專利名稱：：獨(dú)特麥盧卡因子(umf)強(qiáng)化蜂蜜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由UMF改進(jìn)的食品和藥物。尤其是，盡管不是唯一地，本發(fā)明涉及UMF強(qiáng)化蜂蜜、制備UMF強(qiáng)化蜂蜜的方法和制備蜂蜜的含UMF級份的方法。
背景技術(shù)：
：麥盧卡樹土生土長在新西蘭，并且出產(chǎn)具有濃郁風(fēng)味的蜂蜜。除了數(shù)千年用作食品外，蜂蜜已經(jīng)用于醫(yī)學(xué)目的，其主要作為抗菌劑?？咕钚缘闹饕蚴怯捎谕ㄟ^葡萄糖氧化酶在蜂蜜中產(chǎn)生的過氧化氫。除所述抗菌活性之外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜還擁有一些活性。該額外的活性稱為非過氧化物活性，并且商業(yè)上稱為獨(dú)特麥盧卡因子(uniquemanukafactor，UMF)。已經(jīng)作了很多研究以鑒定非過氧化物活性的特，并進(jìn)行了鑒定負(fù)責(zé)所述額外活性的級份的嘗試，但迄今為止尚未成功。蜂蜜已經(jīng)被使用了數(shù)千年，最初涉及蜂蜜的書面文件追溯到大約4000年前。蜂蜜是僅有的不需要處理或加工以使其可被食用的增甜材料(White，1992)。麥盧卡樹，澳洲茶樹(Leptospermumscoparium)，土生土長在新西蘭。它喜較潮濕和低肥滲濾性土壤，可存活大約60年。該樹可長成6-8m高度和7-10cm直徑?；▽?0-12mm并且通常是白色(Ward，2000)。麥盧卡樹出產(chǎn)的蜂蜜具有草本、木本特征的濃郁風(fēng)味并且顏色是黑色。已經(jīng)實(shí)施了很多研究以確定蜂蜜中存在的化合物。原因包括創(chuàng)建蜂蜜的“指紋”數(shù)據(jù)庫以便可以確定其地理和植物來源，并且也可查明蜂蜜的摻假貨。大多數(shù)化合物包括在碳水化合物、酶、芳香酸、碳?xì)浠衔?、直鏈一元和二元酸以及水的種類之內(nèi)。盡管蜂蜜主要由糖類、葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖組成(White，1978)，但是也已經(jīng)鑒定出許多其他低聚糖。在麥盧卡蜂蜜中經(jīng)鑒定重要的低聚糖包括maltulose、曲二糖、松二糖、黑霉糖、麥芽糖、海藻糖、帕拉金糖、蔗糖、erlose和潘糖、松三糖和麥芽三糖(Weston&Brocklebank，1999；Wu，2000)。Wu(2000)發(fā)現(xiàn)松二糖是麥盧卡蜂蜜中的主要低聚糖，然而Weston&Brocklebank(1999)發(fā)現(xiàn)麥芽糖是其中的主要低聚糖。通過蜜蜂添加到蜂蜜中的其他物質(zhì)是氨基酸，最豐富的是脯氨酸，和較少量的過氧化氫酶(White，1992)。過氧化氫酶降解過氧化氫成為水和氧。麥盧卡蜂蜜包含高濃度的芳香酸，其中占主要的是2-羥基-3-苯基丙酸(Tanet.al.，1988；Wilkinset.al.，1993)，并且麥盧卡中的芳香酸濃度大大高于新西蘭苜蓿蜜(高1000倍)(Tanet.al.，1988)。已被鑒定的芳香酸是2-甲氧基苯甲酸、2′-甲氧基苯乙酮、2-癸烯二酸(2-decenedioicacid)、4-羥基-3-5-二甲氧基苯甲酸、2-羥基-3-(4′-甲氧基苯基)丙酸、丁香酸、3，4，5三甲氧基苯甲酸和苯乙酮(Tanet.al.，1988；Wilkinset.al.，1993)。不考慮季節(jié)和地理來源，單花麥盧卡蜂蜜的樣品的特征是丙酸的組合濃度高于700mg/kg蜂蜜、組合的苯甲酸濃度高于35mg/kg蜂蜜、和組合的苯乙酮濃度高于20mg/kg蜂蜜(Wilkinset.al.，1993)。Tanet.al.(1989)也鑒定出2-羥基-3-苯基丙酸是主要的特征性化合物，并且舉例說明了高水平的該化合物與2-甲氧基苯甲酸和2′-甲氧基苯乙酮作為標(biāo)記以確定麥盧卡植物來源的應(yīng)用。Wilkinset.al.(1993)指出經(jīng)常在麥盧卡蜂蜜中發(fā)現(xiàn)比在其他蜂蜜中具有更高濃度的癸二酸和反式-2-癸二酸。已經(jīng)在蜂蜜中有二價(jià)酸，包括辛二酸、壬二酸、癸二酸和反式-2-癸烯二酸(Tanet.al.，1988；Wilkinset.al.，1993)。Whiteet.al.(1962)在其他蜂蜜中鑒定的其他化合物包括內(nèi)脂、淀粉酶、自由酸度(freeacidity)和灰分。該文獻(xiàn)不包含麥盧卡蜂蜜中任何關(guān)于這些的信息，也沒有任何麥盧卡蜂蜜水分含量的已公開信息。從古時(shí)起蜂蜜已經(jīng)被很多文明用于醫(yī)學(xué)(Ransom，1937，Adcock，1962)。由于了解到明確的抗菌作用，最近蜂蜜作為有報(bào)道價(jià)值的藥劑的興趣已經(jīng)增加。蜂蜜的抗菌作用基本上由蜂蜜種類而定(Dustmann，1979)。也已經(jīng)觀察到，麥盧卡(澳洲茶樹桃金娘科)蜂蜜具有更高水平的抗菌活性，其不能僅僅由蜂蜜滲透壓、pH和葡萄糖氧化酶活性來解釋(Russell，1983)。活性的貢獻(xiàn)者現(xiàn)被稱為“非過氧化物活性”或“UMF”。Dustman(1979)已經(jīng)注意到并非因?yàn)槠咸烟茄趸富钚曰蚋邼B透壓所致的抗菌活性的存在。然而，他的觀點(diǎn)是后一活性僅僅是總活性的一小部分。Molan&Russell(1988)給出了在麥盧卡蜂蜜中抗菌活性的存在不是由于過氧化氫所致的證據(jù)，并且也發(fā)現(xiàn)具有高總體活性的麥盧卡蜂蜜也具有高水平的非過氧化物活性。有關(guān)蜂蜜非過氧化物活性的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它具有一些有趣且明顯矛盾的特性。Verge(1951)在水、醇、醚和丙酮中獲得了活性組分。Schuler和Vogel(1956)用醚提取了該活性。Lavie(1960)發(fā)現(xiàn)有可能使用丙酮而不是醚提取活性。Gonnet和Lavie(1960)發(fā)現(xiàn)冷醚提取物中的活性在95℃是揮發(fā)性的。Mladenov(1974)報(bào)道了蜂蜜包含揮發(fā)性、強(qiáng)揮發(fā)性和非揮發(fā)性的抗菌物質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜的活性是熱和光穩(wěn)定性的(Molan&Russell，1988，Tanet.al.，1988，Russellet.al.，1990)，并且Tanet.al.(1988)的初步研究顯示該額外的活性在有機(jī)溶液例如乙醇和醚中是可溶的。