專利名稱：魚腥草和插田泡的提取物及其用于預(yù)防和治療過敏性疾病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚腥草(Houttuynia cordata)和插田泡(Rubus coreanus)的提取物及其用于預(yù)防和治療過敏性疾病的組合物和用途。更具體地，本發(fā)明涉及魚腥草和插田泡的水提取物或有機(jī)溶劑提取物、還涉及包含所述提取物的用于預(yù)防和治療過敏性疾病的組合物及方法。
背景技術(shù)：
近來，隨著工業(yè)發(fā)展所引起的環(huán)境污染的加劇和居住環(huán)境的變化，過敏性疾病正日益增加。
過敏癥是在人免疫系統(tǒng)對(duì)在絕大多數(shù)人中沒有顯示反應(yīng)的外來物質(zhì)顯示出過敏反應(yīng)時(shí)所引起的癥狀的統(tǒng)稱。在過敏反應(yīng)過程中產(chǎn)生的臨床癥狀包括早期的特異性免疫反應(yīng)和晚期的炎癥反應(yīng)等。早期的特異性免疫反應(yīng)大多由肥大細(xì)胞所介導(dǎo)并被位于肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜上的具有高親合性的免疫球蛋白E(IgE)受體(FcεRI)所激活。
肥大細(xì)胞廣泛分布于包括皮膚、呼吸器官、胃腸道粘膜和腦在內(nèi)的系統(tǒng)器官中以及淋巴管和血管周圍。當(dāng)結(jié)合到位于細(xì)胞膜上的IgE受體的IgE抗體與外部引入的抗原或過敏原形成交聯(lián)(bridge)時(shí)，肥大細(xì)胞則被激活而脫顆粒，從而釋放儲(chǔ)存在肥大細(xì)胞內(nèi)的顆粒中的化學(xué)物質(zhì)，例如組胺、肝素和蛋白酶。在這些化學(xué)物質(zhì)中，組胺釋放最為迅速，從而顯示出各種作用，例如末梢血管舒張、支氣管平滑肌收縮和腺細(xì)胞分泌加速，因而導(dǎo)致速發(fā)型過敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。
已知引起肥大細(xì)胞脫顆粒激活的因素包括抗原；化合物48/80(Panton，British Journal of Pharmacology，1951)；IgE抗體；IgE受體抗體；IgE二聚體；Con A；外用抗生素多粘菌素B；聚賴氨酸多肽；諸如α-胰凝乳蛋白酶和豬胰腺磷脂酶A2等酶的刺激；Ca2+偶聯(lián)刺激性分泌的刺激(Ischizaka T等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，1903，1980)；環(huán)核苷酸水平的變化；由蛋白激酶激活引起的磷酸化的增加(Dagmar B等，CancerResearch，35，2056，1975)；以及由肌動(dòng)蛋白絲、中間絲和微管組成的肥大細(xì)胞骨架的改變(LagunoffD和Chi EY，J.Cell Biol.71，182，1976)。
同時(shí)，從肥大細(xì)胞中釋放的化學(xué)介質(zhì)會(huì)引起各種過敏性疾病，例如哮喘、過敏性鼻炎、過敏性耳炎、過敏性休克和過敏性皮膚病。其中，過敏性皮膚病是常見的皮膚病，由于慢性進(jìn)行性發(fā)癢，這種皮膚病會(huì)影響到患者情緒的變化、良好的睡眠和日常的生活，因而導(dǎo)致嚴(yán)重的精神和肉體上的痛苦。過敏性皮膚病通常包括特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、蕁麻疹和牛皮癬。特應(yīng)性皮炎是在2～6個(gè)月齡的嬰兒中發(fā)生的慢性濕疹，對(duì)其發(fā)病機(jī)理還沒有清楚地了解。對(duì)于特應(yīng)性皮炎的治療，最重要的是從一出生就確定并消除引起過敏癥的物質(zhì)。在癥狀嚴(yán)重的情況下，或者將抗組胺制劑作為全身性藥物施用，或者局部施用腎上腺皮質(zhì)激素。接觸性皮炎是濕疹的一類，是皮膚的一種超敏反應(yīng)，在外來物質(zhì)與皮膚接觸時(shí)發(fā)生。根據(jù)所接觸的物質(zhì)，將接觸性皮炎分為日光接觸性皮炎、汞接觸性皮炎和金屬接觸性皮炎。蕁麻疹是由于炎癥使上層皮膚發(fā)生水腫而使皮膚產(chǎn)生暫時(shí)腫脹的現(xiàn)象，是一種伴隨有發(fā)癢的皮膚超敏反應(yīng)。而且，已知蕁麻疹是以下情形中發(fā)生各種化學(xué)介質(zhì)由于各種原因和機(jī)制從肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞釋放，并作用在真皮的微脈管系統(tǒng)上，使所述微脈管系統(tǒng)舒張并增加血管透過性，從而使富含蛋白質(zhì)的液體從血管滲出到真皮組織中。牛皮癬是慢性炎癥皮膚病，其特征在于形成大小不一的、具有清晰的邊界并覆蓋有銀白色鱗屑的紅斑狀丘疹和斑塊，和組織學(xué)中的上皮增生。而且，牛皮癬是一種原因不明的疾病，其中癥狀的改善和惡化反復(fù)發(fā)生。根據(jù)牛皮癬癥狀的嚴(yán)重性，已經(jīng)研究和使用了各種療法。但都難以根治。
