專利名稱：破壞brca2－rad51相互作用的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是涉及哺乳動物中DNA修復(fù)的組合物和方法，尤其是它們涉及RAD51和BRCA2。
背景技術(shù)：
認(rèn)為DNA雙鏈破壞是由放射和/或暴露于交聯(lián)藥物(例如，順鉑、絲裂霉素、阿霉素、博萊霉素等)引起的主要致命損傷。通常，雙鏈破壞導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程的停止和細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制的激活，且DNA修復(fù)的失敗通常導(dǎo)致基因組異常，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
在這些機(jī)制中，同源重組顯著地有助于DNA損傷尤其是雙鏈破壞的修復(fù)。同源重組涉及幾個基因并包括BRCA1、BRCA2、RAD51、XRCC2和XRCC3。在這些基因突變的情況中，細(xì)胞經(jīng)常呈現(xiàn)出高水平的基因組不穩(wěn)定性和對放射和/或交聯(lián)劑的超敏性。另一方面，在許多癌細(xì)胞中，尤其是基因組不穩(wěn)定的那些，觀察到了升高的同源重組比率。在這些癌細(xì)胞中，觀察到升高的野生型RAD51表達(dá)水平，這看來似乎表明了RAD51(其還涉及維持基因組穩(wěn)定性)還可以引起癌細(xì)胞對DNA-損傷放療或化療的抵抗力。
RAD51是真核重組酶并與E.coli RecA蛋白同源。RAD51具有ATP-依賴性DNA結(jié)合活性，在單鏈DNA上聚合(multimerize)成核蛋白細(xì)絲，并報(bào)道了能在體外催化同源DNA配對和鏈交換反應(yīng)。用放射和/或DNA損傷劑處理細(xì)胞后，可以在DNA損傷的部位觀察到大量的RAD51-焦點(diǎn)，這可以進(jìn)一步包括與同源重組相關(guān)的其它蛋白質(zhì)(例如，BRCA1、Rad54、BLM和RPA)，尤其是BRCA2。
基于家族性乳癌的各種研究將BRCA2鑒定為乳房腫瘤抑制因子，且BRCA2缺陷的特征通常在于累積的染色體異常，包括染色體破壞、異常的有絲分裂交換和非整倍體。最近已經(jīng)證明了染色體破壞的同源定向修復(fù)也需要BRCA2。與其在DNA修復(fù)中的牽連相一致，缺乏BRCA2的小鼠胚胎呈現(xiàn)出放射超敏性，這也是缺乏RAD51的小鼠胚胎的特征。
首先通過鑒定它與RAD51的相互作用來揭示DNA修復(fù)中BRCA2的可能作用。已經(jīng)顯示出RAD51和BRCA2之間的相互作用涉及六個高度保守的BRC重復(fù)，且BRCA2的BRC重復(fù)和RAD51之間的相互作用對于對由甲基甲烷磺酸鹽引起的DNA損傷的細(xì)胞應(yīng)答是關(guān)鍵的。在這些支持中，在BRCA2-缺陷細(xì)胞中和使用BRC肽破壞BRCA2和RAD51之間相互作用的細(xì)胞中減少了放射誘導(dǎo)的RAD51焦點(diǎn)形成的發(fā)現(xiàn)中反映出這樣的臨界性。此外，在過量BRC肽存在下在體外特異性地消除RAD51-DNA結(jié)合能力，以及破壞了RAD51核蛋白細(xì)絲形成。
因此，盡管大量數(shù)據(jù)似乎突出了BRCA2/RAD51相互作用在DNA修復(fù)中的重要性，但選擇性干擾這樣相互作用的作為BRCA2-相關(guān)癌癥治療形態(tài)的有效策略是難以捉摸的。因此，仍然需要干擾DNA修復(fù)中BRCA2/RAD51相互作用的組合物和方法，尤其是在腫瘤疾病的治療和化學(xué)預(yù)防的范圍中。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及組合物和方法，其中化合物干擾，更通常地破壞或防止BRCA2/RAD51相互作用，和/或RAD51聚合。通常，這樣的干擾將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對DNA損傷提高的敏感性，和非腫瘤細(xì)胞不能從G1期繼續(xù)到S-期。
本發(fā)明主題的一方面中，藥物組合物包括藥物學(xué)上可接受的載體和根據(jù)通式1的化合物
通式1其中R是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷芳基和 的基團(tuán)，其中Y不存在或者是具有1至4個碳原子的亞烷基(和其中通式1的R與亞烷基共價結(jié)合，或在Y不存在情況中，通式1的R與包括Z的環(huán)的任何一個原子共價結(jié)合)；Q是N或C-R2；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；R’和R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、?；被?、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；其中n為0至4，包括0和4，其中*表示R或S構(gòu)型。更具體地，R1至R11是H，X是NR14，且R是
在這樣的化合物中，尤其優(yōu)選Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。因此，特別優(yōu)選的化合物包括根據(jù)通式2和通式3的那些 通式2 通式3進(jìn)一步考慮在這樣的組合物中，(a)當(dāng)細(xì)胞暴露于化合物時，化合物以有效提高腫瘤細(xì)胞對放射和/或DNA-損傷劑敏感性的濃度存在，或(b)當(dāng)BRCA2-RAD51復(fù)合物暴露于化合物時，化合物以有效降低BRCA2與RAD51結(jié)合的濃度存在。在理想的情況中，所考慮的化合物可以進(jìn)一步包括一種或多種DNA-損傷劑?；蛘撸€考慮了當(dāng)細(xì)胞接觸化合物時，化合物以有效停滯細(xì)胞(更常見是非腫瘤細(xì)胞)于G1期的濃度存在組合物中。在這樣的情況中，考慮將化合物以有效降低植入裝置附近大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞增殖的濃度結(jié)合可植入的裝置(例如，血管內(nèi)支架)。
因此，本發(fā)明主題的另一方面中，涉及處理腫瘤細(xì)胞的方法，其中當(dāng)腫瘤細(xì)胞暴露于化合物時，將腫瘤細(xì)胞接觸有效提高腫瘤細(xì)胞對放射和/或DNA-損傷劑敏感性濃度(例如，1μM至100μM)的所涉及化合物。在該方法進(jìn)一步的步驟中，然后可以將腫瘤細(xì)胞暴露于放射(例如，γ放射或UV-C放射)和/或DNA損傷劑(例如，烷化劑或交聯(lián)劑)。通常，優(yōu)選的腫瘤細(xì)胞包括乳癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞。
本發(fā)明主題的再進(jìn)一步的方面，停止非腫瘤細(xì)胞于G1期的方法包括其中將細(xì)胞接觸所涉及化合物、其前藥或代謝物的步驟，且其中這樣的化合物以有效停滯非腫瘤細(xì)胞于G-期的濃度存在。更優(yōu)選，這樣的方法將進(jìn)一步包括在接觸步驟后將非腫瘤細(xì)胞暴露于DNA-損傷劑的步驟，其中在與沒有使用接觸步驟獲得的DNA損傷相比較減少細(xì)胞DNA損傷的條件下進(jìn)行接觸步驟。如上，合適的DNA損傷條件是，特別是，放射(例如，γ-放射或UV-C)和/或暴露于DNA損傷劑(例如，順鉑、絲裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和博萊霉素)。在理想的情況中，還可以進(jìn)行接觸細(xì)胞的步驟使得細(xì)胞接觸結(jié)合了化合物的植入裝置。
本發(fā)明的各種目的、特征和方面將從以下本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述變得更清楚。
附圖簡述

圖1A是示例反向酵母雙雜交篩選系統(tǒng)的示意圖。
圖1B是使用圖1A的反向酵母雙雜交篩選系統(tǒng)的培養(yǎng)平板的照片。
圖1C描繪了使用反向酵母雙雜交篩選系統(tǒng)鑒定的選定化合物的示例結(jié)構(gòu)。
圖1D左圖描繪了BRC4-Rad51復(fù)合物的計(jì)算機(jī)模擬，右圖為IBR2-Rad51復(fù)合物的計(jì)算機(jī)模擬。
圖1E描繪了IBR2與BRC4和RAD51寡聚基序的結(jié)構(gòu)排列的計(jì)算機(jī)模擬。
圖1F是顯微照片，描繪了使用所涉及的化合物處理的細(xì)胞對對照中Rad51焦點(diǎn)的減少。
圖1G描繪了所測試的化合物的示例結(jié)構(gòu)及其在酵母篩選測定中的活性。
圖2A和2C是測定IBR2結(jié)合伴侶的表面等離子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)的圖示。
圖2B和2D是描繪了選定的表面等離子共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。
圖2E是IBR2介導(dǎo)的Rad51多聚體解離的點(diǎn)印跡分析，如通過凝膠過濾所分析的。
圖2F是描繪了Rad51-BRC1重復(fù)結(jié)合的抑制的圖，以用于IC50測定的溶液競爭形式使用SPR。
圖3A是系列圖，描繪了IBR2對乳房上皮細(xì)胞系(MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、SKBR3和MDA-MB-435)生長的作用。