芳香酸和酚類化合物是除了過氧化氫和溶菌酶之外已從蜂蜜中分離的具有抗菌活性的僅有其他物質(zhì)(Westonet.al.，2000)?？Х人岷桶⑽核幔@兩種酚酸，已經(jīng)被確定為具有抗微生物活性(CizmarikandMatel，1970，Cizmarik，2000)，并且已經(jīng)從蜂蜜中分離出來(Wahdan，1998，Weston，2000)。然而，發(fā)現(xiàn)它們僅僅是低濃度，并且當(dāng)與過氧化氫所起的作用相比時(shí)，它們對蜂蜜的抗菌活性貢獻(xiàn)很少(Weston，2000)。MarhuendaRequendaet.al.(1987)報(bào)道了其他酚酸的抗菌活性，其包括咖啡酸、香草酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸和丁香酸。由蜂蜜分離的類黃酮包括pinocembrine、短葉松素(pinohanksin)、柯因和二氫黃酮(Wahdan，1998，F(xiàn)errereset.al.，1994)。它們具有充分論證的抗菌活性(Rivera-Vargaset.al.，1993，ltohet.all.，1994)，而且在蜂蜜中的濃度不夠高，不具有顯著抗菌作用(Weston，2000)。Russell(1983)鑒定了兩種芳香化合物是來自蜂蜜的主要抗菌組分。它們是4-羥基-3-5-二甲氧基苯甲酸(酯)和甲基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸(酯)。蜂膠，一種通過蜜蜂從樹的樹膠滲出物中收集的、并且在蜂巢中用作抗菌劑的樹脂材料，包括取代的苯甲酸和肉桂酸類以及類黃酮(Marcucci，1995)。Wahdan(1998)指出在抗菌蜂膠中類黃酮是主要物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)該抗菌活性的組分已經(jīng)被鑒定為良姜素、松屬素(pinocembrin)、咖啡酸和阿魏酸。(Lavie，1960，Ghisalbert，1979，Russellet.al.，1990)。Weston(2000)已經(jīng)證明單個(gè)組分缺乏抗微生物活性，而僅僅對全蜂膠觀察到生物活性。蜂毒肽(mellitin)和磷脂酶被認(rèn)為是引起其弱抗菌活性的蜂毒的組分。這兩者都是蛋白質(zhì)，并且凝膠過濾色譜已經(jīng)顯示麥盧卡蜂蜜中的抗菌物質(zhì)具有低于1000amu的分子量(Russellet.al.，1990)。對麥盧卡蜂蜜的非過氧化物活性可能有貢獻(xiàn)的其他產(chǎn)物可能是由蜜蜂體液鑒定的抗生素肽。已經(jīng)鑒定的產(chǎn)物是蜂毒素、多肽抗生素、hymenoptaecin、王漿素、和溶菌酶。所述肽擁有強(qiáng)的抗生素活性，并且如果它們存在于蜂蜜中，則它們能顯著地貢獻(xiàn)非過氧化物活性(Westonet.al.，2000)。盡管已進(jìn)行了多年的研究，麥盧卡蜂蜜抗菌活性的非過氧化物級份(UMF)尚未被分離或鑒定。確實(shí)，一些研究者認(rèn)為不存在麥盧卡蜂蜜組分的可分離級份。Russellet.al.，(1990)認(rèn)為關(guān)于額外抗菌活性(即不是因?yàn)檫^氧化氫或高滲透壓所致的活性)重要性的觀點(diǎn)的差異，有可能是由于所述活性的量中的差異所致。Molan和Russell(1988)發(fā)現(xiàn)，對于一系列新西蘭蜂蜜樣品，該額外的活性從一些樣品中的零變化到其他樣品中幾乎全部的活性。他們也注意到在額外抗菌活性的水平和單個(gè)蜂蜜樣品的總體抗菌活性間存在密切相關(guān)性。Bogdanov(1997)嘗試通過分離揮發(fā)性、非極性和非揮發(fā)性、酸性、和堿性級分以測定在哪個(gè)級份中存在非過氧化物活性。他通過測試樣品的活性、取出級份、然后再測試該活性而完成此項(xiàng)工作。如果樣品中沒有保留該活性，那么他可以得出抗菌組分存在于被取出的級份中的結(jié)論。通過在轉(zhuǎn)子蒸發(fā)器中在60℃下加熱2小時(shí)提取揮發(fā)性物質(zhì)。通過C-18柱提取非極性、非揮發(fā)性物質(zhì)。在陽離子交換柱上以H形式提取堿，并且在陰離子交換柱上以O(shè)H形式提取酸。為了移除酸，調(diào)整蜂蜜到pH11，以使酸以離解的陰離子形式存在。Bogdanov指出，在初始蜂蜜中將pH調(diào)到pH11對抗菌活性沒有影響，因?yàn)榛氐味ǖ皆嫉膒H可導(dǎo)致初始抗菌活性的恢復(fù)。對于麥盧卡蜂蜜，Bogdanov指出，當(dāng)針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)測試時(shí)，100％活性在酸性級分中，當(dāng)針對騰黃微球菌(Micrococcusluteus)測試時(shí)，75％活性在酸性級份中、10％在堿性級份中、5％在非極性級份中、和10％在揮發(fā)性級份中。因此得出結(jié)論，蜂蜜中的非過氧化物抗菌活性存在于酸性級份中，并且與酸含量顯著相關(guān)，但與pH無關(guān)。通過比較糖類溶液和未稀釋蜂蜜的滲透作用，Wahdan(1998)發(fā)現(xiàn)，該高糖濃度是抗菌活性的重要因素，但當(dāng)它被稀釋時(shí)，顯然也存在其它的貢獻(xiàn)因素。其中也指出，在該研究中pH不是這樣的因素，因?yàn)榉涿凼怯脿I養(yǎng)肉湯(pH7.2)稀釋的，因此必然有其他物質(zhì)存在。Weston&Brocklebank(1999)嘗試通過測試數(shù)種方法，包括在酸性和中性條件下進(jìn)行聚(辛基)酰胺、SephadexG-10、BiogelP-2、和XAD-2樹脂的色譜，從而從抗菌材料中分離單糖。同樣測試了使用2-丁醇進(jìn)行分離。在聚酰胺和SephadexG-10上的色譜指示活性材料位于后期組分中，HPLC分析暗示存在類黃酮類。通過薄層色譜在酚提取物中鑒定出主要產(chǎn)物為丁香酸甲酯，次要產(chǎn)物是苯基乳酸。HPLC分析顯示，甲基丁香酸甲酯構(gòu)成超過45％的總酚提取物。該文件也進(jìn)行了測試，并得出了麥盧卡蜂蜜中丁香酸甲酯和苯基乳酸的水平本身不負(fù)責(zé)所有的非過氧化氫活性這一結(jié)論。而且，丁香酸甲酯水平在活性和非活性麥盧卡蜂蜜中是相同的，因此不是引起所觀察到的差異的原因。在XAD-22上，用碳水化合物洗脫下了所有活性，而用酚類未洗脫下顯著的活性。在Biogel-P2上得到了相同的結(jié)果。因?yàn)閱翁菦]有抗菌特性，所以暗示糖類攜帶了該抗菌組分。Westonet.al.