專利名稱：激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽及其篩選方法與用途。
背景技術(shù)：
近年來結(jié)核病(Tuberculosis，TB)在全球范圍內(nèi)又死灰復(fù)燃。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界約有1/3人口約20億人感染了結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)，每年新發(fā)病人約900萬，每年死亡人數(shù)高達300萬。世界衛(wèi)生組織提出了“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”(global emergency)。由此可見，結(jié)核病對人類健康和經(jīng)濟造成的沖擊和損害難以簡單評估。結(jié)核病在我國流行的特點是高患病率，高耐藥率，高死亡率，高感染率和低遞降率，嚴重影響了個人和家庭的生活質(zhì)量、社會和國家的建設(shè)和經(jīng)濟發(fā)展。目前控制結(jié)核病的策略主要是直接使用抗生素。然而，需聯(lián)合使用多種抗生素至少達6個月以上，而且由于Mtb耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)，常造成抗生素治療無效。現(xiàn)今常用的結(jié)核疫苗---卡介苗(BCG)具有很大的局限性(1)對成人結(jié)核的效果并不令人滿意；(2)可在免疫力低下的個體中引起嚴重的疾病甚至死亡；(3)可造成皮膚試驗陽性，使其失去在結(jié)核桿菌感染中的診斷意義。因此，迫切需要開發(fā)新型高效的保護性結(jié)核疫苗，開發(fā)檢測、治療和預(yù)防結(jié)核病的新方法，以有效控制結(jié)核病的發(fā)生和病情發(fā)展，這一研究領(lǐng)域具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。
結(jié)核桿菌(Mtb)是一種細胞內(nèi)病原體，機體對其的控制依賴于對受感染細胞的識別和破壞。在小鼠模型中的研究表明，MHC II類限制性CD4+T細胞，MHC I類限制性CD8+T細胞，IFN-γ，TNF-α，γδT細胞和CD1限制性T細胞在體內(nèi)具有積極的保護性作用。在人體內(nèi)已鑒定了不同型別的CD8+Mtb特異性T細胞，但其在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用尚不明確。巨噬細胞巨噬細胞在人體對Mtb的免疫反應(yīng)中起重要作用。Mtb可存活于未活化的巨噬細胞中。當巨噬細胞被激活，可產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子，誘導(dǎo)NO、活性硝酸鹽介質(zhì)(RNI)以及NO合成酶的產(chǎn)生，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)作用。巨噬細胞發(fā)揮抗微生物活性的另一條途徑是吞噬小體的融合。但Mtb感染巨噬細胞可抑制吞噬小體的融合和酸化，而Mtb得以存活于巨噬細胞內(nèi)。CD4+T細胞Mtb抗原經(jīng)MHC II類分子遞呈至CD4+T細胞。CD4+T細胞可產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子發(fā)揮效應(yīng)作用，也可誘導(dǎo)受染細胞的凋亡，還可協(xié)助B細胞、CD8+T細胞的激活。但是，Mtb感染巨噬細胞可導(dǎo)致巨噬細胞MHC II類分子表達下降，從而抑制CD4+T細胞的免疫效應(yīng)。CD8+T細胞Mtb被巨噬細胞的吞噬小體吞噬，其抗原或其分泌的蛋白質(zhì)進入吞噬小體中，再透過吞噬小體膜進入巨噬細胞，進而被消化處理并由MHC I類分子遞呈至CD8+T細胞。CD8+T細胞可產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子發(fā)揮效應(yīng)作用，也可通過Fas/Fasl途徑、granzyme B等直接發(fā)揮細胞毒性作用。研究表明，BCG不能充分刺激CD8+T細胞，可能由于BCG失去了關(guān)鍵的溶胞膜素，Mtb抗原不能進入受感染細胞的胞液而被遞呈?，F(xiàn)有的研究主要是關(guān)于CD4+T細胞在結(jié)核病中的保護性反應(yīng)，特異性CD4+T細胞免疫反應(yīng)與疾病不同階段的相關(guān)性，正在研究中。而結(jié)核病中CD8+T細胞的作用機制，尚未明確。CD8+T細胞被單個抗原肽激活依賴于許多因素，其中得到公認的是，APC表面存在高密度的肽/MHC復(fù)合物是體內(nèi)或體外“初始”T細胞激活的關(guān)鍵。樹突狀細胞(DC)表達高水平MHC，在激活“初始”T細胞中起重要作用。