圖3B是描繪了各種劑量的IBR2對帶有人乳房癌異種移植物(MDA-MB-468)裸鼠的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖。
圖3C是描繪了圖3B實(shí)驗(yàn)中所用動物的體重的圖。
圖3D是描繪了IBR2對各種細(xì)胞系的IC50值的圖。
圖3E是描繪了使用各種濃度IBR2的各種癌細(xì)胞系增殖的圖。
圖4A是列出了通過FACS對20μM IBR2或DMSO孵育細(xì)胞的細(xì)胞周期分布結(jié)果的表。
圖4B是描繪了用IBR2處理的BrdU陽性細(xì)胞百分比的圖。
圖4C-4E是描繪了BrdU吸收(C)、有絲分裂指數(shù)(排除前期)(D)和用IBR2處理的BrdU陽性細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)目(E)的圖。
圖4F和4G是描繪IBR2處理過細(xì)胞的蛋白質(zhì)特征的蛋白質(zhì)印跡。
圖4H是表示圖4G實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。
圖5A是IBR2處理過的超表達(dá)外源Rad51來拯救S-期進(jìn)入的MCF-7細(xì)胞的顯微照片。
圖5B是描繪以總GFP表達(dá)細(xì)胞的分?jǐn)?shù)來表示的BrdU陽性細(xì)胞的圖。
圖5C是描繪Rad51表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡。
圖5D是描繪選定細(xì)胞系的相對敏感性的圖。
圖5E描繪了選定的細(xì)胞系中剩余的Rad51量。
圖5F描繪了在選定的處理?xiàng)l件下MCF-7細(xì)胞中具有Rad51焦點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)。
圖5G描繪了在選定的處理?xiàng)l件下MCF-7細(xì)胞中具有H2AX焦點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)。
圖5H至5J是描繪了所涉及的化合物和選定化療劑的協(xié)同效果的圖。
圖5K是描繪了γ-放射后MCF-7細(xì)胞克隆發(fā)生存活的圖。
詳述DNA損傷劑和放射對于晚期轉(zhuǎn)移性癌癥是其中最廣泛使用的療法，通常在根除至少部分腫瘤細(xì)胞中是有效的。不幸地，腫瘤細(xì)胞還使用各種機(jī)制來修復(fù)因此誘導(dǎo)的DNA損傷。在修復(fù)機(jī)制中，本發(fā)明人已經(jīng)在對DNA損傷劑和放射的癌癥抵抗力中暗示了BRCA2-介導(dǎo)的修復(fù)。
BRCA2通過其BRC重復(fù)結(jié)合RAD51，且這種相互作用似乎對于DNA修復(fù)是關(guān)鍵的。本發(fā)明人現(xiàn)在考慮可以制備小分子來破壞BRC重復(fù)和RAD51之間的相互作用，因此降低影響以至消除最基本的無誤差DNA修復(fù)機(jī)制中的一種，因此使得癌細(xì)胞對放射或DNA-損傷化療更敏感。
最近解決了BRC4-RAD51復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，其中BRC重復(fù)模擬RAD51寡聚基序。因此，最近表明了BRCA2對RAD51-介導(dǎo)的同源重組起控制作用。還知道BRCA2含有三個寡核苷酸-結(jié)合(OB)折疊和螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋(HTH)基序?；谶@些觀察和其他因素，本發(fā)明人考慮當(dāng)DNA損傷發(fā)生時，BRCA2將識別ssDNA/dsDNA連接，然后結(jié)合的BRCA2的BRC重復(fù)將RAD51帶至損傷部位，其然后在ssDNA上形成核蛋白細(xì)絲，導(dǎo)致RND51焦點(diǎn)的形成，因此能夠進(jìn)行隨后的同源重組過程。因此，本發(fā)明人考慮理想的是產(chǎn)生干擾(即，降低)以至阻斷BRCA2-RAD51復(fù)合物形成的分子，因此使BRCA2-完整(非突變的)乳癌細(xì)胞對放射和其他DNA損傷劑的作用敏感。
本發(fā)明人目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過將BRCA2-RAD51復(fù)合物暴露于特定的分子和包括這些分子的組合物，可以破壞以至完全抑制BRCA2-RAD51復(fù)合和/或復(fù)合物形成。此外，還證明了這些分子干擾RAD51聚合的能力。
因此，通?？紤]通過給藥這樣的分子可以改變與BRCA2-RAD51復(fù)合物形成和/或RAD51聚合相關(guān)的疾病和所有過程。在所考慮的過程和疾病中，特別考慮到根據(jù)本發(fā)明主題的化合物和組合物可以用來(a)使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的作用敏感，(b)通過破壞細(xì)胞分裂來干擾腫瘤細(xì)胞的生長，(c)通過將細(xì)胞停止于G1期來保護(hù)非腫瘤細(xì)胞免受化療藥物的作用，和(d)降低其他刺激細(xì)胞生長的環(huán)境中細(xì)胞(通常是非腫瘤細(xì)胞)的增殖。
所考慮的化合物和組合物通?？紤]到所有分子適于防止、降低或另外破壞BRCA2-RAD51復(fù)合物的形成或存在。因此，在多種其他分子中，考慮了肽(例如，BRC重復(fù)及其類似物、抗體或其他高特異性/親和性結(jié)合肽等)和小分子藥物(例如，源自可購得的化合物文庫)及其衍生物，包括前藥和代謝物。然而，特別考慮的分子包括根據(jù)以下通式1的那些 通式1其中R是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷芳基(其中每個可以由R1取代并可以進(jìn)一步包括雜原子，如N、S、O、Se或O)，和 的基團(tuán)，其中Y不存在或者是具有1至4個碳原子的亞烷基(和其中通式1的R與亞烷基共價結(jié)合，或在Y不存在的情況中，通式1的R與包括Z的環(huán)的任何一個原子共價結(jié)合)；Q是N或C-R2；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H，或任選取代的烷基、芳基、芳烷基或?；?；X選自CH2、O、S或NR14，R14獨(dú)立地如上所定義；R’和R1至R13獨(dú)立地是任選取代的并選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；其中n為0至4，包括0和4。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到考慮了所有異構(gòu)形式(例如，非對映體、對映體、互變異構(gòu)體等)及其混合物。例如，在所考慮的分子具有手性中心(例如，通式1中的C*)的情況中，在此特別地考慮R和S構(gòu)型及其組合。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到通式1中的每一個芳香環(huán)系統(tǒng)(異喹啉、吲哚和苯環(huán))可以進(jìn)一步包括一個或多個雜原子，或可以進(jìn)一步與另一個(任選芳族)環(huán)系統(tǒng)稠合。
更進(jìn)一步優(yōu)選的化合物將具有根據(jù)通式1的結(jié)構(gòu)，其中R1至R11是H，其中X是NR14，且其中R是 且最優(yōu)選就是以上那些化合物，其中Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。因此，特別考慮的化合物包括各種取代的和未取代的苯基磺酰吲哚異喹啉，尤其是具有根據(jù)以下通式2和3結(jié)構(gòu)的那些 通式2通式3如在此所用的，術(shù)語“鹵素”指的是氟、溴、氯或碘，其通常與另一個原子(例如，碳)共價結(jié)合。如在此進(jìn)一步所用的，術(shù)語“羥基”指的是-OH基團(tuán)。如在此更進(jìn)一步所用的，術(shù)語“羰基原子”指的是與三個原子共價連接的碳原子，其中三個原子之一通過雙鍵結(jié)合碳原子(其可以是部分非定域的)。因此，特別考慮的羰基原子包括氨甲酰基團(tuán)、甲脒基團(tuán)和硫代氨甲酰基團(tuán)中的碳原子。
如在此所用的術(shù)語“烷基”指的是環(huán)狀、支鏈或直鏈烴，其中所有的碳-碳鍵是單鍵，且術(shù)語“低級烷基”指的是一至十個碳原子的環(huán)狀、支鏈或直鏈烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁級、異丁基(或2-甲丙基)、環(huán)丙甲基、異戊基、正戊基、己基等)。如在此所用的術(shù)語“亞烷基”指的是比相應(yīng)烷烴少兩個氫原子的烷基(即，CnH2n)。例如，合適的亞烷基包括亞甲基、亞乙基、亞丙基等。如在此所用的術(shù)語“環(huán)烷基”指的是含有3至15個碳的環(huán)狀或多環(huán)狀烷基。對于多環(huán)基團(tuán)，這些可以是多個稠合的環(huán)，其中遠(yuǎn)端環(huán)之一可以是芳香族的(例如，茚滿基、四氫萘等)。如在此所用的術(shù)語“烷芳基”指的是共價結(jié)合芳基部分的烷基。例如，根據(jù)在此提供的定義，將芐基認(rèn)為是烷芳基。
相似地，如在此所用的術(shù)語“烯基”指的是其中至少一個碳-碳鍵是雙鍵的烷基。因此，術(shù)語“低級烯基”包括所有具有一至十個碳原子的烯基。如在此所用的術(shù)語“環(huán)烯基”指的是含有3至15個碳和至少一個雙鍵的環(huán)狀或多環(huán)狀基團(tuán)。同樣地，如在此所用的術(shù)語“炔基”指的是其中至少一個碳-碳鍵是三鍵的烷基或烯基。因此，術(shù)語“低級炔基”包括具有一至十個碳原子的炔基。