(1999)證明了酚類級份整體而言在活性和非活性蜂蜜中具有相同的抗菌作用，所以結(jié)論是，盡管麥盧卡蜂蜜的酚類組分各自地和共同地具有抗菌活性，但是它們不引起該“觀察到”的活性。Weston&Brocklebank(1999)假設(shè)活性麥盧卡蜂蜜可能具有類似于四糖唾液酸化路易斯X的獨(dú)特低聚糖，其是介導(dǎo)可以引起胃胃潰瘍的細(xì)菌黏附到胃內(nèi)層的抗原決定簇。他們測試了活性和非活性麥盧卡蜂蜜的低聚糖組成，并且發(fā)現(xiàn)在活性和無活性麥盧卡蜂蜜間無差異。Perryet.al.(1997)發(fā)現(xiàn)在新西蘭存在三種化學(xué)型的麥盧卡，并且它們可以通過來自葉的精油的組成區(qū)分開來。一種包含大部分蒎烯類，另一種包含大部分倍半萜烯類，生長在東部陸地區(qū)域的第三種包含高比例的環(huán)三酮——纖精酮。該油具有這三種中最強(qiáng)的抗微生物活性。Westonet.al.(2000)嘗試通過三種不同方法在非常高的非過氧化物活性的麥盧卡蜂蜜樣品中檢測纖精酮。一種方法中使用XAD-2樹脂吸收酚類，另一種使用2-丁醇進(jìn)行提取，第三種是液-液提取。對所有三種提取物進(jìn)行的分析未能檢測到任何三酮。其結(jié)論是因?yàn)槔w精酮在水中不溶，所以它不太可能存在于花蜜中，故不存在于蜂蜜中。Westonet.al.(2000)比較了抗菌麥盧卡蜂蜜和無活性麥盧卡蜂蜜中的酚組分，并且顯示其在定性或定量上無差異。桂皮酸和類黃酮的水平也非常相似，并且與很多歐洲蜂蜜相當(dāng)。通過測試19種麥盧卡蜂蜜，顯示了所有樣品中酚類特征譜是同樣的，因此地理不影響酚類特征譜。Weston(2000)指出(i)在蜂蜜中過氧化氫是有任何重要性的唯一抗菌物質(zhì)，并且其他物質(zhì)，例如蜂膠衍生的酚類物質(zhì)，與過氧化氫比較而言都是無關(guān)緊要的。(ii)在蜂蜜中過氧化氫的水平基本上是通過蜂蜜中由植物衍生的過氧化氫酶的量確定的；并且(iii)基于Whiteet.al.(1963)和Dustmann(1971)的發(fā)現(xiàn)，在蜂蜜樣品或其級分中過氧化氫由葡萄糖氧化酶產(chǎn)生。當(dāng)稀釋它們并且為抗菌試驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)，以現(xiàn)在的方法(Allen，MolanandReid，1991，MolanandRussell，1988)加入到這些樣品中的過氧化氫酶的量是不足以破壞所有由這種方式產(chǎn)生的過氧化氫。同樣指出的是，通過GC-MS分析的揮發(fā)物通常是花蜜的組分，并且貢獻(xiàn)花的香味。盡管存在多種揮發(fā)物，但是在蜂蜜中它們的量小，并且對于特定花源和蜂蜜獨(dú)特的組分似乎在蜂蜜中以它們的水平不具有任何抗菌特性。同樣，用于鑒定蜂蜜為單花來源的花蜜酚類成分確實(shí)具有抗氧化劑特性，但并未鑒定為具有適當(dāng)水平的抗菌活性。因此Weston(2000)的結(jié)論是迄今為止的工作忽視了UMF存在的可能性，并且建議更有可能這是因?yàn)橐蛱砑舆^氧化氫酶而被不完全破壞的異常高水平過氧化氫所致。事實(shí)上，該“獨(dú)特因子”可能是在麥盧卡蜂蜜中是否存在或缺乏大量過氧化氫酶，這可以區(qū)分活性和非活性麥盧卡蜂蜜。有高UMF值的蜂蜜，和從這種蜂蜜衍生的產(chǎn)物，是消費(fèi)者所尋求的。這與有高UMF值的蜂蜜的有益特性是否歸因于可分離的含UMF級分無關(guān)。如果與UMF活性有關(guān)的麥盧卡蜂蜜級分能夠被分離，那么能夠制備UMF強(qiáng)化蜂蜜和其他改進(jìn)的食品和藥物。還能夠增強(qiáng)麥盧卡蜂蜜的已知有利特性和有益作用。本發(fā)明的目的是提供一種制備麥盧卡蜂蜜的含UMF級份、或者至少向公眾提供有用選擇的方法。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了UMF強(qiáng)化蜂蜜。優(yōu)選蜂蜜是麥盧卡蜂蜜。優(yōu)選蜂蜜具有的UMF值高于任何未經(jīng)強(qiáng)化的麥盧卡蜂蜜的UMF值。更優(yōu)選強(qiáng)化蜂蜜具有高于25的UMF值，更優(yōu)選高于35。在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供一種制備UMF強(qiáng)化蜂蜜的方法，其包括混合蜂蜜與含UMF級份的步驟。在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，提供一種制備含UMF級份的方法，其通過從獲得該級份的樣品中基本上所有的總單糖中分離該級份。優(yōu)選該方法包括如下步驟·施加一定量的蜂蜜到基質(zhì)中；·用溶劑從該基質(zhì)上洗脫樣品；和·收集合UMF級份。優(yōu)選在洗脫樣品中存在的基本上所有單糖后開始收集含UMF級份。更優(yōu)選所收集的含UMF級份是基本上沒有樣品中存在的總量單糖。優(yōu)選蜂蜜是麥盧卡蜂蜜。優(yōu)選麥盧卡蜂蜜的量具有高于25的UMF值，更優(yōu)選高于35。優(yōu)選基質(zhì)是大小排阻基質(zhì)或反相基質(zhì)。優(yōu)選溶劑是水。優(yōu)選基質(zhì)是色譜柱的形式。在本發(fā)明第三個(gè)方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)是大小排阻和離子交換基質(zhì)。優(yōu)選平衡離子是Na+。更優(yōu)選基質(zhì)具有104的大小排阻限。更優(yōu)選基質(zhì)是苯乙烯二乙烯基苯共聚物。在本發(fā)明第三個(gè)方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)是C18。優(yōu)選基質(zhì)具有15μm粒子大小和100孔大小。盡管優(yōu)選使用全蜂蜜，但是事先從蜂蜜分離的級份或者部分，包括篩分的蜂蜜，也可用在本方法中。在本發(fā)明的笫四個(gè)方面中，提供了麥盧卡蜂蜜的含UMF級份。優(yōu)選該級份是基本上無單糖。優(yōu)選含UMF級份的抗菌活性在堿性pH下是不穩(wěn)定的。更優(yōu)選該堿性pH大于9。優(yōu)選含UMF級份是根據(jù)本發(fā)明第三個(gè)方面的方法制備的。優(yōu)選含UMF級份具有在實(shí)施例2、3和4中所述的色譜特征。優(yōu)選地，當(dāng)將包含含UMF級份的蜂蜜樣品(20μL)施加到串聯(lián)和處于鈉形式的ShodexTMSugarKS-801和KS-802分析柱上、在50℃下操作、并用Milli-Q水以1mL/分鐘的速率洗脫時(shí)，該含UMF級份具有19.4-25分鐘的停留時(shí)間。