專利名稱：金銀花提取物,其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及從中藥金銀花或其基源植物忍冬或同屬植物中提取、精制得到的植物提取物及其提取方法，以及含有該提取物的藥物組合物。用本發(fā)明方法得到的提取物主要含有開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸(裂環(huán)馬錢(qián)子苷酸，secologanic acid)及其衍生物，即環(huán)烯醚萜苷類化合物，或稱為總環(huán)烯醚萜苷。所述的植物提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌和抗病毒作用，該提取物和含有該提取物的藥物組合物可用于制備治療高熱癥、疼痛、感染性疾病，特別是用于治療病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病的藥物和保健品。并且，所述的開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物還可作為中藥金銀花的質(zhì)量控制指標(biāo)。
背景技術(shù)：
金銀花首載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，名忍冬?！吨袊?guó)藥典》(1963年版)將忍冬作為金銀花首載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，名忍冬。《中國(guó)藥典》(1963年版)將忍冬作為金銀花的唯一來(lái)源，1977年后各版《中國(guó)藥典》根據(jù)臨床療效、地區(qū)習(xí)慣用藥等綜合考慮，選定忍冬科的4種植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花為金銀花。其中正品為忍冬的干燥花蕾，我國(guó)大部分地區(qū)均產(chǎn)，以山東產(chǎn)量最大，河南產(chǎn)的質(zhì)量較佳。事實(shí)上，全國(guó)各地所用者遠(yuǎn)不止于此。全世界忍冬屬植物約200種，我國(guó)有98種，廣布于全國(guó)各省區(qū)，而以西南部種類最多，其中可供藥用的品種達(dá)47種。由于金銀花的藥用品種相對(duì)混亂，因此為了保證其質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定性，2005版《中國(guó)藥典》規(guī)定金銀花為忍冬科的植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花；同時(shí)，將紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花Lonicera confusa DC.和毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花為金銀花單獨(dú)列為“山銀花”(參見(jiàn)國(guó)家藥典委員會(huì)編，《中華人民共和國(guó)藥典》一部，2000年版，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，p.177；和國(guó)家藥典委員會(huì)編，《中華人民共和國(guó)藥典》一部，2005年版，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，pp.152～153)。金銀花和山銀花具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱等功效。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱。臨床上用于治療風(fēng)熱犯肺，上呼吸道感染所致發(fā)熱、咽痛等癥。近年來(lái)，以金銀花原料相繼開(kāi)發(fā)了許多單方和復(fù)方制劑。盡管金銀花具有較好的臨床療效，但其有效成分及現(xiàn)行的質(zhì)量控制指標(biāo)仍然有必要進(jìn)行深入研究和探討。
化學(xué)成分研究表明金銀花中含有有機(jī)酸類、三萜皂苷類、黃酮及其苷類、環(huán)烯醚萜苷類、揮發(fā)油等。實(shí)驗(yàn)研究表明金銀花的藥理活性多種多樣，主要有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用。雖然從金銀花中已經(jīng)分離得到并鑒定了多種成分，但目前認(rèn)為金銀花中主要有效成分為綠原酸類化合物；此外，還有揮發(fā)性成分芳樟醇等。因此，通常以綠原酸的含量高低來(lái)評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的優(yōu)劣，金銀花的提取、精制工藝多以綠原酸類化合物為考察指標(biāo)，少部分以揮發(fā)性成分為考察指標(biāo)。綠原酸雖具有解熱和廣譜的抗菌、抗病毒作用，但其并非是金銀花中唯一解熱、抑菌和抗病毒成分，且綠原酸在體內(nèi)能被蛋白質(zhì)滅活，其抗菌和抗病毒作用并不強(qiáng)。因此，對(duì)金銀花解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、抗病毒的有效成分和作用機(jī)理尚不完全清楚。有關(guān)金銀花資源和其中成分的研究可參見(jiàn)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥分析室，上海中藥制藥一廠，金銀花有效成分的初步研究，醫(yī)藥工業(yè)，1975，7，24；石鉞，石任兵和陸蘊(yùn)如，我國(guó)藥用金銀花資源、化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展，中國(guó)藥學(xué)雜志，1999，34(11)，724-727；婁紅祥等人，金銀花中水溶性化合物的分離與結(jié)構(gòu)確定，中草藥，1996，27(4)，195-197；Son KunHo等人，Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica，Phytochemistry，1994，35(4)，1005-1008；Hideaki Kawai等人，Studies on thesaponins of Lonicera japonica Thunb，Chem.Pharm.Bull，1988，36(12)4769-4773；中沖太七郎，金銀花の成分に就いて，藥學(xué)雜志，1949，69，320；中沖太七郎，金銀花の成分に就いて，藥學(xué)雜志，1961，81，558；高玉敏等，金銀花化學(xué)成分的研究，中草藥，1995，26(11)568；黃麗瑛等人，中藥金銀花化學(xué)成分的研究，中草藥，1996，27(11)，645；和SonKun Ho等人，F(xiàn)lavonoids from the aerial parts of Lonicera japonica，Arch.Pharmacal Res.，1992，15(4)，365。以上文獻(xiàn)引入本文作為參考。
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)金銀花中具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒作用的有效部位主要以環(huán)烯醚萜苷類化合物為主，尤其是以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為主(含量大于10％)，而其中綠原酸類化合物的總含量小于5％。在藥理活性評(píng)價(jià)中，該有效部位和其中的主要化合物均表現(xiàn)出顯著的解熱、抗炎、抗菌和抗病毒作用。然而，現(xiàn)有金銀花提取物的制備方法不但忽略了環(huán)烯醚萜苷類化合物，同時(shí)，以綠原酸類化合物為考察指標(biāo)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也無(wú)法反映其中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量情況。
環(huán)烯醚萜類化合物普遍存在于植物界，文獻(xiàn)報(bào)道金銀花的基源植物忍冬Lonicera japonica Thunb.中含有以下結(jié)構(gòu)的5個(gè)環(huán)烯醚萜類化合物，分別為secologanin dimethylacetal[開(kāi)聯(lián)番木鱉苷二甲基縮醛]、loganin(番木鱉苷，或馬錢(qián)子苷)、vogeloside、epi-vogeloside和開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸(或裂環(huán)馬錢(qián)子苷酸，secologanic acid)，參見(jiàn)Kim Youngleem，KimYoungmi，Kim Jinwoong等人，Isolation of flavonoids from herbs ofLudwigia prostrate and flowers of Lonicera jiaponica.Soul TaehakkyoYakhak Nonmunjip，1997，22，43。
文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了通過(guò)反復(fù)多次的正相和反相硅膠柱色譜分離純化，從金銀花及其基源植物忍冬或忍冬屬其他植物中得到包括開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和其他環(huán)烯醚萜衍生物類單體化合物的方法，例如可參見(jiàn)HideakiKawai，Masanori Kuroyanagi，Akira Ueno.Iridoid Glucosides from Lonicerajaponica Thunb，Chem.Pharm.Bull.，1988，36(9)，p3664；王國(guó)亮等，豫北平原栽培金銀花精油化學(xué)成分分析，中國(guó)中藥雜志，1992，17(5)，p268；張玲等，山東金銀花鮮花揮發(fā)油的化學(xué)成分的研究，中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1998，15(1)，p18；姚育法等，超臨界CO2流體萃取金銀花產(chǎn)物的化學(xué)成分研究，中藥材，2000，23(9)，p545；王天志和李永梅，細(xì)氈毛忍冬花蕾揮發(fā)油成分研究，中藥材，1999，22(11)，p574；郭艷文等，黃褐毛忍冬與金銀花的比較研究，藥物分析雜志，1990，10(1)，p2；Sim KylSoon等，sterols and sterol glycosides from Lonicerae flos.Soul TaehakkyoYakhak Nonmunjip，1997，4，p79；Kunitomo Junichi等，On the constituentsof Lonicerae Folium.Shoyakugaku Zasshi，1983，37(3)，p294；張重義和李萍，金銀花藥材的綜合研究.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17(3)。p58-62；邢俊波等，金銀花質(zhì)量與生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)性研究，中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21(8)，p1237-1238；和林丹等，中藥金銀花藥用成分的提取及抑菌實(shí)驗(yàn)研究，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2003，15(5)，p 436-437。以上文獻(xiàn)被引入本文作為參考。