如在此更進(jìn)一步所用的，術(shù)語“烷氧基”指的是-OR基團(tuán)，其中R是低級烷基、取代的低級烷基、?；⒎蓟?、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)雜烷基或取代的環(huán)雜烷基。相似地，術(shù)語“芳氧基”指的是-OAr基團(tuán)，其中Ar是芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基。
此外，術(shù)語“芳基”指的是具有至少一個芳香族環(huán)(例如，苯基或二苯基)或多個稠合環(huán)的芳香族碳環(huán)基團(tuán)，其中至少一個環(huán)是芳香族的，(例如，1，2，3，4-四氫萘、萘、蒽或菲基)。如在此所用的術(shù)語“雜原子”指的是碳以外的原子(例如，S、O或N)，其可以任選地由例如氫、鹵素、低級烷基、烷氧基、低級烷硫基、三氟甲基、氨基、胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、烷硫基、巰基、磺氨基等取代。
再進(jìn)一步，如在此所用的術(shù)語“取代的”意思是共價結(jié)合基團(tuán)或原子(或游離電子對或原子雙鍵的電子對)的氫原子由共價結(jié)合的非氫取代基替代，取代基包括羥基、巰基、烷硫基、鹵素、烷氧基、氨基、胺基、硝基、羧基、環(huán)烷基、雜環(huán)、環(huán)雜烷基、?；?、羧基、芳基、芳氧基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基、烯基、炔基和氰基。
如在此所用的術(shù)語“前藥”指的是所考慮化合物的改變，其中改變的化合物呈現(xiàn)出較低的藥物活性(與改變的化合物相比較)，和其中改變的化合物在目標(biāo)細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)或目標(biāo)器官(例如，卵巢)中轉(zhuǎn)變回改變的形式。例如，在活性藥物對于安全的全身給藥毒性太大的情況中，或在所考慮的化合物在消化道或其他區(qū)隔或細(xì)胞中吸收差的情況中，或在達(dá)到目標(biāo)之前身體降解所考慮的化合物的情況中，所考慮的化合物轉(zhuǎn)化成前藥可能是有用的。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到可以以多種方式來改變根據(jù)本發(fā)明主題的化合物，尤其優(yōu)選的改變包括提高一種或多種藥物代謝動力學(xué)和/或藥物動力學(xué)參數(shù)的那些。例如，可以添加或替換一個或多個取代基來獲得血清中較高的AUC。另一方面，尤其是在需要提高的穩(wěn)定性的情況中，可以添加親水性基團(tuán)。用于將所考慮的化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的前藥形式的合適示例方案可以在“Prodrugs(Drugs and the Pharmaceutical Sciencesa Series ofTextbooks and Monographs)”(前藥(藥物和藥物科學(xué)系列教科書和論文)中找到，Kenneth B.Sloan(ISBN0824786297)，和“Hydrolysisin Drug and Prodrug MetabolismChemistry，Biochemistry，andEnzymology”(藥物和前藥代謝中的水解化學(xué)、生物化學(xué)和酶學(xué))，Bernard Testa，Joachim M.Mayer(ISBN390639025X)，在此將兩篇都引入作為參考。更進(jìn)一步，尤其在化合物代謝(例如，羥基化、葡糖苷酸化等)時，所考慮的化合物具有較高活性的情況中，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到在此還專門考慮了所考慮化合物的代謝物。
根據(jù)特定的目的，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到可以將所考慮的化合物混合(在體內(nèi)或藥物制劑或給藥方案中)至少一種其他的藥物學(xué)上的活性成分，尤其是所考慮的其他成分包括DNA損傷劑、抑制細(xì)胞生長和/或細(xì)胞毒性藥物、抗代謝物、核苷酸類似物等。例如，合適的試劑包括烷化劑和/或交聯(lián)劑，如順鉑、絲裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和/或博萊霉素。第二種藥物學(xué)活性成分的濃度是通常標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)給藥推薦的那些，然而，認(rèn)為較低(而在一些情況中較高)的濃度也適用于在此的用途。
因此，所考慮的藥物組合物尤其將包括其中和合適的載體一起提供所考慮的化合物(和另外的藥物活性成分)的那些，其中所考慮的化合物優(yōu)選在細(xì)胞暴露于化合物時，以有效提高腫瘤細(xì)胞對放射(例如，UV-C放射和/或γ放射)或DNA損傷劑(例如，交聯(lián)劑或烷化劑)敏感性的濃度存在。在進(jìn)一步優(yōu)選的組合物中，還考慮當(dāng)BECA2、RAD51和/或BRCA2-RAD51復(fù)合物暴露于化合物時，化合物以有效降低或防止BRCA2與RAD51結(jié)合的濃度存在。當(dāng)所考慮的組合物是用來至少暫時停滯細(xì)胞周期中的細(xì)胞時，優(yōu)選當(dāng)細(xì)胞接觸化合物時，化合物以有效停止(通常是非腫瘤)細(xì)胞于G1期的濃度存在。因此，可以選擇濃度使得它們以有效降低細(xì)胞(例如，結(jié)合了化合物的植入裝置附近的細(xì)胞，特別包括血管內(nèi)支架附近的親密接觸的細(xì)胞)的細(xì)胞增殖的濃度存在。
根據(jù)特定的用途和結(jié)構(gòu)，因此考慮到根據(jù)本發(fā)明主題的化合物以每單個劑量單位1微克至1000毫克的含量存在于組合物中，更常見為10微克至500毫克，最常見為50微克至500毫克。因此，所考慮的化合物在體內(nèi)或體外的優(yōu)選濃度通常為0.1nM至500微M，更常見為50nM至400微M，最常見為100nM至200微M。
此外，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到認(rèn)為所有制劑適于在此的用途，尤其是包括口服制劑和非腸道制劑。例如，對于口服給藥，所考慮的組合物可以是片劑、膠囊、懸浮液或液體的形式。優(yōu)選以含有特定含量活性成分的劑量單位形式來制得藥物組合物。這樣劑量單位的實(shí)例是片劑或膠囊。還可以作為組合物通過注射來給藥活性成分，其中例如，鹽水、葡萄糖或水可以用作合適的載體。
給藥的治療活性化合物的含量和使用本發(fā)明的化合物和/或組合物治療病癥的劑量方案取決于各種因素，包括患者的年齡、體重、性別和醫(yī)療條件、疾病的嚴(yán)重程度、給藥的途徑和頻率，以及所使用的特定化合物，因此可以廣泛地改變。然而，以上提供了尤其合適的含量，因此可以允許約0.001(以至更低)至100mg/kg體重的每日劑量，優(yōu)選0.01至約50mg/kg體重，和最優(yōu)選約0.1至20mg/kg體重。通常，日劑量可以給藥每天一至四劑。
對于治療或預(yù)防的目的，所考慮的化合物通常與一種或多種適于所確定給藥途徑的佐劑混合。如果口服給藥，可以將化合物與乳糖、蔗糖、淀粉、鏈烷酸的纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、藻朊酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后成片劑或膠囊，用于常規(guī)給藥。這樣的膠囊或片劑可以含有受控釋放的制劑，如可以以活性化合物在羥丙甲基纖維素中的分散體來提供。用于非腸道給藥的制劑可以是含水或非含水等滲無菌注射液或懸浮液的形式?？梢詮木哂幸环N或多種提及的用于口服給藥制劑中的載體或稀釋劑的無菌粉末或顆粒制得這些溶液和懸浮液?？梢詫⒒衔锶芙庥谒?、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化鈉和/或各種緩沖劑中。其他佐劑和給藥方式是制藥領(lǐng)域公知的。
所考慮的用途通?？紤]的是可以使用根據(jù)本發(fā)明主題的化合物和組合物來影響任何與BRCA2-RAD51相互作用相關(guān)的病癥和/或疾病。因此，特別考慮的病癥和疾病包括其中需要給予細(xì)胞對放射和/或DNA損傷劑敏感性和/或其中細(xì)胞分裂應(yīng)答刺激而調(diào)節(jié)失調(diào)或轉(zhuǎn)化成腫瘤表型的那些。其他優(yōu)選的情況包括其中暫時停滯細(xì)胞生長的那些。
例如，在所考慮的化合物和組合物在化療中特別有用的情況下，其中這樣的化合物和組合物給予腫瘤細(xì)胞對DNA損傷劑和/或放射更敏感。因此，可以降低這種治療中化療劑的劑量和/或提高殺傷率。另一方面，所考慮的化合物還將非腫瘤細(xì)胞停止于G1期，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到這樣的化合物可以作為暫時停滯細(xì)胞生長的化學(xué)預(yù)防劑來給藥，并因此保護(hù)非腫瘤細(xì)胞免受其他由化療劑誘導(dǎo)的損傷。此外，還可以將細(xì)胞周期停止用于植入裝置中(例如，血管內(nèi)支架)來降低再狹窄的發(fā)生和/或嚴(yán)重程度。在這樣的方法中，考慮到可以將根據(jù)本發(fā)明主題的化合物涂覆在植入的裝置上。當(dāng)然，認(rèn)為將這樣的化合物結(jié)合在植入裝置中的各種可替換方式也是合適的并包括共價連接支架或釋放結(jié)合裝置的部分，摻入生物可侵蝕或生物可降解材料中等。