更優(yōu)選該含UMF級份具有19.4-21.7分鐘的停留時(shí)間。在本發(fā)明的第五個(gè)方面中，提供一種被本發(fā)明第四個(gè)方面的含UMF級份改進(jìn)的藥物。優(yōu)選地，該藥物是創(chuàng)傷敷料，例如在新西蘭專利公開no.501687中所述的創(chuàng)傷敷料。在本發(fā)明的第六個(gè)方面中，提供一種被本發(fā)明第四個(gè)方面的含UMF級份改進(jìn)的食品。優(yōu)選該食品是蜂蜜?！癠MF強(qiáng)化蜂蜜”指添加了分離的含UMF級份的蜂蜜。“麥盧卡蜂蜜”指主要從麥盧卡花(澳洲茶樹)衍生的植物蜂蜜?！癠MF值”指在瓊脂平板擴(kuò)散試驗(yàn)中，相對于酚相當(dāng)物測量的全或篩分蜂蜜或其級份的抗菌活性測定值。“含UMF級份”指包含非過氧化物抗菌活性的全或篩分麥盧卡蜂蜜的級份。針對級份而言的“基本上無單糖”指在該級份中單糖的量按重量計(jì)只占獲得該級份的樣品中總單糖的一小部分或可忽略的部分，例如小于總單糖的5％(w/w)，更典型小于1％(w/w)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，采用本發(fā)明可以明確檢測早先并不知道其表現(xiàn)非過氧化物活性的全蜂蜜中的含UMF級份?？蛇M(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，除了麥盧卡蜂蜜外的、目前尚未測試含UMF級份的存在情況的蜂蜜也可以表現(xiàn)非過氧化物活性。本發(fā)明將參照附圖詳細(xì)描述如下圖1使用配體交換和大小排阻色譜進(jìn)行麥盧卡蜂蜜的HPLC折射率分析。圖2通過配體交換和大小排阻色譜擴(kuò)大麥盧卡蜂蜜HPLC折射率分析的基線區(qū)域。圖3在KS-2002柱上篩分蜂蜜的HPLC。來自300mg/mL篩分蜂蜜的200μl注射液的洗脫物折射率監(jiān)測。圖4來自KS-2002柱的再注射活性級份的HPLC。來自級份4的200μl注射液(其濃度相當(dāng)于在200mg/ml篩分蜂蜜中出現(xiàn)的濃度)的洗脫物折射率監(jiān)測。圖5來自KS-2002柱的再注射活性級份的HPLC。擴(kuò)大來自級份4的200μl注射液(其濃度相當(dāng)于在200mg/mL篩分蜂蜜中出現(xiàn)的濃度)的洗脫物折射率監(jiān)測。圖6在KS-2002柱上來自級份4的20.5-25分鐘級份的HPLC。來自200μL注射液(其濃度相當(dāng)于在100mg/mL篩分蜂蜜中出現(xiàn)的濃度)的洗脫物折射率監(jiān)測。圖7在KS-2002柱上來自級份4再注射的20.5-25分鐘級份的HPLC光譜。擴(kuò)大來自該級份的200μL注射液(其濃度相當(dāng)于在100mg/mL篩分蜂蜜中出現(xiàn)的濃度)的洗脫物折射率監(jiān)測。圖8.C18柱上的HPLC。來自0.5g/mL篩分蜂蜜的2ml注射液的洗脫物折射率監(jiān)測。圖9.C18柱上的HPLC。擴(kuò)大來自0.5g/mL篩分蜂蜜的2ml注射液的洗脫物折射率監(jiān)測。圖10驗(yàn)證來自C18柱的收集在Milli-Q和MeCN中的級份。圖11活性級份的非過氧化物活性的存儲(chǔ)效果。圖12調(diào)查強(qiáng)化篩分蜂蜜的比例。圖13來自平板分組的強(qiáng)化試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。(1^2是清除區(qū)，單位mm2，比率是級份C對篩分蜂蜜的比率，單位g/g)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明確定了通常構(gòu)成干重中不到百分之一的蜂蜜小級份事實(shí)上包含所有非過氧化物活性，并且其能夠從大體積蜂蜜源中作為含UMF級份分離出來。含UMF級份可以由技術(shù)人員已知的多種方式從大體積蜂蜜中分離出來。然而，盡管早先已經(jīng)嘗試用HPLC分開和分離對蜂蜜賦予非過氧化物生物活性的活性劑，但是在現(xiàn)有技術(shù)中所用柱和溶劑的選擇妨礙了這種目標(biāo)實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中的嘗試可能已經(jīng)不知不覺地使用錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)條件或者使用不允許適當(dāng)分離從而鑒定分離級份的柱而破壞了蜂蜜的生物活性。此外，因?yàn)閁MF級份是蜂蜜的一小部分，也有可能即使早先已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了分離，但洗脫峰被無意中忽略了或者被其他化合物掩蓋。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了為分離蜂蜜中存在的主要單糖而設(shè)計(jì)的分離柱。這些主要單糖是葡萄糖和果糖。所述柱的實(shí)例包括RezexTM、NucleosilTM和ShodexTM。應(yīng)當(dāng)理解，它們只是一些實(shí)例。在通過柱洗脫蜂蜜期間，優(yōu)選收集小級份，并且使用UV吸收和折射率檢測之一或二者進(jìn)行分析以監(jiān)測感興趣級份的洗脫。ShodexTM(混合模式的配體交換和大小排阻)色譜柱已經(jīng)用于將葡萄糖和果糖與蜂蜜的其他組分分離開。已發(fā)現(xiàn)通過折射率監(jiān)測以小峰形式檢測的級份在果糖峰后洗脫。所述級份具有UV吸收，然而果糖沒有。已經(jīng)測試了該級份，并且發(fā)現(xiàn)其中包含了蜂蜜的幾乎所有非過氧化物抗菌活性。該級份被稱為含UMF級份。當(dāng)使用過氧化氫酶破壞蜂蜜的任何基于過氧化物的抗菌活性時(shí)，UMF級份的活性仍被保留。使用醚對蜂蜜進(jìn)行的液-液提取也可以用于簡化含UMF級份的分離。在這些試驗(yàn)中，醚可以除去蜂蜜中的很多非糖、有機(jī)化合物，而在剩余樣品中保留非過氧化物活性。為了進(jìn)一步純化UMF級份，可以使其多次通過柱以消除越來越多的雜質(zhì)，或者使之通過有其他種類填充樹脂的色譜柱，例如反相柱，其可以分離該級份的組分。UMF級份早先根本沒有被分離出來，或者甚至沒有被認(rèn)識(shí)到作為可分離的級份存在，盡管許多不同的研究組進(jìn)行了眾多嘗試。以前已在現(xiàn)有技術(shù)中使用了反相、生物膠P-2、XAD-40和陰離子交換柱，以嘗試分離和鑒定有非過氧化物生物活性的化合物。在這些條件下，或者不能分離所述級份，或者因?yàn)槠漭^小而沒有被認(rèn)識(shí)到，也許在早先的HPLC蜂蜜研究中被大的單糖峰所掩蓋，或者色譜條件破壞了蜂蜜的生物活性。