但是，由于金銀花及其基源植物忍冬或同屬其他植物中環(huán)烯醚萜類化合物的極性較大水溶性很大，利用常規(guī)分離技術(shù)富集高含量環(huán)烯醚萜類(總含量大于50％)，尤其是高含量的開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸有較大難度；同時(shí)，由于開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸的結(jié)構(gòu)特殊，鑒定存在相當(dāng)難度，因此，到目前為止尚未有過(guò)由上述植物中提取適于藥用的有效部位的報(bào)道，更沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道從上述植物中得到開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治療高熱癥、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病。另外，現(xiàn)有技術(shù)的有關(guān)報(bào)道中，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物的制備也難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，發(fā)現(xiàn)了從金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物中制備得到了具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的植物提取物，該植物提取物是適于藥用的有效部位；并且，該提取物的制備方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了從金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物制備得到具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的植物提取物的方法，以及由該方法獲得的植物提取物，該提取物中的有效成分是以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸(裂環(huán)馬錢(qián)子苷酸，secologanic acid)為主要成分的環(huán)烯醚萜類化合物，以提取物的總重量計(jì)，該提取物中以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物為主要成分的環(huán)烯醚萜類有效成分群的含量大于50％，優(yōu)選大于70％，最優(yōu)選70-98％；在所述的環(huán)烯醚萜類化合物中，以提取物的總重量計(jì)，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸單一成分的含量大于25％，優(yōu)選大于50％，最優(yōu)選大于70％，特別優(yōu)選70～95％。
本文中上述植物提取物被簡(jiǎn)稱為“金銀花提取物”。
本發(fā)明所述環(huán)烯醚萜類化合物或開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物包括如下結(jié)構(gòu)式的化合物 其中，X1和X2各自獨(dú)立地表示O、N或S，其中優(yōu)選O；R、R1或R2各自獨(dú)立地表示氫、C1-6低級(jí)烷基或C2-6低級(jí)鏈烯基。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“C1-6低級(jí)烷基”是指具有1-6和碳原子的，直鏈或支鏈的飽和烴基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、正戊基、異戊基、正己基等。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“C2-6低級(jí)鏈烯基”是指具有2-6個(gè)碳原子，以及具有一或二個(gè)不飽和雙鍵的直鏈或支鏈烴基，例如乙烯基、丙烯基、異丁烯基、異戊烯基等。
優(yōu)選的，上述R、R1或R2基團(tuán)各自獨(dú)立的是氫、甲基、乙基或異戊烯基。
最優(yōu)選其中的式(1)化合物，特別是其中X1和X2為O，R為H的化合物，即開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸。
本發(fā)明還提供了從金銀花或忍冬屬植物原料中制備金銀花提取物的方法，應(yīng)用該制備方法得到的提取物中以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物為主要成分的環(huán)烯醚萜類有效成分群，該有效成分群即是所述植物的有效部位。
本發(fā)明所述金銀花提取物的制備方法包括以下步驟1、提取將植物金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作為溶劑進(jìn)行提取，得到提取液；2、后處理(1)將提取液經(jīng)常壓或減壓濃縮干燥得到浸膏，或經(jīng)噴霧干燥得到粉末；(2)將上一步驟得到的產(chǎn)物用溶劑溶解后，用極性相反的其他溶劑進(jìn)行沉淀或沉降，用常規(guī)方法進(jìn)行處理得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物，為沉淀物或溶解液濃縮物；3、色譜分離純化將上述后處理得到的沉淀物或溶解液濃縮物，用色譜方法分離純化，用洗脫溶劑洗脫，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的流份，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物。
其中，所述的色譜方法為大孔吸附樹(shù)脂柱色譜、正相硅膠和/或反相硅膠色譜，或者它們的組合；經(jīng)過(guò)上述色譜方法純化的金銀花提取物中，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量大于50％。
如果需要，可將上述方法得到的產(chǎn)物用凝膠色譜法進(jìn)一步純化，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的餾分，濃縮，干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的植物提取物。其中所述的凝膠色譜的填料優(yōu)選為Sephadex LH-20；以及洗脫所用的溶劑為選自乙醇、甲醇和水中的一種，或數(shù)種溶劑組合的混合溶劑。
具體的，本發(fā)明所述金銀花提取物的制備方法包括以下步驟1、提取將植物金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作為溶劑在室溫至加熱回流的溫度下提取，得到提取液；
其中，所述C1-C6烷醇選自甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇，或其中的二種或多種組成的混合溶劑，優(yōu)選乙醇或甲醇，更優(yōu)選乙醇；2、后處理(1)將上述提取液經(jīng)常壓或減壓濃縮干燥得到浸膏，或經(jīng)噴霧干燥得到粉末；(2)將上一步驟得到的產(chǎn)物用溶劑溶解后，用極性相反的其他溶劑進(jìn)行沉淀或沉降，過(guò)濾收集沉淀物直接干燥，或收集溶液后，再經(jīng)濃縮和干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物；其中，所述用于溶解提取物的溶劑為水或選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇的醇溶劑，或它們的組合，優(yōu)選水、甲醇或乙醇，更優(yōu)選水或乙醇；所述用于沉淀的極性相反的其它溶劑是水或醇溶劑，所述醇溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇，或它們的組合，優(yōu)選水、甲醇或乙醇，更優(yōu)選水或乙醇；3、色譜純化將經(jīng)過(guò)后處理得到的產(chǎn)物用色譜方法分離純化，用洗脫溶劑洗脫，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的餾分，濃縮，干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物，其中所述的色譜方法為大孔吸附樹(shù)脂柱色譜、正相硅膠或反相硅膠色譜，或者它們的組合；經(jīng)過(guò)此處理得到的提取物中環(huán)烯醚萜類化合物含量大于50％；4、凝膠色譜純化將上述色譜精制得到的提取物用凝膠色譜純化，用水或醇溶劑洗脫，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的餾分，濃縮，干燥，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的植物提取物，其中總環(huán)烯醚萜苷含量大于70％。
在上述步驟1中，特別是在工業(yè)化生產(chǎn)中，提取步驟所使用的乙醇可以是工業(yè)乙醇，工業(yè)乙醇中的乙醇含量通常是大約60％-95％。
在上述步驟2中，所用的處理方法是中藥制藥領(lǐng)域常規(guī)的沉淀法，例如使用水提醇沉，或使用醇提水沉，或分別使用不同濃度的醇溶劑進(jìn)行提取和沉淀等，以達(dá)到提純的目的。
在所述步驟3的色譜純化中，所述的色譜法為大孔吸附樹(shù)脂柱色譜、正相硅膠和反相硅膠柱色譜，或者它們的組合。其中所述的大孔吸附樹(shù)脂可使用苯乙烯型大孔吸附樹(shù)脂，例如HP-20、D101、SP-70、SP-700、SP-825、RH等型號(hào)的樹(shù)脂；所述的正相硅膠色譜，其填料例如是硅膠；所述的反相硅膠色譜，其填料例如是C-18。在色譜方法中，優(yōu)選使用大孔吸附樹(shù)脂柱色譜的方法，該方法分離效果好，且成本低廉。
