWP樣品泳道中取出垂直的膠條，用考馬斯蘭R250染色顯示rHMWP帶。染色的區(qū)段在剩余的未染色制備性凝膠上重新定位，鑒定含有rHMWP的丙烯酰胺條帶并切出。
使用Schleicher and Schuell EluTrap電洗脫儀自凝膠膠條中洗出rHMWP。電洗脫基本按照廠商說明進(jìn)行，不同之處在于約1/4強(qiáng)度的SDS電泳緩沖液(Novex)用作洗脫緩沖液。洗脫在約40mA于室溫中進(jìn)行12到14小時(shí)。在洗脫期末細(xì)胞的極性倒轉(zhuǎn)約2到3分鐘，以除去吸附在BT1膜上的任何蛋白。含rHMWP的溶液從收集室中除去，4℃下儲(chǔ)存在聚丙烯錐形管中。
過量的SDS去污劑使用SDS沉淀系統(tǒng)(SDS-OUT沉淀試劑盒，Pierce Chemical)除去。由凝膠洗脫的蛋白溶液中除去過量去污劑按照廠商說明完成。去污劑提取的rHMWP用無菌無內(nèi)毒素的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)稀釋大約15倍，在Amicon攪拌離心室中使用YM30超離心膜超離心濃縮到大約1.0mg/ml。
殘留的內(nèi)毒素通過多粘菌素B Affi-Prep多粘菌素基質(zhì)(BioRad)處理從濃縮的rHMWP溶液中除去。Affi-Prep處理在4℃下按照廠商說明以分批方式進(jìn)行過夜。
濃縮的多粘菌素B處理的rHMWP的蛋白濃度使用Micro BCA法(Pierce Chem.)確定，BSA作為標(biāo)準(zhǔn)物。
純化的rHMWP(約0.9-1.2mg/ml蛋白濃度)分別通過SDS-PAGE、Western印跡和比色內(nèi)毒素測(cè)定法(BioWhittaker)估計(jì)純度、同一性和殘余內(nèi)毒素負(fù)荷。凝膠純化的rHMWP物質(zhì)通過凝膠分析為具有預(yù)期分子量(約110Kdal)的單一帶，顯示其純度大于95％，在Western印跡中它與rHWWP特異性K196抗體強(qiáng)烈反應(yīng)。經(jīng)計(jì)算殘余內(nèi)毒素小于0.05EU/μg。
序列表<110>ANTEXBIOLOGICS，INC.
<120>衣原體蛋白、其基因序列及用途<130>7969-076<140>
<141>
<150>08/942,596<151>1997-10-02<160>41<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4435<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述重組表達(dá)載體<400>1gggcaaaact cttccccccg ggatttatat gggaaagggg aaactttggc ccgtattcaa 60gcgccacggg ttttggggcg gaatgaattt tttcgttccg gaaaaagtaa ttccccggga 120acgtagggta tcggtttcat aggctcgcca aatgggatat aggtggaaag gtaaaaaaaa 180ctgagccaag caaaggatag agaagtcttg taatcatcgc aggttaaagg ggggatgtta 240ttttagcctg caaatagtgt aattattgga tcctgtaaag agaaaaggac gaatgcgctg 300aagataagaa catttattga tattaaatta ttaatttttt atgaagcgga gtaattaatt 360ttatctctca gcttttgtgt gatgcaaacg tctttccata agttctttct ttcaatgatt 420ctagcttatt cttgctgctc tttaaatggg gggggatatg cagcagaaat catggttcct 480caaggaattt acgatgggga gacgttaact gtatcatttc cctatactgt tataggagat 540ccgagtggga ctactgtttt ttctgcagga gagttaacat taaaaaatct tgacaattct 600attgcagctt tgcctttaag ttgttttggg aacttattag ggagttttac tgttttaggg 660agaggacact cgttgacttt cgagaacata cggacttcta caaatggggc agctctaagt 720aatagcgctg ctgatggact gtttactatt gagggtttta aagaattatc cttttccaat 780tgcaattcat tacttgccgt actgcctgct gcaacgacta ataagggtag ccagactccg 840acgacaacat ctacaccgtc taatggtact atttattcta aaacagatct tttgttactc 900aataatgaga agttctcatt ctatagtaat ttagtctctg gagatggggg agctatagat 960gctaagagct taacggttca aggaattagc aagctttgtg tcttccaaga aaatactgct 1020caagctgatg ggggagcttg tcaagtagtc accagtttct ctgctatggc taacgaggct 1080cctattgcct ttgtagcgaa tgttgcagga gtaagagggg gagggattgc tgctgttcag 1140gatgggcagc agggagtgtc atcatctact tcaacagaag atccagtagt aagtttttcc 1200
