亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

篩選方法

文檔序號(hào):1107746閱讀:504來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在刺激攝食(進(jìn)食)、增加體重和增肥中有有益效果的多肽;含有所述多肽的治療劑;篩選活化或抑制所述多肽受體的化合物、物質(zhì)或其鹽的方法;用于所述篩選的試劑盒;以及包含抑制所述多肽表達(dá)的物質(zhì)的藥劑,諸如攝食抑制劑、治療肥胖的治療劑以及治療糖尿病的治療劑。
背景技術(shù)
攝食(進(jìn)食)為動(dòng)物存活所必需的行為。肥胖被認(rèn)為是我們目前社會(huì)飽食年代中未能成功控制或平衡攝食和能量消耗的結(jié)果。由于肥胖為生活方式疾病和各種其它疾病的危險(xiǎn)因素,其社會(huì)關(guān)注日益增加。盡管已具有諸如飲食療法和鍛煉療法的改善攝食和能量消耗之間平衡的基礎(chǔ)療法,目前肥胖的患者和候選者數(shù)量仍在不斷增加。最近,已開(kāi)發(fā)了在外周組織抑制營(yíng)養(yǎng)吸收的藥劑和通過(guò)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起作用而減少攝食量的藥劑;但是人們希望開(kāi)發(fā)出有效和安全的用于抑制攝食量的治療劑作為治療肥胖的藥劑。
已逐漸顯示出攝食行為是由循環(huán)控制,該循環(huán)具有來(lái)自大腦中樞神經(jīng)的指示和外周組織的反饋,由此由中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出進(jìn)一步的指示。因此,集中在起重要作用的大腦中攝食控制機(jī)制的研究已盛行。通過(guò)采用腦特定區(qū)域已損壞的動(dòng)物的研究和采用神經(jīng)肽或神經(jīng)遞質(zhì)的功能分析,已逐漸揭示下丘腦區(qū)域在攝食行為方面起重要作用。另外,下丘腦中表達(dá)數(shù)種神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽和它們的受體,由此已顯示出它們與攝食行為的相關(guān)性。例如,已有報(bào)道,存在于下丘腦的弓狀核中的神經(jīng)肽Y、肥胖相關(guān)基因(agouti gene)相關(guān)肽等涉及攝食刺激,以及存在于相同區(qū)域的黑皮質(zhì)素和下丘腦室旁核釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和促甲狀腺激素釋放激素涉及攝食抑制(非專(zhuān)利參考文獻(xiàn)1)。但是,關(guān)于復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)控制攝食,未知的還有很多,并且關(guān)于新的神經(jīng)遞質(zhì)和它們的位置的新發(fā)現(xiàn)仍然不斷出現(xiàn)。
涉及控制攝食行為的諸如神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的生理活性物質(zhì)通過(guò)存在于細(xì)胞膜上的特異受體發(fā)揮它們的功能。在這些受體中,具有7次穿過(guò)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)并與細(xì)胞內(nèi)G蛋白三聚體偶聯(lián)的受體特別分類(lèi)為G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCRs)。當(dāng)與特異的配體結(jié)合時(shí),GPCRs將信號(hào)傳遞進(jìn)細(xì)胞以活化或抑制細(xì)胞,并由此在各種器官中表現(xiàn)功能方面起重要作用。因此,活化GPCR的激動(dòng)劑和抑制GPCR的拮抗劑已用作藥物。在分類(lèi)進(jìn)GPCR的受體中,已知有許多還未鑒別出特異配體,并稱(chēng)為孤兒GPCR。孤兒GPCR有可能成為新的治療劑的靶標(biāo),因此正在進(jìn)行它們配體的鑒別和活化或抑制它們功能的物質(zhì)的研究。在新藥物開(kāi)發(fā)方面,通過(guò)向身體給予鑒別的配體或物質(zhì)闡明受體和它們的配體的功能是極其重要的。
近幾年,遺傳序列信息的豐富使預(yù)測(cè)和鑒別未知肽或蛋白作為新GPCR配體成為可能,這通過(guò)基于已知蛋白或肽的序列推理其同源性和規(guī)律性(regularity)進(jìn)行。胰島素/松弛素家族的成員松弛素為黃體或胎盤(pán)產(chǎn)生的分泌性激素,早就知道其具有涉及妊娠維持和分娩的功能。作為另一功能,例如最近報(bào)道了在大鼠中靜脈給予松弛素-2刺激水的吸收(非專(zhuān)利參考文獻(xiàn)2);但是,尚不知松弛素和攝食行為的相關(guān)性?;诰幋a松弛素的DNA的堿基序列,由基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)新鑒定的DNA序列編碼的蛋白為稱(chēng)為松弛素-3/INSL的多肽(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。據(jù)報(bào)道由此發(fā)現(xiàn)的松弛素-3活化細(xì)胞,引起免疫系統(tǒng)的THP-1細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán)AMP(cAMP)的增加(專(zhuān)利文獻(xiàn)2,非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。后來(lái)顯示松弛素-3以及松弛素-2為結(jié)合LGR7,一種GPCR,的配體之一(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。LGR7在腦和外周組織中表達(dá),到目前已顯示涉及生殖器官的發(fā)育、妊娠和分娩;但是,其與攝食的相關(guān)性還未被清楚地了解。
最近報(bào)道了未在體內(nèi)鑒別出配體的GPCR,即稱(chēng)為SALPR(GPCR135)的受體和稱(chēng)為GPR100(hGPCR11,GPCR142)的受體,的配體為松弛素-3(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5和6;專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。此外,專(zhuān)利文獻(xiàn)4-7也包括涉及這些受體的說(shuō)明。已知SALPR定位在腦部(非專(zhuān)利文獻(xiàn)7),尤其報(bào)道定位在下丘腦的室旁核和視上核(專(zhuān)利文獻(xiàn)3;非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。另一方面,已報(bào)道GPR100為全身性表達(dá)的受體(非專(zhuān)利文獻(xiàn)8和9);但是,其功能仍未知。
在另一方面,已報(bào)道松弛素-3存在于腦部稱(chēng)為腦橋的區(qū)域(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6),已考慮到松弛素-3可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為腦內(nèi)肽起某些作用;但是,沒(méi)有關(guān)于松弛素-3是否控制攝食或松弛素-3是否涉及體重控制的報(bào)道。另外,還未知松弛素-3是否涉及肥胖。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1WO 01/068862專(zhuān)利文獻(xiàn)2日本專(zhuān)利公開(kāi)No.2002-345468專(zhuān)利文獻(xiàn)3WO 2004/082598專(zhuān)利文獻(xiàn)4WO 00/24891專(zhuān)利文獻(xiàn)5WO 01/48189專(zhuān)利文獻(xiàn)6WO 02/31111專(zhuān)利文獻(xiàn)7WO 02/61087非專(zhuān)利文獻(xiàn)1Spiegelman et al.,Cell,104,p.541-543,2001非專(zhuān)利文獻(xiàn)2Sinnayah et al.,Endocrinology,140,p.5082-5086,1999非專(zhuān)利文獻(xiàn)3Bathgate et al.,J.Biol.Chem.,277,p.1148-1157,2002非專(zhuān)利文獻(xiàn)4Sudo et al.,J.Biol.Chem.,278,p.7855-7862,2003非專(zhuān)利文獻(xiàn)5Takeda et al.,F(xiàn)EBS Letter,520,p.97-101,2002非專(zhuān)利文獻(xiàn)6Liu et al.,J.Biol.Chem.,278,p.50754-50764,2003非專(zhuān)利文獻(xiàn)7Matsumoto et al.,Gene,248,p.183-189,2000非專(zhuān)利文獻(xiàn)8Liu et al.,J.Biol.Chem.,278,p.50765-50770,2003非專(zhuān)利文獻(xiàn)9Boels et al.,Br.J.Pharmacol.,140,p.932-938,200
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明涉及在刺激攝食(開(kāi)胃的)、增加體重和增肥中有有益效果的多肽;含有所述多肽的治療劑;篩選活化或抑制所述多肽的受體的化合物、物質(zhì)或其鹽的方法;用于所述篩選的試劑盒;以及包含抑制所述多肽表達(dá)的物質(zhì)的試劑,諸如攝食抑制劑、治療肥胖的治療劑以及治療糖尿病的治療劑。
解決問(wèn)題的手段作為為解決上述問(wèn)題而進(jìn)行的大量研究的結(jié)果,本發(fā)明人通過(guò)用松弛素-3向大鼠腦室內(nèi)給藥并在給藥后觀察攝食量,發(fā)現(xiàn)松弛素-3具有刺激攝食(開(kāi)胃的)活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn),通過(guò)在向大鼠單次給予松弛素-3后測(cè)量大鼠的血液樣品,已知為身體脂肪增加指數(shù)的血液瘦素濃度增加。此外,當(dāng)松弛素-3連續(xù)地向大鼠腦室內(nèi)給藥時(shí),與對(duì)照載體給藥組比較,觀察到松弛素-3給藥組顯著的攝食增加和體重增加。在連續(xù)給予松馳素-3組和對(duì)照組之間沒(méi)有觀察到運(yùn)動(dòng)行為的差異。這些結(jié)果首次表明,松弛素-3具有增加體重活性以及刺激攝食活性。另外,在通過(guò)給予松弛素-3而體重增加的大鼠中,觀察到脂肪重量增加和與身體脂肪含量有關(guān)的血液瘦素濃度增加。涉及糖尿病的胰島素濃度也增加了。因此,認(rèn)為松弛素-3為具有刺激攝食活性、增加體重活性和增肥活性的多肽。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而完成。
換言之,本發(fā)明涉及(1)一種攝食刺激劑,包括包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
(2)一種增加體重的試劑,包括包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
(3)一種增加脂肪重量的試劑,包括包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
(4)一種篩選刺激攝食的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(5)一種篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
(6)根據(jù)以上(5)所述的篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的方法,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(7)根據(jù)以上(4)、(5)或(6)所述的篩選方法,其中松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
(8)根據(jù)以上(7)所述的篩選方法,其中SALPR為含有SEQ IDNO4表示的氨基酸序列的多肽。
(9)一種篩選刺激攝食的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(10)一種篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
(11)根據(jù)以上(10)所述的篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的試劑盒,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(12)根據(jù)以上(9)、(10)或(11)所述的篩選試劑盒,其中松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
(13)根據(jù)以上(12)所述的篩選試劑盒,其中SALPR為包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
(14)一種治療需要增加體重的疾病的治療劑,包括包含SEQ IDNO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
(15)根據(jù)以上(14)所述的治療劑,其中所述的疾病為厭食癥或惡病質(zhì)。
(16)一種篩選增加體重的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(17)一種篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
(18)根據(jù)以上(17)所述的篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的方法,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(19)根據(jù)以上(16)、(17)或(18)所述的篩選方法,其中所述的松弛素-3為SALPR或其部分多肽。
(20)根據(jù)以上(19)所述的篩選方法,其中SALPR為包含SEQID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
(21)一種篩選增加體重的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(22)一種篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
(23)根據(jù)以上(22)所述的篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的試劑盒,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(24)根據(jù)以上(21)、(22)或(23)所述的篩選試劑盒,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
(25)根據(jù)以上(24)所述的篩選試劑盒,其中SALPR為包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
(26)一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,包括以下步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(27)一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
(28)根據(jù)以上(27)所述的篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(29)根據(jù)以上(26)、(27)或(28)所述的篩選方法,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
(30)根據(jù)以上(29)所述的篩選方法,其中SALPR為包含SEQID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
(31)一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(32)一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
(33)根據(jù)以上(32)所述的篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的試劑盒,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
(34)根據(jù)以上(31)、(32)或(33)所述的篩選方法,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
(35)根據(jù)以上(34)所述的篩選試劑盒,其中SALPR為包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
(36)一種抑制攝食的試劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
(37)根據(jù)以上(36)所述的試劑,其中所述具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)以上(7)或(8)所述的篩選方法獲得的化合物。
(38)一種降低體重的試劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
(39)根據(jù)以上(38)所述的試劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)以上(19)或(20)所述的篩選方法獲得的化合物。
(40)一種減少脂肪重量的試劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
(41)根據(jù)以上(40)所述的試劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)以上(29)或(30)所述的篩選方法獲得的化合物。
(42)一種治療肥胖的治療劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
(43)根據(jù)以上(42)所述的治療劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)以上(19)、(20)、(29)和(30)任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的化合物。
(44)一種治療糖尿病的治療劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
(45)根據(jù)以上(44)所述的治療劑, 其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)以上(19)、(20)、(29)和(30)任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的化合物。
(46)根據(jù)以上(36)-(45)任一項(xiàng)所述的試劑,其中SALPR為包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
(47)一種篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的方法,包括將作用于松弛素-3受體的化合物向人或非人生物體給藥并且在給藥后測(cè)量攝食量的步驟。
(48)根據(jù)以上(47)所述的方法,其中所述的作用于松弛素-3受體的化合物為通過(guò)以上(4)-(8)任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的化合物。
(49)一種篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的方法,包括將作用于松弛素-3受體的化合物向人或非人生物體給藥并且在給藥后測(cè)量體重的步驟。
(50)根據(jù)以上(49)所述的方法,其中所述的作用于松弛素-3受體的化合物為通過(guò)以上(16)-(20)任一項(xiàng)所述的方法獲得的化合物。
(51)一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,包括將作用于松弛素-3受體的化合物向人或非人生物體給藥并且在給藥后測(cè)量肥胖指標(biāo)的步驟。
(52)根據(jù)以上(51)所述的方法,其中所述的作用于松弛素-3受體的化合物為通過(guò)以上(26)-(30)任一項(xiàng)所述的方法獲得的化合物。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示pBabeCL(SALPR)IH的構(gòu)建。
圖2A顯示CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)的構(gòu)建。
圖2B顯示pBabeCLX的構(gòu)建。
圖2C顯示pBabeCLcre4vPdNN的構(gòu)建。
圖3顯示松弛素-3特異性地劑量依賴(lài)地抑制在表達(dá)SALPR的SE302細(xì)胞中由于添加毛喉素而增加的轉(zhuǎn)錄活性。黑方框顯示添加了松弛素-3的情況。白方框顯示添加胰島素的情況。橫軸上的數(shù)字顯示添加的每種配體的最終濃度(nmol/L)??v軸上的數(shù)字顯示計(jì)算出的相對(duì)活性,該計(jì)算將添加1μmol/L毛喉素的細(xì)胞上清液的堿性磷酸酶活性設(shè)為100,無(wú)毛喉素的設(shè)為0。每一點(diǎn)顯示平均值(N=3)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4顯示采用SALPR-SE302細(xì)胞評(píng)估(篩選)松弛素-3拮抗劑化合物。圖4A為采用SALPR-SE302細(xì)胞的情況,圖4B為采用SE302細(xì)胞的情況。在圖中,F(xiàn)K(-)顯示無(wú)毛喉素處理組;FK(+),3μM毛喉素處理組;FK(+)&RLX-3,毛喉素和3nM松弛素-3處理組;以及FK(+)&RLX-3&化合物1,用毛喉素、松弛素-3和化合物1的組合處理的組。
圖5顯示向正常大鼠腦室內(nèi)單次給予松弛素-3對(duì)攝食量的作用。白長(zhǎng)方形條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑長(zhǎng)方形條顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組每只動(dòng)物攝食量(g)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6顯示向正常大鼠腦室內(nèi)單次給予松弛素-3對(duì)血液瘦素濃度的作用。白長(zhǎng)方形條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑長(zhǎng)方形條顯示給予松弛素-3組。縱軸顯示每組中血液瘦素濃度(ng/ml)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖7顯示向正常大鼠腦室內(nèi)持續(xù)給予松弛素-3對(duì)體重增加的作用。白長(zhǎng)方形條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑長(zhǎng)方形條顯示給予松弛素-3組。縱軸顯示每組中每只動(dòng)物增加的體重(g)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖8顯示向正常大鼠腦室內(nèi)持續(xù)給予松弛素-3對(duì)攝食量的作用。白方框顯示載體給藥組(對(duì)照),黑方框顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組中每只動(dòng)物攝食量(g)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖9顯示向正常大鼠腦室內(nèi)持續(xù)給予松弛素-3對(duì)附睪脂肪重量的作用。白長(zhǎng)方形條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑長(zhǎng)方形條顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組中每只動(dòng)物脂肪重量(g)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖10顯示向正常大鼠腦室內(nèi)持續(xù)給予松弛素-3時(shí)血液激素水平的變化。圖10A顯示對(duì)血液瘦素濃度的作用。白長(zhǎng)方形條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑長(zhǎng)方形條顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組中每只動(dòng)物血液瘦素濃度(ng/ml)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖10B顯示對(duì)血液胰島素濃度的作用。白長(zhǎng)方形條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑長(zhǎng)方形條顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組中每只動(dòng)物血液胰島素濃度(ng/ml)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖11顯示腦室內(nèi)連續(xù)給予松弛素-3的大鼠的體重增加的變化,并在飼養(yǎng)時(shí)測(cè)量它們的自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為。白方框顯示載體給藥組(對(duì)照),黑方框顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組中每只動(dòng)物增加的體重(g)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖中,白三角表示在有光期間測(cè)量運(yùn)動(dòng)行為的幾天,黑三角表示在黑暗期間測(cè)量運(yùn)動(dòng)行為的幾天。