因此，以及從分子透視看到的，所考慮的方法將使用干擾BRCA2-Rad51相互作用的化合物，結(jié)合順鉑時，作為治療活性分子來抑制放射誘導(dǎo)的RAD51焦點(diǎn)，促進(jìn)抑制細(xì)胞生長，提供細(xì)胞死亡的協(xié)同誘導(dǎo)，和/或?qū)⑦@樣處理過的細(xì)胞(最常見是癌細(xì)胞)停止于G1期。因?yàn)樗紤]的化合物可以抑制BRC重復(fù)與RAD51的結(jié)合，它們還可以用來防止或降低Rad51聚合，這最終將導(dǎo)致BRCA2和RAD51的降解。因此，合適的方法包括其中細(xì)胞中的BRCA2和RAD51降解將產(chǎn)生所需結(jié)果的所有方法。
示例化合物的合成應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到各種所考慮化合物的合成將按照如下所列出的一般方案，其中通過化合物的三個部分的直接反應(yīng)來制備化合物。例如，合適的反應(yīng)將包括(a)任選取代的和受保護(hù)的(在適當(dāng)?shù)那闆r中)異喹啉，(b)任選取代的和受保護(hù)的(在適當(dāng)?shù)那闆r中)α-芐基磺酰氯或α-苯基-磺酰氯，和(c)任選取代和受保護(hù)的(在適當(dāng)?shù)那闆r中)吲哚，其中按照以下反應(yīng)方案1中示例性列出的來化合每個部分。
實(shí)施例1 反應(yīng)方案12-(芐基磺?；?-1-(1H-吲哚-3-基)-1，2-二氫異喹啉(IBR2)將異喹啉(10.3g，80mmol)溶解于無水苯(140ml)中。將α-苯基甲基磺酰氯(7.64g，40mmol)分批加入。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。加入吲哚(4.68g，40mmol)并在室溫將反應(yīng)持續(xù)20hr。在反應(yīng)過程中，形成淡顏色的沉淀物。然后收集固體并用甲苯和己烷洗滌(各自50ml)。使用快速色譜(硅膠，100％二氯甲烷)將所得到的粗產(chǎn)物進(jìn)一步純化，產(chǎn)生11.1g(97.5％)淡黃色固體。通過從乙醇(200ml)再結(jié)晶來進(jìn)一步純化產(chǎn)物(6.0g)，獲得白色固體的終產(chǎn)物。
MS(m/e)423.05(m+Na+).1HNMR(500MHz，δ/ppm)4.00(d，1H，J＝13.88Hz)，4.16(d，1H，J＝13.92Hz)，6.06(d，1H，J＝7.53Hz)，6.30(d，1H，J＝7.45Hz)，6.37(s，1H)，6.70(d，1H，J＝2.53Hz)，6.86(d，1H，J＝8.1Hz)，6.91(d，2H，J＝7.78Hz)，7.08(t，2H，J＝7.76Hz)，7.13-7.32(m，7H)，7.96(d，1H，J＝9.02Hz)，8.00(s，br，1H).
實(shí)施例2按照實(shí)施例1的程序，用0.5mmol任選取代的異喹啉和0.25mmolα-苯基甲基磺酰氯處理0.25mmol任選取代的吲哚來產(chǎn)生取代的2-(芐基磺?；?-1-(1H-吲哚-3-基)-1，2-二氫異喹啉，就在下表中顯示了(產(chǎn)量源自單次實(shí)驗(yàn)且不是最佳的)。
實(shí)施例32(芐基磺?；?-1-(7-氮雜-1H-吲哚-3-基)-1，2-二氫異喹啉按照實(shí)施例1的程序，用64.58mg(0.5mmol)異喹啉和47.67mg(0.25mmol)α-苯基甲基磺酰氯處理29.54mg(0.25mmol)7-氮雜吲哚來產(chǎn)生58.95mg(60％產(chǎn)率)的2-(芐基磺?；?-1-(7-氮雜-1H-吲哚-3-基)-1，2-二氫異喹啉。
實(shí)施例42-(芐基磺?；?-1-(7-氮雜-1H-吲哚-3-基)-4-溴-1，2-二氫異喹啉按照實(shí)施例的程序，用104.03mg(0.5mmol)的4-溴異喹啉和47.67mg(0.25mmol)α-苯基甲基磺酰氯處理29.54mg(0.25mmol)7-氮雜吲哚來產(chǎn)生71.98mg(61％產(chǎn)率)的2-(芐基磺?；?-1-(7-氮雜-1H-吲哚-3-基)-4-溴-1，2-二氫異喹啉。
實(shí)驗(yàn)干擾BRCA2-RAD51復(fù)合物的化合物的鑒定為了鑒定能夠抑制BRC-Rad51相互作用的化合物，通過誘導(dǎo)型反向酵母雙雜交方法(Proc Natl Acad Sci USA 94，13396-13401)篩選了24,000種合成化合物的文庫(Nanoscale CombinatorialSynthesis，Inc.Palo Alto，CA)，圖1A中用圖表描繪了這。兩種融合蛋白，TetR-BRC融合蛋白(TetR/NCB，組成型表達(dá))，和Rad51-激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白(在GAL1啟動子下表達(dá)的AD/Rad51)，一起工作來作為帶有TetOp-驅(qū)動的URA3基因的酵母菌株中的轉(zhuǎn)錄激活因子(Proc Natl Acad Sci USA 94，12473-12478)。這兩種融合蛋白之間的相互作用誘導(dǎo)了URA3基因的表達(dá)；然后，來自培養(yǎng)基中5-FOA的毒性代謝物引起了細(xì)胞死亡(Methods Enzymol 154，164-175)。如果所測試的小分子抑制了TetR/BRC/AD/Rad51相互作用，消除URA3表達(dá)并使細(xì)胞生長。圖1B中顯示了來自反向酵母雙雜交篩選的陽性發(fā)現(xiàn)(positive hit)的實(shí)例。在篩選文庫時，發(fā)現(xiàn)十六種化合物在低于10μM的濃度促進(jìn)酵母生長。然后測試這些化合物對MCF-7乳癌細(xì)胞中IR-誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)形成的作用。兩種化合物(IBR1和IBR2，圖1C中描繪了結(jié)構(gòu))顯著地降低了Rad51焦點(diǎn)形成(圖1F)并選擇用于進(jìn)一步的調(diào)查研究。特別地，在該論文中進(jìn)行的大部分實(shí)驗(yàn)中研究了IBR2，其具有比IBR1略強(qiáng)的活性。
顯著地，IBR1和IBR2的分子結(jié)構(gòu)相似。它們都包括三個芳香環(huán)、異喹啉、吲哚和苯環(huán)，這形成了性質(zhì)上非常疏水的化合物。這兩種化合物之間僅有的差異在于連接苯環(huán)和核心結(jié)構(gòu)的亞甲基。結(jié)構(gòu)相似性表明了這些化合物在它們的功能中共享相似的機(jī)理。令人感興趣的，用其他基團(tuán)替代苯環(huán)不能破壞RAD51/BRC相互作用，如通過一些IBR化合物類似物的反向酵母雙雜交篩選所揭示的，這表明了苯環(huán)在結(jié)合其目標(biāo)物中起著作用。在最初的篩選中，還發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)上具有較大取代基的其他IBR類似物不能破壞BRC/Rad51相互作用。圖1G描繪了選定的測試化合物的示例結(jié)構(gòu)。這些和其他結(jié)果表明苯環(huán)在目標(biāo)結(jié)合中起著作用。在吲哚環(huán)的N-位置具有取代基的IBR類似物在克隆發(fā)生測定中失去了活性(數(shù)據(jù)未顯示)，表明NH基團(tuán)可能的結(jié)合作用，可能是通過氫鍵。
結(jié)合機(jī)理的調(diào)查研究BRC重復(fù)具有高度保守的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，(例如，BRC4中的1524-FHTASGK-1530)，其涉及與RAD51的結(jié)合。BRCA2序列1524-FHTA-1527通過抗平行β-鏈配對與RAD51的B3相互作用；在Rad51細(xì)絲形成中也觀察到了相似的結(jié)合模式。重要地，BRC4-RAD51復(fù)合物中BRC4的F1524或人RAD51的F86(等于酵母Rad51中的F144或P.furiosus Rad51中的F97)可以深入地到達(dá)B3和A4之間的疏水口袋，由RAD51的M210、M158、A207、A190、A192、Q206、L203和I160形成。IBR2結(jié)構(gòu)與BRC4發(fā)夾結(jié)構(gòu)和Rad51寡聚基序的仔細(xì)比對表明苯環(huán)可以模擬BRC4的F1524，同時保留的環(huán)系統(tǒng)替代了鄰近的β鏈。IBR2和RAD51的分子入塢還表明了IBR2通過將其苯基延伸至用于BRCA2結(jié)合或寡聚的相同結(jié)合口袋來結(jié)合RAD51(參見圖1D和1E)?；贗BR化合物的苯環(huán)似乎對它們的有效性是必要的觀察，發(fā)明人進(jìn)一步假設(shè)IBR1/2作用機(jī)理的一種可能性是通過模擬BRCA2的F1524并阻斷F1524疏水性口袋的進(jìn)入，因此引起B(yǎng)RCA2/RAD51入塢的失敗。