關(guān)于激活“初始”T細胞所需的肽/MHC復(fù)合物分子數(shù)的報道，具有較大差異，從每細胞300個到10000個。但總的來講，“初始”T細胞的反應(yīng)需要激活記憶細胞所需肽/MHC復(fù)合物分子數(shù)的100-1000倍。而且有研究表明，90％被CD8+T細胞識別的肽，與其MHC I類分子高親合性結(jié)合。從HLA I類分子洗脫的肽多為8-10氨基酸。而用合成肽進行的研究表明，長度為15-20氨基酸的肽亦可結(jié)合HLA I類分子而激活T細胞。HLA II類分子結(jié)合的肽的長度則具有相當?shù)娜嵝浴?br> 目前的TB疫苗可分為4類亞單位疫苗，DNA疫苗，全細菌疫苗和混合疫苗。亞單位疫苗是基于假設(shè)一個或少數(shù)幾個抗原即足以誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)。已有研究在小鼠模型上對亞單位疫苗進行檢驗，包括培養(yǎng)液濾過蛋白，單個蛋白，蛋白混合物以及融合蛋白。雖然這類疫苗很安全，但這種模式的抗原遞呈只能刺激有限數(shù)量的特異性T細胞，大多數(shù)是CD4+T細胞，而且總的來講，這類反應(yīng)比較短暫。DNA疫苗能刺激CD4+和CD8+T細胞反應(yīng)而且持久，但其安全性仍令人擔(dān)心，包括基因組整合的風(fēng)險。迄今經(jīng)測試，最成功的TB DNA疫苗是Ag85A。也有許多對全細菌疫苗的研究。從Mtb去除單個基因如毒力因子，可能降低細菌毒力但仍保持刺激CD4+、CD8+和非傳統(tǒng)T細胞的能力。對于這些突變子的安全性仍有爭議?；旌弦呙缡橇D利用上述策略的優(yōu)勢，如BCG可經(jīng)工程改造，過量表達一個或多個免疫原性/保護性蛋白。如，BCG經(jīng)工程改造可分泌listerlysin，這使BCG蛋白可進入受感染細胞的胞漿，增強其刺激CD8+T細胞的能力。同樣，經(jīng)工程改造的BCG過量表達Ag85，在豚鼠實驗中優(yōu)于單獨用BCG。
當Mtb以及其他一些細胞內(nèi)病原體生長在培養(yǎng)基中時，也釋放蛋白質(zhì)(培養(yǎng)基濾過蛋白)進入胞外基質(zhì)中。有學(xué)者用雙相聚丙烯酰胺瓊脂糖電泳分析Mtb培養(yǎng)濾過液，鑒定了200多種不同的蛋白點。將胞內(nèi)產(chǎn)生的和培養(yǎng)基中生長的Mtb產(chǎn)生蛋白用雙相聚丙烯酰胺瓊脂糖電泳進行比較分析，可發(fā)現(xiàn)顯著差異。Horwitz等純化并鑒定了在Mtb培養(yǎng)濾過液中最豐富的6種蛋白質(zhì)，包括抗原85A，抗原85B，超氧化物歧化酶，hsp71，Mpt51，Mpt63。用這些純化蛋白質(zhì)免疫豚鼠可使之獲得對Mtb的免疫力。
盡管許多抗原帶有潛在的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)表位，但在初次反應(yīng)中只有少數(shù)能產(chǎn)生CTL反應(yīng)，主要的表位稱為免疫優(yōu)勢決定簇，其它的表位稱為次要決定簇或結(jié)構(gòu)性決定簇。次要決定簇能被處理和遞呈，但在免疫優(yōu)勢決定簇存在時，次要決定簇不能激發(fā)CTL反應(yīng)。結(jié)構(gòu)性表位不能被遞呈，可能在抗原處理過程中有問題，包括蛋白小體剪切的特異性以及由于包饒表位的側(cè)面序列。影響免疫優(yōu)勢的因素包括(1)APC的抗原處理無效；(2)缺乏適當?shù)腡CR以識別表位/HLA復(fù)合物分子；(3)CD8+T細胞抗原遞呈的競爭；(4)由免疫優(yōu)勢CD8+T細胞產(chǎn)生的對其它決定簇反應(yīng)的抑制。對于TB疫苗而言，尤其應(yīng)考慮這些影響因素，因為幾乎每個人都會暴露于環(huán)境中的細菌，BCG和/或Mtb。雖然疫苗研究集中于免疫優(yōu)勢表位，但對次要決定簇的研究可能將免疫反應(yīng)集中于不能逃避免疫識別的表位。有報道，將ESAT-6的次要決定簇免疫小鼠，可誘導(dǎo)顯著的抗TB的保護性免疫反應(yīng)，而用有的免疫優(yōu)勢表位卻不能產(chǎn)生這樣的保護性反應(yīng)。因此，研究激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位，包括免疫優(yōu)勢決定簇和次要決定簇，十分必要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，研究結(jié)核病的保護性免疫反應(yīng)機制，進一步開發(fā)出新型的多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗，更有效地預(yù)防和控制結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展。