所述色譜法的洗脫溶劑為水；C1-C6烷醇，如甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等；鹵代烴，如二氯甲烷、氯仿等；醚類溶劑，如乙醚、甲基叔丁醚等；酮類溶劑，如丙酮、2-丁酮等；酯類溶劑，如乙酸乙酯、甲酸乙酯等；以及由上述二種或多種溶劑組成的混合溶劑。其中，優(yōu)選的洗脫溶劑為氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水以及其中的二種或數(shù)種混合的溶劑。在所述色譜方法中，當(dāng)用苯乙烯型大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行分離純化時(shí)，洗脫溶劑優(yōu)選水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；當(dāng)用反相硅膠色譜精制時(shí)，洗脫溶劑優(yōu)選水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；當(dāng)用正相硅膠精制時(shí)，洗脫溶劑為三氯甲烷或乙酸乙酯和90-100％乙醇水溶液或甲醇組成的混合溶劑，它們的比例為10∶1-1∶1。
本發(fā)明所述的色譜法也可以將經(jīng)后處理步驟得到的產(chǎn)物混合于硅膠或硅藻土中，晾干后用洗脫溶劑逐步洗脫或回流洗脫的方法，所用的洗脫溶劑與使用硅膠或苯乙烯型大孔吸附樹(shù)脂柱時(shí)類似。
經(jīng)過(guò)色譜方法處理得到的提取物中環(huán)烯醚萜類化合物含量大于50％，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸的含量通常可大于25％，優(yōu)選大于50％。
關(guān)于步驟4的凝膠色譜純化，其中所述的凝膠色譜填料優(yōu)選為Sephadex LH-20；洗脫所用的溶劑為選自乙醇、甲醇和水中的一種，或其中數(shù)種組成的混合溶劑。
以提取物的總重量計(jì)，凝膠色譜處理后得到的金銀花提取物中環(huán)烯醚萜類化合物的含量大于70％，優(yōu)選大于90％，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸的含量大于60％，優(yōu)選大于70％。
如果希望所得到的提取物含有更高含量的環(huán)烯醚萜類化合物，可進(jìn)行多次凝膠色譜處理。
實(shí)驗(yàn)證明，用以上提取和精制方法從金銀花或忍冬屬植物中制備提取物，采用大孔吸附樹(shù)脂、反相硅膠或正相硅膠進(jìn)行植物提取物精制，植物提取物的收率和有效成分群總環(huán)烯醚萜苷類化合物以及主要有效成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸的含量差別不十分顯著。
從上述任一步驟得到的產(chǎn)物，包括提取物、浸膏、沉淀物等均可用作含有開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物的金銀花提取物使用。
其中，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量的測(cè)定方法是以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸或其衍生物或其他可替代的環(huán)烯醚萜苷類化合物為參照物質(zhì)，按分光光度法比色測(cè)定；或，按反相HPLC(外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法或歸一化法等)方法測(cè)定。
本發(fā)明的另一目的是提供了含有所述金銀花提取物的藥物組合物及其制備方法，該組合物含有治療有效量的本發(fā)明的金銀花提取物，以及任選的含有藥用載體。其中所述的藥用載體的藥學(xué)領(lǐng)域常用的藥用載體；所述組合物的制備方法是藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物制備方法。
本發(fā)明的藥物組合物中還可以含有其它的植物提取物或其它的藥物化合物，制成復(fù)合制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供了由含有所述金銀花提取物的藥物組合物制備的各種藥用制劑。
利用本發(fā)明方法得到的植物提取物可以與藥物上可接受的載體一起制成各種藥物制劑，其中所述的藥物制劑可以是藥學(xué)領(lǐng)域常用的劑型，例如注射劑或口服制劑，所述的注射劑例如是溶液、懸浮液、乳液或凍干粉針制劑等，所述的口服制劑例如是片劑、膠囊、口服液或滴丸等。利用本發(fā)明的金銀花提取物制備所需各種劑型時(shí)，可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。
與常規(guī)的中藥制劑方法相比，應(yīng)用本發(fā)明的金銀花提取物制備各種制劑時(shí)，因其中的有效成分高，以及其含量可以得到有效地控制，因此可獲得高效的、質(zhì)量均一的藥品，有利于中藥制劑的標(biāo)準(zhǔn)化。
因此，本發(fā)明的另一目的是提供了本發(fā)明金銀花提取物在制藥和保健品領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是本發(fā)明金銀花提取物在制備用于解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的金銀花提取物可用于制備治療高熱癥、疼痛、感染性疾病，特別是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病的藥物和保健品。
在將本發(fā)明的金銀花提取物或本發(fā)明的組合物用于治療上述疾病時(shí)，其用藥量可參照使用金銀花進(jìn)行治療時(shí)的用量；在將本發(fā)明的金銀花提取物或本發(fā)明的組合物用作保健品，或?qū)⑵浼尤氡＝∑窌r(shí)，其用量應(yīng)少于通常的治療量。
本發(fā)明人進(jìn)行了大量的藥物實(shí)驗(yàn)，證明了本發(fā)明的金銀花提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒的作用，對(duì)高熱癥、疼痛、感染性疾病，特別是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病具有良好的治療作用，并可用作或加入保健品，有利于改善身體狀況，提高免疫力。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前中藥領(lǐng)域認(rèn)為金銀花中的主要有效成分為綠原酸類化合物，另外還有揮發(fā)性成分芳樟醇等。因此，通常以綠原酸的含量高低來(lái)評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的優(yōu)劣，金銀花的提取、精制工藝多以綠原酸類化合物為考察指標(biāo)，少部分以揮發(fā)性成分為考察指標(biāo)。
本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)金銀花中具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒作用的有效部位主要是以環(huán)烯醚萜苷類化合物為主，而不是綠原酸類化合物。在金銀花提取物中，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸的含量(大約10％)遠(yuǎn)高于綠原酸類化合物的含量(大約5％)，大約是綠原酸類化合物的二倍。因此，在藥理活性評(píng)價(jià)中，該有效部位和其中的主要化合物開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸所表現(xiàn)出的解熱、抗炎、抗菌、抗病毒作用顯然大于綠原酸的作用。以綠原酸類化合物為考察指標(biāo)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法真實(shí)地反映金銀花提取物的內(nèi)在質(zhì)量。
因此，另一方面，本發(fā)明還提供了中藥金銀花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，所述的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是以從中藥金銀花中提取的具有解熱、抗炎、抗菌和抗病毒的有效部位，即以環(huán)烯醚萜苷類化合物為有效成分群，以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為主要有效成分或質(zhì)量控制的指標(biāo)成份；以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸或其他可替代的環(huán)烯醚萜苷類化合物為參照物質(zhì)，按分光光度法比色測(cè)定有效部位中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物(總環(huán)烯醚萜苷)類化合物的總含量；按HPLC方法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸單一成分的含量。
本發(fā)明新的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)改變了通常以綠原酸的含量高低來(lái)評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，能夠更真實(shí)準(zhǔn)確的反映所述中藥的內(nèi)在質(zhì)量。
以上質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)可用于金銀花或忍冬屬植物原料、提取物及其單獨(dú)制備的制劑、復(fù)合制劑中間品和終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水浸泡提取3次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡24小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入500毫升蒸餾水，加熱溶解，冷卻至室溫，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，得澄清濾液。
(2)醇沉精制金銀花水提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為70％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯型大孔吸附樹(shù)脂HP-20，依次用6倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹(shù)脂柱體積的20％乙醇洗脫，減壓回收20％乙醇洗脫液至濃縮液，冷凍干燥，得到提取物5.81g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量為75.6％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為33.4％。