結(jié)合目標(biāo)的調(diào)查研究發(fā)明人然后研究了所考慮的化合物是否結(jié)合Rad51，而不是結(jié)合BRCA2。為此，使用表面等離子共振(SPR)來直接測定是否Rad51或BRC重復(fù)結(jié)合相同的化合物。替代直接檢測小分子的結(jié)合，這將產(chǎn)生非常弱的信號，使用可替換的方法來檢測蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制。簡而言之，將蛋白之一連接傳感器芯片，并使IBR化合物通過表面。然后，測定第二種蛋白的結(jié)合。如果IBR化合物結(jié)合固定的蛋白質(zhì)，第二種蛋白的結(jié)合將降低，圖2A和2C中用圖表描繪了這。如圖2B和2D中所示的，在IBR化合物預(yù)處理時，固定的Rad51失去了結(jié)合BRC重復(fù)的能力(圖2B)，盡管化合物預(yù)處理沒有影響固定的BRC重復(fù)與Rad51的結(jié)合(圖2D)。這些結(jié)果表明IBR化合物結(jié)合Rad51，而不是結(jié)合BRC重復(fù)。
如果IBR化合物真正地占據(jù)了用于BRCA2中Phe524進(jìn)入的疏水性口袋，Rad51的寡聚也應(yīng)當(dāng)受到影響，因?yàn)樗鼈児蚕硐嗤慕Y(jié)合片段。之前的研究表明顯示BRC重復(fù)可以引起Rad51多聚體的解離。因此，如果IBR2模擬BRC發(fā)夾結(jié)構(gòu)，Rad51聚合也將受到IBR2的抑制。我們比較了用和不用IBR2之間的Rad51的凝膠過濾特征。Rad51呈現(xiàn)出寬的洗脫特征，表示多聚和單體物質(zhì)的存在，和之前所述的一樣。然而，在IBR2存在下，Rad51洗脫特征呈現(xiàn)出與單體分子量相一致的主峰，如圖2E中所示的。這些結(jié)果表明IBR2，和BRC重復(fù)一樣，解離了Rad51多聚體。以溶液競爭形式通過SPR技術(shù)來進(jìn)一步分析Rad51和BRC重復(fù)結(jié)合的抑制，如之前所述的(參見，例如，Science 303，844-848)。如從圖2F可以看到的，IBR2化合物替代了來自與Rad51的復(fù)合物的BRC重復(fù)，具有約115nM的中數(shù)抑制濃度(IC50)值。
基于上述觀察，發(fā)明人考慮IBR化合物的苯環(huán)是否真正地模擬BRC4重復(fù)的Phe1524并到達(dá)結(jié)合口袋，苯基部分的合適大小對活性是關(guān)鍵的。這樣的假設(shè)受到各種實(shí)驗(yàn)的支持，其中發(fā)現(xiàn)當(dāng)苯環(huán)不存在(NS16856)或異喹啉和苯環(huán)之間的連接物太長(NS7786、NS7787、NS7788、NS34240和NS40298)時，這些化合物在反向酵母雙雜交測定中的活性是可忽略的(參見圖1G)。發(fā)明人進(jìn)一步檢測在苯環(huán)的對位具有大取代基(叔-丁基)的IBR2類似物(NS35552)，其已經(jīng)在反向酵母雙雜交測定中顯示出陰性結(jié)果。在NS35552存在下，Rad51仍然能夠形成多聚體，如圖2E中所示的，進(jìn)一步表明了所考慮化合物上的苯環(huán)結(jié)構(gòu)的大小至少在一定程度上對于它們的效果是關(guān)鍵的。
因此，發(fā)明人考慮所考慮的化合物的機(jī)理至少一定程度上基于與Rad51核心結(jié)構(gòu)域上相同結(jié)合口袋的疏水相互作用，來防止BRC重復(fù)的結(jié)合以及破壞Rad51多聚體形成。
所考慮的化合物對各種細(xì)胞和動物模型的生物效果在各種其他生物效果中(數(shù)據(jù)未顯示)，所考慮的化合物，特別是IBR2，阻止了培養(yǎng)物中乳房腫瘤細(xì)胞的生長并顯著降低了裸鼠中的腫瘤發(fā)生。此外，用所考慮的化合物處理過的癌細(xì)胞呈現(xiàn)出停止于G1期和缺少有絲分裂的進(jìn)入。這還與通過蛋白體途徑加速的Rad51降解相關(guān)。所考慮的化合物進(jìn)一步增大了所選定化療劑和電離放射處理腫瘤細(xì)胞時的細(xì)胞毒活性，化療劑包括VP-16、紫杉醇、喜樹堿。基于以下的數(shù)據(jù)和其他考慮，因此發(fā)明人考慮根據(jù)本發(fā)明主題的化合物適于瞄準(zhǔn)BRCA2和Rad51之間的相互作用，并用其來治療與BRCA2-Rad51復(fù)合物形成和/或Rad51作用的異常相關(guān)的疾病。
使用所考慮的化合物抑制癌細(xì)胞的生長發(fā)明人檢測了IBR2對一組乳癌細(xì)胞系的生長和存活力的作用。用各種濃度(0、5、10和20μM)的IBR2將五種指數(shù)生長的乳癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、SKBR3和MDA-MB-435)孵育不同的時間段(1、2、3、4和5天)。然后通過錐蟲藍(lán)排除測定來計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示IBR2以劑量和時間依賴性方式顯著抑制了所有五種乳癌細(xì)胞系的生長，如圖3A中所示的。我們還使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)測定檢測了IBR2對培養(yǎng)的乳癌細(xì)胞(MDA-MB-468、MDA-MB-435、MCF-7、T47D)的生長和存活力的作用。結(jié)果顯示了所測試的細(xì)胞系中IBR2的IC50值為約10μM(參見圖3D)。此外，通過IBR2處理還顯著抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(CALU-1、A427、Sklu-1和CALU-6)、骨肉瘤細(xì)胞系(SaoS2和U2OS)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(T98G)的增殖(參見圖3E)。
為了測試IBR2對裸鼠中所建立的腫瘤異種移植物生長的抑制效果，我們選擇了人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-468用于該研究。每隔一天用三個劑量的IBR2(10、50和150mg/kg i.p.)處理腫瘤大小大約為85mm3的小鼠，達(dá)五周。與對照組(只有載體)相比較，IBR2處理的組呈現(xiàn)出劑量依賴性方式的腫瘤生長的顯著抑制，達(dá)65％(參見圖3B)，而裸鼠的平均體重幾乎保持恒定(參見圖3C)。這些結(jié)果證明了IBR2可以用來抑制乳房腫瘤生長而對動物沒有明顯毒性。
IBR2對MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期的作用為了研究IBR2怎樣抑制癌細(xì)胞生長的機(jī)理，發(fā)明人通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACS)分析了IBR2處理的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。如圖4A中所示的，以時間依賴性方式，提高了G1部分，耗盡了S和G2/M部分，并顯著提高了次-G1部分，與凋亡性細(xì)胞無關(guān)。
為了測試IBR2處理過的細(xì)胞是否停止于G1并因此不能進(jìn)入S期，通過nocodazole處理使MCF-7細(xì)胞同步于M期，然后重新涂布使其進(jìn)入G1期。在不同的時間點(diǎn)，用BrdU標(biāo)記脈沖細(xì)胞來監(jiān)控S期進(jìn)入。如圖4B中所示的，將IBR2處理過的細(xì)胞完全停止于G1且不能進(jìn)入S期。
為了進(jìn)一步檢測IBR2處理時S期細(xì)胞的命運(yùn)，通過羥基脲處理使MCF-7細(xì)胞同步于G1/S過渡，然后通過洗掉試劑釋放來允許S期進(jìn)入。用20μM IBR2和BrdU處理這些細(xì)胞，且在18-小時的時間過程中，為了DNA合成測量BrdU吸收，以及有絲分裂指數(shù)和活細(xì)胞數(shù)量。如圖4C中所示的，模擬物和IBR2處理細(xì)胞中的DNA合成以相似的速率降低，表明IBR2處理沒有干擾S期進(jìn)程。模擬物處理的細(xì)胞在12小時時達(dá)到最大M期，而沒有或少許IBR2處理過的細(xì)胞進(jìn)入M期(圖4D)。此外，模擬物處理細(xì)胞的數(shù)量在M期完成時加倍，而IBR2處理細(xì)胞的數(shù)量降低至約50％。這表明IBR2處理的S期細(xì)胞不能進(jìn)入M期，可能是由于S/G2期的細(xì)胞死亡(圖4E)。
為了檢測IBR2對Rad51蛋白表達(dá)的影響，通過直接的蛋白質(zhì)印跡檢測了IBR2處理過的MCF-7細(xì)胞，用一組抗BRCA2、Rad51、Rad50、p84和Rb的抗體做探針。如圖4F中所示的，BRCA2和Rad51以時間依賴性方式顯著降低，而p84和Rad50保持恒定。與我們的FACS分析相一致(圖4A)，Rb的亞磷酸化(hypo-phosphorylated)形式，G1期的一種標(biāo)記，是在后期的時間點(diǎn)觀察到的主要形式，進(jìn)一步證實(shí)IBR2將細(xì)胞停止于G1期(圖4A)。已經(jīng)報(bào)道了BRCA2水平是細(xì)胞周期依賴性的，其在G1期表達(dá)低和在G1/S邊界達(dá)到峰值。因此，IBR2處理細(xì)胞中BRCA2降低的水平可能是由于G1期停止。不同于BRCA2蛋白，Rad51表達(dá)在MCF-7細(xì)胞中的整個細(xì)胞周期恒定(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，Rad51蛋白的丟失可以是IBR2處理的直接效果，替代G1停止的結(jié)果。為了測試通過失去穩(wěn)定IBR2是否降低了Rad51水平，發(fā)明人通過加入放線菌酮(CHX)來抑制蛋白質(zhì)的重新合成進(jìn)行了穩(wěn)定性測定。然后觀察到與對照細(xì)胞中的5.5小時相比較，Rad51而不是Rad50的半衰期，縮短至1.5小時，如圖4G和4H中所示的。加入蛋白體抑制劑MG132，將Rad51的半衰期延長至與IBR2處理和對照細(xì)胞中Rad50相似的程度(圖4G和4H)，表明IBR2瞄準(zhǔn)Rad50用于蛋白體介導(dǎo)的降解。因此，發(fā)明人考慮將IBR2處理的MCF-7細(xì)胞停止于G1，阻斷M期進(jìn)入，并死于S/G2期。