圖12顯示向大鼠腦室內(nèi)持續(xù)給予松弛素-3對(duì)自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為的影響。白條顯示載體給藥組(對(duì)照),黑條顯示給予松弛素-3組??v軸顯示每組中每只動(dòng)物總運(yùn)動(dòng)行為(計(jì)數(shù))的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施本發(fā)明的最優(yōu)方式松弛素-3用在本發(fā)明中的“松弛素-3”為通過(guò)基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)新發(fā)現(xiàn)的稱(chēng)為松弛素-3(也即INSL7(GenBank登錄號(hào)NM_080864))的多肽(J.Biol.Chem.277,1148-1157,2002),含義為(i)包含SEQ ID NO2代表的氨基酸序列的多肽。另外,松弛素-3還意在包括(ii)修飾的多肽,其在功能上等同于包含SEQ ID NO2代表的氨基酸序列的多肽,以及(iii)包含氨基酸序列的同源多肽,該氨基酸序列與包含SEQ ID NO2代表的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列有70%或以上的同源性。用在本發(fā)明中的松弛素-3優(yōu)選為“包含SEQ ID NO2代表的氨基酸序列的多肽”。另外,上述多肽意在包括該多肽的鹽,以及有和無(wú)糖鏈的那些。
本文采用的術(shù)語(yǔ)“功能上等同的修飾多肽(以下稱(chēng)為修飾多肽)”指一種多肽,該多肽具有有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸刪除、置換、插入和/或添加并具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的修飾的氨基酸序列,并展示與松弛素-3基本相同的活性[例如松弛素-3受體結(jié)合能力、與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)、攝食刺激、體重增加和增肥]。
本說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)“置換”指用其它化學(xué)上類(lèi)似的氨基酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基,以便基本上不改變肽活性。例如,特定的疏水殘基可由另一疏水殘基置換,特定的極性殘基可由另一具有相同電荷的極性殘基置換。對(duì)每一氨基酸來(lái)說(shuō)能進(jìn)行這些置換的功能上類(lèi)似的氨基酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。更具體地,非極性(疏水)氨基酸的實(shí)例包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。極性(中性)氨基酸的實(shí)例包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。帶正電荷(堿性)氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、組氨酸和賴(lài)氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸的實(shí)例包括天冬氨酸和谷氨酸。
要?jiǎng)h除、置換、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目例如為1-30、優(yōu)選1-20、更優(yōu)選1-10、再更優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-2。另外,上述的修飾多肽意圖包括修飾多肽的鹽,包括有糖鏈和無(wú)糖鏈的那些。因此,只要滿足以上條件,上述的修飾多肽的來(lái)源并不限于人。例如,包括衍生自不同于人的生物體[例如非人的哺乳動(dòng)物(例如,小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)]的松弛素-3和其變異體。
只要上述的同源多肽包含與松弛素-3的氨基酸序列有70%或以上的同源性的氨基酸序列,則該同源多肽并無(wú)特別限制;這意味著包含與松弛素-3優(yōu)選有80%或以上、再優(yōu)選85%或以上、更優(yōu)選有90%或以上、再更優(yōu)選有95%或以上、特別優(yōu)選有98%或以上、最優(yōu)選有99%或以上的同源性的氨基酸序列并展示與松弛素-3基本相同活性(例如松弛素-3受體結(jié)合能力、與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性、攝食刺激、體重增加和增肥)的氨基酸序列。本說(shuō)明書(shū)中用于“同源性”的數(shù)字可為采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性搜索程序計(jì)算的數(shù)字;例如它們可采用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的同源性算法BLAST(基本的局部比對(duì)搜索工具)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/利用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算。此外,上述同源多肽包括同源多肽的鹽,包括有糖鏈和無(wú)糖鏈的那些。因此,只要滿足以上條件,上述的同源多肽的來(lái)源并不限于人。例如,包括衍生自不同于人的生物體[例如非人的哺乳動(dòng)物(例如,小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)]的松弛素-3和其變異體。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“變異體”指相同物種中的相同多肽內(nèi)個(gè)體之間的差異或不同物種之間的同源多肽之間的變異。
用在本發(fā)明中的松弛素-3(即松弛素-3、修飾多肽或同源多肽)可通過(guò)諸如遺傳工程方法和合成方法的各種已知方法獲得。更具體地,在遺傳工程方法中,將編碼松弛素-3的多核苷酸引入合適的宿主細(xì)胞中,得到的轉(zhuǎn)化體在能使其表達(dá)的條件下培養(yǎng),并且接著通過(guò)通常用于分離和純化表達(dá)的蛋白的方法從培養(yǎng)物中分離和純化目的多肽。在合成方法中,合成可采用普通的方法,諸如液相方法和固相方法;通??刹捎米詣?dòng)合成儀?;瘜W(xué)修飾的化合物可通過(guò)普通方法合成。另外,要使用的多肽可為SEQ ID NO2的全長(zhǎng)或部分,或經(jīng)歷諸如半胱氨酸交聯(lián)、N末端環(huán)谷氨酰胺化和C末端酰胺化的分泌型蛋白加工的多肽。
編碼松弛素-3的多核苷酸用在本發(fā)明中的編碼松弛素-3的多核苷酸無(wú)特別限制,只要其為編碼用在本發(fā)明中的多肽的多核苷酸。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具體地,用在本發(fā)明中的多核苷酸選自以下(a)至(e)構(gòu)成的組(a)由SEQ ID NO1表示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸;(b)編碼“由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽”的多核苷酸;(c)編碼“包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列并展示與上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸;(d)編碼“包含具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸刪除、置換、插入和/或添加的、SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的修飾氨基酸序列,并展示與上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸;以及(e)在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1表示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交并編碼具有與上述松弛素-3基本相同活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為編碼“包含具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸刪除、置換、插入和/或添加的SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的修飾氨基酸序列,并展示與上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸。這里,能被刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目例如為1-30、優(yōu)選1-20、更優(yōu)選1-10、再更優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-2。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為與由SEQ ID NO1表示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)緊條件下雜交并編碼“具有與上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸。
在本說(shuō)明書(shū)中,在嚴(yán)緊條件下雜交的多核苷酸的特定實(shí)例為,當(dāng)同源性通過(guò)同源性搜索軟件諸如FASTA、BLAST、Smith-Waterman(Meth.Enzym.,164,765,1988)利用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算時(shí),與SEQ ID NO1表示的堿基序列有至少70%或以上、優(yōu)選80%或以上、更優(yōu)選85%或以上、再優(yōu)選90%或以上、再更優(yōu)選95%或以上、特別優(yōu)選98%或以上、最優(yōu)選99%或以上的同源性的多核苷酸。此外,“嚴(yán)緊條件下”的雜交可例如通過(guò)如下方法進(jìn)行,該方法中在40-70℃、優(yōu)選60-65℃下在本領(lǐng)域技術(shù)人員通常采用的雜交緩沖液中進(jìn)行反應(yīng),并且在15-300mmol/L、優(yōu)選15-60mmol/L的鹽濃度的清洗溶液中進(jìn)行清洗。溫度和鹽濃度可以根據(jù)待用的探針的長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)。
要用在本發(fā)明中的多核苷酸可例如為天然來(lái)源或全合成。此外,它可利用部分天然產(chǎn)物合成。典型地,要用在本發(fā)明中的多核苷酸可例如通過(guò)遺傳工程領(lǐng)域常用的方法從商業(yè)文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中獲得,例如通過(guò)利用基于部分氨基酸序列(例如SEQ ID NO2表示的氨基酸序列)的信息而構(gòu)建的合適DNA探針的篩選方法。
作為要用在本發(fā)明中的多核苷酸,“包含SEQ ID NO1表示的堿基序列的多核苷酸”為優(yōu)選的。SEQ ID NO1表示的堿基序列具有以位置1-3處的ATG起始并以位置427-429處的TAG結(jié)束的開(kāi)放閱讀框。
含有松弛素-3的藥物組合物用在本發(fā)明中的松弛素-3可用作攝食刺激劑以治療攝食減少的食欲障礙和營(yíng)養(yǎng)病癥、用作體重增加劑和增肥劑以治療需要體重增加的疾病、用作藥物以治療由控制肥胖中的一些異常引起的疾病以及用作藥物以治療松弛素-3或編碼松弛素-3的多核苷酸的異常引起的疾病。此外,它還可用作治療藥物,用于恢復(fù)由于多種疾病的發(fā)作或多種疾病的治療(例如,手術(shù)期間或之后)導(dǎo)致的攝食(或食欲)和/或體重減少。上述多種疾病的實(shí)例包括涉及消化道運(yùn)動(dòng)或功能的疾病(例如,腹瀉、便秘、功能性便秘、過(guò)敏性腸道綜合癥和在消化道檢查時(shí)或手術(shù)之前或之后需要通便以去除腸道內(nèi)容物的狀況)、涉及免疫功能的控制的疾病(例如,慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病、硬皮病、特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性間質(zhì)性肺炎、肉瘤樣病、克隆氏疾病、炎性結(jié)腸炎、肝硬化、慢性肝炎、暴發(fā)型肝炎、腦脊髓炎和重癥肌無(wú)力)、攝食病癥、厭食、AIDS、癌癥以及惡病質(zhì)。它們優(yōu)選的是厭食和惡病質(zhì)。
所述多肽或其鹽可單獨(dú)使用;但是它也可通過(guò)與藥物上可接受的載體混合作為藥物組合物使用。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“鹽”無(wú)特別限制,只要它是與本發(fā)明的化合物形成的鹽并且藥物上可接受。這些鹽的優(yōu)選實(shí)例包括鹵代氫酸鹽(例如,氫氟化物、氫氯化物、氫溴化物、氫碘化物)、無(wú)機(jī)酸鹽(例如,硫酸鹽、硝酸鹽、高氯酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽)、有機(jī)羧酸鹽(例如,乙酸鹽、三氟乙酸鹽、草酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、檸檬酸鹽)、有機(jī)磺酸鹽(例如,甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、樟腦磺酸鹽)、氨基酸鹽(例如,天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽)、季胺鹽、堿金屬鹽(例如,鈉鹽、鉀鹽)以及堿土金屬鹽(例如,鎂鹽、鈣鹽)。氫氯化物、草酸鹽等優(yōu)選為所述的“藥物上可接受的鹽”這里,載體中活性成分的百分比可在1-90重量%之間變化。上述藥物可以各種形式經(jīng)口或胃腸外(例如,通過(guò)靜脈、肌內(nèi)、皮下、直腸或皮膚給藥)向人或不同于人的生物體[例如,非人哺乳動(dòng)物(例如牛、猴、家禽、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)以及昆蟲(chóng)類(lèi)]給藥。相應(yīng)地,含有本發(fā)明的松弛素-3的藥物組合物按照給藥途徑配制成合適的劑型。更具體地,它可配制成諸如片劑、膠囊、顆粒、分散性粉劑以及糖漿的口服制劑,諸如注射劑、靜脈滴液、脂質(zhì)體組合物以及栓劑的胃腸外制劑。這些藥物制劑可通過(guò)普通方法采用常用的賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、表面活性劑、滑潤(rùn)劑、分散劑、緩沖劑、防腐劑、增溶劑、抗菌劑、矯味劑、鎮(zhèn)痛劑、穩(wěn)定劑等等制成。要采用的上述非毒性添加劑的實(shí)例包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明膠、硬脂酸鎂、甲基纖維素或其鹽、乙醇、檸檬酸、氯化鈉和磷酸鈉。
劑型和給藥量取決于多肽的選擇、給藥的對(duì)象、給藥途徑、制劑的特性、患者的狀況以及醫(yī)師的判斷。但是,每1kg患者體重的合適劑量范圍例如為約0.1-500μg,優(yōu)選約0.1-100μg,更優(yōu)選約1-50μg。考慮到效率會(huì)隨給藥途徑而不同,預(yù)計(jì)必需劑量會(huì)在大范圍變化。例如,預(yù)計(jì)經(jīng)口給藥的所需劑量比靜脈注射的高。這種劑量水平的變化可通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化程序進(jìn)行調(diào)整。
采用松弛素-3受體篩選涉及攝食控制的化合物的方法作為用在本發(fā)明中的松弛素-3受體,在各種受體中,可采用能結(jié)合松弛素-3并展示松弛素-3受體表達(dá)細(xì)胞的各種細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)的受體。
更具體地,作為松弛素-3受體,可采用經(jīng)報(bào)道的已知受體,例如LGR7(GenBank登錄號(hào)NM_021634)、SALPR(GenBank登錄號(hào)NM_016568,也稱(chēng)為GPCR135)或GPR100(GenBank登錄號(hào)AB_083593,也稱(chēng)為hGPCR11或GPCR142)。另外,這些受體的部分多肽(partial polypeptide)無(wú)特別限制,只要它可用在后面描述的篩選方法中,也可采用與松弛素-3有結(jié)合能力的部分多肽、包含對(duì)應(yīng)于細(xì)胞膜外部區(qū)域的氨基酸序列的部分多肽等等。
本發(fā)明的內(nèi)容將參考采用SALPR作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例的篩選方法,在以下的本說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行詳細(xì)解釋。換言之,本發(fā)明提供篩選結(jié)合SALPR或其部分多肽并涉及控制攝食(刺激或抑制攝食)的化合物的方法。此外,可通過(guò)使測(cè)試物作用于SALPR或其部分多肽并測(cè)量細(xì)胞刺激活性而確定該物質(zhì)是否具有刺激或抑制攝食的活性。
可通過(guò)各種已知的方法獲得SALPR或其部分多肽;例如,它可通過(guò)已知的遺傳工程方法采用編碼SALPR的多核苷酸(GenBank登錄號(hào)NM_016568)制備。在另一實(shí)施方案中,它可通過(guò)已知的多肽合成方法獲得,諸如普通方法,例如液相方法或固相方法;通??刹捎米詣?dòng)合成儀。此外,在另一實(shí)施方案中,SALPR的部分多肽可通過(guò)采用合適的蛋白水解酶剪切SALPR而制備。
編碼要用在本發(fā)明中的SALPR的多肽指包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽、功能上等同于包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽的修飾多肽或包含與SEQ ID NO4表示的氨基酸序列有70%或以上、優(yōu)選80%或以上、更優(yōu)選85%或以上、再優(yōu)選90%或以上、再更優(yōu)選95%或以上、特別優(yōu)選98%或以上、最優(yōu)選99%或以上同源性的氨基酸序列并展示與松弛素-3基本相同活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性或攝食控制活性)的多肽。
這里,功能上等同于包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽的修飾多肽指包含氨基酸序列并展示與SALPR基本相同活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性或攝食控制活性)的多肽,該氨基酸序列在包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽中具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的一處或幾處刪除、置換、插入和/或添加。
此外,也可采用SALPR的部分多肽,只要它具有與SALPR基本相同的活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性或攝食控制活性)。
遺傳工程方法將在以下采用SALPR更加具體地詳細(xì)解釋?zhuān)坏?,也可采用其部分多肽,只要其可用在以后描述的篩選方法中。
將編碼SALPR的多核苷酸引入合適的宿主細(xì)胞中,在能使其表達(dá)的條件下培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體,由此通過(guò)常用的分離和純化表達(dá)的蛋白的方法從培養(yǎng)物中分離和純化目的多肽。用于上述分離和純化的方法的實(shí)例包括硫酸胺鹽析、采用離子交換纖維素的離子交換柱層析、采用分子篩凝膠的分子篩柱層析、采用蛋白質(zhì)-A結(jié)合多糖的親和柱層析、透析和凍干。
編碼要用在本發(fā)明中的SALPR的多核苷酸無(wú)特別限制,只要它為編碼要用在本發(fā)明中的多肽的多核苷酸。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具體地,用在本發(fā)明中的該多核苷酸選自以下(a)至(e)構(gòu)成的組(a)包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸;(b)編碼“包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽”的多核苷酸;(c)編碼“包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸;(d)編碼“包含在SEQ ID NO4表示的氨基酸序列中具有在一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸序列,并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸;以及(e)在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸。上述SEQ ID NO3表示的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的SALPR。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為編碼“包含在SEQ ID NO4表示的氨基酸序列中在一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))位點(diǎn)上具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸序列,并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸。這里,能被刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目例如為1-30、優(yōu)選1-20、更優(yōu)選1-10、再更優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-2。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。此外,根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO3表示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。