本發(fā)明人的初步調(diào)查已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，分離的UMF級份不能出現(xiàn)在需要堿性pH的柱中，例如陰離子交換柱。已發(fā)現(xiàn)堿性條件破壞蜂蜜的活性。因此必須使用在中性pH或接近中性pH下運(yùn)行的柱。已發(fā)現(xiàn)含UMF級份在pH9下30分鐘后損失其大部分生物活性。在pH10下5分鐘后該級份被破壞。HPLC分離法一般都比這花費(fèi)更長時(shí)間。在pH11下蜂蜜的生物活性立即被破壞。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用醚提取顯示非過氧化物活性(UMF)的麥盧卡蜂蜜樣品，以除去可能干擾色譜的脂肪酸。使用抗菌試驗(yàn)測試水相和醚相，以確定UMF活性被分離在哪一相中。發(fā)現(xiàn)UMF活性保留在水相中，在醚相中沒有發(fā)現(xiàn)顯著的生物活性。為檢測蜂蜜樣品中非過氧化物活性的水平，使用過氧化氫酶破壞過氧化氫賦予給蜂蜜的任何抗菌活性。通過溶解過氧化氫酶(0.02g)在蒸餾水中(10ml)來制備過氧化氫酶溶液。將蜂蜜溶解在蒸餾水中形成1g蜂蜜/ml水的濃度，以1ml等分。然后將1ml蒸餾水(對于總活性)或者1ml過氧化氫酶溶液(單獨(dú)對于非過氧化物活性)加入到每個(gè)樣品瓶。實(shí)施例1-抗菌活性的孔擴(kuò)散試驗(yàn)通過在蒸餾水中(1L)溶解瓊脂(23g)制備營養(yǎng)瓊脂，并且在高壓滅菌前以150ml的量倒入燒瓶。當(dāng)需要時(shí)，在水浴中(30min，100℃)蒸燒瓶，然后使瓊脂溫度在另一個(gè)水浴中降低至細(xì)菌培養(yǎng)物耐受的溫度(30min，50℃)。用玻珠培養(yǎng)物無菌接種胰蛋白酶豆胨培養(yǎng)液(30g/L)，然后培養(yǎng)(18h，37℃)，得到金黃色葡萄球(S.aureus)培養(yǎng)物。使用ThermoSpectronicHeliosγ分光光度計(jì)(540nm)，用胰蛋白酶豆胨培養(yǎng)液調(diào)整金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物到0.5AU的光密度。胰蛋白酶豆胨培養(yǎng)液用作空白。在水平面上通過傾注接種有金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物(100μl，0.5OD如上制備)的150ml營養(yǎng)瓊脂制備大方格試驗(yàn)平板(Corning431111無菌生物測試皿，245mm×245mm×18mm)。一旦凝固，在4℃下倒立儲(chǔ)存該平板過夜。通過稱重全蜂蜜(1.00g)并溶解在蒸餾水(1mL)中制備全蜂蜜樣品。為了試驗(yàn)的重現(xiàn)性，對該方法輔以培養(yǎng)(37℃，30分鐘)以軟化蜂蜜，同時(shí)保持可使H2O2產(chǎn)量恒定的時(shí)間。對于不測定H2O2活性的其他試驗(yàn)，在室溫下攪拌樣品直至溶解。所得的50％(w/v)溶液進(jìn)一步通過將等體積(1∶1)的樣品與或者蒸餾水或者過氧化氫酶溶液(20mg/10mL蒸餾水)合并而稀釋，其取決于是否需要總非過氧化物活性。將來自HPLC和液/液提取的蜂蜜級份在蒸餾水中稀釋(1∶1)，以達(dá)到在分離蜂蜜前存在的相同濃度。所得的50％溶液用過氧化氫酶溶液進(jìn)一步稀釋(1∶1)，因?yàn)閮H僅對非過氧化物活性感興趣。從苯酚的10％原液(10g苯酚/100mL蒸餾水)制備2、3、4、5、6和7％的苯酚標(biāo)準(zhǔn)液。這些溶液在被替換之前在4℃暗處儲(chǔ)存長達(dá)一個(gè)月。使用8mm穿孔器和接種針在規(guī)格8×8載網(wǎng)上打孔，以移除瓊脂。用于在平板上放置樣品的模板是在平板上有16個(gè)編號(hào)并重復(fù)4次的孔的準(zhǔn)拉丁方，其在每對行和列中一次。這就允許在平板上隨意地放置樣品以消除邊緣效應(yīng)的偏差。在每個(gè)孔中(11μl)以分配的位置放置25％濃度的蜂蜜樣品和苯酚標(biāo)準(zhǔn)液。實(shí)施例2在使用515HPLC泵、2410折射率檢測器、996光電二極管陣列檢測器和Millennium操作軟件的WatersHPLC系統(tǒng)上實(shí)施高效液相色譜(HPLC)。在起始的研究中，發(fā)現(xiàn)ShodexTMSugarKS800系列柱在所有使用的柱中提供最好分離。在此，串聯(lián)使用ShodexTMSugarKS801和KS802以通過結(jié)合大小排阻和配體交換色譜對蜂蜜樣品分級分離。KS801是鈉的形式，排阻限度為103。KS802也是鈉的形式并具有104的排阻限度。兩者都填充苯乙烯二乙烯基苯。按照廠商的建議使用的操作溫度開始是80℃，流速為1mL/分鐘。洗脫液是Milli-Q水。將20mg/20μl注射液的蜂蜜樣品加樣到KS800系列HPLC柱上。圖1和2顯示了用折射率檢測獲得的繪圖。從20次注射中收集用于抗菌試驗(yàn)的級份。在圖1中，級份A從0-12分鐘收集，級份B從12-19.4分鐘間收集，級份C從19.4-25分鐘收集。該繪圖顯示葡萄糖(1)峰之后是果糖(2)峰。同樣顯示了低聚糖(3)峰。使用孔擴(kuò)散技術(shù)，用金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為測試培養(yǎng)物，測試所述分離級份的抗菌活性。在耦聯(lián)了40℃下Biichi461水浴的BiichiRE111旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在減壓下蒸發(fā)從HPLC收集用于測試的級份。該樣品在包含200μL蒸餾水和200μL過氧化氫酶溶液中再次溶解，以確保僅有非過氧化物活性存在。以25％的濃度測試蜂蜜樣品的抗菌活性。使用范圍為2％-6％的3個(gè)重復(fù)苯酚標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)施抗菌試驗(yàn)，并且將3-5個(gè)重復(fù)的測試樣品引入到瓊脂平板上已記錄的任意孔中。在37℃下培養(yǎng)所述平板過夜，以使細(xì)菌在可能的情況下生長。培養(yǎng)后，使用數(shù)字游標(biāo)卡尺測量孔周圍抑制區(qū)域的直徑。蜂蜜的非過氧化物抗菌活性完全包含在級份C中(圖1)。當(dāng)聚焦在HPLC繪圖的基線區(qū)域時(shí)，在級份C的活性區(qū)域中可見兩個(gè)峰(圖2)。