專利名稱：具有抗癌活性的新的三萜皂苷類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫金?？谱辖鹋僦参镒唏R胎Ardisia gigantifolia Stapf中分離得到的多個具有抗癌活性的下列新的三萜皂苷類化合物。這些化合物在體外試驗中具有明顯的抗腫瘤活性。
3，R1＝-CHO 4，R1＝-CH3 5，R1＝-CH3 6，R1＝-CH3
7，R1＝-CH3 8，R1＝-CH2OCOCH3 9，R1＝-CH2OCOCH3 10， 背景技術(shù)及文獻(xiàn)紫金牛科紫金牛屬植物(Ardisia)全世界約300種，分布于熱帶美洲、太平洋諸島、印度半島東部、亞洲東部至南部，我國68種，12變種，分布于長江流域以南各地。70年代以前僅對紫金牛、開喉箭等少數(shù)品種有過研究，近20年多年來，已對10多個品種進(jìn)行了化學(xué)和藥理方面的研究，發(fā)現(xiàn)了一些具生理活性的新成分，從而引起了更多學(xué)者的興趣。紫金牛科植物走馬胎Ardisia gigantifolia Stapf又名大葉紫金牛，分布于廣西、廣東、江西、福建等地。[1]MTT試驗法原理1963年Slater發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能脫下琥珀酸的氫原子，使之氧化為延胡索酸。作為氫原子的接受劑，能使可溶性的MTT(四甲基偶氮唑鹽)3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide還原為不可溶的蘭紫色衍生物甲瓚(Formazan)，通過反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚顏色的深淺以反映活細(xì)胞量的變化。1983年Mosmann提出，凡具有代謝活性的細(xì)胞，不管處于靜止期還是分裂期，都有還原MTT的能力，而死細(xì)胞和紅細(xì)胞則沒有這種能力。反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比。吸光度值A(chǔ)(OD)可以在自動酶標(biāo)讀數(shù)儀上連續(xù)記數(shù)，因此利用此原理，測定抗腫瘤藥物作用后的腫瘤細(xì)胞(A)值變化，并計算出腫瘤細(xì)胞存活率，從而預(yù)測腫瘤細(xì)胞對某抗腫瘤藥物的敏感程度，據(jù)此建立MTT法對抗腫瘤藥物敏感性的檢測。[2]申請者采用該活性篩選方法，從廣西產(chǎn)藥用植物走馬胎(Ardisia gigantifolia Stapf)中成功地分離得到多個具有抗腫瘤活性的三萜皂苷類化合物。
參考文獻(xiàn)[1]張清華。紫金牛屬植物化學(xué)成分研究概況。華西藥學(xué)雜志，1994；9(2)99-103[2]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvivalApplication toProliferation and cytotoxic assay.J Immunol Meth，1983，6555.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在利用中國的天然藥物資源尋找新的抗腫瘤活性化合物，為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物。
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的新的三萜皂苷類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
具體實施例方式
實施例1新的三萜皂苷類化合物的分離方法本發(fā)明所用原料來自中國廣西壯族自治區(qū)，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)孫啟時教授鑒定為紫金?？谱辖鹋僦参镒唏R胎(Ardisia gigantifolia Stapf)。本發(fā)明化合物具體制備方法如下干燥的走馬胎根莖用10倍量60％乙醇回流提取1次，8倍量回流提取1次，合并提取液，減壓干燥。殘留物分散于10倍體積的水中，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，再用等體積的正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，真空減壓干燥，得正丁醇提取物。該提取物經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫。氯仿-甲醇7∶3洗脫部分經(jīng)大孔樹脂(HP20)柱層析，乙醇-水梯度洗脫；50％、70％乙醇-水洗脫部分經(jīng)反相ODS開放柱層析，甲醇-水梯度洗脫得到化合物1、4；60％甲醇-水洗脫部分經(jīng)反相高效液相分離(60％甲醇-水)得到化合物2、3、5、6、7、8、9、10。
化合物1白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。IR3422cm-1、2700cm-1、1717cm-1、1075cm-1、1042cm-1；13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、3、5。
化合物2白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、3、5。
化合物3白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、3、5。
化合物4白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、3、5。
化合物5白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、3、5。
化合物6白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、4、6。
化合物7白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、4、6。
化合物8白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、4、6。
化合物9白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、4、6。
化合物10白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)陽性。13C and1H NMR數(shù)據(jù)見表1、2、4、6。
表1化合物1-10苷元部分13C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d5，400MHz)

表2化合物1-10糖部分13C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d5，400MHz)


表3化合物1-5苷元部分1H-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d5，400MHz)


Overlapped signals are indicated by“(o)”表4化合物6-10苷元部分1H-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d5，400MHz)

Overlapped signals are indicated by“(o)”表5化合物1-5糖部分1H-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d5，400MHz)


Overlapped signals are indicated by“(o)”表6化合物6-10糖部分1H-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d5，400MHz)

Overlapped signals are indicated by“(o)”實例2化合物MTT法體外抗腫瘤活性的測定方法將MCF-7等人體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入15％胎牛血清，1％抗生素(10,000U/mL青霉素，10,000μg/mL鏈霉素)，于37℃，5％CO2條件的濕熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天繼代培養(yǎng)，使細(xì)胞保持在對數(shù)生長期。MTT用PBS(Phosphate-Buffer Saline)溶液配成5mg/mL的母液，于4℃避光保存。
實驗樣品1mg溶于1ml DMSO中，-20℃保存，用培養(yǎng)液稀釋成0.5％作為供試液。在96孔培養(yǎng)板的每一個孔中加入90μL生長良好的腫瘤細(xì)胞(約含有10000個細(xì)胞)，24小時后加入不同濃度的供試樣品，每組平行設(shè)四個復(fù)孔，同時設(shè)陽性對照，空白對照，在37℃，5％CO2條件下共同培養(yǎng)48小時。然后，每孔加入10μL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心棄去培養(yǎng)液，染色的細(xì)胞用DMSO(150μL/孔)溶解10分鐘，待結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀于570nm處測吸光度OD值，并按如下公式計算細(xì)胞增殖抑制率，用SPSS法以藥理學(xué)統(tǒng)計軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50值。陽性對照藥為抗癌藥物-順鉑(CDDP)。
細(xì)胞增殖抑制率＝(空白對照組OD值的平均值-樣品組OD值的平均值)÷空白對照組OD值的平均值×100％1化合物1、2、4-6的抗腫瘤活性結(jié)果

*表示化合物沒活性
權(quán)利要求
1.具有下列結(jié)構(gòu)的新的三萜皂苷類化合物。
2.權(quán)力要求1所述的新的三萜皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的新的三萜皂苷類化合物。申請者從來自中國廣西壯族自治區(qū)的原料走馬胎(Ardisia gigantifolia Stapf)中分離得到的新的三萜皂苷類化合物，在體外具有明顯的抗腫瘤活性?？稍谥苽淇鼓[瘤藥物中應(yīng)用，也有助于中國傳統(tǒng)中草藥的進(jìn)一步開發(fā)利用。
文檔編號A61K31/7042GK1931871SQ200610063110
公開日2007年3月21日 申請日期2006年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月16日
發(fā)明者姚新生, 王乃利, 張曉明, 趙鳳光 申請人:深圳中藥及天然藥物研究中心