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<223>人工序列描述重組表達(dá)載體<400>23atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60ttaaatgggg gggggtatgc agaaatcatg gttcctcaag gaatttacga tggggagacg 120ttaactgtat catttcccta tactgttata ggagatccga gtgggactac tgttttttct 180gcaggagagt taacgttaaa aaatcttgac aattctattg cagctttgcc tttaagttgt 240tttgggaact tattagggag ttttactgtt ttagggagag gacactcgtt gactttcgag 300aacatacgga cttctacaaa tggagctgca ctaagtgaca gcgctaatag cgggttattt 360actattgagg gttttaaaga attatctttt tccaattgca acccattact tgccgtactg 420cctgctgcaa cgactaataa tggtagccag actccgtcga caacatctac accgtctaat 480ggtactattt attctaaaac agatcttttg ttactcaata atgagaagtt ctcattctat 540agtaattcag tctctggaga tgggggagct atagatgcta agagcttaac ggttcaagga 600attagcaagc tttgtgtctt ccaagaaaat actgctcaag ctgatggggg agcttgtcaa 660gtagtcacca gtttctctgc tatggctaac gaggctccta ttgcctttgt agcgaatgtt 720gcaggagtaa gagggggagg gattgctgct gttcaggatg ggcagcaggg agtgtcatca 780tctacttcaa cagaagatcc agtagtaagt ttttccagaa atactgcggt agagtttgat 840gggaacgtag cccgagtagg aggagggatt tactcctacg ggaacgttgc tttcctgaat 900aatggaaaaa ccttgtttct caacaatgtt gcttctcctg tttacattgc tgctgagcaa 960ccaacaaatg gacaggcttc taatacgagt gataattacg gagatggagg agctatcttc 1020tgtaagaatg gtgcgcaagc agcaggatcc aataactctg gatcagtttc ctttgatgga 1080gagggagtag ttttctttag tagcaatgta gctgctggga aagggggagc tatttatgcc 1140aaaaagctct cggttgctaa ctgtggccct gtacaactct tagggaatat cgctaatgat 1200ggtggagcga tttatttagg agaatctgga gagctcagtt tatctgctga ttatggagat 1260atgattttcg atgggaatct taaaagaaca gccaaagaga atgctgccga tgttaatggc 1320gtaactgtgt cctcacaagc catttcgatg ggatcgggag ggaaaataac gacattaaga 1380gctaaagcag ggcatcagat tctctttaat gatcccatcg agatggcaaa cggaaataac 1440cagccagcgc agtcttccga acctctaaaa attaacgatg gtgaaggata cacaggggat 1500attgtttttg ctaatggaaa cagtactttg taccaaaatg ttacgataga gcaaggaagg 1560attgttcttc gtgaaaaggc aaaattatca gtgaattctc taagtcagac aggtgggagt 1620ctgtatatgg aagctgggag tacattggat tttgtaactc cacaaccacc acaacagcct 1680