所考慮的化合物對Rad51和體內(nèi)IR-誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)的作用基于在此呈現(xiàn)的觀察，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IBR2在體外結(jié)合Rad51并破壞BRCA2-Rad51復(fù)合物的形成。在細(xì)胞中，IBR2處理導(dǎo)致Rad51的降解、G1停止和S期的細(xì)胞死亡。如果體內(nèi)效果來自IBR2瞄準(zhǔn)Rad51，期望IBR2處理細(xì)胞中內(nèi)源Rad51蛋白的超表達(dá)拯救這樣的效果。為了測試這種可能性，發(fā)明人在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)Rad51和GFP以及GFP單獨(dú)。用IBR2處理后，細(xì)胞超表達(dá)Rad51，如可以從圖5C看到，并顯著恢復(fù)S期進(jìn)入基于BrdU吸收分析如從圖5A和B所示的，其隨后表明Rad51通過IBR2特異性地瞄準(zhǔn)。
接著，發(fā)明人檢測了對等基因MEF的IBR2處理的敏感性，與BRCA1-/-p53-/-和p53-/-MEF相比較時，具有BRCA2-/-p53-/-，BRCA1-/-p53-/-。BRCA2-/-p53-/-MEF表型對IBR2最敏感的，可以從圖5D中看到。然后比較了這些MEF中Rad51蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BRCA2-/-p53-/-MEF中的Rad51半衰期短于其他的(參見圖5E)。這些結(jié)果表明內(nèi)源BRCA2可以通過其結(jié)合穩(wěn)定Rad51，而沒有BRCA2，Rad51具有縮短的半衰期且容易通過IBR2瞄準(zhǔn)來降解。
因?yàn)锽RCA2和Rad51之間的相互作用似乎對于IR-誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)的形成是關(guān)鍵的，考慮到IBR2可以模擬BRC重復(fù)來破壞BRCA2-Rad51相互作用且因此消除IR-誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)形成。為了測試這種可能性，在IBR2處理后測量形成的IR-誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)的MCF-7細(xì)胞數(shù)量。如圖5F中所示的，IBR2處理顯著降低了IR-誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)形成，表明IBR2削弱了Rad51的雙鏈破壞(DSB)修復(fù)功能。為了測試這種效果是否適用于DSB修復(fù)中涉及的其他分子，發(fā)明人然后檢測了g-H2AX的IR-誘導(dǎo)的焦點(diǎn)形成，這是在絲氨酸139通過ATM磷酸化的組蛋白H2AX，用于NBS1、53BP和BRCA1的補(bǔ)充，而不是Rad51。如圖5G中所示的，IR處理時，IBR2對g-H2AX焦點(diǎn)形成沒有作用，表明IBR2特異性地干擾Rad51 HR途徑而沒有影響g-H2AX補(bǔ)充至DNA損傷部位。
所考慮的化合物和化療劑的協(xié)同作用IBR2顯著抑制了細(xì)胞周期進(jìn)程以及HR中的Rad51功能。因此很可能IBR2和其他化療劑的結(jié)合具有協(xié)同效果。為了測試這種可能性，測量了用8μM IBR2加上不同劑量的VP-16、紫杉醇、喜樹堿或γ-放射處理的MCF-7乳癌細(xì)胞的存活。發(fā)現(xiàn)IBR2和VP-16(圖5H)、紫杉醇(圖5I)、喜樹堿(Camp)(圖5J)和γ-放射(圖5K)對殺滅乳癌細(xì)胞的顯著協(xié)同作用。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到IBR2和其他常規(guī)治療劑的結(jié)合在治療各種癌癥中具有潛在的臨床應(yīng)用。
之前的研究顯示出癌細(xì)胞比正常細(xì)胞具有較高的S部分。這種差異對于發(fā)展瞄準(zhǔn)這種性質(zhì)的許多傳統(tǒng)藥物是有用的。還觀察到許多癌細(xì)胞中Rad51增大的表達(dá)水平。這種癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間Rad51功能的顯著差異因此可以提供潛在的用于癌癥治療的Rad51治療窗口。一貫地，在我們的動物研究中，所考慮的化合物在50mg/kg的劑量能夠阻止腫瘤生長高達(dá)65％，而沒有明顯體重丟失直達(dá)150mg/kg。該結(jié)果似乎證實(shí)了所考慮的化合物抑制乳房腫瘤生長，同時對身體的組織具有低的影響且沒有明顯的一般毒性。然而，用IBR單獨(dú)處理不足以消除癌細(xì)胞，因?yàn)镮BR自身在G0/G1期具有小的殺傷活性。因此，和其他化療劑的結(jié)合對獲得更好的結(jié)果是必需的。在這點(diǎn)上，IBR2和其他化療劑如VP-16、紫杉醇和喜樹堿，或電離放射的共同治療，可以產(chǎn)生協(xié)同效果，表明化合物可以用作常規(guī)化療或放療的敏化劑。
細(xì)胞中BRCA2的不存在還似乎對Rad51穩(wěn)定性具有顯著影響，給予它們對IBR2處理更敏感。一貫地，初步結(jié)果表明胰腺癌細(xì)胞系，CAPAN-1，其含有平截的BRCA2，顯示出對IBR2顯著的敏感性。因此所考慮的是IBR2在處理缺乏功能BRCA2(或具有降低的BRCA2表達(dá))的癌細(xì)胞中特別有用，盡管只有小部分癌癥。
實(shí)驗(yàn)程序反向酵母雙雜交篩選從Nanosyn，Inc.(Menlo Park，CA)購買化學(xué)文庫。組成型表達(dá)含有BRC1-4重復(fù)的TetR/NCB；AD/Rad51的表達(dá)在GAL1啟動子下是半乳糖誘導(dǎo)型的。將酵母生長于含有5-FOA的半乳糖培養(yǎng)基中。在96孔平板上進(jìn)行測定，在100μl總體積中使用10μM化合物。通過酵母的存活力鑒定可以破壞BRC-Rad51相互作用的化合物。
分子模型化使用Sybyl(Tripos co.ltd.)產(chǎn)生IBR2結(jié)構(gòu)，并使用Gasteiger-Huckel方法(Gastiger和Marsili，1980)添加電荷。通過彈性入塢方法使用UCSF Dock(Ewing和Kuntz，1997)進(jìn)行分子入塢，并用Chimera(Huang等，1996)觀察結(jié)果。Rad51和BRC4坐標(biāo)來自PDB(登錄號No1N0W)。Rad51寡聚基序坐標(biāo)來自PDB(登錄號No1PZN)。對于3D結(jié)構(gòu)比對，IBR2坐標(biāo)來自入塢構(gòu)型之一。
表面等離子共振結(jié)合測定在Biacore3000(Biacore Inc.)上在HBSD緩沖劑(10mM HEPES，150mM NaCl，0.1％DMSO)中在25℃進(jìn)行測定。使用傳感器芯片NTA或谷胱甘肽-修飾的CM5來各自捕獲His-Rad51或GST-BRC1。捕獲水平在5μl/min的低速大約是130共振單位。對于連續(xù)結(jié)合測定，用化合物(1μM)和然后蛋白質(zhì)(50μg/ml)處理芯片。記錄保持的共振單位(RU)并從重復(fù)三次的實(shí)驗(yàn)獲得平均值。對于競爭測定(Vassilev等，2004)，在使用之前用50μg/ml BRC在25℃孵育IBR2 15分鐘。相對于沒有使用IBR2的結(jié)合計(jì)算相對結(jié)合百分比，并從兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)獲得平均值。
凝膠過濾將Rad51(3.2μg)和小化合物(摩爾比1∶10)的混合物在37℃孵育15分鐘，補(bǔ)充緩沖劑(50mM三乙醇胺-HCl[pH7.5]，0.5mM Mg(OAc)2，1mM二硫蘇糖醇，2mM ATP和100μg/mlBSA，總體積20μl)并再孵育15分鐘。然后將混合物裝載在用相同緩沖劑平衡的2.4ml Superdex 200 PC 3.2/30柱上(Pharmacia)，如所述的(Davies等，2001)。收集級分(50μl)并將0.5μl的每個級分點(diǎn)在PVDF膜上。使用抗Rad51抗體(mAb 14B4)檢測Rad51。
細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞同步、BrdU標(biāo)記和有絲分裂指數(shù)的測定在含有10％胎牛血清的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)乳癌細(xì)胞系和MEF細(xì)胞系。按照之前所述的培養(yǎng)MCF-10A細(xì)胞(Debnath等，2003)。通過用0.1μg/ml nocodazle處理8小時來獲得M期的細(xì)胞同步。用1mM羥基脲處理17小時、9小時的釋放和再次用1mM羥基脲處理14小時來獲得G1/S期邊界的細(xì)胞同步。對于BrdU標(biāo)記，使用BrdU標(biāo)記試劑盒(Amersham Biosciences)用BrdU孵育細(xì)胞30分鐘并固定BruD免疫染色。對于有絲分裂指數(shù)的測定，將細(xì)胞在室溫固定于含有0.1μg/ml DAPI的PBS中的4％多聚甲醛中30分鐘，并通過熒光顯微鏡來檢測。計(jì)數(shù)每個樣品500-1000個核來測定M期細(xì)胞的數(shù)目，M期細(xì)胞只包括前中期、中期、后期和末期。