為了確定哪個(gè)峰與活性有關(guān)，設(shè)計(jì)級份收集時(shí)間的另一個(gè)方案級份D0-19.4分鐘，級份E19.4-21.7分鐘，和級份F21.7-25分鐘。在這些試驗(yàn)中，所有的抗菌活性均分離在級份E中。重復(fù)該測試另外兩次，獲得了相同的結(jié)果。實(shí)施例3-蜂蜜的半制備分級分離(結(jié)合大小排阻和離子交換)先前的研究(實(shí)施例2和Snow(2001))已確定了串聯(lián)使用ShodexTMSUGARKS-801和KS-802分析柱可以從單糖的主要部分中拆分出含UMF級份。因?yàn)楸容^合乎需要的是增加可以通過柱的樣品的量，所以使用所述柱的制備型(KS-2002柱)。被篩分蜂蜜的洗脫譜的特征在于早期的酚物質(zhì)、接著二糖和低聚糖、最后是單糖。ShodexTMSUGARKS2002(20mm×300mm，20μm粒子大小，60孔大小)制備級柱結(jié)合了大小排阻和配體交換。該柱是以鈉(Na+)的形式并具有1×104排阻限度。在室溫下使用Milli-Q水作為洗脫液實(shí)施色譜，其以3mL/分鐘的流速運(yùn)行。注射300mg/mL高加樣量的蜂蜜到200μL環(huán)路中。使用996PDA和2410RI檢測監(jiān)測光譜。在大蒸發(fā)皿中冷凍干燥任何收集的級份。圖3提供了從300mg/mL篩分蜂蜜溶液的200μL注射液所獲得的洗脫譜。由于在注射前篩分蜂蜜，故與果糖峰相比而言葡萄糖峰縮小，而不是它們在全蜂蜜中所存在的大約相等濃度(Whiteetal.，1962)。大小排阻基質(zhì)通常是輕微疏水性和弱陰離子性，其導(dǎo)致不能理想地分離，由此分離不是嚴(yán)格的分子大小的函數(shù)(Cunicoetat.，1998)。該柱子使用苯乙烯二乙烯基苯作為大小排阻聚合物，其可與酚類相互作用從而進(jìn)行離子交換。因此，停留時(shí)間不是必然地意味著分子大小。開始以四個(gè)級份的形式收集柱的洗脫液10.0-13.0分鐘酚類213.0-18.4分鐘二糖和低聚糖318.4-22.6分鐘葡萄糖和果糖422.6-30.0分鐘后期洗脫物質(zhì)在18.4和30分鐘間的級份內(nèi)一致地發(fā)現(xiàn)有活性。然后嘗試將所有活性集中在一個(gè)級份中。表1從KS-2002柱收集的級份的活性各值基于a)所有平板上的單個(gè)孔，和b)各平板的酚活性的計(jì)算值.表1顯示三種不同級份收集時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果，和所得級份的非過氧化物活性。注意所示的第一試驗(yàn)使用全蜂蜜，然而后兩者使用篩分的蜂蜜。所有可檢測的活性最終被限制在19.5-25.0分鐘的級份中。這兩種級份的95％置信區(qū)間(CI＝平均數(shù)±2×SE)給于表2。置信區(qū)間不與清除區(qū)或者酚相當(dāng)物重疊，其顯示了級份4的活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與篩分蜂蜜的情況并不相同。這指示在低于試驗(yàn)的檢測限度的水平下有活性的部分損失，其或者通過吸收到柱或者分配到其他級份中而導(dǎo)致。級份4中的活性的平均量是篩分蜂蜜對應(yīng)酚活性的90％。表2在KS-2002柱上，最后試驗(yàn)的活性的清除區(qū)和酚相當(dāng)物95％的置信區(qū)間清除區(qū)的值基于單個(gè)孔，而酚相當(dāng)物的值基于從平板計(jì)算的數(shù)據(jù).由圖3可見，該級份包含幾乎所有果糖。除了減低水活性的物理作用和為葡萄糖氧化酶提供底物以產(chǎn)生H2O2和葡萄糖酸外，單糖本身不具有抗菌活性。因此，顯然有其他化合物以低濃度存在于該級份中。Snow(2001)在使用所述柱的分析級型的研究中觀察到果糖峰尾部的小峰。Snow(2001)嘗試分離該級份，并且通過GC-MS和NMR鑒定其組成。然而，樣品中組分多表明該結(jié)果不是結(jié)論性的。也嘗試將該峰的大小和全蜂蜜的活性聯(lián)系起來，但并未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)系。這指示該峰由很多化合物組成，其中至少有一種沒有活性。Snow(2001)注意到與所述活性級份相關(guān)的峰是UV活性的。因?yàn)橹闹苽湫蕴卣鹘档土朔直媛?，以及該區(qū)域中弱UV活性開鏈單糖的高濃度造成的干擾，所以該操作不能鑒定這些UV活性峰。決定再次注射級份4以獲得無單糖的級份。被再次注射的級份的光譜(圖4)沒有顯示在單糖峰尾部有集中峰的證據(jù)，但注意到在10.5分鐘出現(xiàn)新的峰。單糖峰開始處的凸起可能是殘留的葡萄糖?；€的擴(kuò)大顯示在圖5。糖類通常會(huì)提高有限可溶分子在水性體系中的溶解度。因此，有可能存在與所述糖類結(jié)合或者被其溶解化的化合物。當(dāng)糖類濃度降低時(shí)，它們離解并且更早地被洗脫。有可能所這一峰就是活性因子，并且該峰的大小與負(fù)責(zé)該非過氧化物活性的化合物以異常低的濃度存在的觀點(diǎn)一致?；蛘撸赡苁墙到猱a(chǎn)物，因?yàn)樗玫臉悠芬呀?jīng)在冷凍機(jī)中儲(chǔ)存了一個(gè)月。然而，在再次注射前對樣品中的活性進(jìn)行的測試顯示無活性損失，這得到了活性級份在分離后在冷凍機(jī)中儲(chǔ)存超過2個(gè)月仍然保持穩(wěn)定這些發(fā)現(xiàn)的支持。有可能所述峰反映非抗菌組分的降解。收集來自再次注射的級份4的20.5-25.0分鐘級份，并且再次注射以調(diào)查Snow(2001)觀察到的活性峰是否仍然能被鑒定出來。顯然在10.5分鐘處觀察到的新峰在光譜中也出現(xiàn)(圖6和圖7中的擴(kuò)大圖)，但是大為降低。這暗示該峰不是儲(chǔ)存的降解產(chǎn)物，并且的確可以反映活性由糖類所解離。對于再次注射級份的活性的生物試驗(yàn)，沒有收集到足夠大的量(為了非常粗略的指示活性，需要最少200mg蜂蜜通過柱，或者對于嚴(yán)格的活性試驗(yàn)需要800mg)。對于再次注射后色譜行為的變化無法下任何結(jié)論。決定不繼續(xù)該方法，代之以嘗試不同方法的分離和更高容量的柱。實(shí)施例4-蜂蜜的半制備分級分離(反相)C1825mm反相柱的優(yōu)點(diǎn)是具有顯著更大的容量，從而一次可以注射1g在柱子上，而不象在KS-2002柱上僅注射60mg。所用的反相制備柱是3個(gè)串聯(lián)的Delta-PakC18柱體(25mm×100mm，15μm粒子大小，100孔大小)。其裝配了Delta-C18保護(hù)內(nèi)插件(25mm×10mm，15μm粒子大小，100孔大小)。