綜合應(yīng)用基因組序列、生物信息學(xué)、功能基因組學(xué)和免疫學(xué)研究，本發(fā)明提供了一種能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，所述肽含有選自以下的氨基酸序列RLLALLCAAV(SEQ ID NO2)，KLILTQPFDV(SEQ ID NO5)，RLSQSADQYL(SEQ ID NO10)，F(xiàn)LTREMPAWL(SEQ ID NO12)，KLIANNTRV(SEQ ID NO14)，GLPVEYLQV(SEQ ID NO15)。
本發(fā)明還提供了一種能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽的篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟I表位預(yù)測和分子模擬肽合成應(yīng)用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI對結(jié)核桿菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173進行HLA-A*0201限制性CTL表位預(yù)測，以F-moc化學(xué)法合成上述預(yù)測得到的分子模擬肽；II上述分子模擬肽經(jīng)親和力分析、穩(wěn)定性分析、細胞增殖實驗、細胞活性檢測和特異性抗體檢測，篩選出親和力強、穩(wěn)定性好、能產(chǎn)生較強增殖反應(yīng)、具有較強細胞毒活性和免疫后能產(chǎn)生特異性抗體的分子模擬肽。
本發(fā)明還提供了上述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備免疫原、免疫動物、或產(chǎn)生免疫保護上的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗上的用途。
該多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗，它含有上述分子模擬肽SEQ ID NO2，5，10，12，14，15中一個或多個直接或間接地連接而成的肽段。
本發(fā)明大大有助于對結(jié)核病的預(yù)防和治療，尤其是對多耐藥性菌株的控制，也有利于研究結(jié)核病中的分子、細胞作用機制，促進困擾臨床的多耐藥性難題的解決。


圖1預(yù)測抗原肽與HLA-A*0201的親和力及穩(wěn)定性分析結(jié)果圖2結(jié)核桿菌抗原肽刺激PBMCs產(chǎn)生的增殖反應(yīng)圖3結(jié)核桿菌抗原肽誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生特異性的CTL殺傷活性圖4結(jié)核抗原肽誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例11材料與方法1.1研究對象肺結(jié)核確診患者200例，其中HLA-A*0201陽性100例，HLA-A*0201陰性100例，均經(jīng)放射學(xué)和臨床痰培養(yǎng)檢驗。100例HLA-A*0201陽性其他慢性肺病患者為疾病對照組，100例HLA-A*0201陽性健康志愿者為正常對照組。
1.2試劑和試劑盒淋巴細胞分離液LymphoprepTM購自挪威AXIS-SHIELD公司；LPS、人重組IL-2、DMSO、BFA、β2-mg均購自Sigma公司；人重組GM-CSF、人重組IL-4購自R&D公司；
RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；(Sigma)；FITC標記的抗-CD3、抗-CD8、抗-HLA.A2流式單克隆抗體與檢測細胞內(nèi)因子FITC標記抗體(IFN-γ、TNF-α、IL-10)均為Caltag公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒購自Qiagen公司；時間分辨熒光DELFIA細胞增殖(AD0200)與細胞毒性(AD0016)檢測試劑盒均購自Wallac Oy公司；多肽由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；T2細胞株購自美國ATCC細胞庫。
1.3主要儀器流式細胞儀(Coulter EPICS XL)時間分辨熒光檢測儀(DELFIA 1235，Perkin Elmer)1.4表位預(yù)測和多肽合成應(yīng)用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI對結(jié)核桿菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173進行HLA-A*0201限制性CTL表位預(yù)測，根據(jù)多肽上的氨基酸是否為錨定殘基、輔助殘基或優(yōu)勢殘基進行記分，分值高于21分者有可能是T細胞表位。由上海生工生物工程技術(shù)有限公司以F-moc化學(xué)法合成上述預(yù)測得到的多肽，合成的抗原肽均經(jīng)高效液相色譜純化(純度＞95％)，并經(jīng)質(zhì)譜鑒定。凍干粉保存于4℃，用前以無菌蒸餾水復(fù)蘇多肽(2μg/ul)。