要用在上述轉(zhuǎn)化中的質(zhì)粒無(wú)特別限制,只要它含有編碼上述SALPR的多核苷酸;例如,它可通過(guò)將所述多核苷酸插入根據(jù)采用的宿主細(xì)胞適當(dāng)選擇的已知表達(dá)載體中而獲得。
上述的轉(zhuǎn)化體也無(wú)特別限制,只要它含有編碼上述SALPR的多核苷酸;例如,它可為所述多核苷酸已并入宿主細(xì)胞的染色體中的轉(zhuǎn)化體、以質(zhì)粒形式含有所述多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或不表達(dá)SALPR的轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體可例如通過(guò)采用上述質(zhì)粒或上述多核苷酸自身轉(zhuǎn)化希望的宿主細(xì)胞而獲得。
上述宿主細(xì)胞的實(shí)例包括通常采用的已知微生物,諸如Escherichia coli(例如,E.coli JM109)和酵母(例如,Saccharomycescerevisiae W303),以及已知的培養(yǎng)細(xì)胞,諸如動(dòng)物細(xì)胞(例如,CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、COS細(xì)胞)和昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如BmN4細(xì)胞)。
上述表達(dá)載體的實(shí)例包括用于E.coli的pUC、pTV、pGEX、pKK以及pTrcHis;用于酵母的pEMBLY和pYES2;用于CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞以及COS細(xì)胞的pcDNA3,pMAMneo以及pBabe Puro;用于BmN4細(xì)胞的具有家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的多角體啟動(dòng)子的載體(例如,pBK283)。
含有SALPR的細(xì)胞無(wú)特別限制,只要它在細(xì)胞膜表面表達(dá)SALPR,并可例如通過(guò)在能使SALPR表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(即,用含有編碼SALPR的多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)或通過(guò)將編碼SALPR的RNA注射到合適的細(xì)胞并在能使SALPR表達(dá)的條件下培養(yǎng)它來(lái)獲得。
要用在本發(fā)明中的含有SALPR的細(xì)胞膜組分(fraction)例如可通過(guò)使本發(fā)明的表達(dá)SALPR的細(xì)胞破裂并分離富含細(xì)胞膜的成分而獲得。破裂細(xì)胞的方法的實(shí)例包括如下方法采用勻漿器(例如,Potter-Elvehiem型勻漿器)破裂細(xì)胞、通過(guò)韋林氏攪攔器或Polytron(Kinematica)破裂、超生破裂以及采用法國(guó)壓(French press)等在壓力下通過(guò)將細(xì)胞從細(xì)小的管口噴射而破裂。另外,分級(jí)分離細(xì)胞膜的方法的實(shí)例包括通過(guò)離心的分級(jí)分離方法,該離心諸如為差速離心和密度梯度離心。
在篩選經(jīng)由本發(fā)明的SALPR刺激或抑制攝食的化合物的方法中,可采用上述細(xì)胞膜組分(即含有SALPR的細(xì)胞膜組分)或上述細(xì)胞(即含有SALPR的細(xì)胞)。
此外,本發(fā)明的篩選方法包括并利用檢測(cè)測(cè)試物是否與SALPR特異結(jié)合的方法和檢測(cè)測(cè)試物與SALPR的結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)的方法。
在本發(fā)明的篩選方法中,例如將SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞與測(cè)試物接觸,以分析SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞是否與所述測(cè)試物結(jié)合,由此無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力而實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。
具體地,在有或無(wú)測(cè)試物存在時(shí),將SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞與標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)結(jié)合,以比較經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞特異結(jié)合的上述天然配體的量,由此無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力而實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。即,當(dāng)上述測(cè)試物具有經(jīng)由SALPR的攝食刺激或抑制能力時(shí),則在測(cè)試物存在下,經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞特異結(jié)合的天然配體的量相對(duì)于無(wú)該測(cè)試物存在時(shí)的相應(yīng)的特異結(jié)合量會(huì)減小。
在本發(fā)明的篩選方法中,當(dāng)比較所述天然配體經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞特異結(jié)合的量時(shí),標(biāo)記的天然配體可用作上述天然配體。對(duì)于上述標(biāo)記,可采用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素的實(shí)例包括[3H],[14C],[125I]以及[35S]。酶的實(shí)例包括β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括異硫氰酸熒光素和BODIPY。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素和光澤精。偶爾,生物素-抗生物素系統(tǒng)可用于天然配體和標(biāo)記物的結(jié)合。
因此,本發(fā)明的篩選方法可篩選結(jié)合SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而抑制它們結(jié)合天然配體的化合物,無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力。
在本發(fā)明的篩選方法的另一實(shí)施方案中,將上述細(xì)胞在有或無(wú)測(cè)試物存在的條件下與標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)接觸,以比較在這些條件下經(jīng)由上述細(xì)胞特異結(jié)合的上述天然配體的量,接著比較在這些條件下上述天然配體的特異細(xì)胞刺激活性,由此使得在區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力(stimulating and suppressing abilities infeeding via SALPR)時(shí)篩選化合物成為可能。
在上述實(shí)施方案中,結(jié)合上述細(xì)胞并經(jīng)由包含在上述細(xì)胞中的受體展示細(xì)胞刺激活性的物質(zhì)可選作經(jīng)由SALPR刺激攝食的化合物。
在另一方面,在上述實(shí)施方案中,抑制上述細(xì)胞與天然配體的結(jié)合但不展示細(xì)胞刺激活性的測(cè)試物可選作經(jīng)由SALPR抑制攝食的化合物。
本發(fā)明的篩選方法例如可采用抑制腺苷酸環(huán)化酶活性作為細(xì)胞刺激活性來(lái)進(jìn)行。
在該實(shí)施方案的篩選方法中,例如通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶的活化而在細(xì)胞中生成的cAMP可采用已知方法測(cè)量,由此使得區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力時(shí)篩選化合物成為可能。該實(shí)施方案利用了通過(guò)天然配體與SALPR的結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,即抑制SALPR的細(xì)胞刺激活性之一的腺苷酸環(huán)化酶活性。具體地,當(dāng)天然配體結(jié)合SALPR時(shí),偶聯(lián)到SALPR的G蛋白家族的成員Gi家族抑制腺苷酸環(huán)化酶以降低細(xì)胞中生成的環(huán)狀A(yù)MP的量(cAMP,通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶從ATP生成)。
例如,當(dāng)將腺苷酸環(huán)化酶活化劑[例如,毛喉素(FSK)]添加到在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR的哺乳動(dòng)物衍生的細(xì)胞(例如,HEK-293細(xì)胞或CHO細(xì)胞)時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加。
另外,當(dāng)SALPR的天然配體在添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑時(shí)添加的情況下,除了腺苷酸環(huán)化酶活化劑引起的腺苷酸環(huán)化酶活性刺激以外,由于上述天然配體對(duì)本發(fā)明的SALPR的作用,也可產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶活性抑制,這導(dǎo)致與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比cAMP生成減少。因此,當(dāng)進(jìn)行具有攝食刺激活性的化合物的篩選時(shí),通過(guò)與測(cè)試物單獨(dú)接觸,可選擇減少cAMP生成(即具有與天然配體相同的活性)的化合物,以替換在該篩選系統(tǒng)中經(jīng)由SALPR起作用的天然配體。
當(dāng)進(jìn)行具有攝食抑制活性化合物的篩選時(shí),可將腺苷酸環(huán)化酶活化劑、SALPR的天然配體和測(cè)試物添加到細(xì)胞用于篩選。由于天然配體的作用,與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,cAMP生成減少;但是,當(dāng)測(cè)試物拮抗天然配體的作用時(shí),cAMP生成減少受到抑制。這時(shí),該測(cè)試物可被選作具有攝食抑制活性的化合物。
可采用免疫分析等作為測(cè)量細(xì)胞內(nèi)cAMP的量的方法;例如,也可采用定量cAMP的商品化試劑盒。
在篩選方法的另一實(shí)施方案中,例如,通過(guò)采用在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR(優(yōu)選通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))并含有位于5′端上游具有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的報(bào)告基因[例如,堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、硝基還原酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或諸如GFP(綠色熒光蛋白)基因的熒光蛋白基因]的細(xì)胞(以下有時(shí)指“篩選細(xì)胞”),可在區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力時(shí)實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。該實(shí)施方式利用了該事實(shí),即上述篩選細(xì)胞中在啟動(dòng)子區(qū)域引入了CRE的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄由于上述cAMP生成的減少而被抑制。
以下將更加詳細(xì)地解釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述實(shí)施方案在區(qū)分經(jīng)由SALPR的攝食刺激和抑制能力時(shí)的化合物篩選方法。
換言之,引入上述篩選細(xì)胞中的CRE為常常存在于一組基因(cAMP誘導(dǎo)基因)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的堿基序列,該組基因在細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加時(shí)加速表達(dá)。因此,當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶活化劑(例如FSK)添加到篩選細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加,這導(dǎo)致位于CRE下游的報(bào)告基因的表達(dá)量增加??赏ㄟ^(guò)測(cè)量來(lái)自底物與報(bào)告基因產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光或來(lái)自作為報(bào)告基因產(chǎn)物生成的熒光蛋白的熒光而容易地測(cè)量報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)量。
此外,當(dāng)在添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑時(shí)添加SALPR的天然配體的情況下,除了由于腺苷酸環(huán)化酶活化劑引起的上述腺苷酸環(huán)化酶活性刺激以外,由于上述天然配體對(duì)本發(fā)明SALPR的作用,也會(huì)出現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶活性抑制,這導(dǎo)致與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)量降低。因此,當(dāng)進(jìn)行具有攝食刺激活性的化合物篩選時(shí),可通過(guò)單獨(dú)接觸測(cè)試物選擇降低報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量的化合物(即與天然配體具有相同活性),在該篩選系統(tǒng)中替代經(jīng)由SALPR起作用的天然配體。
當(dāng)進(jìn)行具有攝食抑制活性化合物的篩選時(shí),可將腺苷酸環(huán)化酶活化劑、SALPR的天然配體和測(cè)試物添加到篩選細(xì)胞。與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,由于天然配體的作用,報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量降低;但是,當(dāng)測(cè)試物拮抗天然配體的作用時(shí),報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量的降低受到抑制。這時(shí),測(cè)試物可被選作具有攝食抑制活性的化合物。
可容易地證實(shí)測(cè)試物是否通過(guò)與SALPR結(jié)合作用而起作用。例如,平行于采用篩選細(xì)胞(即,在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR并含有在5′端上游具有CRE的報(bào)告基因的細(xì)胞)的上述測(cè)試,采用對(duì)照細(xì)胞(例如,含有在5′端上游具有CRE的報(bào)告基因,但不在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR的細(xì)胞)進(jìn)行類(lèi)似測(cè)試。結(jié)果,當(dāng)上述測(cè)試物不通過(guò)與SALPR結(jié)合起作用時(shí),用于篩選的細(xì)胞和用于對(duì)照的細(xì)胞對(duì)于報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量顯示相同的現(xiàn)象,而當(dāng)上述測(cè)試物通過(guò)與SALPR結(jié)合起作用時(shí),用于篩選的細(xì)胞和用于對(duì)照的細(xì)胞對(duì)于報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量顯示不同的現(xiàn)象。
此外,在另一實(shí)施方案中,可通過(guò)向人或非人生物體[例如,非人的哺乳動(dòng)物(例如,牛、猴、家禽、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)類(lèi)]給予經(jīng)上述篩選方法選擇的測(cè)試物,并在給藥后分析諸如攝食量和血液參數(shù)的變化的指標(biāo),來(lái)證實(shí)和確定影響攝食控制的測(cè)試物。上述哺乳動(dòng)物不限于正常的動(dòng)物,還可以是遺傳突變的疾病動(dòng)物模型(例如,病態(tài)肥胖模型,諸如ob/ob小鼠、db/db小鼠和Zucker肥胖大鼠)和遺傳修飾動(dòng)物。測(cè)試物可口服或胃腸外給藥。胃腸外途徑的實(shí)例包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)和腦內(nèi)給藥,優(yōu)選在臨近下丘腦的腦室內(nèi)給藥。作為用于該篩選的指標(biāo),除了攝食量以外還可有效地測(cè)量體重、運(yùn)動(dòng)的數(shù)量、能量代謝量、血糖和血脂量、激素量、分泌性肽量等等。此外,在給藥時(shí),可添加諸如禁食、飽食和過(guò)量脂肪食物的條件。
測(cè)試物可以每天單一劑量或分開(kāi)的劑量的方式給藥,給藥或觀察周期可為一天至數(shù)周。
采用松弛素-3受體篩選涉及體重控制的化合物的方法作為用在本發(fā)明中的松弛素-3受體,在各種受體中,可采用能結(jié)合松弛素-3并展示松弛素-3受體表達(dá)細(xì)胞的各種細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)的受體。
更具體地,作為松弛素-3受體,經(jīng)報(bào)道的已知受體,例如LGR7(GenBank登錄號(hào)NM_021634)、SALPR(GenBank登錄號(hào)NM_016568,也稱(chēng)為GPCR135)或GPR100(GenBank登錄號(hào)AB_083593,也稱(chēng)為hGPCR11或GPCR142)可以被使用。另外,這些受體的部分多肽無(wú)特別限制,只要它可用在后面描述的篩選方法中,也可采用與松弛素-3有結(jié)合能力的部分多肽、包含對(duì)應(yīng)于細(xì)胞膜外部區(qū)域的氨基酸序列的部分多肽等等。
本發(fā)明的內(nèi)容將參考采用SALPR作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例的篩選方法,在以下的本說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行詳細(xì)解釋。換言之,本發(fā)明將提供篩選結(jié)合SALPR或其部分多肽并涉及體重控制(體重增加或降低)的化合物的方法。此外,可通過(guò)使測(cè)試物作用于SALPR或其部分多肽并測(cè)量細(xì)胞刺激活性而確定該物質(zhì)是否具有增加或降低體重的活性。
可通過(guò)各種已知的方法獲得SALPR或其部分多肽;例如,它可通過(guò)已知的遺傳工程方法采用編碼SALPR的多核苷酸(GenBank登錄號(hào)NM_016568)制備。在另一實(shí)施方案中,它可通過(guò)已知的多肽合成方法獲得,諸如普通方法,例如液相方法或固相方法;通??刹捎米詣?dòng)合成儀。此外,在另一實(shí)施方案中,SALPR的部分多肽可通過(guò)采用合適的蛋白水解酶剪切SALPR而制備。
編碼要用在本發(fā)明中的SALPR的多肽指包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽、功能上等同于包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽的修飾多肽或包含與SEQ ID NO4表示的氨基酸序列有70%或以上、優(yōu)選80%或以上、更優(yōu)選85%或以上、再優(yōu)選90%或以上、再更優(yōu)選95%或以上、特別優(yōu)選98%或以上、最優(yōu)選99%或以上同源性的氨基酸序列并展示與松弛素-3基本相同活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性或體重控制活性)的多肽。
這里,功能上等同于包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽的修飾多肽指包含氨基酸序列并展示與SALPR基本相同活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性,或體重控制活性)的多肽,所述氨基酸序列在包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽中具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的一處或幾處刪除、置換、插入和/或添加。
此外,也可采用SALPR的部分多肽,只要它具有與SALPR基本相同的活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性或體重控制活性)。
遺傳工程方法將在以下采用SALPR更加具體地詳細(xì)解釋?zhuān)坏牵部刹捎闷洳糠侄嚯?,只要其可用在以后描述的篩選方法中。
將編碼SALPR的多核苷酸引入合適的宿主細(xì)胞中,得到的轉(zhuǎn)化體在能使其表達(dá)的條件下培養(yǎng),然后通過(guò)常用的分離和純化表達(dá)的蛋白的方法從培養(yǎng)物中分離和純化目的多肽,由此制備SALPR。用于上述分離和純化的方法的實(shí)例包括硫酸胺鹽析、采用離子交換纖維素的離子交換柱層析、采用分子篩凝膠的分子篩柱層析、采用蛋白質(zhì)-A結(jié)合多糖的親和柱層析、透析和凍干。
編碼要用在本發(fā)明中的SALPR的多核苷酸無(wú)特別限制,只要它為編碼要用在本發(fā)明中的多肽的多核苷酸。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具體地,用在本發(fā)明中的該多核苷酸選自以下(a)至(e)構(gòu)成的組中(a)包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸;(b)編碼“包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽”的多核苷酸;(c)編碼“包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸;(d)編碼“包含在SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))位點(diǎn)處具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸序列,并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸;以及(e)在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸。上述SEQ ID NO3表示的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的SALPR。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為編碼“包含在SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))位點(diǎn)處具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸序列,并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸。這里,能被刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目例如為1-30、優(yōu)選1-20、更優(yōu)選1-10、再更優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-2。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。此外,根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。