實(shí)施例2(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水煎煮二次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，煎煮溫度為98℃，每次煎煮時(shí)間為1小時(shí)；合并水提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/mL。
(2)醇沉精制金銀花水提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘拢右掖?95％)，使溶液含醇量為75％，靜置16小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯型大孔吸附樹(shù)脂D-101，依次用5倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹(shù)脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至干，得到提取物4.94g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為75.5％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為27.6％。
實(shí)施例3(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水浸泡提取2次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡18小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入500毫升蒸餾水加熱溶解，冷卻至室溫，靜置18小時(shí)，過(guò)濾，得澄清濾液。
(2)水沉精制金銀花水提取濃縮液，減壓濃縮至干，加1500毫升乙醇(95％)，在充分?jǐn)嚢枞芙?，同時(shí)緩慢加入蒸餾水使溶液含醇量為75％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯RH型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，依次用4倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用5倍量樹(shù)脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至無(wú)醇味，冷凍干燥，得到提取物4.28g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為51.4％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為25.8％。
實(shí)施例4(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水煎煮二次，每次用水量為金銀花藥材干重的12倍，每次煎煮時(shí)間為1.5小時(shí)；合并水提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花水提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為80％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水400毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，用6倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹(shù)脂柱體積的18％乙醇洗脫，減壓回收18％乙醇洗脫液至干，得到提取物4.68g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為76.6％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為56.8％。
實(shí)施例5(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加50％乙醇回流提取2次，每次用50％乙醇量為金銀花藥材干重的13倍，每次提取1小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入450毫升蒸餾水加熱溶解，冷卻至室溫，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，得澄清濾液。
(2)水沉精制金銀花50％乙醇提取濃縮液，減壓濃縮至干，加1600毫升乙醇(95％)，在充分?jǐn)嚢枞芙?，同時(shí)緩慢加入蒸餾水使溶液含醇量為75％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯SP-825型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，依次用5倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用6倍量樹(shù)脂柱體積的20％乙醇洗脫，減壓回收20％乙醇洗脫液至無(wú)醇味，冷凍干燥，得到提取物4.31g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為69.6％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為52.6％。
實(shí)施例6(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加50％乙醇浸泡提取3次，每次用50％乙醇量為金銀花藥材干重的15倍，每次提取24小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至稠浸膏，加入500毫升蒸餾水加熱溶解，冷卻至室溫，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，得澄清濾液。
(2)醇沉精制金銀花50％乙醇提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢枞芙?，加乙?95％)至溶液含醇量為85％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯SP-70型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，依次用4倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹(shù)脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至無(wú)醇味，冷凍干燥，得到提取物6.22g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為66.3％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為38.1％。
實(shí)施例7(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次回流提取時(shí)間為1.5小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花95％乙醇提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為60％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，用6倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹(shù)脂柱體積的12％乙醇洗脫，減壓回收12％乙醇洗脫液至干，得到提取物3.60g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.5％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為54.9％。
實(shí)施例8(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡提取時(shí)間為24小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花95％乙醇提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為60％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)反相硅膠(C-18)柱色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)中壓反相硅膠(C-18)色譜柱，用4倍量柱體積的水洗脫，然后再用4倍量柱體積10％乙醇洗脫，再用8配量柱體積的20％乙醇洗脫，減壓回收20％乙醇洗脫液至干，得到提取物2.63g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.3％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為65.6％。
實(shí)施例9(1)提取取山銀花藥材(500g)，粗粉碎，加水煮提2次，每次用水量為山銀花藥材干重的13倍，每次煮提時(shí)間為1小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制山銀花水提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為70％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，用6倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹(shù)脂柱體積的18％乙醇洗脫，減壓回收18％乙醇洗脫液至干，得到提取物6.26g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為76.7％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為53.8％。