1.5抗原肽親和力分析采用T2細胞株進行抗原肽親和力分析，其原理主要是利用T2細胞系的特點。T2細胞表面空載的HLA-A2分子表達極不穩(wěn)定，遞呈后很快降解，抗原肽與之結(jié)合后穩(wěn)定了HLA-A2的表達，抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力越強，T2細胞表面HLA-A2分子的表達量就越高。而且由于T2細胞的內(nèi)源性抗原遞呈途徑中必需的抗原多肽轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)缺乏，所以T2細胞表面HLA-A2分子的表達量的增加直觀的反映了外來抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力。
具體方法為T2細胞以pH3.2的檸檬酸鈉-磷酸鹽緩沖液預(yù)處理1min，使細胞表面的MHCI類復(fù)合物變性，立即用過量的RPMI1640(Gibco BRL)培養(yǎng)液洗1遍，調(diào)節(jié)細胞濃度至3×105，以1ml/孔種于24孔細胞培養(yǎng)板。以抗原肽(20ug/ml)刺激，補充Brefeldin(BFA，10ug/ml)和β2-MG(1ug/ml)，37℃5％CO2飽和濕度孵育4h，并以未加抗原肽為空白對照孔。收集細胞，以FACS(含0.2％FCS和0.1％疊氮鈉的PBS)洗1遍，用FITC標記的小鼠抗人HLA-A*0201單克隆抗體染色，常溫暗處反應(yīng)30min，F(xiàn)ACS液洗2遍，以鞘液懸浮，流式細胞儀(Coulter EPICS XL)檢測平均熒光強度。每個實驗重復(fù)3次，平均熒光強度高于空白對照孔平均熒光強度+3SD的抗原肽具有HLA-A*0201高親和力。
1.6抗原肽穩(wěn)定性分析T2細胞同前預(yù)處理，將抗原肽濃度提高至80μg/ml，37℃5％CO2飽和濕度孵育18h，補充BFA至終濃度為10ug/ml，繼續(xù)孵育3h。收集細胞，同前測平均熒光強度。平均熒光強度高于空白對照孔平均熒光強度+3SD的抗原肽進行細胞增殖反應(yīng)及細胞毒性實驗。
1.7抗原肽誘導(dǎo)CTL制備密度梯度離心法分離經(jīng)EDTA抗凝的靜脈血中的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，分離得到的PBMCs種于6孔細胞培養(yǎng)板，在含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃5％CO2孵育1.5h。收集懸浮細胞(主要為淋巴細胞)，以10％二甲亞砜90％小牛血清保存于液氮備用。貼壁細胞為抗原提呈細胞-樹突狀細胞(DC)，補充含GM-CSF(1000U/ml，R&D)、IL-4(1000U/ml，R&D)及含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃5％CO2培養(yǎng)7d，需要時補充新鮮培養(yǎng)液。5d后，加入LPS(1μg/ml，Sigma)培養(yǎng)2d后，γ照射使其失去增殖活性。將經(jīng)過照射的DC與抗原肽(10μmol/L)在培養(yǎng)液中，37℃5％CO2共孵過夜。將1×105負載有抗原肽的DC與1×106自體PBMCs種于含10％FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液的24孔細胞培養(yǎng)板，37℃5％CO2混合培養(yǎng)3d后，加入rIL-2(20U/ml，Sigma)繼續(xù)培養(yǎng)10d，進行細胞增殖實驗和細胞活性檢測。
1.8細胞增殖實驗采用時間分辨熒光DELFIA細胞增殖檢測試劑盒(AD0200，Wallaroy)，將經(jīng)輻射的5×103負載抗原肽的DC100ul與5×104抗原肽誘導(dǎo)的自體CTL100ul種于96孔細胞培養(yǎng)板，并以未負載抗原肽的DC作為陰性對照。加入20ulBrdU標記液孵育10h，離心1遍，加入Eu標記的抗BrdU單抗，室溫孵育2h，洗滌，固定。時間分辨熒光檢測儀(DELFIA 1235)檢測熒光強度，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，取平均值為檢測結(jié)果。增殖系數(shù)(SI)＝含抗原肽的平均熒光強度/陰性對照的平均熒光強度，SI＞2的抗原肽視為能誘導(dǎo)淋巴細胞增殖。
1.9細胞毒性分析采用時間分辨熒光DELFIA EUTDA細胞毒性試驗(AD0116，Wallaroy)，抗原肽誘導(dǎo)CTL為效應(yīng)細胞(E)，負載抗原肽的T2細胞為靶細胞(T)，檢測殺傷活性。參照說明書進行操作，效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為40∶1，培養(yǎng)4h。時間分辨熒光檢測儀(DELFIA 1235)檢測熒光強度，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，取平均值為檢測結(jié)果。細胞殺傷活性＝(待測孔熒光強度-自然釋放孔熒光強度)/(最大釋放孔熒光強度-自然釋放孔熒光強度)×100％。