細(xì)胞增殖測定和克隆發(fā)生存活測定為了獲得細(xì)胞生長曲線，將1×104細(xì)胞接種于12孔平板中24小時。然后在0.4％DMSO存在下用各種濃度的IBR2處理細(xì)胞，重復(fù)雙份。每日通過錐蟲藍(lán)排除測定來計(jì)數(shù)活細(xì)胞。按照之前所述的進(jìn)行MTT測定(Alley等，1988)。
為了進(jìn)行克隆發(fā)生存活測定，將1.5×103個MCF-7細(xì)胞接種于10-cm培養(yǎng)皿中24小時。然后用5μM IBR2處理細(xì)胞12小時，然后g-放射，重復(fù)雙份。將細(xì)胞連續(xù)暴露于5μM IBR2并每4天用新鮮培養(yǎng)基和IBR2再次喂養(yǎng)。14-16天后，將細(xì)胞固定并用2％亞甲基藍(lán)染色。計(jì)數(shù)由多于50個細(xì)胞組成的克隆。
蛋白質(zhì)印跡分析用20mM IBR2或50μg/ml放線菌酮(CHX)或1μM MG132處理細(xì)胞并在不同時間點(diǎn)收集用于蛋白質(zhì)印跡分析。將懸浮于Lysis 250緩沖劑中的細(xì)胞接受三次凍/融循環(huán)(液氮/37℃)，然后在室溫14,000rpm離心2分鐘。測量蛋白質(zhì)濃度后，將等量總細(xì)胞蛋白接受SDS-PAGE，并按照之前所述的進(jìn)行免疫印跡分析(Chen等，1999)。所用的抗體是Rad51(兔子5952)；BRCA2(兔子PC146，Oncogene)；Rb(mAb 11D7)；Rad50(mAb 13B3)和p84(mAb 5E10)。使用Labworks 4.5軟件通過密度測定法來定量條帶的強(qiáng)度。用p84信號標(biāo)準(zhǔn)化后，相對于未處理樣品來計(jì)算條帶強(qiáng)度的相對值。
免疫染色Rad51和g-H2AX焦點(diǎn)用20μM IBR2處理MCF-7細(xì)胞7或19小時，然后在20Gy g-放射。用20μM IBR2將細(xì)胞另外孵育5小時，然后用含有0.5％曲通X-100的PBS中的4％多聚甲醛固定。用a-Rad51抗體(mAb 1F5)或a-g-H2AX抗體(Upstate)孵育固定的細(xì)胞。隨后按照所述的(Chen等，1999)計(jì)數(shù)Rad51和g-H2AX焦點(diǎn)陽性細(xì)胞。
通過流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞周期分析為了分析細(xì)胞周期分布，將5’105個MCF-7細(xì)胞接種于10-cm培養(yǎng)皿中24小時，并用20mM IBR2處理不同的時間。然后將細(xì)胞胰蛋白酶化，并用70％乙醇(-20℃)固定，用碘化丙啶(PI)染色溶液染色30分鐘(Yun等，2005)(PBS中50μg/ml PI，0.1％檸檬酸鈉，50μg/ml RNase A，0.03％NP-40)。使用FACScalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析并用CellQuest軟件(Beckton Dickson)分析細(xì)胞周期分布。分析每個樣品10000個事件并將實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
MCF-7細(xì)胞中Rad51蛋白的構(gòu)建和超表達(dá)通過將1.1kb Rad51片段插入逆轉(zhuǎn)錄載體pCLpGKEFP中來產(chǎn)生Rad51-EGFP。然后產(chǎn)生Rad51-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒并感染至MCF-7細(xì)胞中。用20μM IBR2處理Rad51-EGFP穩(wěn)定感染的細(xì)胞24小時，然后用BrdU標(biāo)記或裂解用于蛋白質(zhì)印跡分析。
裸鼠中腫瘤抑制測定將100μl PBS中5×106個MDA-MB-468細(xì)胞注射至6-8周大的無胸腺雌性BALB/c-裸鼠(nu/nu)(Charles RiverLaboratories)的乳房脂墊中。腫瘤生長至85mm3(12天)后，將小數(shù)隨機(jī)分成四組(每組n＝5)，每隔一天接受腹膜內(nèi)注射IBR2(10、50或150mg/kg)或載體(15％DMSO、20％吐溫20、10％PEG400、55％鹽水)，持續(xù)5周。在藥物治療的過程中，每周兩次測量小鼠的體重和腫瘤體積。使用Student’st測試來測定P值。
因此，已經(jīng)公開了破壞BRCA2-Rad51相互作用的組合物和方法的特定實(shí)施方案和應(yīng)用。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚除了已經(jīng)描述的那些以外的許多其他的改變是可能的，且沒有脫離在此的本發(fā)明概念。因此，本發(fā)明的主題沒有受到限制，除了在所附權(quán)利要求的精神內(nèi)。此外，在解釋說明書和權(quán)利要求書中，應(yīng)當(dāng)以與內(nèi)容相一致的最可能寬的方式來解釋所有術(shù)語。特別地，術(shù)語包括和包含應(yīng)當(dāng)解釋為以非排他的方式涉及要素、成分或步驟，表明所參照的要素、成分或步驟可以存在或利用或結(jié)合其他沒有專門提及的要素、成分或步驟。此外，在通過在此引入作為參考的參考文獻(xiàn)中術(shù)語的定義或使用與在此提供的術(shù)語定義不一致或相反的情況中，使用在此提供的術(shù)語定義而不使用參考文獻(xiàn)中的術(shù)語定義。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.用于治療診斷為患有癌癥的人的藥物組合物，所述組合物包括藥物學(xué)上可接受的載體和根據(jù)通式1的化合物 通式1其中R是 其中Y不存在或者是亞甲基；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H；Q是N或C-R2；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、?；被?、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；R’是H、C1-C3烷基、C1-C3烯基、C1-C3炔基、鹵素、硝基、羥基、C1-C3烷氧基、C1-C3烯氧基、氰基、羧基、氨基、C1-C3?；被1-C3烷基氨基、C1-C3二烷基氨基、N-C1-C3烷基、氨基、巰基、C1-C3烷硫基和鹵代烷基；其中n為0至4，包括0和4，且其中*表示R或S構(gòu)型；和其中化合物以有效實(shí)現(xiàn)以下至少一種的濃度存在(a)提高腫瘤細(xì)胞對放射和DNA-損傷劑中至少一種的敏感性，和(b)停滯非腫瘤細(xì)胞于G-期。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中R1至R11是H，其中X是NR14，且其中R是 3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中化合物具有根據(jù)通式2的結(jié)構(gòu) 通式2。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中化合物具有根據(jù)通式3的結(jié)構(gòu)
通式3。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將細(xì)胞暴露于化合物時，化合物以有效提高腫瘤細(xì)胞對放射和DNA損傷劑中至少一種的敏感性的濃度存在于組合物中。
7.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將BRCA2-RAD51復(fù)合物暴露于化合物時，化合物以有效降低BRCA2與RAD51結(jié)合的濃度存在于組合物中。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述組合物還包括DNA-損傷劑。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將細(xì)胞接觸化合物時，化合物以有效停滯細(xì)胞于G1期的濃度存在于組合物中。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將化合物以有效降低植入裝置附近多個細(xì)胞的細(xì)胞增殖的濃度結(jié)合植入裝置。
11.處理腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括將腫瘤細(xì)胞接觸根據(jù)通式1的化合物、其前藥或代謝物，其中將腫瘤細(xì)胞暴露于化合物時，化合物以有效提高腫瘤細(xì)胞對放射和DNA-損傷劑中至少一種的敏感性的濃度存在；
通式1其中R是 其中Y不存在或者是亞甲基；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H；Q是N或C-R2；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、?；被?、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；R’是H、C1-C3烷基、C1-C3烯基、C1-C3炔基、鹵素、硝基、羥基、C1-C3烷氧基、C1-C3烯氧基、氰基、羧基、氨基、C1-C3?；被1-C3烷基氨基、C1-C3二烷基氨基、N-C1-C3烷基、氨基、巰基、C1-C3烷硫基和鹵代烷基；和其中n為0至4，包括0和4，且其中*表示R或S構(gòu)型。