實(shí)施例10(1)提取取忍冬(莖和枝)藥材(500g)，粗粉碎，加水煮提3次，每次用水量為藥材干重的8倍，每次煮提時(shí)間為1.5小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制忍冬(莖和枝)水提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘拢右掖?95％)，使溶液含醇量為75％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)大孔吸附樹(shù)脂色譜精制將(2)中的流浸膏加水350毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的苯乙烯SP-700型大孔吸附樹(shù)脂色譜柱，用6倍量樹(shù)脂柱體積的水洗脫，然后再用8倍量樹(shù)脂柱體積的15％乙醇洗脫，減壓回收15％乙醇洗脫液至干，得到提取物5.58g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為74.3％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為56.1％。
實(shí)施例11(1)提取取金銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次浸泡提取時(shí)間為24小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制金銀花95％乙醇提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為65％，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)反相硅膠(C-18)柱色譜精制將(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并過(guò)濾，濾液，通過(guò)中壓反相硅膠(C-18)色譜柱，用4倍量柱體積的水洗脫，然后再用4倍量柱體積10％乙醇洗脫，再用8配量柱體積的18％乙醇洗脫，減壓回收18％乙醇洗脫液至干，得到提取物2.63g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.3％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為65.6％。
實(shí)施例12(1)提取取忍冬藥材(莖和枝)(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的10倍，每次提取時(shí)間為2.5小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制忍冬藥材(莖和枝)95％乙醇提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為75％，靜置36小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)正相硅膠柱色譜精制將(2)中的流浸膏加乙醇200毫升，充分加熱溶解，拌入350g色譜用硅膠(100目)，室溫放置72小時(shí)至干燥，將拌有樣品的硅膠置正相硅膠(1000g)色譜柱上，然后用氯仿-甲醇(50∶1-1∶1)進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫用溶劑量為4～5個(gè)柱床體積，收集氯仿-甲醇(5∶1-3∶1)洗脫部位，減壓回收溶劑至干，得到提取物5.99g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為78.8％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為64.0％。
實(shí)施例13(1)提取取山銀花藥材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量為金銀花藥材干重的12倍，每次提取時(shí)間為2.5小時(shí)；合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，再加蒸餾水至1g生藥/ml。
(2)醇沉精制山銀花水提取濃縮液，在充分?jǐn)嚢柘?，加乙?95％)，使溶液含醇量為75％，靜置32小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液，再減壓回收乙醇至流浸膏狀。
(3)正相硅膠柱色譜富集將(2)中的流浸膏加乙醇200毫升，充分加熱溶解，拌入250g色譜用硅膠(100目)，室溫放置72小時(shí)至干燥，將拌有樣品的硅膠置正相硅膠(1000g)色譜柱上，然后用乙酸乙酯-乙醇(50∶1-1∶1)進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫用溶劑量為5～7個(gè)柱床體積，收集乙酸乙酯-乙醇(10∶1-5∶1)洗脫部位，減壓回收溶劑至干，得到提取物3.86g。
(4)以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，以上述提取物總量計(jì)，總環(huán)烯醚萜苷含量為81.2％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為70.8％。
實(shí)施例14有效部位的凝膠色譜純化將上述實(shí)施例7中得到的金銀花植物提取物有效部位3.60g，用50毫升蒸餾水溶解后，通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜柱純化，用H2O洗脫，收集樣品液，減壓回收，冷凍干燥，得到進(jìn)一步純化的有效部位2.18g。
進(jìn)一步純化的有效部位的定量分析以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定，經(jīng)過(guò)凝膠柱色譜進(jìn)一步純化的有效部位中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物，即總環(huán)烯醚萜苷含量為94.6％；用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為78.9％。
純化后的有效部位定性分析經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)檢測(cè)分析，初步確定進(jìn)一步純化的有效部位中含有的環(huán)烯醚萜苷類化合物包括番木鱉苷(M＝390)，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷(M＝388)，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷二甲基縮醛(M＝434)，獐牙菜苷(sweroside) (M＝358)，四乙酰開(kāi)聯(lián)番木鱉苷(secologanoside)7-甲基酯(M＝404)，金銀花甙(kingiside)(M＝404)，莫羅忍冬甙(morroniside)(M＝406)，8-表-番木鱉甙(loganin)(M＝390)，vogeloside(M＝388)，epi-vogeloside(M＝388)，loniceracetalides A(M＝460)，loniceracetalides B(M＝460)和開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸(M＝374)。具體結(jié)構(gòu)如下 實(shí)施例15有效部位中主要環(huán)烯醚萜苷類化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定上述實(shí)施例14中得到的進(jìn)一步純化的金銀花植物提取物有效部位2.18g，用20毫升蒸餾水溶解后，注入中壓反相硅膠(C-18)柱色譜，用H2O-甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜檢查，合并組成成分相似的洗脫液。減壓回收溶劑至干燥，按極性大小得到5個(gè)分離部位F1(0.18g)、F2(0.44g)、F3(0.62g)、F4(0.20g)和F5(0.31g)。
取F2部位(0.44g)用純凈水溶解后，經(jīng)過(guò)反相(C-18)制備型HPLC分離純化得到一個(gè)單體化合物F2-1(305.8mg)。該化合物經(jīng)過(guò)HPLC歸一化法測(cè)定，含量為99.7％；經(jīng)過(guò)紫外光譜，紅外光譜，低分辨和高分辨電噴霧質(zhì)譜，一維核磁共振氫譜、碳和DEPT譜，二維核磁共振同核化學(xué)位移相關(guān)(COSY)譜、異核單量子相干(HSQC)譜和異核多鍵化學(xué)位移相關(guān)(HMBC)譜測(cè)定，以及化學(xué)衍生化后得到的衍生物的紫外光譜，紅外光譜，一維核磁共振氫譜、碳和DEPT譜，二維核磁共振COSY譜、HSQC譜和HMBC譜測(cè)定，確定為開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸。
取F3部位(0.25g)用純凈水溶解后，經(jīng)過(guò)反相(C-18)制備型HPLC分離純化得到三個(gè)單體化合物F3-1(96.1mg)、F3-2(83.8mg)和F3-3(46.2mg)。經(jīng)HPLC歸一化法測(cè)定，得到的三個(gè)化合物的純度分別為98.6％，97.4％和95.6％；經(jīng)過(guò)分別測(cè)定三個(gè)化合物的紫外光譜，紅外光譜，一維核磁共振氫譜、碳和DEPT譜，以及電噴霧質(zhì)譜測(cè)定，確定F3-1與F2-1為同一化合物；F3-2和F3-3分別鑒定為開(kāi)聯(lián)番木鱉苷(甙)(或裂環(huán)馬錢(qián)子苷secologanin)和開(kāi)聯(lián)氧化番木鱉苷(或裂環(huán)氧化馬錢(qián)子苷，secoxyloganin)。
實(shí)施例16對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹模型的影響通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的抗炎活性。
(1)受試藥物①開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸來(lái)源為實(shí)施例16分離鑒定單一化合物。
②金銀花提取物來(lái)源為前述實(shí)施例2得到的金銀花提取物，以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸(裂環(huán)馬錢(qián)子苷酸，secologanic acid)為參照物，用紫外分光光度法測(cè)定其中環(huán)烯醚萜苷類化合物總含量為75.5％，用HPLC外標(biāo)法測(cè)定開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸含量為27.6％。
③陽(yáng)性對(duì)照藥物阿司匹林片陜西白鹿制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格0.3g/片，100片/瓶。生產(chǎn)批號(hào)020527。人日最大用量為1.8g.