要用在上述轉(zhuǎn)化中的質(zhì)粒無(wú)特別限制,只要它含有編碼上述SALPR的多核苷酸;例如,它可通過(guò)將所述多核苷酸插入根據(jù)采用的宿主細(xì)胞適當(dāng)選擇的已知表達(dá)載體中而獲得。
上述的轉(zhuǎn)化體也無(wú)特別限制,只要它含有編碼上述SALPR的多核苷酸;例如,它可為所述多核苷酸已并入宿主細(xì)胞的染色體中的轉(zhuǎn)化體、以質(zhì)粒形式含有所述多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或不表達(dá)SALPR的轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體可例如通過(guò)采用上述質(zhì)?;蛏鲜龆嗪塑账嶙陨磙D(zhuǎn)化希望的宿主細(xì)胞而獲得。
上述宿主細(xì)胞的實(shí)例包括通常采用的已知微生物,諸如Escherichiacoli(例如,E.coliJM109)和酵母(例如,SaccharomycescerevisiaeW303),以及已知的培養(yǎng)細(xì)胞,諸如動(dòng)物細(xì)胞(例如,CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、COS細(xì)胞)和昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如BmN4細(xì)胞)。
上述表達(dá)載體的實(shí)例包括用于E.coli的pUC、pTV、pGEX、pKK以及pTrcHis;用于酵母的pEMBLY和pYES2;用于CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞以及COS細(xì)胞的pcDNA3,pMAMneo以及pBabe Puro;用于BmN4細(xì)胞的具有家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的多角體啟動(dòng)子的載體(例如,pBK283)。
含有SALPR的細(xì)胞無(wú)特別限制,只要它在細(xì)胞膜表面表達(dá)SALPR,并可例如通過(guò)在能使SALPR表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(即,用含有編碼SALPR的多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)或通過(guò)將編碼SALPR的RNA注射到合適的細(xì)胞中并在能使SALPR表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞來(lái)獲得。
要用在本發(fā)明中的含有SALPR的細(xì)胞膜組分例如可通過(guò)使本發(fā)明的表達(dá)SALPR的細(xì)胞破裂并分離富含細(xì)胞膜的成分(a fraction richin the cell membrane)而獲得。破裂細(xì)胞的方法的實(shí)例包括采用勻漿器(例如,Potter-Elvehiem型勻漿器)碎裂細(xì)胞、通過(guò)韋林氏攪切器或Polytron(Kinematica)破裂、超生破裂以及采用法國(guó)壓等在壓力下通過(guò)將細(xì)胞從細(xì)小的管口噴射而破裂的方法。另外,分級(jí)分離細(xì)胞膜的方法的實(shí)例包括通過(guò)離心的分級(jí)分離方法,該離心諸如為差速離心和密度梯度離心。
在篩選經(jīng)由本發(fā)明的SALPR增加或降低體重的化合物的方法中,可采用SALPR、上述細(xì)胞膜組分(即含有SALPR的細(xì)胞膜組分)或上述細(xì)胞(即含有SALPR的細(xì)胞)。
此外,本發(fā)明的篩選方法包括并利用檢測(cè)測(cè)試物是否與SALPR特異結(jié)合的方法和檢測(cè)測(cè)試物與SALPR的結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)的方法。
在本發(fā)明的篩選方法中,例如將SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞與測(cè)試物接觸,以分析SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞是否與所述測(cè)試物結(jié)合,由此無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的體重增加和降低能力而實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。
具體地,在有或無(wú)測(cè)試物存在時(shí),將SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞與標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)接觸,以比較經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而特異結(jié)合的上述天然配體的量,由此無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的體重增加和降低能力而實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。即,當(dāng)上述測(cè)試物具有經(jīng)由SALPR的增加或降低體重能力時(shí),則在測(cè)試物存在下,經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞特異結(jié)合的天然配體的量相對(duì)于無(wú)該測(cè)試物存在時(shí)的相應(yīng)的特異結(jié)合量會(huì)減小。
在本發(fā)明的篩選方法中,當(dāng)比較經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而特異結(jié)合的天然配體的量時(shí),標(biāo)記的天然配體可用作上述天然配體。對(duì)于上述標(biāo)記,可采用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素的實(shí)例包括[3H],[14C],[125I]以及[35S]。酶的實(shí)例包括β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括異硫氰酸熒光素和BODIPY。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素和光澤精。偶爾,生物素-抗生物素系統(tǒng)可用于天然配體和標(biāo)記物的結(jié)合。
因此,本發(fā)明的篩選方法可篩選結(jié)合SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而抑制它們結(jié)合天然配體的化合物,無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的增加和降低體重能力。
在本發(fā)明的篩選方法的另一實(shí)施方案中,將上述細(xì)胞在有或無(wú)測(cè)試物存在的條件下與標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)接觸,以比較在上述條件下經(jīng)由上述細(xì)胞特異結(jié)合的上述天然配體的量,接著進(jìn)一步比較在這些條件下上述天然配體的特異細(xì)胞刺激活性,由此使得在區(qū)分經(jīng)由SALPR的增加和降低體重能力時(shí)篩選化合物成為可能。
在上述實(shí)施方案中,結(jié)合上述細(xì)胞并經(jīng)由包含在上述細(xì)胞中的受體展示細(xì)胞刺激活性的物質(zhì)可被選作經(jīng)由SALPR增加體重的化合物。
在另一方面,在上述實(shí)施方案中,抑制上述細(xì)胞與天然配體的結(jié)合但不展示細(xì)胞刺激活性的測(cè)試物可被選作經(jīng)由SALPR降低體重的化合物。
本發(fā)明的篩選方法例如可采用腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制作為細(xì)胞刺激活性來(lái)進(jìn)行。
在該實(shí)施方案的篩選方法中,例如,通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶的活化而在細(xì)胞中生成的cAMP可采用已知方法測(cè)量,由此使得區(qū)分經(jīng)由SALPR的增加和降低體重能力時(shí)篩選化合物成為可能。該實(shí)施方案利用了通過(guò)天然配體與SALPR的結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,即作為SALPR的細(xì)胞刺激活性之一的腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制。具體地,當(dāng)天然配體結(jié)合SALPR時(shí),偶聯(lián)到SALPR的G蛋白家族的成員Gi家族抑制腺苷酸環(huán)化酶以降低細(xì)胞中生成的環(huán)狀A(yù)MP(cAMP,通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶從ATP生成)的量。
例如,當(dāng)將腺苷酸環(huán)化酶活化劑[例如,毛喉素(FSK)]添加到在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR(優(yōu)選地,通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))的哺乳動(dòng)物衍生的細(xì)胞(例如,HEK-293細(xì)胞或CHO細(xì)胞)時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加。
另外,當(dāng)SALPR的天然配體在添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況下添加時(shí),除了腺苷酸環(huán)化酶活化劑引起的腺苷酸環(huán)化酶活性刺激以外,由于上述天然配體對(duì)本發(fā)明的SALPR的作用,也可產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶活性抑制,這導(dǎo)致與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比cAMP生成的減少。因此,當(dāng)進(jìn)行具有增加體重活性的化合物的篩選時(shí),通過(guò)與測(cè)試物單獨(dú)接觸,可以選擇減少cAMP生成(即與天然配體的活性相同)的化合物,以替換在該篩選系統(tǒng)中經(jīng)由SALPR起作用的天然配體。
當(dāng)進(jìn)行具有減輕體重活性化合物的篩選時(shí),可將腺苷酸環(huán)化酶活化劑、SALPR的天然配體和測(cè)試物添加到細(xì)胞用于篩選。由于天然配體的作用,與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,cAMP生成減少;但是,當(dāng)測(cè)試物拮抗天然配體的作用時(shí),cAMP生成的減少受到抑制。這時(shí),該測(cè)試物可被選作具有減輕體重活性的化合物。
可采用免疫分析等作為測(cè)量細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的方法;例如,也可采用定量cAMP的商品化試劑盒。
在篩選方法的另一實(shí)施方案中,例如,通過(guò)采用在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR(優(yōu)選通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))并含有在5′端上游具有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的報(bào)告基因[例如,堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、硝基還原酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或諸如GFP(綠色熒光蛋白)的熒光蛋白基因]的細(xì)胞(以下有時(shí)稱(chēng)作“篩選細(xì)胞”),可在區(qū)分經(jīng)由SALPR的增加和降低體重能力的情況下實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。該實(shí)施方式利用了該事實(shí),即上述篩選細(xì)胞中在啟動(dòng)子區(qū)域引入了CRE的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄由于上述cAMP生成的減少而被抑制。
以下將更加詳細(xì)地解釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述實(shí)施方案在區(qū)分經(jīng)由SALPR的增加和減輕體重能力的情況下的化合物篩選方法。
換言之,引入上述篩選細(xì)胞中的CRE為常常存在于一組基因(cAMP誘導(dǎo)基因)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的堿基序列,該組基因在細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加時(shí)被加速表達(dá)。因此,當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶活化劑(例如FSK)添加到篩選細(xì)胞中時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加,這導(dǎo)致位于CRE下游的報(bào)告基因的表達(dá)量增加??赏ㄟ^(guò)測(cè)量來(lái)自底物與報(bào)告基因產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光或來(lái)自作為報(bào)告基因產(chǎn)物生成的熒光蛋白的熒光而容易地測(cè)量報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)量。
此外,當(dāng)在添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況下添加SALPR的天然配體時(shí),除了由于腺苷酸環(huán)化酶活化劑引起的上述腺苷酸環(huán)化酶活化刺激以外,由于上述天然配體對(duì)本發(fā)明SALPR的作用,也會(huì)出現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶活性抑制,這導(dǎo)致與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)量降低。因此,當(dāng)進(jìn)行具有體重增加活性的化合物篩選時(shí),可通過(guò)單獨(dú)接觸測(cè)試物選擇降低報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量的化合物(即與天然配體具有相同活性),在該篩選系統(tǒng)中替代經(jīng)由SALPR起作用的天然配體。
當(dāng)進(jìn)行具有降低體重活性化合物的篩選時(shí),可將腺苷酸環(huán)化酶活化劑、SALPR的天然配體和測(cè)試物添加到篩選細(xì)胞。與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,由于天然配體的作用,報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量降低;但是,當(dāng)測(cè)試物拮抗天然配體的作用時(shí),報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量的降低受到抑制。這時(shí),測(cè)試物可被選作具有降低體重活性的化合物。
可容易地證實(shí)測(cè)試物是否通過(guò)與SALPR結(jié)合而起作用。例如,平行于采用篩選細(xì)胞(即,在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR并含有在5′端上游具有CRE的報(bào)告基因的細(xì)胞)的上述測(cè)試,采用對(duì)照細(xì)胞(例如,含有在5′端上游具有CRE的報(bào)告基因,但不在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR的細(xì)胞)進(jìn)行類(lèi)似測(cè)試。結(jié)果,當(dāng)上述測(cè)試物不通過(guò)與SALPR結(jié)合起作用時(shí),用于篩選的細(xì)胞和用于對(duì)照的細(xì)胞對(duì)于報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量顯示相同的現(xiàn)象,而當(dāng)上述測(cè)試物通過(guò)與SALPR結(jié)合起作用時(shí),用于篩選的細(xì)胞和用于對(duì)照的細(xì)胞對(duì)于報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量顯示不同的現(xiàn)象。
此外,在另一實(shí)施方案中,可通過(guò)向人或除人以外的生物體[例如,非人的哺乳動(dòng)物(例如,牛、猴、家禽、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)類(lèi)]給予經(jīng)上述篩選方法選擇的測(cè)試物,并在給藥后測(cè)量攝食量、體重和肥胖指標(biāo)(例如,身體脂肪百分比、BMI(身體質(zhì)量指數(shù))、肥胖程度、體質(zhì)、生理年齡(physicalage)、阻抗、體脂重量、無(wú)脂肪質(zhì)量、身體水質(zhì)量、身體蛋白質(zhì)量、肌肉質(zhì)量、無(wú)機(jī)質(zhì)量、身體細(xì)胞質(zhì)量、肌肉質(zhì)量與身體區(qū)域之比(musclemass by the region of the body)、水質(zhì)量與身體區(qū)域之比、BMR(基礎(chǔ)代謝率)、能量需求、內(nèi)臟-皮下脂肪比(VSR)、內(nèi)臟脂肪重、皮下脂肪重、內(nèi)臟脂肪重量水平、器官重量、血液參數(shù)變化以及血液中的瘦素、葡萄糖、脂質(zhì)、激素、分泌性肽的量),以證實(shí)和確定測(cè)試物影響體重控制。上述哺乳動(dòng)物不限于普通的動(dòng)物,還可以是遺傳突變的疾病動(dòng)物模型(例如,病態(tài)肥胖模型,諸如ob/ob小鼠、db/db小鼠和Zucker肥胖大鼠)和遺傳修飾動(dòng)物。測(cè)試物可口服或胃腸外給藥。胃腸外途徑的實(shí)例包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)和腦內(nèi)給藥,優(yōu)選在臨近下丘腦的腦室內(nèi)給藥。作為用于該篩選的指標(biāo),例如攝食量和肥胖指標(biāo)以及體重可被有效地測(cè)量。此外,在給藥時(shí),可添加諸如禁食、飽食和過(guò)量脂肪食物的條件。
測(cè)試物可以每天單一劑量或分開(kāi)的劑量的方式給藥,給藥或觀察周期可為一天至數(shù)周。
采用松弛素-3受體篩選涉及肥胖控制的化合物的方法作為用在本發(fā)明中的松弛素-3受體,在各種受體中,可采用能結(jié)合松弛素-3并展示松弛素-3受體表達(dá)細(xì)胞的各種細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)的受體。
更具體地,作為松弛素-3受體,經(jīng)報(bào)道的已知受體,例如LGR7(GenBank登錄號(hào)NM_021634)、SALPR(GenBank登錄號(hào)NM_016568,也稱(chēng)為GPCR135)或GPR100(GenBank登錄號(hào)AB_083593,也稱(chēng)為hGPCR11或GPCR142)可被采用。另外,這些受體的部分多肽無(wú)特別限制,只要它可用在后面描述的篩選方法中,也可采用與松弛素-3有結(jié)合能力的部分多肽、包含對(duì)應(yīng)于細(xì)胞膜外部區(qū)域的氨基酸序列的部分多肽等等。
本發(fā)明的內(nèi)容將參考采用SALPR作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例的篩選方法,在以下的本說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行詳細(xì)解釋。換言之,本發(fā)明將提供篩選結(jié)合SALPR或其部分多肽并涉及肥胖控制(刺激或抑制肥胖)的化合物的方法。此外,可通過(guò)使測(cè)試物作用于SALPR或其部分多肽并測(cè)量細(xì)胞刺激活性而確定該物質(zhì)是否具有刺激或抑制肥胖的活性。
可通過(guò)各種已知的方法獲得SALPR或其部分多肽;例如,它可通過(guò)已知的遺傳工程方法采用編碼SALPR的多核苷酸(GenBank登錄號(hào)NM_016568)制備。在另一實(shí)施方案中,它可通過(guò)已知的多肽合成方法獲得,諸如普通方法,例如液相方法或固相方法;通??刹捎米詣?dòng)合成儀。此外,在另一實(shí)施方案中,SALPR的部分多肽可通過(guò)采用合適的蛋白水解酶剪切SALPR而制備。
編碼要用在本發(fā)明中的SALPR的多肽指包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽、功能上等同于包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽的修飾多肽或包含與SEQ ID NO4表示的氨基酸序列有70%或以上、優(yōu)選80%或以上、更優(yōu)選85%或以上、再優(yōu)選90%或以上、再更優(yōu)選95%或以上、特別優(yōu)選98%或以上、最優(yōu)選99%或以上同源性的氨基酸序列并展示與松弛素-3基本相同活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性,或肥胖控制活性)的多肽。
這里,功能上等同于包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽的修飾多肽指包含氨基酸序列并展示與SALPR基本相同活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性,或肥胖控制活性)的多肽,所述氨基酸序列在包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽中具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的一處或幾處刪除、置換、插入和/或添加。
此外,也可采用SALPR的部分多肽,只要它具有與SALPR基本相同的活性(例如,與松弛素-3的結(jié)合能力和與該結(jié)合有關(guān)的各種細(xì)胞刺激活性或肥胖控制活性)。
遺傳工程方法將在以下采用SALPR更加具體地詳細(xì)解釋?zhuān)坏牵部刹捎闷洳糠侄嚯?,只要其可用在以后描述的篩選方法中。
將編碼SALPR的多核苷酸引入合適的宿主細(xì)胞中,得到的轉(zhuǎn)化體在能使其表達(dá)的條件下培養(yǎng),然后可以通過(guò)常用的分離和純化表達(dá)的蛋白的方法從培養(yǎng)物中分離和純化目的多肽,由此制備SALPR。用于上述分離和純化的方法的實(shí)例包括硫酸銨鹽析、采用離子交換纖維素的離子交換柱層析、采用分子篩凝膠的分子篩柱層析、采用蛋白質(zhì)-A結(jié)合多糖的親和柱層析、透析和凍干。
編碼要用在本發(fā)明中的SALPR的多核苷酸無(wú)特別限制,只要它為編碼要用在本發(fā)明中的多肽的多核苷酸。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具體地,用在本發(fā)明中的該多核苷酸選自以下(a)至(e)構(gòu)成的組中(a)包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸;(b)編碼“包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽”的多核苷酸;(c)編碼“包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸;