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<223>人工序列描述重組表達(dá)載體<400>24atgcaaacgt ctttccataa gttctttctt tcaatgattc tagcttattc ttgctgctct 60ttaagtgggg gggggtatgc agcagaaatc atgattcctc aaggaattta cgatggggag 120acgttaactg tatcatttcc ctatactgtt ataggagatc cgagtgggac tactgttttt 180tctgcaggag agttaacgtt aaaaaatctt gacaattcta ttgcagcttt gcctttaagt 240tgttttggga acttattagg gagttttact gttttaggga gaggacactc gttgactttc 300gagaacatac ggacttctac aaatggagct gcactaagtg acagcgctaa tagcgggtta 360tttactattg agggttttaa agaattatct ttttccaatt gcaaeteatt acttgccgta 420ctgcctgctg caacgactaa taatggtagc cagactccga cgacaacatc tacaccgtct 480aatggtacta tttattctaa aacagatctt ttgttactca ataatgagaa gttctcattc 540
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權(quán)利要求
1.分離的衣原體HMW蛋白或其片段或類似物，其中通過SDS-PAGE測(cè)定的該蛋白的表觀分子量為約105到115kDa。
2.權(quán)利要求1的蛋白，其為基本上純化的。
3.權(quán)利要求1的蛋白，其中衣原體為砂眼衣原體、貓心衣原體、鸚鵡熱衣原體或肺炎衣原體。
4.具有SEQ ID NO2、15或16所示氨基酸序列的權(quán)利要求1的蛋白或其片段或保守取代的類似物。
5.權(quán)利要求4的片段，具有SEQ ID NO3、17或25-37所示氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的蛋白或其片段或保守取代的類似物，其中所述蛋白可被特異性與具有SEQ ID NO2、15或16氨基酸序列的肽結(jié)合的抗體制品識(shí)別。
7.編碼權(quán)利要求1的HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子。
8.權(quán)利要求7的核酸分子，其中衣原體為砂眼衣原體、貓心衣原體、鸚鵡熱衣原體或肺炎衣原體。
9.權(quán)利要求7的核酸分子或其片段或保守取代的類似物，其中其編碼的蛋白具有SEQ ID NO2、15或16的氨基酸序列。
10.分離核酸分子，具有選自以下的序列a)SEQ ID NO1、23或24的DNA序列或其互補(bǔ)序列或片段；b)編碼具有SEQ ID NO 2、15或16的氨基酸序列的HMW蛋白的DNA序列或其片段；c)編碼SEQ ID NO1、15或16的推導(dǎo)的氨基酸序列的DNA序列或其互補(bǔ)序列或簡(jiǎn)并序列或其片段；和d)在嚴(yán)緊條件下與a)，b)或c)中限定的序列之一雜交的核酸序列。
11.適用于轉(zhuǎn)化宿主的重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求7或10的核酸分子。
12.適用于轉(zhuǎn)化宿主的重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求7或10的核酸分子，以及與該核酸分子可操作連接的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物。
13.權(quán)利要求12的表達(dá)載體，其中表達(dá)元件包括編碼用于由宿主分泌HMW蛋白或其片段或類似物的前導(dǎo)序列的核酸部分。
14.含有權(quán)利要求12的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
15.含有權(quán)利要求13的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
16.可以通過權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)化宿主生產(chǎn)的分離重組蛋白或其片段或類似物。
17.可以通過權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化宿主生產(chǎn)的分離重組蛋白或其片段或類似物。
18.用于將HMW蛋白或其片段或類似物傳遞給宿主的重組載體，含有權(quán)利要求7或10的核酸分子。