受試藥物的配制方法臨用時(shí)加適量蒸餾水或注射用水稀釋至所需濃度的藥液。
(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，雄性，體重18-20g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。
(3)實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠，18-20g，雄性，隨機(jī)分為8組，即空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組(阿司匹林)、受試藥物高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)3d，給藥體積均為25mL/Kg，對(duì)照組給予同體積蒸餾水。于末次給藥后1h，將二甲苯涂于各組小鼠右耳，每只50μL，30min后處死動(dòng)物，用直徑9mm的打孔器將雙耳同部位的等面積打下，精密天平稱重，以左右耳片重之差值為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率，比較組間差異。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表1。
表1開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(X±SD；n＝10)

注與對(duì)照組比較*p＜0.05；**p＜0.01。
(5)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制二甲苯所致小鼠的耳腫脹，同模型對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的抗炎作用，作用效果開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實(shí)施例17對(duì)角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹模型的影響通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的抗炎活性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物ICR小鼠，雌雄性各半，體重18-20g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。
(2)實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠，18-20g，雌雄性各半，禁食過(guò)夜，隨機(jī)分為8組，即空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組(阿司匹林)、受試藥物高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組12只。小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)3d，給藥體積均為25mL/Kg，對(duì)照組給予同體積蒸餾水。于末次給藥后45分鐘，小鼠右后足跖部皮下注射1％角叉菜膠0.03mL致炎，4小時(shí)后處死小鼠，在關(guān)節(jié)處剪下雙后足，以右后足與左后足重之差為腫脹程度的指標(biāo)。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表2。
表2開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(X±SD；n＝12)

注與對(duì)照組比較*p＜0.05；**p＜0.01。
(4)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制角叉菜膠致小鼠足跖腫脹，同模型對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的抗炎作用，作用效果開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實(shí)施例18對(duì)酵母菌懸液所致大鼠體溫的影響通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的解熱作用。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物大鼠SD種，雌雄各半，體重160-180g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。
(2)試驗(yàn)方法在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天和前一天早上測(cè)量大鼠肛溫，以每只動(dòng)物的兩天的平均體溫作為實(shí)驗(yàn)前的基礎(chǔ)體溫。除正常對(duì)照組外，其余大鼠1ml/100g體重皮下注射20％的酵母菌懸液，注射4h后測(cè)量大鼠的肛溫，按體溫增高值將大鼠均勻分為9組。試驗(yàn)分別設(shè)①正常對(duì)照組；②模型對(duì)照組；③開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸大劑量組；④開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸中劑量組；⑤開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸小劑量組；⑥金銀花提取物大劑量組；⑦金銀花提取物中劑量組；⑧金銀花提取物小劑量組；和⑨陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林(0.3g/kg)組；每組10只，各給藥組分別灌胃給藥1次，給藥體積為10mL/Kg體重，正常對(duì)照和模型組均灌胃等體積的蒸餾水。各組分別在藥后的0.5h、1h、2h和4h測(cè)量大鼠的肛溫。以每只大鼠各不同時(shí)間點(diǎn)的體溫與致熱前的基礎(chǔ)體溫的差值作為體溫的增加值。
(3)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。
(4)試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表。
表3開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物對(duì)酵母菌懸液致大鼠發(fā)熱體溫的影響(X±SD；n＝10)

注*表示同對(duì)照組比較P＜0.05；**表示同對(duì)照組比較P＜0.01。
(5)結(jié)論金銀花提取物和開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸對(duì)酵母所致大鼠發(fā)熱模型具有明顯的抑制作用，提示它們均具有一定的解熱作用。作用效果開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實(shí)施例19對(duì)內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型的影響通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的對(duì)內(nèi)毒素引起發(fā)熱的解熱活性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用家兔，體重1.8-2.5Kg，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。
(2)實(shí)驗(yàn)方法健康家兔，每日次量體溫3次，連續(xù)測(cè)3天，在第4天，測(cè)量正常體溫3次，每次間隔30分鐘，三次體溫波動(dòng)不超過(guò)0.3℃的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)，耳緣靜脈注射250ng/mL大腸桿菌內(nèi)毒素1mL/Kg，注射后測(cè)量體溫，30分鐘測(cè)量一次，體溫升高0.6℃以上的動(dòng)物分為8組，即模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林，口服給藥)、藥物低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組5只。各給藥組分別耳緣靜脈注射給藥1次，模型對(duì)照給生理鹽水和陽(yáng)性對(duì)照灌胃給藥。各組動(dòng)物分別在藥后的1h、2h、3h、4h和5h測(cè)量家兔體溫。以每只家兔各不同時(shí)間點(diǎn)的體溫與致熱后的基礎(chǔ)體溫的差值作為體溫的變化。
(3)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表。
表4開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物對(duì)內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱體溫的影響(X±SD；n＝5)

注*表示同對(duì)照組比較P＜0.05；**表示同對(duì)照組比較P＜0.01。
(5)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制大腸桿菌內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱，給藥3-4小時(shí)后，同模型對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的抗內(nèi)毒素致熱作用，作用效果開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實(shí)施例20對(duì)醋酸所致小鼠疼痛扭體模型的影響通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的鎮(zhèn)痛活性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物ICR小鼠，雄性，體重18-20g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。