1.10動物實驗1.10.1動物及分組C57BL/6小鼠20只，2月齡，體重(18±2)g，雌雄不限，隨機分為4組，每組5只。
1.10.2免疫方法以體外實驗篩選出的結(jié)核抗原肽為免疫原，共注射3次，每次間隔2周，首次以CFA為佐劑，加強免疫以IFA為佐劑。小鼠首次及加強免疫量為50μg/只，與0.3ml佐劑完全乳化后，在腋窩、腹股溝、腋部皮下及腹腔多點注射。
1.10.3標本的采集與分離在首次免疫、二次免疫和三次免疫后21天，分別對5只/組小鼠在眼眶采血，分離血清，并凍存于-20℃冰箱備用。
1.10.4檢測特異性抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。按100孔包被96孔酶聯(lián)板，抗原濃度為20μg/ml，4℃過夜；以5％BSA-PBS 37℃封閉120min，洗滌3次，3min/次；加倍比稀釋的被測動物血清，100孔，37℃孵育90min。洗滌3次后，加入HRP酶標二抗，37℃30min；洗滌3次后，加入DAB底物，37℃10min，終止反應(yīng)。酶聯(lián)儀于490nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結(jié)果以雙復(fù)孔A值均值表示。以待測標本A值/陰性對照A值＞2為陽性標準，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為該樣本中抗體滴度。
1.10.5免疫小鼠的攻毒保護性實驗對每組剩下5只C57BL/6鼠免疫三次后間隔8周攻毒，攻毒注射部位為小鼠尾靜脈，注射劑量為1×106CFU，攻毒株為H37Rv。攻毒后8周殺死小鼠，將肺臟、脾臟勻漿稀釋接種到固體羅氏培養(yǎng)基上，四周后活菌計數(shù)。
2結(jié)果2.1表位預(yù)測及多肽合成結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，選擇以下肽序列進行合成。合成的多肽經(jīng)質(zhì)譜鑒定，純度經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)分析均大于95％。
Rv0309VLAPVSLAV(SEQ ID NO1)RLLALLCAAV(SEQ ID NO2)SLAVVNPWFA(SEQ ID NO3)VLAPVSLAVV(SEQ ID NO4)Rv0173KLILTQPFDV(SEQ ID NO5)FLGKLDTFT(SEQ ID NO6)VLLVLALLL(SEQ ID NO7)RVMVADVWV(SEQ ID NO8)YLVGALKLI(SEQ ID NO9)RLSQSADQYL(SEQ ID NO10)Rv0129cGLPVEYLQV(SEQ ID NO11)
FLTREMPAWL(SEQ ID NO12)Rv3804cAIYGPQQFV(SEQ ID NO13)KLIANNTRV(SEQ ID NO14)GLPVEYLQV(SEQ ID NO15)2.2抗原肽親和力及穩(wěn)定性分析結(jié)果99％培養(yǎng)的T2細胞都表達HLA-A*0201分子，但平均熒光強度較弱。上述合成的抗原肽與HLA-A*0201結(jié)合活性見表1。經(jīng)抗原肽1-15處理后的細胞平均熒光強度出現(xiàn)升高，其中以抗原肽2和14升高最為明顯。T2細胞平均熒光強度經(jīng)抗原肽處理后的增長倍數(shù)＝抗原肽處理后的平均熒光強度/無抗原肽的平均熒光強度，以抗原肽14處理的最高，抗原肽15其次?？乖呐cHLA-A*0201分子結(jié)合的穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，抗原肽與T2細胞上的HLA-A*0201分子結(jié)合后，抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15能使T2細胞HLA-A*0201分子表達穩(wěn)定上調(diào)(見圖1)。根據(jù)結(jié)合力和穩(wěn)定性結(jié)果，選擇抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15繼續(xù)下游實驗。
表1抗原肽刺激后的T2細胞HLA-A*0201平均熒光強度