目前，抗組胺藥或類固醇藥經(jīng)常用于治療過敏性疾病。然而，這些藥大多只具有臨時(shí)性效果，并經(jīng)常具有嚴(yán)重的副作用。因此，需要開發(fā)對(duì)過敏性疾病具有預(yù)防和治療效果，同時(shí)具有較小副作用以及具有持續(xù)的效果的新的治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在研究能夠有效地預(yù)防或治療過敏性疾病的組合物的過程中，本發(fā)明人已經(jīng)從草藥提取物中選擇了具有優(yōu)異的抗過敏活性的物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)所選擇的草藥提取物具有預(yù)防或治療過敏性疾病的效果?；谶@些發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺具有抑制活性的草藥提取物，該草藥提取物是通過用水或有機(jī)溶劑對(duì)魚腥草和插田泡進(jìn)行提取而得到的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用作藥物的所述草藥提取物以及所述草藥提取物在制備抗過敏性疾病的治療劑或者對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺具有抑制活性的抑制劑中的用途。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物組合物，該藥物組合物含有所述草藥提取物作為活性成分。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于預(yù)防和改善過敏性疾病的食品組合物，該食品組合物含有所述草藥提取物作為活性成分。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療過敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)所需要的患者施用有效量的所述草藥提取物的步驟。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的方法，該方法包括對(duì)所需要的患者施用有效量的所述草藥提取物的步驟。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺具有抑制活性的草藥提取物，所述草藥提取物通過用水或有機(jī)溶劑對(duì)魚腥草和插田泡進(jìn)行提取而獲得。
另一方面，本發(fā)明提供用作藥物的所述草藥提取物以及所述草藥提取物在制備抗過敏性疾病的治療劑或者對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺具有抑制活性的抑制劑中的用途。
另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物組合物，該藥物組合物含有所述草藥提取物作為活性成分。
另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或改善過敏性疾病的食品組合物，該食品組合物含有所述草藥提取物作為活性成分。
又一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療過敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)所需要的患者施用有效量的所述草藥提取物的步驟。
另一方面，本發(fā)明提供抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的方法，該方法包括對(duì)所需要的患者施用有效量的所述草藥提取物的步驟。
下文將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本文使用的術(shù)語″過敏性疾病″是指人體對(duì)任何物質(zhì)的超敏反應(yīng)，即，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)外來物質(zhì)產(chǎn)生的超敏反應(yīng)所引起的疾病。優(yōu)選地，該術(shù)語是指介質(zhì)物質(zhì)(如組胺)因外來物質(zhì)而釋放，從而引起疾病的超敏反應(yīng)。這些過敏性疾病的例子包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性耳炎、過敏性休克和過敏性皮膚病。所述的過敏性皮膚病包括特應(yīng)性皮炎、牛皮癬、接觸過敏性皮炎和蕁麻疹。
為了研究能夠預(yù)防或治療過敏性疾病的組合物，本發(fā)明人分析了11種草藥提取物的抗過敏活性，這些草藥提取物包括桑葉(Mori folium)提取物、牛蒡(Arctii fructus)提取物、五味子(Schizandra chinensis)提取物、枸杞(Lycium chinense)提取物、肉桂(Cinnamomum cassia)提取物、山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)提取物、山楂(Crataegi fructus)提取物、柳根皮(Salicis Radicis Cortex)提取物、黑芝麻提取物、魚腥草提取物和插田泡提取物。抗過敏活性通過下述方法測定用化合物48/80(已知是誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒的強(qiáng)有力的物質(zhì))處理大鼠腹膜的肥大細(xì)胞，然后測量草藥提取物是否抑制由化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒。由測試結(jié)果可以看出，包括魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物，山楂提取物和桑葉提取物在內(nèi)的5種草藥提取物具有抑制由化合物48/80誘導(dǎo)的大鼠腹膜肥大細(xì)胞的肥大細(xì)胞脫顆粒的活性(見測試?yán)?)。