(d)編碼“包含在SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))位點(diǎn)處具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸序列,并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸;以及(e)在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸。上述SEQ ID NO3表示的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的SALPR。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為編碼“包含在SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))位點(diǎn)處具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或幾個(gè))氨基酸的刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸序列,并展示與上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸。這里,可以被刪除、置換、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目例如為1-30、優(yōu)選1-20、更優(yōu)選1-10、再更優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-2。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。此外,根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的多核苷酸為在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO3表示的堿基序列的多核苷酸雜交并編碼展示與上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。
要用在上述轉(zhuǎn)化中的質(zhì)粒無(wú)特別限制,只要它含有編碼上述SALPR的多核苷酸;例如,它可通過(guò)將所述多核苷酸插入根據(jù)采用的宿主細(xì)胞適當(dāng)選擇的已知表達(dá)載體中而獲得。
上述的轉(zhuǎn)化體也無(wú)特別限制,只要它含有編碼上述SALPR的多核苷酸;例如,它可為所述多核苷酸已并入宿主細(xì)胞的染色體中的轉(zhuǎn)化體、以質(zhì)粒形式含有所述多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或不表達(dá)SALPR的轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體可例如通過(guò)采用上述質(zhì)粒或上述多核苷酸自身轉(zhuǎn)化希望的宿主細(xì)胞而獲得。
上述宿主細(xì)胞的實(shí)例包括通常采用的已知微生物,諸如Escherichiacoli(例如,E.coliJM109)和酵母(例如,SaccharomycescerevisiaeW303),以及已知的培養(yǎng)細(xì)胞,諸如動(dòng)物細(xì)胞(例如,CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、COS細(xì)胞)和昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如BmN4細(xì)胞)。
上述表達(dá)載體的實(shí)例包括用于E.coli的pUC、pTV、pGEX、pKK以及pTrcHis;用于酵母的pEMBLY和pYES2;用于CHO細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞以及COS細(xì)胞的pcDNA3,pMAMneo以及pBabe Puro;用于BmN4細(xì)胞的具有家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的多角體啟動(dòng)子的載體(例如,pBK283) 。
含有SALPR的細(xì)胞無(wú)特別限制,只要它在細(xì)胞膜表面表達(dá)SALPR,并可例如通過(guò)在能使SALPR表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(即,用含有編碼SALPR的多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)或通過(guò)將編碼SALPR的RNA注射到合適的細(xì)胞并在能使SALPR表達(dá)的條件下培養(yǎng)來(lái)獲得。
要用在本發(fā)明中的含有SALPR的細(xì)胞膜組分例如可通過(guò)使本發(fā)明的表達(dá)SALPR的細(xì)胞破裂并分離富含細(xì)胞膜的成分而獲得。破裂細(xì)胞的方法的實(shí)例包括采用勻漿器(例如,Potter-Elvehiem型勻漿器)碎裂細(xì)胞、通過(guò)韋林氏攪切器或Polytron(Kinematica)破裂、超生破裂以及采用法國(guó)壓等在壓力下通過(guò)將細(xì)胞從細(xì)小的管口噴射而破裂的方法。另外,分級(jí)分離細(xì)胞膜的方法的實(shí)例包括通過(guò)離心的分級(jí)分離方法,該離心諸如為差速離心和密度梯度離心。
在篩選經(jīng)由本發(fā)明的SALPR刺激或抑制肥胖的化合物的方法中,可采用上述細(xì)胞膜組分(即含有SALPR的細(xì)胞膜組分)或上述細(xì)胞(即含有SALPR的細(xì)胞)。
此外,本發(fā)明的篩選方法包括并利用檢測(cè)測(cè)試物是否與SALPR特異結(jié)合的方法和檢測(cè)測(cè)試物與SALPR的結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)的方法。
在本發(fā)明的篩選方法中,例如將SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞與測(cè)試物接觸,以分析SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞是否與所述測(cè)試物結(jié)合,由此無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的刺激和抑制肥胖能力而實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。
具體地,在有或無(wú)測(cè)試物存在時(shí),將SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞與標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)結(jié)合,以比較經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而特異結(jié)合的上述天然配體的量,由此無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的肥胖刺激和抑制能力而實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。即,當(dāng)上述測(cè)試物具有經(jīng)由SALPR的刺激或抑制肥胖能力時(shí),則在測(cè)試物存在下,經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而特異結(jié)合的天然配體的量相對(duì)于無(wú)該測(cè)試物存在時(shí)的相應(yīng)的特異結(jié)合量會(huì)減小。
在本發(fā)明的篩選方法中,當(dāng)比較經(jīng)由SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞特異結(jié)合的天然配體的量時(shí),標(biāo)記的天然配體可用作上述天然配體。對(duì)于上述標(biāo)記,可采用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素的實(shí)例包括[3H],[14C],[125I]以及[35S]。酶的實(shí)例包括β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括異硫氰酸熒光素和BODIPY。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素和光澤精。偶爾,生物素-抗生物素系統(tǒng)可用于天然配體和標(biāo)記物的結(jié)合。
因此,本發(fā)明的篩選方法可篩選結(jié)合SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞而抑制它們結(jié)合天然配體的化合物,無(wú)需區(qū)分經(jīng)由SALPR的刺激和抑制肥胖能力。
在本發(fā)明的篩選方法的另一實(shí)施方案中,將上述細(xì)胞在有或無(wú)測(cè)試物存在的條件下與標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)接觸,以比較在上述條件下經(jīng)由上述細(xì)胞特異結(jié)合的上述天然配體的量,接著進(jìn)一步比較在這些條件下上述天然配體的特異細(xì)胞刺激活性,由此使得在區(qū)分經(jīng)由SALPR的刺激和抑制肥胖能力時(shí)篩選化合物成為可能。
在上述實(shí)施方案中,結(jié)合上述細(xì)胞并經(jīng)由包含在上述細(xì)胞中的受體展示細(xì)胞刺激活性的物質(zhì)可被選作經(jīng)由SALPR刺激肥胖的化合物。
在另一方面,在上述實(shí)施方案中,抑制上述細(xì)胞與天然配體的結(jié)合但不展示細(xì)胞刺激活性的測(cè)試物可被選作經(jīng)由SALPR抑制肥胖的化合物。
本發(fā)明的篩選方法例如可采用腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制作為細(xì)胞刺激活性來(lái)進(jìn)行。
在該實(shí)施方案的篩選方法中,例如通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶的活化而在細(xì)胞中生成的cAMP可采用已知方法測(cè)量,由此使得區(qū)分經(jīng)由SALPR的刺激和抑制肥胖能力時(shí)篩選化合物成為可能。該實(shí)施方案利用了通過(guò)天然配體與SALPR的結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,即作為SALPR的細(xì)胞刺激活性之一的腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制。具體地,當(dāng)天然配體結(jié)合SALPR時(shí),偶聯(lián)到SALPR的G蛋白家族的成員Gi家族抑制腺苷酸環(huán)化酶以降低細(xì)胞中生成的環(huán)狀A(yù)MP(cAMP,通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶從ATP生成)的量。
例如,當(dāng)將腺苷酸環(huán)化酶活化劑[例如,毛喉素(FSK)]添加到在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR(優(yōu)選通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))的哺乳動(dòng)物衍生的細(xì)胞(例如,HEK-293細(xì)胞或CHO細(xì)胞)時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加。
另外,當(dāng)SALPR的天然配體在添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況下添加時(shí),除了腺苷酸環(huán)化酶活化劑引起的腺苷酸環(huán)化酶活性刺激以外,由于上述天然配體對(duì)本發(fā)明的SALPR的作用,也可產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制,這導(dǎo)致與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比cAMP生成減少。因此,當(dāng)進(jìn)行具有刺激肥胖活性的化合物的篩選時(shí),通過(guò)與測(cè)試物單獨(dú)接觸來(lái)選擇減少cAMP生成(即與天然配體的活性相同)的化合物,以替換在該篩選系統(tǒng)中經(jīng)由SALPR起作用的天然配體。
當(dāng)進(jìn)行具有抑制肥胖活性化合物的篩選時(shí),可將腺苷酸環(huán)化酶活化劑、SALPR的天然配體和測(cè)試物添加到細(xì)胞用于篩選。由于天然配體的作用,與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,cAMP生成減少;但是,當(dāng)測(cè)試物拮抗天然配體的作用時(shí),cAMP生成的減少受到抑制。這時(shí),該測(cè)試物可被選作具有抑制肥胖活性的化合物。
可采用免疫分析等作為測(cè)量細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的方法;例如,也可采用定量cAMP的商品化試劑盒。
在篩選方法的另一實(shí)施方案中,例如,通過(guò)采用在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR(優(yōu)選通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))并含有在5′端上游具有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的報(bào)告基因[例如,堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、硝基還原酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或諸如GFP(綠色熒光蛋白)基因的熒光蛋白基因]的細(xì)胞(以下有時(shí)稱(chēng)為“篩選細(xì)胞”),可在區(qū)分經(jīng)由SALPR的刺激和抑制肥胖能力時(shí)實(shí)現(xiàn)化合物的篩選。該實(shí)施方式利用了該事實(shí),即上述篩選細(xì)胞中在啟動(dòng)子區(qū)域引入了CRE的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄由于上述cAMP生成的減少而被抑制。
以下將更加詳細(xì)地解釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述實(shí)施方案在區(qū)分經(jīng)由SALPR的刺激和抑制肥胖能力時(shí)的化合物篩選方法。
換言之,引入上述篩選細(xì)胞中的CRE為常常存在于一組基因(cAMP誘導(dǎo)基因)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的堿基序列,該組基因在細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加時(shí)加速表達(dá)。因此,當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶活化劑(例如FSK)被添加到篩選細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加,這導(dǎo)致位于CRE下游的報(bào)告基因的表達(dá)量增加??赏ㄟ^(guò)測(cè)量來(lái)自底物與報(bào)告基因產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光或來(lái)自作為報(bào)告基因產(chǎn)物而生成的熒光蛋白的熒光而容易地測(cè)量報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)量。
此外,當(dāng)在添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況下添加SALPR的天然配體時(shí),除了由于腺苷酸環(huán)化酶活化劑引起的上述腺苷酸環(huán)化酶活化刺激以外,由于上述天然配體對(duì)本發(fā)明SALPR的作用,也會(huì)出現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制,這導(dǎo)致與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)量降低。因此,當(dāng)進(jìn)行展示刺激肥胖活性的化合物篩選時(shí),可通過(guò)單獨(dú)接觸測(cè)試物選擇降低報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量的化合物(即與天然配體具有相同活性),在該篩選系統(tǒng)中替代經(jīng)由SALPR起作用的天然配體。
當(dāng)進(jìn)行具有抑制肥胖活性化合物的篩選時(shí),可將腺苷酸環(huán)化酶活化劑、SALPR的天然配體和測(cè)試物添加到篩選細(xì)胞。與單獨(dú)添加腺苷酸環(huán)化酶活化劑的情況相比,由于天然配體的作用,報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量降低;但是,當(dāng)測(cè)試物拮抗天然配體的作用時(shí),報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量降低受到抑制。這時(shí),測(cè)試物可被選作具有抑制肥胖活性的化合物。
可容易地證實(shí)測(cè)試物是否通過(guò)與SALPR的結(jié)合而起作用。例如,平行于采用篩選細(xì)胞(即,在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR并含有在5′端上游具有CRE的報(bào)告基因的細(xì)胞)的上述測(cè)試,采用對(duì)照細(xì)胞(例如,含有在5′端上游具有CRE的報(bào)告基因,但不在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR的細(xì)胞)進(jìn)行類(lèi)似測(cè)試。結(jié)果,當(dāng)上述測(cè)試物不通過(guò)與SALPR結(jié)合起作用時(shí),用于篩選的細(xì)胞和用于對(duì)照的細(xì)胞對(duì)于報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量顯示相同的現(xiàn)象,而當(dāng)上述測(cè)試物通過(guò)與SALPR結(jié)合起作用時(shí),用于篩選的細(xì)胞和用于對(duì)照的細(xì)胞對(duì)于報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)量顯示不同的現(xiàn)象。
此外,在另一實(shí)施方案中,可通過(guò)向人或除人之外的生物體[例如,非人的哺乳動(dòng)物(例如,牛、猴、家禽、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)類(lèi)]給予經(jīng)上述篩選方法選擇的測(cè)試物,并在給藥后測(cè)量攝食量、體重和肥胖指標(biāo)(例如,身體脂肪百分比、BMI(身體質(zhì)量指數(shù))、肥胖程度、體質(zhì)、生理年齡、阻抗、體脂重量、無(wú)脂質(zhì)量、身體水質(zhì)量、身體蛋白質(zhì)量、肌肉質(zhì)量、無(wú)機(jī)質(zhì)量、身體細(xì)胞質(zhì)量、肌肉質(zhì)量與身體區(qū)域之比、水質(zhì)量與身體區(qū)域之比、BMR(基礎(chǔ)代謝率)、能量需求、內(nèi)臟-皮下脂肪比(VSR)、內(nèi)臟脂肪重、皮下脂肪重、內(nèi)臟脂肪重量水平、器官重量、血液參數(shù)變化以及血液中的瘦素、葡萄糖、脂質(zhì)、激素、分泌性肽的量),以證實(shí)和確定影響導(dǎo)致肥胖的活性的測(cè)試物。上述哺乳動(dòng)物不限于普通的動(dòng)物,還可以是遺傳突變的疾病動(dòng)物模型(例如,病態(tài)肥胖模型,諸如ob/ob小鼠、db/db小鼠和Zucker肥胖大鼠)和遺傳修飾的動(dòng)物。測(cè)試物可口服或胃腸外給藥。胃腸外途徑的實(shí)例包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)和腦內(nèi)給藥,優(yōu)選在臨近下丘腦的腦室內(nèi)給藥。作為用于該篩選的指標(biāo),例如攝食量和體重以及肥胖指標(biāo)可被有效地測(cè)量。此外,在給藥時(shí),可添加諸如禁食、飽食和過(guò)量脂肪食物的條件。
測(cè)試物可以每天單一劑量或分開(kāi)的劑量的方式給藥,給藥或觀察周期可為一天至數(shù)周。
這里,本發(fā)明中采用的測(cè)試物可為任何化合物,并且可例如為基因庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物、合成的低分子量化合物庫(kù)、核酸(寡聚DNA、寡聚RNA)、合成肽庫(kù)、抗體、細(xì)菌釋放物質(zhì)、細(xì)胞提取液(微生物、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)、細(xì)胞(微生物、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞)培養(yǎng)上清液、純化或部分純化的多肽、來(lái)自海洋生物體、植物或動(dòng)物、土壤的提取物或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫(kù)。
篩選試劑盒本發(fā)明的篩選試劑盒含有松弛素-3受體,優(yōu)選為SALPR,或上述細(xì)胞膜組分(即含有SALPR的細(xì)胞膜組分),或上述細(xì)胞(即,含有SALPR的細(xì)胞)。上述篩選試劑盒另外含有各種試劑,如標(biāo)記的松弛素-3、非標(biāo)記的松弛素-3、用于結(jié)合反應(yīng)的緩沖液和/或用于清洗的緩沖液、說(shuō)明書(shū),以及如需要還含有儀器。
具體地,上述篩選試劑盒含有SALPR、上述細(xì)胞膜組分或上述細(xì)胞以及可以含有標(biāo)記的天然配體(即松弛素-3)、非標(biāo)記的天然配體和/或用于結(jié)合反應(yīng)的緩沖液、說(shuō)明書(shū),以及如需要還含有儀器。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的篩選試劑盒包括在細(xì)胞膜上表達(dá)松弛素-3受體,優(yōu)選為SALPR,(優(yōu)選通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))而且含有在5′端上游具有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的報(bào)告基因的細(xì)胞,如果需要,還可包含堿性磷酸酶、熒光素酶等的底物,腺苷酸環(huán)化酶活化劑(例如,F(xiàn)SK)、天然配體(即松弛素-3)和/或用于結(jié)合反應(yīng)的緩沖液、說(shuō)明書(shū),以及儀器。
本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案的篩選試劑盒包括在細(xì)胞膜上表達(dá)松弛素-3受體,優(yōu)選為SALPR,(優(yōu)選通過(guò)引入含有SALPR的表達(dá)載體而過(guò)量表達(dá))并且含有在5′端上游具有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的報(bào)告基因的細(xì)胞,以及含有在5′端上游具有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的報(bào)告基因但不在細(xì)胞膜上表達(dá)SALPR的細(xì)胞,并且如果需要,可含有報(bào)告基因產(chǎn)物的底物、腺苷酸環(huán)化酶活化劑(例如,F(xiàn)SK)和/或用于結(jié)合反應(yīng)的緩沖液、說(shuō)明書(shū),以及儀器。