2.3抗原肽刺激細胞增殖以細胞增殖反應(yīng)評價抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14和15在結(jié)核病患者PBMC中誘導(dǎo)抗原特異性CTL的能力，進一步鑒定其是否為特異性細胞表位。其中，HLA-A*0201陽性結(jié)核病患者100例，HLA-A*0201陰性結(jié)核病患者100例，100例HLA-A*0201陽性其他慢性肺病患者為疾病對照組，100例HLA-A*0201陽性健康志愿者為正常對照組。設(shè)以刺激系數(shù)(SI)＞3為增殖反應(yīng)陽性。結(jié)果表明，結(jié)核病患者(HLA-A*0201陽性和陰性患者)PBMC對抗原肽2、5、10、12、14和15均產(chǎn)生較強的陽性增殖反應(yīng)，而在疾病對照組和健康對照組未出現(xiàn)顯著的增殖反應(yīng)(見圖2)。
2.4抗原肽誘導(dǎo)CTL殺傷毒性以負載抗原肽的T2細胞為靶細胞，抗原肽誘導(dǎo)的CD8+CTL為效應(yīng)細胞，效靶比(E/T)為20∶1，經(jīng)時間分辨熒光DELFIA EUTDA細胞毒性試驗分析結(jié)核桿菌抗原肽誘導(dǎo)的CTL細胞毒活性。結(jié)果表明，經(jīng)抗原肽2、5、10、12、14和15刺激的CD8+CTL為效應(yīng)細胞具有較強的細胞毒活性(見圖3)。
2.5小鼠抗體滴度的動態(tài)測定首次免疫后2周始，取血1次/周，分離血清，以結(jié)核抗原肽為包被抗原，ELISA間接法測定特異性抗體滴度，首次免疫3周后即可檢出特異性抗體，抗體滴度在測定時間內(nèi)，抗體滴度逐漸增高，首次免疫后8周，抗體滴度達最高1∶64?？贵w滴度隨免疫次數(shù)和時間升高，而陰性對照組未檢測到抗體(見圖4)。
2.6疫苗對免疫鼠的保護效果分析以攻毒8周后的小鼠為實驗材料，研究了各疫苗誘導(dǎo)的保護效力。實驗表明，各免疫組小鼠肺臟和脾臟的細菌數(shù)顯著減少。其保護效率如表2。
表2疫苗誘導(dǎo)的保護性應(yīng)答能力

*保護率的計算方法為陰性組細菌數(shù)對數(shù)值減去疫苗或BCG組的細菌數(shù)的對數(shù)值而得到。數(shù)值越大保護效率越高。
3結(jié)論綜合應(yīng)用基因組序列、生物信息學(xué)、功能基因組學(xué)和免疫學(xué)研究，結(jié)果證實，以下抗原表位的分子模擬肽，可以激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)
1.RLLALLCAAV(SEQ ID NO2)，模擬來源Rv0309aa.3～12；2.KLILTQPFDV(SEQ ID NO5)，模擬來源Rv0173aa.302～311；3.RLSQSADQYL(SEQ ID NO10)，模擬來源Rv0173aa.260～269；4.FLTREMPAWL(SEQ ID NO12)，模擬來源Rv0129caa.144～153；5.KLIANNTRV(SEQ ID NO14)，模擬來源Rv3804caa.242～250；6.GLPVEYLQV(SEQ ID NO15)，模擬來源Rv3804caa.48～56。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位及其用途<130>說明書，權(quán)利要求書<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>1Val Leu Ala Pro Val Ser Leu Ala Val1 5<210>2<211>10
<212>PRT<213>人工序列<400>2Arg Leu Leu Ala Leu Leu Cys Ala Ala Val1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>3Ser Leu Ala Val Val Asn Pro Trp Phe Ala1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>人工序列
<400>4Val Leu Ala Pro Val Ser Leu Ala Val Val1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>5Lys Leu Ile Leu Thr Gln Pro Phe Asp Val1 5 10<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>6Phe Leu Gly Lys Leu Asp Thr Phe Thr1 5
<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>7Val Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>8Arg Val Met Val Ala Asp Val Trp Val1 5<210>9<211>9
<212>PRT<213>人工序列<400>9Tyr Leu Val Gly Ala Leu Lys Leu Ile1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>10Arg Leu Ser Gln Ser Ala Asp Gln Tyr Leu1 5 10<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列