12.權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括將細(xì)胞暴露于放射和DNA損傷劑中至少一種的步驟。
13.權(quán)利要求11的方法，其中放射是γ放射或UV-C放射，且其中DNA損傷劑是烷化基或交聯(lián)劑。
14.權(quán)利要求11的方法，其中腫瘤細(xì)胞是乳癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述濃度為1μM至100μM。
16.停滯非腫瘤細(xì)胞于G-期的方法，所述方法包括將細(xì)胞接觸根據(jù)通式1的化合物、其前藥或代謝物，其中化合物以有效停滯非腫瘤細(xì)胞于G-期的濃度存在； 通式1其中R是 其中Y不存在或者是亞甲基；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H；Q是N或C-R2；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；
R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；R’是H、C1-C3烷基、C1-C3烯基、C1-C3炔基、鹵素、硝基、羥基、C1-C3烷氧基、C1-C3烯氧基、氰基、羧基、氨基、C1-C3?；被?、C1-C3烷基氨基、C1-C3二烷基氨基、N-C1-C3烷基、氨基、巰基、C1-C3烷硫基和鹵代烷基；其中n為0至4，包括0和4，且其中*表示R或S構(gòu)型。
17.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括在接觸步驟后將非腫瘤細(xì)胞暴露于DNA-損傷條件的步驟，其中在與沒有使用接觸步驟獲得的DNA損傷相比較降低細(xì)胞DNA損傷的條件下進(jìn)行接觸步驟。
18.權(quán)利要求17的方法，其中DNA損傷條件是放射和暴露于DNA損傷劑中的至少一種。
19.權(quán)利要求18的方法，其中DNA損傷劑選自順鉑、絲裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和博萊霉素。
20.權(quán)利要求16的方法，其中進(jìn)行接觸細(xì)胞的步驟使得細(xì)胞接觸結(jié)合了化合物的植入裝置。
權(quán)利要求
1.包括藥物學(xué)上可接受的載體和根據(jù)通式1的化合物的藥物組合物， 通式1其中R是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷芳基和 的基團(tuán)；其中Y不存在或者是具有1至4個碳原子的亞烷基基團(tuán)；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；Q是N或C-R2；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；R’和R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、?；被?、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；和其中n為0至4，包括0和4，且其中*表示R或S構(gòu)型。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中R1至R11是H，其中X是NR14，且其中R是
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中Z是-C(R12)＝C(R13)-，且Y不存在。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中化合物具有根據(jù)通式2的結(jié)構(gòu) 通式2。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中化合物具有根據(jù)通式3的結(jié)構(gòu) 通式3。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將細(xì)胞暴露于化合物時，化合物以有效提高腫瘤細(xì)胞對放射和DNA損傷劑中至少一種的敏感性的濃度存在于組合物中。
7.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將BRCA2-RAD51復(fù)合物暴露于化合物時，化合物以有效降低BRCA2與RAD51結(jié)合的濃度存在于組合物中。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述組合物還包括DNA-損傷劑。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將細(xì)胞接觸化合物時，化合物以有效停滯細(xì)胞于G1期的濃度存在于組合物中。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將化合物以有效降低植入裝置附近多個細(xì)胞的細(xì)胞增殖的濃度結(jié)合植入裝置。
11.處理腫瘤細(xì)胞的方法，包括將腫瘤細(xì)胞接觸根據(jù)通式1的化合物、其前藥或代謝物，其中將腫瘤細(xì)胞暴露于化合物時，化合物以有效提高腫瘤細(xì)胞對放射和DNA-損傷劑中至少一種的敏感性的濃度存在； 通式1其中R是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷芳基和 的基團(tuán)；其中Y不存在或者是具有1至4個碳原子的亞烷基基團(tuán)；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或?；?；Q是N或C-R2；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；R’和R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；和其中n為0至4，包括0和4，且其中*表示R或S構(gòu)型。
12.權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括將細(xì)胞暴露于放射和DNA損傷劑中至少一種的步驟。
13.權(quán)利要求11的方法，其中放射是γ放射或UV-C放射，且其中DNA損傷劑是烷化基或交聯(lián)劑。
14.權(quán)利要求11的方法，其中腫瘤細(xì)胞是乳癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞。
15.權(quán)利要求11的方法，其中濃度為1μM至100μM。
16.停滯非腫瘤細(xì)胞于G-期的方法，包括將細(xì)胞接觸根據(jù)通式1的化合物、其前藥或代謝物，其中化合物以有效停滯非腫瘤細(xì)胞于G-期的濃度存在； 通式1其中R是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷芳基和 的基團(tuán)；其中Y不存在或者是具有1至4個碳原子的亞烷基基團(tuán)；Z選自-C(R12)＝C(R13)-、-CH＝N-、-N＝CH-、O、S或NR14，其中R14是H、烷基、芳基、芳烷基或酰基；Q是N或C-R2；X選自CH2、O、S或NR14，其中R14獨(dú)立地如上所定義；R’和R1至R13獨(dú)立地選自H、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵素、硝基、羥基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、N-烷基、N-環(huán)烷基、氨基、巰基、烷硫基和鹵代烷基；前提條件是R12和R13任選地結(jié)合來形成碳環(huán)或雜環(huán)；和其中n為0至4，包括0和4，且其中*表示R或S構(gòu)型。
17.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括在接觸步驟后將非腫瘤細(xì)胞暴露于DNA-損傷條件的步驟，其中在與沒有使用接觸步驟獲得的DNA損傷相比較降低細(xì)胞DNA損傷的條件下進(jìn)行接觸步驟。
18.權(quán)利要求17的方法，其中DNA損傷條件是放射和暴露于DNA損傷劑中的至少一種。
19.權(quán)利要求18的方法，其中DNA損傷劑選自順鉑、絲裂霉素、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和博萊霉素。
20.權(quán)利要求16的方法，其中進(jìn)行接觸細(xì)胞的步驟使得細(xì)胞接觸結(jié)合了化合物的植入裝置。
全文摘要
所考慮的化合物破壞了BRCA2和RAD51之間的相互作用，很可能是通過結(jié)合RAD51?；贐RCA2－RAD51復(fù)合物形成在DNA修復(fù)中的關(guān)鍵作用和RAD51在從G1進(jìn)入S－期中的控制作用，呈現(xiàn)了多種組合物和方法。在這些有利的用途中，所考慮的化合物可以用作化療中細(xì)胞暴露于化療藥物之前的非腫瘤細(xì)胞的保護(hù)劑和/或作為腫瘤細(xì)胞的DNA－損傷敏化劑。
文檔編號A61P35/00GK101083990SQ200580043619
公開日2007年12月5日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者W·－H·李, P·－L·陳, J·朱 申請人:加州大學(xué)評議會