19.一種免疫原性組合物，含有至少一種選自以下的成分a)分離的HMW蛋白或其片段或類似物，所述蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其分子量約為105-115KDa；b)編碼a)中HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子；c)具有SEQ ID NO1，23或24的序列的分離核酸分子，其互補(bǔ)序列，或在嚴(yán)緊條件下能與其雜交的核酸序列，或其片段；d)能由含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的分離的重組蛋白或其片段或類似物，所述表達(dá)載體含有b)或c)所述的核酸分子和與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物；e)含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的b)或c)所述核酸序列的重組載體；f)含有e)之載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述組合物還任選含有佐劑，和可藥用載體或稀釋劑，所述組合物在施用于宿主時(shí)可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
20.一種抗原性組合物，含有至少一種選自以下的成分a)分離的HMW蛋白或其片段或類似物，所述蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其分子量約為105-115KDa；b)編碼a)中HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子；c)具有SEQ ID NO1，22，23或24的序列的分離核酸分子，其互補(bǔ)序列或簡(jiǎn)并序列，或在嚴(yán)緊條件下能與其雜交的核酸序列；d)能由含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的分離的重組蛋白或其片段或類似物，所述表達(dá)載體含有b)或c)所述的核酸分子和與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物；e)含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的b)或c)所述核酸序列的重組載體；f)含有e)之載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述組合物還任選含有佐劑，所述組合物在施用于宿主時(shí)可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
21.在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求20的抗原性組合物或權(quán)利要求19的免疫原性組合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物或鳥類。
23.針對(duì)權(quán)利要求20的抗原性組合物或權(quán)利要求19的免疫原性組合物產(chǎn)生的抗血清。
24.權(quán)利要求23的抗血清中存在的抗體，其與HMW蛋白或其片段或類似物特異性結(jié)合。
25.選自以下的診斷試劑權(quán)利要求1的蛋白，權(quán)利要求10的核酸分子，權(quán)利要求20的免疫原性組合物，權(quán)利要求19的抗原性組合物，權(quán)利要求23的抗血清，權(quán)利要求12的載體，權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，權(quán)利要求24的抗體。
26.檢測(cè)待測(cè)樣品中抗衣原體抗體的方法，包括下列步驟a)將所述樣品與權(quán)利要求1的HMW蛋白、權(quán)利要求20的抗原性組合物或權(quán)利要求19的免疫原性組合物接觸，若存在所述抗體，就會(huì)形成衣原體抗原抗衣原體抗體免疫復(fù)合物；并且b)檢測(cè)步驟a)中形成的所述免疫復(fù)合物的存在或測(cè)定其量以作為待測(cè)樣品中存在所述抗衣原體抗體的指征。
27.檢測(cè)抗衣原體抗體的診斷試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1的HMW蛋白，權(quán)利要求20的抗原性組合物或權(quán)利要求19的免疫原性組合物，使所述蛋白或組合物與懷疑含有所述抗體的試樣接觸的容器，以及檢測(cè)或測(cè)定所述蛋白或組合物與所述抗體形成的衣原體抗原抗衣原體抗體免疫復(fù)合物的試劑。
28.檢測(cè)試樣中衣原體的方法，包括以下步驟a)將試樣與權(quán)利要求24的抗體接觸足夠時(shí)間，使所述抗體與試樣可能中存在的衣原體結(jié)合并形成衣原體抗衣原體抗體免疫復(fù)合物；并且b)檢測(cè)步驟a)中形成的所述免疫復(fù)合物的存在或測(cè)定其量以作為待測(cè)樣品中存在衣原體的指征。
29.檢測(cè)衣原體的診斷試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求24的抗體，使所述抗體與懷疑含有所述衣原體的試樣接觸的容器，以及檢測(cè)或測(cè)定所述抗體與衣原體形成的衣原體抗衣原體抗體免疫復(fù)合物的試劑。