<400>11Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val1 5<210>12<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>12Phe Leu Thr Arg Glu Met Pro Ala Trp Leu1 5 10<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>13
Ala Ile Tyr Gly Pro Gln Gln Phe Val1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>14Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>15Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val1 權(quán)利要求
1.能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，其特征在于，所述肽含有選自以下的氨基酸序列RLLALLCAAV(SEQ ID NO2)，KLILTQPFDV(SEQ ID NO5)，RLSQSADQYL(SEQ ID NO10)，F(xiàn)LTREMPAWL(SEQ ID NO12)，KLIANNTRV(SEQ ID NO14)，GLPVEYLQV(SEQ ID NO15)。
2.能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽的篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟I表位預(yù)測和分子模擬肽合成應(yīng)用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI對結(jié)核桿菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173進行HLA-A*0201限制性CTL表位預(yù)測，以F-moc化學(xué)法合成上述預(yù)測得到的分子模擬肽；II上述分子模擬肽經(jīng)親和力分析、穩(wěn)定性分析、細胞增殖實驗、細胞活性檢測和特異性抗體檢測，篩選出親和力強、穩(wěn)定性好、能產(chǎn)生較強增殖反應(yīng)、具有較強細胞毒活性和免疫后能產(chǎn)生特異性抗體的分子模擬肽。
3.如權(quán)利要求1所述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備免疫原、免疫動物、或產(chǎn)生免疫保護上的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗上的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽在制備多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗上的用途，其特征在于，該多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗含有分子模擬肽SEQ ID NO2，5，10，12，14，15中一個或多個直接或間接地連接而成的肽段。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，近年來結(jié)核病在全球范圍內(nèi)又死灰復(fù)燃，由于耐藥菌株的出現(xiàn)，抗生素治療常常無效；常用的結(jié)核疫苗——卡介苗也具有局限性。本發(fā)明的目的是篩選出能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，研究結(jié)核病的保護性免疫反應(yīng)機制，進一步開發(fā)出新型的多聯(lián)多聚表位結(jié)核疫苗。本發(fā)明提供了一種能激發(fā)人體抗結(jié)核桿菌的保護性免疫反應(yīng)的抗原表位的分子模擬肽，所述肽含有選自SEQ ID NO2，5，10，12，14，15的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了上述肽的篩選方法和用途。本發(fā)明將更有效地預(yù)防和控制結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展。
文檔編號A61P31/00GK1858059SQ20061002731
公開日2006年11月8日 申請日期2006年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者鄧安梅, 仲人前, 婁加陶, 吳傳勇, 陳孫孝, 周曄, 陳燕, 陳波, 錢琤, 蔣廷旺 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)