(2)實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠，18-20g，雌雄兼有，隨機(jī)分為8組，即生理鹽水對(duì)照組、陽(yáng)性藥(阿司匹林)組、試驗(yàn)藥物低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12只。各組小鼠灌胃給藥30分鐘后，各鼠均腹腔注射0.5％醋酸0.2mL/只。觀察10分鐘內(nèi)各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)小鼠只數(shù)，計(jì)算各藥物鎮(zhèn)痛百分率。
鎮(zhèn)痛百分率(％)＝(對(duì)照組扭體反應(yīng)小鼠數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)小鼠數(shù))/對(duì)照組扭體反應(yīng)小鼠數(shù)×100％(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)下表。
表5.開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物醋酸致小鼠疼痛扭體的影響(X±SD；n＝12)

注與對(duì)照組比較*p＜0.05；**p＜0.01。
(4)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物能夠明顯抑制醋酸致小鼠疼痛扭體作用，同模型對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示它們均具有較明顯的鎮(zhèn)痛作用，作用效果金銀花提取物＞開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸。
實(shí)施例21體外抗病毒實(shí)驗(yàn)通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的抗病毒活性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)病毒株和細(xì)胞呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)，Hela細(xì)胞。
(2)實(shí)驗(yàn)方法①病毒毒力測(cè)定將經(jīng)Hela細(xì)胞活化擴(kuò)增的呼吸道合胞病毒進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度10-1～10-9。將各稀釋度的病毒液分別接種2孔生長(zhǎng)良好的Hela細(xì)胞，每孔接種0.1mL RSV液，37℃吸附1小時(shí)后，棄病毒液，每孔細(xì)胞加入培養(yǎng)液1mL，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，于24小時(shí)和48小時(shí)觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果表明，培養(yǎng)48小時(shí)呼吸道合胞病毒的滴毒為10-7(見(jiàn)下表)。
表6呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)致Hela細(xì)胞病變

②開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸、金銀花提取物和陽(yáng)性對(duì)照藥物病毒唑的細(xì)胞毒性稱取受試樣品各500mg，分別用10mL蒸餾水溶解后，煮沸15分鐘，分別取1.5mL，加入培養(yǎng)液0.5mL，用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2。將上述藥液用培養(yǎng)液進(jìn)行2倍系列稀釋，稀釋度1∶2～1∶4096。將各稀釋度藥液加入到24孔Hela細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1mL，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物在稀釋度為1∶2～1∶8的情況下，細(xì)胞壞死、脫落，均表現(xiàn)出有明顯的細(xì)胞毒性；在稀釋度為1∶16時(shí)，均無(wú)明顯細(xì)胞毒性，在稀釋度為1∶32～1∶4096的藥液中，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，與對(duì)照組培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)明顯差異。陽(yáng)性對(duì)照藥物病毒唑，在稀釋度為1∶2～1∶64的情況下，細(xì)胞壞死、脫落，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性；在1∶128～1∶4096稀釋度的病毒唑藥液中，細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，與正常培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照組無(wú)明顯差別。
③藥物抗病毒作用測(cè)試將RSV病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度為10-5。將病毒液接種于24孔生長(zhǎng)良好的Hela細(xì)胞，每孔接種0.1mL RSV液，37℃吸附1小時(shí)后，棄去病毒液，并加入如下待測(cè)藥液和陽(yáng)性藥物藥液。將開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸、金銀花提取物和陽(yáng)性對(duì)照藥物病毒唑分別進(jìn)行2倍系列稀釋，稀釋度為1∶128～1∶4096(開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物的濃度分別為293、146、73、18、9μg/mL；病毒唑的濃度為781、391、195、98、49和24μg/mL)。將各稀釋度的藥液分別加入經(jīng)病毒液(10-5)吸附過(guò)的單層培養(yǎng)Hela細(xì)胞孔中，每一稀釋度平行加入2孔。然后在37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表7。
表7開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸、金銀花提取物和陽(yáng)性對(duì)照藥物病毒唑?qū)粑篮习《?RSV)的致Hela細(xì)胞病變的抑制作用

(4)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物均能夠明顯抑制呼吸道合胞病毒(RSV)致體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞的病變作用，提示它們均具有較明顯體外抗病毒作用，作用效果開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實(shí)施例22體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的體內(nèi)抗病毒活性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物ICR小鼠，雌雄各半，體重14-16g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。
(2)試驗(yàn)方法ICR小鼠，隨機(jī)分為8組，即空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組(病毒唑)、受試藥物高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組12只。各組小鼠腹腔注射給藥，每天給藥1次，連續(xù)3天，給藥體積均為25mL/Kg，對(duì)照組給予同體積生理鹽水。于末次給藥2h后，除正常對(duì)照組小鼠外，其余各組動(dòng)物用乙醚淺度麻醉后，用10個(gè)LD50流感病毒肺適應(yīng)株(FM1)病毒液，滴鼻感染，每鼠0.05mL，動(dòng)物自然蘇醒后，繼續(xù)給藥，連續(xù)4天(共給藥7天)。每天觀察動(dòng)物自主活動(dòng)情況，并記錄動(dòng)物死亡情況，死亡動(dòng)物立即稱重后解剖，取肺并稱濕重；第4天給藥后，禁食8小時(shí)后，稱重，并解剖取肺，稱肺濕重；計(jì)算肺指數(shù)，求肺指數(shù)抑制率。
肺指數(shù)＝肺濕重(g)/體重×100％

肺指數(shù)越大表示肺病變?cè)絿?yán)重。
(3)試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表。
表8開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物對(duì)流感病毒肺適應(yīng)株(FM1)感染小鼠肺指數(shù)的抑制作用(X±SD；n＝12)

注*表示同對(duì)照組比較P＜0.05；**表示同對(duì)照組比較P＜0.01。
(4)結(jié)論金銀花提取物和開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸對(duì)流感病毒肺適應(yīng)株(FM1)感染小鼠的肺指數(shù)有抑制作用，提示它們均具有體內(nèi)抗流感病毒的作用。作用效果開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸＞金銀花提取物。