30.一種藥物組合物，含有有效量的至少一種選自以下的成分a)HMW蛋白或其片段或類似物，所述蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其分子量約為105-115KDa；b)編碼a)中HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子；c)具有SEQ ID NO1，23或24的序列的分離核酸分子，其互補(bǔ)序列或簡(jiǎn)并序列，或在嚴(yán)緊條件下能與其雜交的核酸序列；d)能由含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的分離的重組蛋白或其片段或類似物，所述表達(dá)載體含有b)或c)所述的核酸分子和與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物；e)含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的b)或c)所述核酸序列的重組載體；f)含有e)之載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，g)特異性結(jié)合a)，b)，c)，d)，e)或f)的成分的抗體，所述組合物還可任選含有可藥用載體或稀釋劑。
31.一種疫苗，含有有效量的至少一種選自以下的成分a)HMW蛋白或其片段或類似物，所述蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其分子量約為105-115KDa；b)編碼a)中HMW蛋白或其片段或類似物的分離核酸分子；c)具有SEQ ID NO1，23或24的序列的分離核酸分子，其互補(bǔ)序列或簡(jiǎn)并序列，或在嚴(yán)緊條件下能與其雜交的核酸序列；d)能由含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的分離的重組HMW蛋白或其片段或類似物，所述表達(dá)載體含有b)或c)所述的核酸分子和與核酸分子可操作相連的表達(dá)元件以通過宿主表達(dá)所述HMW蛋白或其片段或類似物；e)含有編碼HMW蛋白或其片段或類似物的b)或c)所述核酸序列的重組載體；f)含有e)之載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，g)特異性結(jié)合a)，b)，c)，d)，e)或f)的成分的抗體，所述疫苗還可任選含有佐劑、可藥用載體或稀釋劑，其中所述疫苗在施用于宿主時(shí)會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
32.在需要接受治療的宿主中預(yù)防、治療或緩解衣原體相關(guān)疾病的方法，包括向宿主給予有效量的權(quán)利要求30的藥物組合物或權(quán)利要求31的疫苗組合物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述疾病選自衣原體細(xì)菌感染，結(jié)膜炎，尿道炎，性病淋巴肉芽腫(LGV)，宮頸炎，附睪炎，子宮內(nèi)膜炎，盆腔炎性疾病(PID)，輸卵管炎，輸卵管閉塞，不育，宮頸癌，動(dòng)脈硬化和動(dòng)脈粥樣硬化。
34.權(quán)利要求33的方法，其中宿主為鳥類或哺乳動(dòng)物。
35.權(quán)利要求19、20、30或31之一的組合物，被配制供體內(nèi)施用于宿主以提供對(duì)由衣原體所致疾病的保護(hù)作用。
36.權(quán)利要求19、20、30或31之一的組合物，其中衣原體種選自砂眼衣原體、貓心衣原體、鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體。
37.權(quán)利要求19、20、30或31之一的組合物，被配制成微粒，膠囊或脂質(zhì)體制劑。
38.權(quán)利要求1、4、6、16和17之一的蛋白，其中蛋白與肝素或硫酸乙酰肝素結(jié)合。
39.權(quán)利要求1、4、6、16或17之一的蛋白，其中所述蛋白為外膜蛋白。
40.測(cè)定樣品中編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸存在與否的方法，包括以下步驟a)使樣品與權(quán)利要求7或10的核酸分子或其片段或互補(bǔ)物接觸，以生成包括所述核酸分子和樣品中編碼HMW蛋白并可與所述核酸分子特異性雜交的任何核酸分子的雙鏈體；以及b)確定雙鏈體的生成。
41.確定樣品中編碼HMW蛋白或其片段或類似物的核酸存在與否的診斷試劑盒，包括a)權(quán)利要求7或10的核酸分子或其任何片段或互補(bǔ)物；b)使核酸與樣品接觸以生成包括所述核酸分子和樣品中編碼HMW蛋白并可與所述核酸分子特異性雜交的任何核酸分子的雙鏈體；以及c)確定雙鏈體生成的工具。
全文摘要
本發(fā)明公開了衣原體高分子量(“HMW”)蛋白，其氨基酸序列，特異性結(jié)合HMW蛋白的抗體及其編碼核酸序列。還公開了包括疫苗的預(yù)防和治療組合物，含有HMW蛋白，其片段，或特異性結(jié)合HMW蛋白或其部分的抗體，或編碼HMW蛋白或其片段的核酸序列。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1911960SQ20061008877
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期1998年10月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月2日
發(fā)明者J·W·杰克遜, J·L·佩斯 申請(qǐng)人:安特斯生物公司