在室溫下以10mL/分鐘的流速，用0.5g/mL高加樣量進(jìn)入2mL環(huán)路實(shí)施色譜。使用兩種不同的洗脫液體系。第一種中僅使用Milli-Q水。然而，后來決定以100％Milli-Q水開始運(yùn)行，然后在糖類被洗脫后轉(zhuǎn)換成100％乙腈。由于所用的高流速，只可能使用大口徑垂直的Waters410差示折射計(jì)檢測。水中收集的級份在大蒸發(fā)皿中冷凍干燥。MeCN中收集的級份在減壓真空下濃縮，然后在冷凍干燥機(jī)上完全干燥。這樣大量地減少了為活性生物試驗(yàn)收集足夠樣品所花費(fèi)的時(shí)間。此外，比較感興趣的是是否所述柱能夠更有效地從單糖中拆分出該活性。圖8顯示了在高柱加樣量下(0.5g/ml，2mL注射液)以Milli-Q水運(yùn)行，使用該柱獲得的光譜。單糖峰在光譜中占主要。該柱不能從果糖中拆分出葡萄糖，但是它確實(shí)顯示在單糖后馬上洗脫的一組峰，大約14-25分鐘。這些峰中的某些歸因于低聚糖，其在活性麥盧卡蜂蜜中以大約總蜂蜜8％的水平存在(WestonandBrocklebank，1999)。圖9顯示了證實(shí)這些峰的基線擴(kuò)大。初始時(shí)以四個(gè)級份的形式收集柱的洗脫液A0.0-8.3分鐘初期洗脫物質(zhì)B8.3-11.8分鐘糖類C11.8-25.0分鐘后期洗脫物質(zhì)發(fā)現(xiàn)所有可檢測的活性洗脫在級份C中(表3)。表3C18柱上起始收集的級份的活性.各值基于a)所有平板上的單個(gè)孔，和b)各平板上酚活性的計(jì)算值.比較感興趣的是是否該活性的一部分能夠通過MeCN洗脫下來，因?yàn)檫@可以顯示該級份的差別溶解度。此外，有必要確定用Milli-Q水是否從柱中洗脫下所有活性。在反相色譜中MeCN是比H2O更強(qiáng)的溶劑，所以它能用于從柱中沖洗下任何殘留的物質(zhì)。收集的級份如圖10所示。如前面所述，開始用Milli-Q水運(yùn)行柱，然后收集級份A和B。在橫跨級份B到級份C處(11.8分鐘)，停止泵，并且將溶劑直接轉(zhuǎn)換為100％MeCN。正如通過溶劑折射率變化引起的在基線中的快速升高所指示，從11.8分鐘開始收集級份CH2O直至MeCN達(dá)到檢測器(大概13分鐘或者在24分鐘停留時(shí)間處)。從此時(shí)起，通過柱沖洗MeCN的3個(gè)柱體積，并且收集洗脫液作為級份CMeCN。如表4所示，所有可檢測的活性保留在級份CH2O中，并且不與CMeCN相關(guān)聯(lián)。這顯示活性未被柱可逆地保留。級份C和CH2O僅分別占篩分蜂蜜相當(dāng)物苯酚活性的72％和75％，沒有其他級份顯示可檢測的活性。這暗示該活性可能已經(jīng)不可逆地結(jié)合在柱上。所用柱是制備型的，并且由在非封端的硅支持物上的C18鏈組成，有可能該物質(zhì)已經(jīng)黏附到硅上，或者甚至通過與活性硅烷醇基團(tuán)反應(yīng)而已經(jīng)分解。此外，該級份一貫地顯示部分活性的變化水平。在這種特定情況中，這可能是由于當(dāng)糖類含量降低時(shí)，在試驗(yàn)中缺乏非過氧化物活性的擴(kuò)散性所致。表4.來自C18柱反相色譜的級份的重量和活性.值基于a)重復(fù)的HPLC試驗(yàn)，b)所有平板上的單個(gè)孔，和c)單個(gè)平板上酚活性的測定值.比較KS-2002和C18Delta-PakC18活性級份包含比KS-2002活性級份少得多的糖類，并且反映了該活性與所述糖類的更好分離。相反，從KS-2002柱回收了更高比例的活性，這可能反映了活性物質(zhì)與C18柱中硅支持物的化學(xué)相互作用。與C18柱級份中的部分活性相反，在來自KS-2002柱的活性級份中觀察到全部活性。然而，這可能與試驗(yàn)中KS-2002級份的更高糖類含量幫助擴(kuò)散有關(guān)。實(shí)施例5-在含UMF級份中非過氧化物活性的穩(wěn)定性早先的作者已注意到，在加熱(Bogdanov，1984；MolanandRussell，1988；RothetaL.，1986)或儲(chǔ)存(Bogdanov，1984；Sealey，1988)蜂蜜后，具有非過氧化物活性的蜂蜜剩余有顯著的活性，并且這是導(dǎo)致提議非過氧化物活性的觀察的部分。該研究著眼于在室溫和冰箱溫度下經(jīng)短期(8-24小時(shí))，和在冷凍機(jī)溫度下經(jīng)中等時(shí)期(1-8周)儲(chǔ)存時(shí)在分離的HPLC級份中的穩(wěn)定性。與試驗(yàn)期間一樣，這是具有實(shí)際的意義，我們希望確定該級份不是正在降解，因而活性的任何損失都是由于非活性組分的去除。此外，知道多少樣品能被“貯存堆積”以便用于測試是有用的。附帶的興趣是觀察在儲(chǔ)存中該活性是否由于在工業(yè)中暗示儲(chǔ)存能增加全蜂蜜活性的軼事證據(jù)而確實(shí)能夠增加。表5給出該試驗(yàn)的綜合結(jié)果，并且該結(jié)果直觀地顯示在圖11。表5.穩(wěn)定性試驗(yàn)的綜合數(shù)據(jù).值基于a)所有平板上的單個(gè)孔，和b)單個(gè)平板的酚活性的計(jì)算值.在KS-2002柱上分離篩分蜂蜜，并且收集19.5-25分鐘間的級份，然后立即轉(zhuǎn)移至冷凍機(jī)。當(dāng)完成當(dāng)天的注射后，冷凍干燥該級份。一旦干燥，用蒸餾水將它們重溶成50％的強(qiáng)度，然后或者在室溫或者在冰箱或冷凍機(jī)中儲(chǔ)存一段時(shí)間。每個(gè)樣品相當(dāng)于480mg的篩分蜂蜜。儲(chǔ)存后，將樣品稀釋成25％的強(qiáng)度，并且在雙份板上的四個(gè)孔中測試，以調(diào)查是否出現(xiàn)活性的任何損失或獲得。該結(jié)果與在相同平板上測試的新鮮收集活性級份的活性相比較。此外，冷凍干燥兩個(gè)重復(fù)的篩分蜂蜜以調(diào)查冷凍干燥過程對蜂蜜活性的影響。表6給出原始級份的保留百分?jǐn)?shù)原始活性的保留在清除區(qū)中是94-106％，在酚相當(dāng)物這是86-114％。因此，各種形式的儲(chǔ)存已經(jīng)對分離的活性級份中的非過氧化物活性產(chǎn)生某些影響。表6.在儲(chǔ)存的級份中非過氧化物的活性的保留.原始活性的百分表.表7提供這些結(jié)果的REML分析。該結(jié)果顯示儲(chǔ)存中活性的某些改變在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比較顯著。使用清除區(qū)數(shù)據(jù)，室溫和冰箱樣品都顯著地低于對照。