含有通過(guò)本發(fā)明篩選方法獲得的化合物的藥物通過(guò)本發(fā)明篩選方法獲得的化合物為刺激或抑制攝食的化合物、增加或降低體重的化合物、或刺激或抑制肥胖的化合物。所述化合物可以為鹽的形式,例如,藥物可接受的鹽。相應(yīng)地,通過(guò)本發(fā)明篩選方法獲得的化合物或其鹽可用作藥物,用于治療由某些攝食(或食欲)控制異常引起的疾病、由某些控制體重方面的異常引起的疾病、由某些控制肥胖方面的異常引起的疾病及由于松弛素-3的異?;蚓幋a松弛素-3的多核苷酸異常而引起的疾病。另外,其可以用作治療藥物,目的是恢復(fù)攝食(或食欲)和/或體重,其由于各種疾病的發(fā)作或各種疾病的治療(例如,手術(shù)中或手術(shù)后)而增加或降低。上述疾病的實(shí)例包括涉及消化道活動(dòng)或功能的疾病(例如,腹瀉、便秘、功能性便秘、過(guò)敏性腸綜合癥和在消化道檢查時(shí)或手術(shù)之前或之后需要通便刺激以除去腸內(nèi)容物的情況),涉及控制免疫功能的疾病(例如,慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病、硬皮病、特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性間質(zhì)性肺炎、肉瘤樣病、克隆氏疾病、炎性結(jié)腸炎、肝硬化、慢性肝炎、暴發(fā)型肝炎、腦脊髓炎和重癥肌無(wú)力),涉及能量代謝的疾病(例如,糖尿病、肥胖型糖尿病、葡萄糖耐受異常、酮癥、酸中毒、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、高血脂、動(dòng)脈硬化、心絞痛、心肌梗塞、肥胖、病態(tài)肥胖、攝食障礙和厭食)、AIDs、腫瘤以及惡病質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的篩選方法,提供了具有經(jīng)由松弛素-3受體、優(yōu)選SALPR或其部分多肽抑制刺激細(xì)胞活性的活性(SALPR-抑制活性)的化合物,更具體地,由天然配體與SALPR或其部分多肽結(jié)合引起的細(xì)胞刺激活性(例如,細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、腺苷酸環(huán)化酶活化、細(xì)胞內(nèi)cAMP生成、細(xì)胞內(nèi)cGMP生成、肌醇磷脂生成、細(xì)胞膜的電位改變、細(xì)胞膜附近的pH改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化、c-fos和c-jun誘導(dǎo)/活化、花生四烯酸的釋放)。含有這種化合物的藥物實(shí)例包括攝食抑制劑、體重降低劑、脂肪減少劑、用于肥胖治療的治療劑和用于糖尿病治療的治療劑。
由此獲得的化合物或其鹽可以單獨(dú)使用;但其也可與藥物可接受的載體混合作為藥物組合物使用。載體中活性成份的百分比可在1-90重量%之間變化。上述藥物可以各種形式經(jīng)口或胃腸外(例如,靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸和皮膚給藥)向人或不同于人的生物體[例如,非人哺乳動(dòng)物(例如牛、猴、家禽、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)以及昆蟲(chóng)類(lèi)]給藥。相應(yīng)地,含有通過(guò)本發(fā)明獲得的化合物或其鹽的藥物組合物按照給藥途徑配制成合適的劑型。具體地,它可配制成諸如片劑、膠囊、顆粒、分散性粉劑以及糖漿的口服制劑,或諸如注射劑、靜脈滴液、脂質(zhì)體組合物以及栓劑的胃腸外制劑。這些制劑可通過(guò)普通方法采用常用的賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、表面活性劑、滑潤(rùn)劑、分散劑、緩沖劑、防腐劑、增溶劑、抗菌劑、矯味劑、鎮(zhèn)痛劑、穩(wěn)定劑等等制成。要采用的上述非毒性添加劑的實(shí)例包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明膠、硬脂酸鎂、甲基纖維素或其鹽、乙醇、檸檬酸、氯化鈉和磷酸鈉。
它們的劑型和給藥量取決于通過(guò)本發(fā)明篩選方法獲得的化合物或其鹽的選擇、給藥的對(duì)象、給藥途徑、制劑的特性、患者的狀況以及醫(yī)師的判斷。但是,每kg患者體重的合適劑量范圍例如為約1.0-1,500μg,優(yōu)選約10-500μg??紤]到效率會(huì)隨給藥途徑而不同,預(yù)計(jì)必需劑量會(huì)在大范圍變化。例如,預(yù)計(jì)經(jīng)口給藥的所需劑量比靜脈注射的高。這種劑量水平的變化可通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化程序進(jìn)行調(diào)整。
抑制松弛素-3活性的物質(zhì)及其應(yīng)用本發(fā)明使用的抑制松弛素-3(即松弛素-3、修飾多肽或同源多肽)活性的物質(zhì)能夠抑制或阻止攝食刺激、體重增加和肥胖。因此,抑制松弛素-3表達(dá)的物質(zhì)有可能用于通過(guò)松弛素-3在體內(nèi)、離體和體外控制與攝食控制和體重控制(例如,能量代謝控制,生長(zhǎng))以及肥胖相關(guān)的功能。
本發(fā)明中使用的抑制松弛素-3活性的物質(zhì)無(wú)特別限制,只要其具有上述活性,例如可為抑制松弛素-3表達(dá)的物質(zhì),諸如具有編碼松弛素-3的堿基序列的反義序列的DNA、具有編碼松弛素-3的堿基序列的雙鏈RNA(小干擾RNA(siRNA))或核酶;或者與松弛素-3或松弛素-3受體(優(yōu)選SALPR)相互作用以抑制松弛素-3的活性的化合物,例如松弛素-3抗體、糖蛋白,或通過(guò)上述篩選方法獲得的化合物。
上述物質(zhì)可以鹽的形式存在,例如藥物可接受的鹽。因此,抑制松弛素-3(即松弛素-3、修飾多肽或同源多肽)活性的物質(zhì)或其鹽可用作藥物,用于治療由某些攝食(或食欲)控制異常引起的疾病,由某些體重控制異常引起的疾病,由某些肥胖控制異常引起的疾病以及由于松弛素-3或編碼松弛素-3的多核苷酸異常引起的疾病。另外,其可以用作治療藥物,目的是恢復(fù)攝食(或食欲)和/或體重,其由于各種疾病的發(fā)作或各種疾病的治療(例如,手術(shù)中或手術(shù)后)而增加或降低。上述疾病的實(shí)例包括涉及消化道運(yùn)動(dòng)或功能的疾病(例如,腹瀉、便秘、功能性便秘、過(guò)敏性腸綜合癥和在消化道檢查時(shí)或手術(shù)之前或之后需要通便刺激以除去腸內(nèi)容物的情況),涉及控制免疫功能的疾病(例如,慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病、硬皮病、特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性間質(zhì)性肺炎、肉瘤樣病、克隆氏疾病、炎性結(jié)腸炎、肝硬化、慢性肝炎、暴發(fā)型肝炎、腦脊髓炎和重癥肌無(wú)力),涉及能量代謝的疾病(例如,糖尿病、肥胖型糖尿病、葡萄糖耐受異常、酮癥、酸中毒、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、高血脂、動(dòng)脈硬化、心絞痛、心肌梗塞、肥胖、病態(tài)肥胖和攝食障礙)。優(yōu)選地,其可用作攝食控制劑、體重降低劑、脂肪減少劑、用于治療肥胖的治療劑或用于治療糖尿病的治療劑。
反義核酸抑制靶基因表達(dá)的機(jī)理為,例如,(1)通過(guò)三鏈鏈的形成抑制轉(zhuǎn)錄的起始,(2)在由RNA聚合酶形成的局部開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)處通過(guò)雜交的形成抑制轉(zhuǎn)錄,(3)通過(guò)與正在合成的RNA形成雜交體抑制轉(zhuǎn)錄,(4)通過(guò)在內(nèi)含子-外顯子連接處形成雜交體而抑制剪接,(5)通過(guò)在剪接體的形成位點(diǎn)形成雜交體而抑制剪接,(6)通過(guò)與mRNA形成雜交體而抑制mRNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),(7)通過(guò)在加帽位點(diǎn)或poly-A添加位點(diǎn)形成雜交體而抑制剪接,(8)通過(guò)在翻譯起始因子結(jié)合位點(diǎn)形成雜交體而抑制翻譯起始,(9)通過(guò)在核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜交體而抑制翻譯,(10)通過(guò)在mRNA翻譯區(qū)或多核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜交體而抑制肽鏈的延長(zhǎng),和(11)通過(guò)在核酸/蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)形成雜交體而抑制基因表達(dá)(New ExperimentalCourse of Biochemistry 2,Nucleic Acid IV,Gene Replication andExpression,by Hirashima and Inoue,compiled by the JapaneseBiochemical Society,Tokyo Kagaku Dojin,pp.319-347,1993)。
用于本發(fā)明的松弛素-3的反義核酸可以為通過(guò)任何上述機(jī)理(1)-(11)抑制基因表達(dá)的任何核酸。也就是,其可以不僅含有抑制表達(dá)的基因翻譯區(qū),還可含有非翻譯區(qū)序列的反義序列。編碼反義核酸的DNA可通過(guò)與合適的調(diào)節(jié)序列連接使其表達(dá)而應(yīng)用。反義核酸不必完全互補(bǔ)于靶基因的翻譯區(qū)或非翻譯區(qū),只要其有效抑制靶基因表達(dá)即可。這種反義核酸為至少15bp或以上,優(yōu)選100bp或以上,更優(yōu)選500bp或以上,并且一般鏈長(zhǎng)為3000bp或以下,優(yōu)選2000bp或以下,更優(yōu)選100bp或以下,并且與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈的同源性?xún)?yōu)選90%或以上,更優(yōu)選95%或以上。這種反義核酸可基于松弛素-3序列信息采用硫逐磷酸酯方法(Stein(1988)Nucleic Acids Res.163209-21)等制備。
核酶是RNA構(gòu)成的催化劑的一般術(shù)語(yǔ),可不嚴(yán)格地分成大核酶和小核酶。大核酶是切斷核酸的磷酸二酯鍵的酶,反應(yīng)后在反應(yīng)位點(diǎn)留下5′-磷酸和3′-羥基基團(tuán)。大核酶進(jìn)一步分成(1)組I內(nèi)含子RNA,其在5′剪接位點(diǎn)通過(guò)尿嘌呤核苷進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng),(2)組II內(nèi)含子RNA,其經(jīng)套索結(jié)構(gòu)通過(guò)兩步反應(yīng)自剪接,和(3)核糖核酸酶P的RNA組分,其通過(guò)水解作用將tRNA前體在5′側(cè)切斷。另一方面,小核酶為相對(duì)小的結(jié)構(gòu)單元(約40bp)并通過(guò)切斷RNA產(chǎn)生5′-羥基基團(tuán)和2′,3′-環(huán)磷酸酯。小核糖酶包括錘頭型核酶(Koizumi等人(1988)FEBS Lett.228225)、發(fā)夾型核酶(Buzayan(1986)Nature323349;Kikuchi and Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.196751;HiroshiKikuchi(1992)Kagaku to Seibutsu 30112)等等。由于核酶很容易被修飾和合成,因此已知有各種改進(jìn)方法。例如,錘頭型核酶在可通過(guò)將核酶的底物結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)成互補(bǔ)于靶位點(diǎn)附近的RNA序列而生成,其在靶RNA中識(shí)別并切斷堿基序列UC、UU或UA(Koizumi等人(1988)FEBS Lett.228225;Makoto Koizumi and Eiko Otsuka(1990)Tampakushitsu Kakusan Koso 352191;Koizumi et al.(1989)NucleicAcids Res.177059)。根據(jù)已知方法,也可以設(shè)計(jì)并產(chǎn)生發(fā)夾型核酶(Kikuchi and Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.196751;Hiroshi Kikuchi(1992)Kagaku to Seibutsu 30112)。
1998年,在秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegance)中觀察到RNAs彼此干擾而失去其功能的現(xiàn)象(RNA干擾)(Fire等人(1998)Nature391806-11)。該RNA干擾是由于將合成的雙鏈RNA引入細(xì)胞而分解具有相同堿基序列的RNA的現(xiàn)象。隨后的研究顯示,諸如RNA干擾的RNA沉默現(xiàn)象是除去缺陷mRNA并防衛(wèi)諸如轉(zhuǎn)座子和病毒的分子寄生物的細(xì)胞機(jī)制。如今,雙鏈RNA(小干擾RNA;siNRA)用作抑制許多基因的表達(dá)的工具,以及采用siRNA通過(guò)控制致病基因等的表達(dá)而治療或預(yù)防疾病的方法正在研究中。本發(fā)明中的siRNA無(wú)特別限制,只要其抑制松弛素-3的mRNA的轉(zhuǎn)錄即可。一般地,siRNA是靶mRNA的有義鏈與反義鏈的結(jié)合并且長(zhǎng)度為至少10個(gè)核苷酸至與靶mRNA相同的核苷酸數(shù)目。該長(zhǎng)度優(yōu)選15-75個(gè),更優(yōu)選18-50個(gè),進(jìn)一步更優(yōu)選20-25個(gè)核苷酸。為了抑制松弛素-3表達(dá),可以通過(guò)已知方法將siRNA引入細(xì)胞。例如,設(shè)計(jì)在單一鏈上的構(gòu)成siRNA的兩RNA鏈的編碼DNA并且導(dǎo)入表達(dá)載體中,用獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞,由此該siRNA可在細(xì)胞中表達(dá)為具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA。已設(shè)計(jì)通過(guò)轉(zhuǎn)染不斷產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體(例如,RNAi-Ready pSIRENVector,RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector(BD BiosciencesClontech))。也可以設(shè)計(jì)siRNA的堿基序列,例如,應(yīng)用在Ambion網(wǎng)址(http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)的計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)。用于篩選功能性siRNA的試劑盒等等(例如,BD KnockoutRNAi System(BD Biosciences Clontech))也可購(gòu)得。
在抑制患者細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的基因治療中,本發(fā)明的反義核酸,核酶和siRNA可直接給藥進(jìn)入組織,或具有如此構(gòu)建以便表達(dá)這些元件的結(jié)構(gòu)的載體(例如,病毒衍生的載體,例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒載體,以及非病毒載體,例如脂質(zhì)體)可直接給藥進(jìn)入組織(體內(nèi)方法)。可通過(guò)注射進(jìn)入組織位點(diǎn),例如肌肉內(nèi)注射、皮下注射、動(dòng)脈內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射完成給藥。
或者,事先,可將具有如此構(gòu)建以便表達(dá)本發(fā)明反義核酸的結(jié)構(gòu)的載體、核酶和siRNA引入離體細(xì)胞。由此獲得的細(xì)胞例如通過(guò)肌肉注射、皮下注射、動(dòng)脈注射或靜脈注射(離體方法)注射進(jìn)患者組織。可以使用患者細(xì)胞的異源或同源細(xì)胞,優(yōu)選同源細(xì)胞,更優(yōu)選取自患者的細(xì)胞。
本發(fā)明的反義核酸、核酶和siRNA或如此構(gòu)建的以便表達(dá)這些元件的載體可單獨(dú)使用;然而,它們可與藥物可接受的載體混合用作藥物組合物(例如,攝食抑制劑、用于肥胖治療的治療劑、用于糖尿病治療的治療劑)。例如,當(dāng)以注射劑形式給藥時(shí),該藥物組合物可含有蒸餾水,鹽如氯化鈉的溶液或氯化鈉和無(wú)機(jī)鹽的混合物,糖例如甘露醇、乳糖、右旋糖苷和葡萄糖的溶液,氨基酸如甘氨酸和精氨酸的溶液,有機(jī)酸溶液或鹽溶液和葡萄糖溶液的混合溶液,等等。
給藥劑量根據(jù)患者體重和年齡、癥狀情況、給藥形式等等而變化;然而,可由本領(lǐng)域技術(shù)人員合適地選擇劑量。
要用在本發(fā)明中的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體以及抗體片段。
除了松弛素-3(即,松弛素-3,修飾多肽或同源多肽)或其部分片段用作免疫抗原和篩選抗原以外,要用在本發(fā)明中的單克隆抗體可以通過(guò)已知方法獲得。例如,用上述免疫抗體免疫小鼠,從該小鼠獲得的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞用細(xì)胞融合方法(Nature,256,495(1975))或細(xì)胞電融合方法(J.Immunol.Method,100,181-189(1987))進(jìn)行細(xì)胞融合,融合的細(xì)胞用上述篩選抗原進(jìn)行篩選,由此可以獲得要用在本發(fā)明中的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
作為培養(yǎng)上述雜交瘤的培養(yǎng)基,可采用任何適合培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基,優(yōu)選補(bǔ)充了胎牛血清、L-谷氨酰胺、L-丙酮酸和抗生素(青霉素G和鏈霉素)的Dulbecco改良的Eagle最低必需培養(yǎng)基。上述雜交瘤可在培養(yǎng)基中在5% CO2氣氛中于37℃培養(yǎng)3天?;蛘撸稍谛∈蟾鼓?nèi)培養(yǎng)約14天。
從如此獲得的培養(yǎng)液或小鼠腹部液體中,上述單克隆抗體可通過(guò)普通蛋白質(zhì)分離和純化方法進(jìn)行分離和純化。這些方法的實(shí)例包括硫酸銨鹽析法、采用離子交換纖維素的離子交換柱色譜法、采用分子篩凝膠的分子篩柱色譜法、采用蛋白質(zhì)-A結(jié)合多糖的親和柱層析法、透析和凍干法。
除了松弛素-3(即,松弛素-3,修飾多肽或同源多肽)或其部分片段用作免疫抗原和篩選抗原之外,要用在本發(fā)明中的單克隆抗體可以通過(guò)已知方法獲得,例如,如下文所述。具體地,含有抗原的生理鹽水與等量的弗氏完全佐劑或不完全佐劑或其等同物如Hunter’sTiterMaxTM(Funakoshi)混合并乳化的乳劑,經(jīng)皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)向哺乳動(dòng)物(尤其是兔或山羊)給藥(初此免疫)。其后,以2-4周時(shí)間間隔以同樣方式進(jìn)行數(shù)次免疫。最后一次免疫后的1-2周,從哺乳動(dòng)物的頸動(dòng)脈或心臟取血,經(jīng)硫酸銨鹽析制備血清。
要用在本發(fā)明中的抗體片段為上述抗體(包括單克隆抗體和多克隆抗體)的部分片段,無(wú)特別限制,只要其與原始抗體具有相同的反應(yīng)特異性即可。根據(jù)本發(fā)明抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv。例如,可將上述方法獲得的單克隆抗體或多克隆抗體根據(jù)普通方法經(jīng)蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)消化,然后產(chǎn)物經(jīng)過(guò)普通蛋白分離和純化方法處理而獲得要用在本發(fā)明中的抗體片段。
此外,根據(jù)另一實(shí)施方案,要用在本發(fā)明中的抗體可通過(guò)WO01/068862和日本專(zhuān)利公開(kāi)No.2002-345468的說(shuō)明書(shū)描述的方法獲得。也可采用已知的松弛素-3抗體,例如,日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2002-345468(單克隆抗體HK4-144-10)的實(shí)施例中描述的抗體。
要用在本發(fā)明中的抗體也可用作藥物組合物,例如攝食(或食欲)抑制劑、用于治療肥胖的治療劑和用于治療糖尿病的治療劑。要用在本發(fā)明中的抗體可通過(guò)與藥物可接受的載體混合用作藥物組合物。載體中的活性成分百分比可在1-90重量%之間變化。另外,上述藥物可以各種形式經(jīng)口或胃腸外(例如,靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸或皮膚給藥)向人或不同于人的生物體[例如,非人哺乳動(dòng)物(例如牛、猴、家禽、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豬、犬)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)以及昆蟲(chóng)類(lèi)]給藥。相應(yīng)地,含有本發(fā)明抗體的藥物組合物按照給藥途徑配制成合適的劑型。具體地,它可配制成諸如片劑、膠囊、顆粒、分散性粉劑以及糖漿的口服制劑,或諸如注射劑、靜脈滴液、脂質(zhì)體組合物以及栓劑的胃腸外制劑。這些藥物組合物可通過(guò)普通方法采用常用的賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、表面活性劑、滑潤(rùn)劑、分散劑、緩沖劑、防腐劑、增溶劑、抗菌劑、矯味劑、鎮(zhèn)痛劑、穩(wěn)定劑等等制成。要采用的上述非毒性添加劑的實(shí)例包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明膠、硬脂酸鎂、甲基纖維素或其鹽、乙醇、檸檬酸、氯化鈉和磷酸鈉。
它們的劑型和給藥量取決于抗體的選擇、給藥的對(duì)象、給藥途徑、制劑的特性、患者的狀況以及醫(yī)師的判斷。但是,每kg患者體重的合適劑量范圍例如為約0.01-30mg,優(yōu)選約0.1-10mg??紤]到效率會(huì)隨給藥途徑而不同,預(yù)計(jì)必需劑量會(huì)在大范圍變化。例如,預(yù)計(jì)經(jīng)口給藥的所需劑量比靜脈內(nèi)注射的高。這種劑量水平的變化可通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化程序進(jìn)行調(diào)整。
與松弛素-3或松弛素-3受體(優(yōu)選SALPR)作用并抑制松弛素-3活性的物質(zhì)可通過(guò)本發(fā)明的篩選方法獲得。通過(guò)上述篩選方法獲得的化合物的合適的實(shí)例為在隨后的實(shí)施例中描述的1,2,5-二唑并[3,4-a]1,2,5-二唑并[3,4-e]1,2,5-二唑并[3,4-i]1,2,5-二唑并[3,4-m][16]環(huán)輪烯(下文中有時(shí)稱(chēng)為“化合物1”)。該化合物的給藥方式可以參考上述那些含有通過(guò)本發(fā)明篩選方法獲得的化合物的藥物。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“治療(therapy)”一般指獲得期望的藥理作用和/或生理作用。對(duì)于完全或部分預(yù)防疾病和/或癥狀來(lái)說(shuō),該作用是預(yù)防性的,或者,對(duì)于完全或部分治愈由疾病和/或癥狀引起的不良作用來(lái)說(shuō),它們是治療性的。這里所用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括治療哺乳動(dòng)物疾病,尤其是人類(lèi),并通過(guò)以下療法舉例證明(a)在可能有疾病或癥狀的病因因素但并沒(méi)有被診斷出具有疾病或癥狀的患者中,預(yù)防疾病或癥狀發(fā)作;(b)抑制疾病癥狀,或防止或延遲其發(fā)展;以及(c)減緩疾病癥狀,即,使疾病或癥狀減輕或逆轉(zhuǎn)癥狀的發(fā)展。
將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施例通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明,但不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1編碼SALPR的多核苷酸的制備基于SEQ ID NO3表示的核酸序列,編碼SALPR的多核苷酸的分離如下進(jìn)行。在SEQ ID NO3中,顯示有1857堿基對(duì)并且已知編碼SALPR的區(qū)域?yàn)閺奈恢?61至位置1770(1410堿基對(duì),470個(gè)氨基酸殘基)(GenBank登錄號(hào)NM_016568)。為了通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分離基因,根據(jù)普通方法制備SEQ ID NO5和SEQ ID NO6表示的PCR引物。