實(shí)施例23溶血性試驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的溶血作用，以判斷其在制劑中作為注射用藥的可行性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物家兔1只，雄性，體重1.65Kg。
(2)實(shí)驗(yàn)方法自家兔心臟取血20mL，只三角瓶中，去纖維蛋白后，均分轉(zhuǎn)移至8支10mL刻度離心管內(nèi)，每管加入生理鹽水2.5mL，混勻后離心，去除上清液，再分別加5mL生理鹽水，混勻離心，反復(fù)處理3次，至上清液無(wú)色。將得到的紅細(xì)胞按體積用生理鹽水稀釋稱2％的紅細(xì)胞混懸液。取試管14支，編號(hào)并按下表加入藥液。并判斷結(jié)果。其中，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物藥液均為生理鹽水配制，濃度分別為10和20mg/mL。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)下表。
表9開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物的溶血性試驗(yàn)結(jié)果

“+”表示有溶血現(xiàn)象；“-”表示無(wú)溶血現(xiàn)象。
(4)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物無(wú)溶血性。
實(shí)施例24刺激性試驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察從金銀花中分離鑒定的主要成分開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的血管刺激性，以判斷其在制劑中作為注射用藥的可行性。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物家兔3只，雄性1只，雌性2只，體重1.60-1.80Kg。
(2)實(shí)驗(yàn)方法按照8.33mg/Kg體重，右側(cè)耳緣靜脈滴注給予藥液(濃度0.5mg/mL)，每天1次，連續(xù)給藥3天，末次給藥后24小時(shí)，處死動(dòng)物，剪下雙耳，左側(cè)耳作為對(duì)照，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果三只家兔，其左側(cè)和右側(cè)耳均無(wú)明顯組織病理學(xué)差別。
(4)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸和金銀花提取物，濃度分別為0.5mg/mL，家兔耳緣靜脈給藥無(wú)明顯血管刺激性。
實(shí)施例25急性毒性實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察以環(huán)烯醚萜苷類為主要成分的金銀花提取物的急性毒性和半數(shù)致死量(LD50)。
此試驗(yàn)的受試藥物與實(shí)施例16相同。
(1)動(dòng)物ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。
(2)實(shí)驗(yàn)方法ICR小鼠，18-20g，雌雄性各半，隨機(jī)分為4組，每組10只。分別通過(guò)尾靜脈注射給不同劑量的金銀花提取物藥液，各組動(dòng)物的給藥劑量分別為每公斤體重2.70g、2.43 g、2.19g和1.97g。給藥后觀察并記錄各組小鼠出現(xiàn)的中毒癥狀和死亡情況。觀察7日。死亡率按Bliss法計(jì)算LD50和95％可信限，并注意死亡率與性別的關(guān)系。
(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果金銀花提取物靜脈注射后，較大劑量組多數(shù)小鼠立即出現(xiàn)跳躍、掙扎驚厥，然后俯臥或仰臥，翻正反射消失，耳廓蒼白，呼吸停止而死亡。尸檢未見(jiàn)各臟器組織明顯異常。部分小鼠上述癥狀出現(xiàn)數(shù)秒鐘后逐漸消失。小劑量組小鼠注射給藥后呼吸減慢、俯臥，持續(xù)近1分鐘后恢復(fù)正常。觀察7日，按Bliss法計(jì)算LD50和95％可信限，結(jié)果見(jiàn)下表。
表10金銀花提取物小鼠靜脈注射給藥的的急性毒性和半數(shù)致死量測(cè)定(LD50)(Bliss法)

(4)結(jié)論本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花提取物小鼠靜脈注射給藥LD50為2.28g/Kg體重；95％可信限為2.14～2.42g/Kg體重。
以上已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方案，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很明顯可以做很多改進(jìn)和變化而不會(huì)背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進(jìn)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，所附權(quán)利要求的技術(shù)特征由上述說(shuō)明書(shū)確定。
權(quán)利要求
1.一種具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的金銀花提取物，該提取物是從金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物中提取制備的，其中的有效成分是以開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸為主要成分的環(huán)烯醚萜類化合物，其中所述環(huán)烯醚萜類化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中X1和X2各自獨(dú)立地表示O、N或S；R、R1或R2各自獨(dú)立地表示氫、C1-6低級(jí)烷基或C2-6低級(jí)鏈烯基；其中以提取物的總重量計(jì)，所述環(huán)烯醚萜類化合物的含量大于50％。
2.按照權(quán)利要求1所述的金銀花提取物，其中所述基團(tuán)X1和X2各自獨(dú)立地表示O。
3.按照權(quán)利要求1所述的金銀花提取物，其中所述的R、R1或R2基團(tuán)各自獨(dú)立的是氫、甲基、乙基或異戊烯基。
4.按照權(quán)利要求3的所述的金銀花提取物，其中所述的化合物是開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸。
5.按照權(quán)利要求1所述的金銀花提取物，其中環(huán)烯醚萜類化合物的含量大于70％，優(yōu)選70％-98％。
6.按照權(quán)利要求1所述的金銀花提取物，其中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸單一成分的含量大于25％，優(yōu)選大于50％，更優(yōu)選大于70％，最優(yōu)選70％-98％。
7.按照權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的金銀花提取物的制備方法，該方法包括以下步驟(1)提取將植物金銀花或其基源植物忍冬或同屬其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作為溶劑進(jìn)行提取，得到提取液；(2)后處理A.將該提取液經(jīng)常壓或減壓濃縮干燥得到浸膏，或經(jīng)噴霧干燥得到粉末；B.將上一步驟得到的產(chǎn)物用溶劑溶解后，用極性相反的其他溶劑進(jìn)行沉淀或沉降，用常規(guī)方法進(jìn)行處理得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物，得到沉淀物或溶解液濃縮物；(3)色譜分離純化將上述后處理得到的產(chǎn)物用色譜方法分離純化，收集含有環(huán)烯醚萜類化合物的洗脫液餾分，得到含有環(huán)烯醚萜類化合物的金銀花提取物；其中所述的色譜方法為大孔吸附樹(shù)脂柱色譜、正相硅膠或反相硅膠色譜，或者它們的組合；由此得到的金銀花提取物中環(huán)烯醚萜類化合物含量大于50％。
8.按照權(quán)利要求7所述金銀花提取物的制備方法，該方法還包括將上述方法獲得的產(chǎn)物用凝膠色譜進(jìn)一步純化的步驟，得到環(huán)烯醚萜類化合物含量大于70％的金銀花提取物。
9.一種用于治療高熱癥、疼痛和感染性疾病的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的金銀花提取物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的金銀花提取物和權(quán)利要求8的藥物組合物中在制備治療高熱癥、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從中藥金銀花(Lonicera japonica Thunb.)或其基源植物忍冬或同屬其他植物中制備植物提取物的方法，以及由該方法制備的金銀花提取物，和含有該提取物的藥物組合物，所述組合物的有效成分為開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物類化合物。該方法包括水或醇提取，提取物經(jīng)沉淀和色譜方法精制，如果需要還可用凝膠柱色譜進(jìn)一步純化，得到的提取物中開(kāi)聯(lián)番木鱉苷酸及其衍生物的含量在50％以上，優(yōu)選70％以上。用本發(fā)明的制備方法得到的金銀花提取物具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌和抗病毒的活性，可用于治療高熱癥、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101085795SQ20061008355
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日
發(fā)明者石建功, 李帥, 王素娟, 楊永春, 安玉偉, 韓豐年 申請(qǐng)人:石家莊漢康生化藥品有限公司