在這些處理中酚相當(dāng)物沒有顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，這很可能是由于數(shù)據(jù)組的重復(fù)更少，所以較大的標(biāo)準(zhǔn)誤差模糊了預(yù)計(jì)平均值間的任何差異。在八周冷凍級份的清除區(qū)數(shù)據(jù)中，以及在四周冷凍級份的酚相當(dāng)物數(shù)據(jù)中也可見活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。然而，本實(shí)驗(yàn)中的局限是沒有重復(fù)地實(shí)施這些處理，并且是在同一天在雙份板上進(jìn)行測試。因此，各日之間的變化可以在確定顯著性中發(fā)揮重要作用。使用酚標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生酚相當(dāng)物可給出比使用清除區(qū)甚至更寬范圍的值，暗示酚標(biāo)準(zhǔn)物沒有補(bǔ)償這些日之間效果。盡管這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，仍然可觀察活性的良好保留。在冷凍機(jī)中儲(chǔ)存的某些樣品也有增加活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性證據(jù)。然而，由于沒有重復(fù)進(jìn)行這些處理，在該實(shí)驗(yàn)中日之間和板之間效果的影響仍然未知。表7.有關(guān)儲(chǔ)存活性HPLC級份后，非過氧化物的活性變化的顯著性的統(tǒng)計(jì)信息.平均值間的差異用處理的預(yù)測平均值減去對照的運(yùn)測平均值表示值基于a)所有平板上的單個(gè)孔，和b)單個(gè)平板上酚活性的計(jì)算值.實(shí)施例6-蜂蜜的強(qiáng)化有格外高抗菌活性的蜂蜜通常不會(huì)天然出現(xiàn)，故它們的要價(jià)很高。因此，如果能夠開發(fā)一種方法來濃縮因活性太低而在醫(yī)學(xué)上沒有用處的蜂蜜的活性，或者將已經(jīng)具有高活性的蜂蜜的潛力提高到天然條件下不能常規(guī)獲得的水平，將會(huì)有商業(yè)上的優(yōu)勢。這僅僅對濃縮非過氧化物活性(UMF)有用，因?yàn)榉涿鄣倪^氧化物活性是原位產(chǎn)生的，并且其取決于過氧化物破壞物的濃度和葡萄糖過氧化酶的穩(wěn)定性。由于反相HPLC能夠拆分UMF，并且該柱能處理大加樣量的樣品，因此，與大小排阻/離子交換上的級份4相反，收集級份C(用100％Milli-Q水洗脫)，并且用于強(qiáng)化篩分蜂蜜。為產(chǎn)生強(qiáng)化的樣品，向在1ml蒸餾水中的1g未加工的篩分蜂蜜添加級份C(從1g篩分蜂蜜的分離中產(chǎn)生)。該50％溶液進(jìn)一步用過氧化氫酶稀釋成25％溶液。因此，樣品在技術(shù)上具有雙倍于篩分蜂蜜對照的UMF量。初步試驗(yàn)(表8)顯示與篩分蜂蜜的活性相比獲得了少量的增加。表8.初始調(diào)查篩分蜂蜜的強(qiáng)化值基于a)所有平板上的單個(gè)孔，和b)單個(gè)平板上酚活性的計(jì)算值.這占了篩分蜂蜜的對應(yīng)酚活性的23.5％增加。因?yàn)闆]有觀察到雙倍的活性，所以擴(kuò)展本實(shí)驗(yàn)到包括強(qiáng)化的增加水平，以調(diào)查是否有可能對增加劑量的活性級份產(chǎn)生正比例的應(yīng)答。每個(gè)劑量包括向1g如上所述未加工的篩分蜂蜜中以相當(dāng)于1、2和3g篩分蜂蜜中的濃度添加級份C。表9顯示所得樣品的活性，圖12以圖表形式顯示了清除區(qū)的結(jié)果。表9.調(diào)查強(qiáng)化的篩分蜂蜜的比例性.值基于a)所有平板上的單個(gè)孔，和b)單個(gè)平板上酚活性的計(jì)算值.觀察到強(qiáng)關(guān)聯(lián)性(R2＝0.9874)，指示出現(xiàn)了正比例的應(yīng)答。這確定有可能增加蜂蜜的非過氧化物活性。然而，線性回歸分析顯示，在測試這些樣品中所用的雙份板在梯度上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(p值＝0.011)。由圖13的Minitab結(jié)果可見這些曲線。觀察到象這樣的平板效果并非不尋常。如已討論的，在WDA方法中平板變化是最重要變量之一，因此所有樣品都在雙份板上進(jìn)行測試，對其平均以補(bǔ)償這種作用。作為替代，相比于其他三種強(qiáng)化水平，在1∶3強(qiáng)化(比率3，圖13)的數(shù)據(jù)點(diǎn)在兩條曲線之間顯示更多的變化。因此可能某些局限于該點(diǎn)的某些因素使曲線歪斜。這可能是簡單地因?yàn)楫?dāng)加入到兩個(gè)平板時(shí)該樣品不均一。然而，在高活性下本實(shí)驗(yàn)沒有如此敏感。對此的原因有三層(i)清除區(qū)可能重疊，其趨向引起清除區(qū)延長，使測量困難。(ii)分散更加易變。(iii)清除區(qū)能超過最高標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，小心地隔開各級份以減小清除區(qū)重疊的機(jī)會(huì)，然而，1∶3的強(qiáng)化樣品接近活性的最高標(biāo)準(zhǔn)。不管這些考慮，現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)了制備麥盧卡蜂蜜的含UMF級份的方法和它在強(qiáng)化蜂蜜中的應(yīng)用。在前面的描述中提及具有已知相當(dāng)物的整數(shù)或組分之處，這樣的相當(dāng)物象單獨(dú)列出一樣引入本文中。盡管已經(jīng)通過實(shí)施例并參考其可能的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，可以對其進(jìn)行改良和/或修改而不離開本發(fā)明的范圍或精神。參考文獻(xiàn)Abuharfeil，N.；Al-Oran，R.；Abo-Shehada，M.(1999)TheeffectofbeehoneyonproliferativeactivityofhumanB-&T-lymphocytesandtheactivityofphagocytesFood&Agri.Invn.11，169-177Adcock，D.(1962)TheeffectofcatalaseontheinhibineandperoxidevaluesofvarioushoneysJ.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