采用人類(lèi)基因組DNA(Roche Diagnostics)作為模板,利用SEQID NO5和SEQ ID NO6表示的一套PCR引物,采用(Expand HighFidelity PCR系統(tǒng)(Roche Diagnostics)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū),30次重復(fù)循環(huán)(98℃ 1分鐘,57℃ 1分鐘,以及72℃ 3分鐘)進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果,獲得約1400堿基對(duì)的DNA片段。
將該DNA片段插入pCR2.1(Invitrogen),該序列經(jīng)ABI prism DNA測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer Applied Biosystems)證實(shí)。結(jié)果,插入通過(guò)由SEQ ID NO5和SEQ ID NO6組成的該套引物獲得的pCR2.1-SALPR中的1410堿基對(duì)的序列,其長(zhǎng)度與SEQ ID NO3中從位置361至位置1770的長(zhǎng)度一致,但其在序列中有一突變。顯然該突變不影響該位點(diǎn)核酸序列到氨基酸的翻譯,并且因此可以獲得編碼SALPR的多核苷酸。
實(shí)施例2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒的制備將pBabe Puro(Morgenstern,J.P.and Land,H.Nucleic Acids Res.Vol.18,3587-3596(1990)(SEQ ID NO7)用SalI和ClaI酶切去除SV40啟動(dòng)子-puro(r)區(qū)域,得到的片段用Klenow片段補(bǔ)平。在切斷位點(diǎn)插入IRES-hyg(r)區(qū)域,從而獲得pBabeXIH,其中IRES-hyg(r)區(qū)域是采用NsiI和XbaI酶切從pIREShyg(Clontech)中切除并且用T4聚合酶補(bǔ)平的。
用SspI和BamHI酶切pBabeXIH除去5’-LTR-包裝信號(hào)。在切斷位點(diǎn)插入5’LTR-CMV啟動(dòng)子-包裝信號(hào),從而獲得pBabeCLXIH,其中5’LTR-CMV啟動(dòng)子-包裝信號(hào)是采用SspI和BamHI酶切從pCLXSN(IMGENEX)切除的。
實(shí)施例3用于SALPR基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒的制備采用限制酶HpaI酶切以上實(shí)施例2中描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pBabeCLXIH。在切斷位點(diǎn)插入編碼SALPR的多核苷酸以獲得pBabeCL(SALPR)IH,其中該多核苷酸是采用EcoRV酶切從以上實(shí)施例1獲得的pCR2.1-SALPR中切除并用T4聚合酶補(bǔ)平而獲得的(圖1)。
實(shí)施例4用于SALPR基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備將293-EBNA細(xì)胞(Invitrogen)(2×106)在10-cm膠原包被的培養(yǎng)皿(IWAKI)中采用補(bǔ)加了10%胎牛血清(FBS)和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(PS)的10ml DMEM(Sigma)(以下稱(chēng)為“EBNA培養(yǎng)液”)中培養(yǎng)。第二天,上述293-EBNA細(xì)胞采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑TransIT(Panvera)以pV-gp(由NsiI和XbaI酶切pVPack-GP(Stratagene)去除IRES-hisD并用T4聚合酶補(bǔ)平,且隨后得到的片段自身連接而制備)、pVPack-VSV-A(Stratagene)和實(shí)施例3中獲得的SALPR基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒各3.3μg轉(zhuǎn)染。EBNA培養(yǎng)液6-12小時(shí)后更換并且在37℃繼續(xù)孵育。
轉(zhuǎn)染2天后回收培養(yǎng)液并且以1,200×g離心10分鐘。得到的上清用0.45μm濾膜(Millipore)過(guò)濾,得到未濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體組分,隨后按以下方式進(jìn)行病毒載體的進(jìn)一步濃縮。
50個(gè)用于超速離心的Ultra-Clear Tube(Beckman)用70%乙醇滅菌并用蒸餾水沖洗,向其中倒入35ml未濃縮病毒載體組分。離心管放置在SW28超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子(Beckman)中,采用XL-90超速離心機(jī)(Beckman)以19,500rpm離心100分鐘。離心后,棄去得到的上清,離心管冰凍保存。1小時(shí)后,獲得約100μl濃縮的病毒載體溶液,即保留在試管壁上的培養(yǎng)液。
實(shí)施例5用于轉(zhuǎn)移含有環(huán)AMP響應(yīng)元件的報(bào)告基因的SE302細(xì)胞的構(gòu)建(1)構(gòu)建含有環(huán)AMP應(yīng)答元件的報(bào)告DNA參考已發(fā)表的文章(Durocher等人Anal Biochem 2000,284(2),316-26)按如下方式構(gòu)建涉及cAMP應(yīng)答轉(zhuǎn)錄的單元。
為了構(gòu)建含有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的單元,根據(jù)普通方法構(gòu)建了用于CREx2hb的SEQ ID NO8和SEQ ID NO9表示的寡聚DNA以及用于CREx2bp的SEQ ID NO10和SEQ ID NO11表示的寡聚DNA。
各個(gè)組合的寡聚DNA加熱到95℃,之后逐漸降低溫度至室溫以形成雙鏈DNAs(CREx2hb和CREx2bp)。用HindIII和BamHI消化CREx2hb并且用BamHI and PstI消化CREx2bp,同時(shí),用HindIII和PstI消化pBluescriptIISK(+)(Stratagene)。消化后的DNA經(jīng)電泳以純化在兩端具有限制性酶切位點(diǎn)的DNA,隨后這3DNA(CREx2hb、CREx2bp和pBluescriptIISK(+))同時(shí)被連接,得到的質(zhì)粒序列經(jīng)分析以構(gòu)建CRE4/pBluescriptIISK。
接著,為了獲得含有VIP(血管活性腸肽)啟動(dòng)子的DNA,根據(jù)普通方法構(gòu)建了SEQ ID NO12和SEQ ID NO13表示的PCR引物。
使用人類(lèi)基因組DNA(Roche Diagnostics)作為模板,以SEQ ID NO12和SEQ ID NO13表示的一套PCR引物,采用重組Taq聚合酶(Takara)35次重復(fù)循環(huán)(94℃ 30秒,55℃ 30秒以及72℃ 1分鐘)進(jìn)行PCR,獲得264堿基對(duì)的DNA片段(SEQ ID NO14)。該264堿基對(duì)的DNA用PstI消化并插入CRE4/pBluescriptIISK(+)的PstI位點(diǎn),得到的質(zhì)粒的序列經(jīng)證實(shí)構(gòu)建CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)(圖2A)。如此得到的CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)用HindIII和SmaI消化,然后得到的CRE4VIP啟動(dòng)子片段被補(bǔ)平。
從上述病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pBabeCLXIH去除IRES-hygro(r)區(qū)域以構(gòu)建pBabeCLX(圖2B)。將含有CRE和VIP啟動(dòng)子及報(bào)告基因的序列引入用于外源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒中,以獲得pBabeCLcre4vPdNN(圖2C),其中報(bào)告基因?yàn)樘ケP(pán)衍生的堿性磷酸酯酶(PLAP)基因(Goto等,Molecular Pharmacology,49,860-873,1996),用于外源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒是通過(guò)從pBabeCLX去除內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒增強(qiáng)子活性(LTR)的NheI-NarI區(qū)域而得到。
(2)用于轉(zhuǎn)移含有環(huán)AMP應(yīng)答元件的報(bào)告基因的SE302細(xì)胞的建立采用其中PLAP報(bào)告基因由環(huán)AMP應(yīng)答元件誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pBabeCLcre4vPdNN,根據(jù)實(shí)施例4中描述的方法制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將如此制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入HEK293細(xì)胞,得到的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋方法克隆。在PLAP誘導(dǎo)方面展示最好反應(yīng)性的克隆的細(xì)胞(下文中稱(chēng)“SE302細(xì)胞”)用于以下的實(shí)驗(yàn)中。
實(shí)施例6通過(guò)用于SALPR基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備表達(dá)SALPR的細(xì)胞通過(guò)以上實(shí)施例4中制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,按以下方式將SALPR基因轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。
在以上實(shí)施例5中構(gòu)建的SE302(3×103)細(xì)胞在96孔板(AsahiTechno Glass)中,采用補(bǔ)加了10%胎牛血清(FBS)和PS的100μlDMEM(Sigma)(下文稱(chēng)為“培養(yǎng)液”)中培養(yǎng)。第二天,適當(dāng)稀釋實(shí)施例4中制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,稀釋液的100μl的部分和配制在培養(yǎng)液中的凝聚胺(或稱(chēng)為海美溴銨,Sigma)(終濃度8μg/ml)被加入到SE302細(xì)胞。第二天,培養(yǎng)液被補(bǔ)加了500μg/ml潮霉素(Invitrogen)的200μl培養(yǎng)液置換,然后繼續(xù)孵育。合適地傳代培養(yǎng)用于SALPR基因轉(zhuǎn)移的在這些條件下生長(zhǎng)的SE302細(xì)胞(下文中稱(chēng)為“SALPR-SE302細(xì)胞”),以用于實(shí)驗(yàn)用途。
實(shí)施例7通過(guò)松弛素-3抑制在SALPR-SE302細(xì)胞中通過(guò)加入毛喉素引起的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)在以上實(shí)施例6中構(gòu)建的SALPR-SE302細(xì)胞被懸浮在培養(yǎng)基中用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性(補(bǔ)加了10% FBS(65℃ 30分鐘滅活)的DMEM),然后以1×104細(xì)胞/孔接種在96孔板中(Beckton Dickinson)。第二天,添加特定濃度的以檢測(cè)培養(yǎng)基(補(bǔ)加了0.1%牛血清白蛋白的DMEM)稀釋的松弛素-3(Phoenix Pharmaceuticals)或胰島素(Invitrogen),然后加入毛喉素(Calbiochem)使終濃度為1μmol/L。孵育1天后,每孔吸取15μl細(xì)胞上清液并轉(zhuǎn)移到用于化學(xué)發(fā)光測(cè)量的96孔板中(Sumitomo Bakelite),加入60μl用于檢測(cè)的緩沖溶液(280mmol/LNa2CO3-NaHCO3,8mmol/L MgSO4,pH 10)以及70μl Lumiphos530(Lumigen),室溫反應(yīng)1小時(shí),然后通過(guò)融合板讀取器(fusion platereader)(Perkin Elmer)針對(duì)每個(gè)孔測(cè)量化學(xué)發(fā)光以評(píng)估轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)于每一檢測(cè)樣品加入的細(xì)胞上清液的活性表示為百分比,其中設(shè)定以加入1μmol/L毛喉素的細(xì)胞上清液的轉(zhuǎn)錄活性為100%而沒(méi)有加入毛喉素的上清液活性為0%(圖3)。
結(jié)果顯示,松弛素-3經(jīng)由SALPR活化抑制由毛喉素引起的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。由于該轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)不受相關(guān)多肽影響即胰島素的影響,因此該反應(yīng)顯示為特異于松弛素-3。也就是說(shuō),其顯示通過(guò)采用該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),可區(qū)分影響松弛素-3對(duì)SALPR活化的化合物或物質(zhì)。
實(shí)施例8用SALPR-SE302細(xì)胞篩選松弛素-3的拮抗物應(yīng)用實(shí)施例7顯示的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),進(jìn)行拮抗松弛素-3活性的化合物的篩選,以發(fā)現(xiàn)具有拮抗活性的化合物。
將SALPR-SE302細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中以便檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性(補(bǔ)加了10% FBS(65℃ 30分鐘滅活)的DMEM-F12),然后以5000細(xì)胞/孔接種在384孔板(Greiner)上。第二天,將測(cè)試化合物1,2,5-二唑并[3,4-a]1,2,5-二唑并[3,4-e]1,2,5-二唑并[3,4-i]1,2,5-二唑并[3,4-m][16]環(huán)輪烯(化合物1)溶解在毛喉素(Fermentek)溶液中,將得到的溶液加入細(xì)胞上清液中(終濃度3μmol/L毛喉素,20μg/ml測(cè)試化合物,0.5% DMSO(二甲亞砜))。然后,加入在檢測(cè)培養(yǎng)基(補(bǔ)充了0.1%牛血清白蛋白的DMEM-F12)中稀釋的松弛素-3(Peptide Institute,Inc.),使終濃度為3nmol/L。孵育1天后,每孔吸取5μl細(xì)胞上清液,然后轉(zhuǎn)移至384孔板用于化學(xué)發(fā)光測(cè)量(Corning),加入20μl檢測(cè)用緩沖溶液和25μl Lumiphos530,反應(yīng)在室溫進(jìn)行2小時(shí),之后每一孔的化學(xué)發(fā)光通過(guò)ARVOsx3板讀取器(Perkin Elmer)測(cè)量以評(píng)估轉(zhuǎn)錄活性。無(wú)SALPR表達(dá)的SE302細(xì)胞也以同樣方式處理,以便確定測(cè)試物的特異性。
結(jié)果顯示,在SALPR-SE302細(xì)胞中松弛素-3抑制由毛喉素引起的轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)并且測(cè)試物化合物1拮抗松弛素-3對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的抑制(圖4A)。另外,在無(wú)SALPR表達(dá)的SE302細(xì)胞中,化合物1不能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性(圖4B)。因此,可以確定測(cè)試物為特異性抑制松弛素-3對(duì)SALPR的活化(activation of SALPR by relaxin-3)的化合物。
實(shí)施例9松弛素-3腦室內(nèi)給藥引起的攝食刺激(1)腦室內(nèi)給藥試驗(yàn)動(dòng)物和預(yù)處理使Wistar雄性大鼠(7周大;Japan Charles River)進(jìn)食用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的食物(MF;Oriental Yeast)使之適應(yīng)。麻醉狀態(tài)下大鼠(250-300g)在側(cè)部腦室插管。給藥試驗(yàn)在一星期或之后進(jìn)行。
(2)松弛素-3溶液制備松弛素-3(60μg;Phoenix Pharmaceuticals)溶解于DMSO并加入人工腦脊液,使其終濃度為200μmol/L。離心除去沉積的沉淀物,得到的上清液用作松弛素-3給藥溶液。當(dāng)采用實(shí)施例7所示實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的松弛素-3標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算時(shí),給藥量(給藥溶液中松弛素-3的濃度)為約50pmol/大鼠。
(3)松弛素-3溶液的腦室內(nèi)給藥帶有植入導(dǎo)管的大鼠分為兩組(每組6只),使用灌輸泵以5μl/2分鐘速度給予松弛素-3給藥溶液或載體溶液(與上述(2)組分相同但無(wú)松弛素-3的溶液)。
(4)攝食量的測(cè)量緊接給藥溶液的腦室內(nèi)給藥之后,將大鼠放進(jìn)已放置預(yù)先稱(chēng)重飼料的籠中并且隨意進(jìn)食。2小時(shí)后,通過(guò)測(cè)量飼料的減少計(jì)算進(jìn)食量。圖5顯示平均攝食量和每組的標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示,接受約50pmol松弛素-3的大鼠與接受對(duì)照載體溶液的大鼠相比,其在給藥后2小時(shí)測(cè)量的攝食量顯著增加(t-test,p<0.01)。因此,揭示了松弛素-3刺激攝食行為。
實(shí)施例10松弛素-3單次腦室內(nèi)給藥時(shí)血液中瘦素濃度的增加血液瘦素濃度的測(cè)量上述大鼠在攝食測(cè)量后(給藥后約3小時(shí)),用戊巴比妥鈉麻醉,從腹主動(dòng)脈取血。取出的血液以1,750×g離心15分鐘,得到的上清液儲(chǔ)存在-80℃。隨后,上清液中的瘦素的量用大鼠瘦素定量ELISA試劑盒(Amersham Bioscience)定量檢測(cè)。
結(jié)果揭示,單次松弛素-3給藥組與對(duì)照載體給藥組比較,其血液瘦素濃度顯著增加(t-test,p<0.05;圖6)。
實(shí)施例11松弛素-3持續(xù)給藥對(duì)體重增加和增肥的刺激(1)松弛素-3溶液的制備將松弛素-3(Peptide Institute,Inc.)以100μmol/L的濃度溶解在生理鹽水中制備松弛素-3溶液。載體溶液(生理鹽水)或松弛素-3溶液倒入滲透泵(Alzet滲透泵型號(hào)1002(DURECT);遞送速率6μl/天)、用于給藥的管和插管中,之后將它們連接在一起。
(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和腦室內(nèi)給藥處理使Wistar雄性大鼠(6周大;Japan Charles River)進(jìn)食用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的食物(MF;Oriental Yeast),在單個(gè)籠中適應(yīng)4天。在麻醉狀態(tài)下,導(dǎo)管插入這些大鼠(250-270g)的側(cè)部腦室中并且將滲透泵植入皮下。
(3)體重增加和攝食量的測(cè)量大鼠自由進(jìn)食,每天早晨測(cè)量其體重和攝食。如圖7所示,體重從手術(shù)日(0天)增加。另外,每天減少的飼料量顯示為攝食量(圖8)。
松弛素-3給藥組大鼠從術(shù)后1天起被確認(rèn)體重顯著增加。另外,也觀察到,從1天起松弛素-3給藥組大鼠攝食量顯著增加(t-test;**p<0.01,*p<0.05)。
4)測(cè)量脂肪重量和定量檢測(cè)血液瘦素和血液胰島素水平在實(shí)驗(yàn)最后一天(第14天)測(cè)量體重和攝食量后,大鼠用戊巴比妥鈉麻醉,取出附睪脂肪并測(cè)量全部脂肪重量(圖9)。另外,從腹主動(dòng)脈取血。血液經(jīng)1,750×g離心15分鐘,得到的上清液儲(chǔ)存在-80℃。隨后,用大鼠瘦素檢測(cè)試劑盒(L)(IBL)定量檢測(cè)上清液中瘦素的量(圖10A)。另外,用超敏大鼠胰島素檢測(cè)試劑盒(Morinaga Institute ofBiological Science)定量檢測(cè)上清液中胰島素的量(圖10B)。
結(jié)果顯示,松弛素-3持續(xù)給藥組大鼠與對(duì)照載體給藥組的大鼠相比,其附睪脂肪的量顯著增加。另外,揭示了在松弛素-3持續(xù)給藥組大鼠血液中瘦素和胰島素濃度也有顯著增加(t-test;**p<0.01,*p<0.05)。因此,揭示松弛素-3給藥刺激了與脂肪積累有關(guān)的增肥活性,并同時(shí)增加了胰島素水平。
實(shí)施例12松弛素-3持續(xù)給藥對(duì)體重增加和運(yùn)動(dòng)行為的影響(1)松弛素-3溶液的制備將松弛素-3(Peptide Institute,Inc.)以100μmol/L的濃度溶解在生理鹽水中以制備松弛素-3溶液。將載體溶液(生理鹽水)或松弛素-3溶液倒入滲透泵(Alzet滲透泵型號(hào)1002(DURECT);遞送速率6μl/天)、用于給藥的管和插管中,之后將其連接在一起。
(2)試驗(yàn)動(dòng)物和腦室內(nèi)給藥處理使Wistar雄性大鼠(5周大;Japan Charles River)進(jìn)食用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的食物(MF;Oriental Yeast),在各個(gè)籠中適應(yīng)5天。在麻醉狀態(tài)下,將導(dǎo)管插入這些大鼠(170-200g)的側(cè)部腦室中,將滲透泵植入皮下。手術(shù)當(dāng)天設(shè)為第0天。大鼠自由進(jìn)食和飲水,并且除了檢測(cè)運(yùn)動(dòng)行為的幾天以外,每天早晨測(cè)量體重(圖11)。
證實(shí)松弛素-3給藥組大鼠從給藥后1天起體重顯著增加,同上述實(shí)施例11類(lèi)似(t-test;**p<0.01,*p<0.05)。
(3)自發(fā)性運(yùn)動(dòng)行為測(cè)量在識(shí)別到接受松弛素-3給藥的大鼠體重增長(zhǎng)行為的顯著差異的幾天,應(yīng)用Versamax系統(tǒng)(Accuscan)在有光期間和黑暗期間中測(cè)量自發(fā)性運(yùn)動(dòng)行為。
有光期間的大鼠(開(kāi)始給藥后第2天和第7天)與黑暗期間的大鼠(開(kāi)始給藥后第3天和第8天)從各自籠子轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室,試驗(yàn)前至少適應(yīng)1小時(shí),然后將大鼠引入Versamax籠中,立即記錄運(yùn)動(dòng)行為并持續(xù)90分鐘。90分鐘的總體運(yùn)動(dòng)行為如圖12所示。
任何天任何組的大鼠中都沒(méi)有觀察到運(yùn)動(dòng)行為的明顯變化。也就是說(shuō),其揭示了松弛素-3的增加體重活性不是因?yàn)樽园l(fā)運(yùn)動(dòng)行為的變化。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明,提供了在刺激攝食、增加體重和增肥中有有益效果的多肽;含有所述多肽的治療劑;篩選活化或抑制所述多肽受體的化合物、物質(zhì)或其鹽的方法;用于所述篩選的試劑盒;以及包含抑制所述多肽表達(dá)的物質(zhì)的藥劑,諸如攝食抑制劑、治療肥胖的治療劑以及治療糖尿病的治療劑。
序列表<110>EISAI CO.,LTD.
<120>篩選方法<130>E1-A0410Y1P<150>JP 2004-31591<151>2004-02-09<150>JP 2004-368509<151>2004-12-20<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>429<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)..(429)<223>
<400>1atg gcc agg tac atg ctg ctg ctg ctc ctg gcg gta tgg gtg ctg acc 48Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr1 5 10 15ggg gag ctg tgg ccg gga gct gag gcc cgg gca gcg cct tac ggg gtc 96Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val20 25 30agg ctt tgc ggc cga gaa ttc atc cga gca gtc atc ttc acc tgc ggg144Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly35 40 45ggc tcc cgg tgg aga cga tca gac atc ctg gcc cac gag gct atg gga192Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly
50 55 60gat acc ttc ccg gat gca gat gct gat gaa gac agt ctg gca ggc gag240Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu65 70 75 80ctg gat gag gcc atg ggg tcc agc gag tgg ctg gcc ctg acc aag tca288Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser85 90 95ccc cag gcc ttt tac agg ggg cga ccc agc tgg caa gga acc cct ggg336Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly100 105 110gtt ctt cgg ggc agc cga gat gtc ctg gct ggc ctt tcc agc agc tgc384Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys115 120 125tgc aag tgg ggg tgt agc aaa agt gaa atc agt agc ctt tgc tag429Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys130 135 140<210>2<211>142<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr1 5 10 15Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val20 25 30Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly35 40 45Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly50 55 60
Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu65 70 75 80Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser85 90 95Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly100 105 110Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys115 120 125Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys130 135 140<210>3<211>1857<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(361)..(1770)<223>
<400>3gatttgggga gttatgcgcc agtgccccag tgaccgcggg acacggagag gggaagtctg 60cgttgtacat aaggacctag ggactccgag cttggcctga gaacccttgg acgccgagtg120cttgccttac gggctgcact cctcaactct gctccaaagc agccgctgag ctcaactcct180gcgtccaggg cgttcgctgc gcgccaggac gcgcttagta cccagttcct gggctctctc240ttcagtagct gctttgaaag ctcccacgca cgtcccgcag gctagcctgg caacaaaact300ggggtaaacc gtgttatctt aggtcttgtc ccccagaaca tgacctagag gtacctgcgc360
atg cag atg gcc gat gca gcc acg ata gcc acc atg aat aag gca gca408Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala1 5 10 15ggc ggg gac aag cta gca gaa ctc ttc agt ctg gtc ccg gac ctt ctg456Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu20 25 30gag gcg gcc aac acg agt ggt aac gcg tcg ctg cag ctt ccg gac ttg504Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu35 40 45tgg tgg gag ctg ggg ctg gag ttg ccg gac ggc gcg ccg cca gga cat552Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His50 55 60ccc ccg ggc agc ggc ggg gca gag agc gcg gac aca gag gcc cgg gtg600Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val65 70 75 80cgg att ctc atc agc gtg gtg tac tgg gtg gtg tgc gcc ctg ggg ttg648Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu85 90 95gcg ggc aac ctg ctg gtt ctc tac ctg atg aag agc atg cag ggc tgg696Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp100 105 110cgc aag tcc tct atc aac ctc ttc gtc acc aac ctg gcg ctg acg gac744Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp115 120 125ttt cag ttt gtg ctc acc ctg ccc ttc tgg gcg gtg gag aac gct ctt792Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu130 135 140gac ttc aaa tgg ccc ttc ggc aag gcc atg tgt aag atc gtg tcc atg840Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met145 150 155 160gtg acg tcc atg aac atg tac gcc agc gtg ttc ttc ctc act gcc atg888Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met165 170 175
agt gtg acg cgc tac cat tcg gtg gcc tcg gct ctg aag agc cac cgg 936Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg180 185 190acc cga gga cac ggc cgg ggc gac tgc tgc ggc cgg agc ctg ggg gac 984Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp195 200 205agc tgc tgc ttc tcg gcc aag gcg ctg tgt gtg tgg atc tgg gct ttg1032Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu210 215 220gcc gcg ctg gcc tcg ctg ccc agt gcc att ttc tcc acc acg gtc aag1080Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys225 230 235 240gtg atg ggc gag gag ctg tgc ctg gtg cgt ttc ccg gac aag ttg ctg1128Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu245 250 255ggc cgc gac agg cag ttc tgg ctg ggc ctc tac cac tcg cag aag gtg1176Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val260 265 270ctg ttg ggc ttc gtg ctg ccg ctg ggc atc att atc ttg tgc tac ctg1224Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu275 280 285ctg ctg gtg cgc ttc atc gcc gac cgc cgc gcg gcg ggg acc aaa gga1272Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly290 295 30Oggg gcc gcg gta gcc gga gga cgc ccg acc gga gcc agc gcc cgg aga1320Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg305 310 315 320ctg tcg aag gtc acc aaa tca gtg acc atc gtt gtc ctg tcc ttc ttc1368Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe325 330 335ctg tgt tgg ctg ccc aac cag gcg ctc acc acc tgg agc atc ctc atc1416Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile340 345 350
aag ttc aac gcg gtg ccc ttc agc cag gag tat ttc ctg tgc cag gta1464Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val355 360 365tac gcg ttc cct gtg agc gtg tgc cta gcg cac tcc aac agc tgc ctc1512Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu370 375 380aac ccc gtc ctc tac tgc ctc gtg cgc cgc gag ttc cgc aag gcg ctc1560Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu385 390 395 400aag agc ctg ctg tgg cgc atc gcg tct cct tcg atc acc agc atg cgc1608Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg405 410 415ccc ttc acc gcc act acc aag ccg gag cac gag gat cag ggg ctg cag1656Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln420 425 430gcc ccg gcg ccg ccc cac gcg gcc gcg gag ccg gac ctg ctc tac tac1704Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr435 440 445cca cct ggc gtc gtg gtc tac agc ggg ggg cgc tac gac ctg ctg ccc1752Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro450 455 460agc agc tct gcc tac tga cgcaggcctc aggcccaggg cgcgccgtcg 1800Ser Ser Ser Ala Tyr465gggcaaggtg gccttccccg ggcggtaaag aggtgaaagg atgaaggagg gctgggg 1857<210>4<211>469<212>PRT<213>智人<400>4Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala
1 5 10 15Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu20 25 30Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu35 40 45Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His50 55 60Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val65 70 75 80Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu85 90 95Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp100 105 110Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp115 120 125Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu130 135 140Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met145 150 155 160Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met165 170 175Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg
180 185 190Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp195 200 205Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu210 215 220Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys225 230 235 240Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu245 250 255Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val260 265 270Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu275 280 285Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly290 295 300Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg305 310 315 320Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe325 330 335Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile340 345 350Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val
355 360 365Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu370 375 380Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu385 390 395 400Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg405 410 415Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln420 425 430Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr435 440 445Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro450 455 460Ser Ser Ser Ala Tyr465<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>有義引物<400>5gatatcgccg ccaccatgca gatggccgat gcagccac38<210>6
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義引物<400>6gatatctcag taggcagagc tgctgggc 28<210>7<211>5020<212>DNA<213>質(zhì)粒<400>7ctgcagcctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 60gggccaagaa cagatggaac agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt120tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag180tttctagaga accatcagat gtttccaggg tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc240ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga300gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc360gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc420tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcattt480gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg540taagctggcc agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg actgatttta600tgcgcctgcg tcggtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa660ctgacgagtt ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc720gtttttgtgg cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg780tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt840
cggtttggaa ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt 900ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt 960ttgaccttag atcactggaa agatgtcgag cggctcgctc acaaccagtc ggtagatgtc1020aagaagagac gttgggttac cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg1080ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca1140cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct1200tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttctt1260ccatccgcgc cgtctctccc ccttgaacct cctctttcga ccccgcctca atcctccctt1320tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc ggccggatcc cagtgtggtg gtacgtagga1380attcgccagc acagtggtcg acctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc1440aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg1500tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc1560agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc1620ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc1680ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaal740acgctgcttg aggctgaagg tgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac1800gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga1860taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt1920accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc1980tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc2040cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta2100agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat2160
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca2220gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct2280tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt2340acgatcgata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc2400cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac2460ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg2520gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg2580aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg2640gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc cagccctcag cagtttctag agaaccatca2700gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa2760tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc2820acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta2880tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc2940tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca catgcagcat gtatcaaaat3000taatttggtt ttttttctta agtatttaca ttaaatggcc atagttgcat taatgaatcg3060gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg3120actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa3180tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc3240aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc3300ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat3360aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc3420cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct3480
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg3540aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc3600cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga3660ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa3720ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta3780gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc3840agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg3900acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga3960tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagtttgcg gccgcaaatc aatctaaagt4020atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca4080gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg4140atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca4200ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt4260cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt4320agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca4380cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca4440tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga4500agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact4560gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga4620gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg4680ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc4740tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga48O0
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4860gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4920caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4980atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5020<210>8<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CREx2hb的有義鏈<400>8cccaagcttg atatcgaatt cgacgtcaca gtatgacggc catgggaatt cgacgtcaca 60gtatgacggc catggggatc ccg 83<210>9<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CREx2hb的反義鏈<400>9cgggatcccc atggccgtca tactgtgacg tcgaattccc atggccgtca tactgtgacg 60tcgaattcga tatcaagctt ggg 83<210>10<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CREx2bp的有義鏈<400>10tgcactgcag gaattcccat ggccgtcata ctgtgacgtc gaattcccat ggccgtcata 60ctgtgacgtc ggatcccg 78<210>11<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CREx2bp的反義鏈<400>11cgggatccga cgtcacagta tgacggccat gggaattcga cgtcacagta tgacggccat 60gggaattcct gcagtgca 78<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>有義引物<400>12tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg 30<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義引物<400>13tgcactgcag gtcggagctg actgttctgg 30
<210>14<211>264<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>血管活性腸肽啟動(dòng)子<400>14tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg tgacgtcttt cagagcactt tgtgattgct 60cagtcctaag tataagccct ataaaatgat gggctttgaa atgctggtca gggtagagtg120agaagcacca gcaggcagta acagccaacc cttagccatt gctaagggca gagaactggt180ggagcctttc tcttactccc aggacttcag cacctaagac agctccaaaa caaaccagaa240cagtcagctc cgacctgcag tgca 26權(quán)利要求
1.一種攝食刺激劑,包括包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
2.一種增加體重的試劑,包括包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
3.一種增加脂肪重量的試劑,包括包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
4.一種篩選刺激攝食的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
5.一種篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的方法,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的篩選方法,其中所述松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法,其中SALPR為含有SEQ IDNO4表示的氨基酸序列的多肽。
9.一種篩選刺激攝食的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
10.一種篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的試劑盒,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求9、10或11所述的篩選試劑盒,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的篩選試劑盒,其中SALPR為包含SEQID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
14.一種治療需要增加體重的疾病的治療劑,包括包含SEQ IDNO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的治療劑,其中所述的疾病為厭食癥或惡病質(zhì)。
16.一種篩選增加體重的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
17.一種篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的方法,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的篩選方法,其中所述的松弛素-3為SALPR或其部分多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的篩選方法,其中SALPR為包含SEQ IDNO4表示的氨基酸序列的多肽。
21.一種篩選增加體重的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
22.一種篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的試劑盒,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
24.根據(jù)權(quán)利要求21、22或23所述的篩選試劑盒,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的篩選試劑盒,其中SALPR為包含SEQID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
26.一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,包括以下步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
27.一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)所述的篩選方法,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的篩選方法,其中SALPR為包含SEQ IDNO4表示的氨基酸序列的多肽。
31.一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸,以及(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
32.一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的試劑盒,包括步驟(A)使包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽,其功能上等同的修飾多肽,或由與包含SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,或其鹽,以及測(cè)試物與松弛素-3受體、含有松弛素-3受體的細(xì)胞或所述細(xì)胞的膜組分接觸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的試劑盒,其中包括步驟(B)測(cè)量經(jīng)由所述松弛素-3受體的細(xì)胞刺激活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)所述的篩選方法,其中所述的松弛素-3受體為SALPR或其部分多肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的篩選試劑盒,其中SALPR為包含SEQID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
36.一種抑制攝食的試劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑,其中所述具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)權(quán)利要求7或8所述的篩選方法獲得的化合物。
38.一種降低體重的試劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)權(quán)利要求19或20所述的篩選方法獲得的化合物。
40.一種減少脂肪重量的試劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)權(quán)利要求29或30所述的篩選方法獲得的化合物。
42.一種治療肥胖的治療劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的治療劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)權(quán)利要求19、20、29和30之任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的化合物。
44.一種治療糖尿病的治療劑,包含具有SALPR抑制活性的化合物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的治療劑,其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物為通過(guò)權(quán)利要求19、20、29和30之任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的化合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求36-45任一項(xiàng)所述的試劑,其中SALPR為包含SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的多肽。
47.一種篩選刺激或抑制攝食的化合物或其鹽的方法,包括將作用于松弛素-3受體的化合物向人或非人生物體給藥并且在給藥后測(cè)量攝食量的步驟。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法,其中所述的作用于松弛素-3受體的化合物為通過(guò)權(quán)利要求4-8之任一項(xiàng)所述的篩選方法獲得的化合物。
49.一種篩選增加或降低體重的化合物或其鹽的方法,包括將作用于松弛素-3受體的化合物向人或非人生物體給藥并且在給藥后測(cè)量體重的步驟。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法,其中所述的作用于松弛素-3受體的化合物為通過(guò)權(quán)利要求16-20之任一項(xiàng)所述的方法獲得的化合物。
51.一種篩選涉及肥胖控制的化合物或其鹽的方法,包括將作用于松弛素-3受體的化合物向人或非人生物體給藥并且在給藥后測(cè)量肥胖指標(biāo)的步驟。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法,其中所述的作用于松弛素-3受體的化合物為通過(guò)權(quán)利要求26-30之任一項(xiàng)所述的方法獲得的化合物。
全文摘要
本發(fā)明人通過(guò)用松弛素-3向大鼠腦室內(nèi)給藥,并在給藥后觀察攝食量、體重和脂肪重量等等,發(fā)現(xiàn)松弛素-3具有攝食刺激活性、增加體重活性以及增加脂肪重量活性。根據(jù)本發(fā)明,提供了在刺激攝食、增加體重和增肥中有有益效果的多肽;含有所述多肽的治療劑;篩選活化或抑制所述多肽的受體的化合物、物質(zhì)或其鹽的方法;用于所述篩選的試劑盒;以及包含抑制所述多肽表達(dá)的物質(zhì)的試劑,諸如攝食抑制劑、治療肥胖的治療劑以及治療糖尿病的治療劑。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1918290SQ20058000447
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月9日
發(fā)明者飛彈隆之, 關(guān)矢智子, 澤井徹, 生木尚志, 高橋英機(jī), 小笹美智子, 原田耕吉, 新井徹 申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司
網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1