而且，本發(fā)明人對(duì)確定具有抗過敏活性的魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物是否具有細(xì)胞毒性進(jìn)行了測定。結(jié)果證實(shí)所有這些草藥提取物都沒有顯示出細(xì)胞毒性，表明它們能夠在體內(nèi)安全使用(見測試?yán)?)。
而且，本發(fā)明人在所述5種草藥提取物中選擇抗過敏活性最高的魚腥草提取物和插田泡提取物，制備所選擇的魚腥草和插田泡的混合提取物，并分析所述混合提取物的抗過敏活性。
在本發(fā)明的一個(gè)測試?yán)?，用魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)大鼠的腹膜肥大細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后以化合物48/80進(jìn)行處理。結(jié)果表明所述混合提取物具有抑制肥大細(xì)胞釋放組胺的效果。而且結(jié)果還表明，混合提取物的組胺釋放抑制效果明顯優(yōu)于魚腥草提取物或插田泡提取物(見測試?yán)?)。由此效果可見，據(jù)信所述混合提取物增加了肥大細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)AMP水平，并降低了細(xì)胞的鈣吸收，從而抑制了肥大細(xì)胞的脫顆粒和組胺釋放。
在本發(fā)明的另一個(gè)測試?yán)?，用魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)過敏性休克的小鼠模型進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述混合提取物具有優(yōu)異的抑制小鼠因過敏性休克而死亡的效果，并具有100％存活率。而且結(jié)果還表明，魚腥草和插田泡的混合提取物有效地抑制了過敏性休克的小鼠模型的腸系膜的肥大細(xì)胞的脫顆粒(見測試?yán)?)。
在本發(fā)明的另一個(gè)測試?yán)校敏~腥草和插田泡的混合提取物對(duì)皮膚反應(yīng)的大鼠模型進(jìn)行預(yù)處理，由結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，所述混合提取物降低了由化合物40/80誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)，并有效地抑制了血管透過性的增加(見測試?yán)?)。
另外，本發(fā)明人還對(duì)除包含魚腥草和插田泡的提取物以外還包含經(jīng)證實(shí)具有抗過敏活性的山茱萸、山楂和桑葉的提取物在內(nèi)的混合提取物的抗過敏活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明所述混合物具有抑制化合物48/80誘導(dǎo)的大鼠腹膜肥大細(xì)胞釋放組胺的活性(見測試?yán)?)。
另外，在本發(fā)明的另一個(gè)測試?yán)校瑢?duì)患有特應(yīng)性皮炎的患者施用含有魚腥草和插田泡的混合提取物的膠囊制劑或者含有魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物的膠囊制劑。然后，測量患者血清中的IgE和組胺的濃度，并對(duì)病變進(jìn)行臨床觀察。由結(jié)果可以看出，本發(fā)明的制劑與現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)使用的類固醇藥和抗組胺藥具有相同的治療效果(見測試?yán)?)。
因此，本發(fā)明的魚腥草和插田泡的混合提取物的特征在于，所述混合提取物具有有效地抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的活性，以及抑制因過敏性休克導(dǎo)致死亡的活性，和降低由化合物40/80誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)并有效地抑制血管透過性的增加。
因此，本發(fā)明的用于預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物組合物的特征在于，所述藥物組合物含有魚腥草和插田泡的提取物作為活性成分。
而且，本發(fā)明的用于預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物組合物特征在于，所述組合物除了含有魚腥草和插田泡的提取物之外，還進(jìn)一步含有選自山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物的至少一種提取物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物含有其中魚腥草和插田泡以1∶4至4∶1的重量比混合的提取物。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的藥物組合物含有其中魚腥草和插田泡以1∶1的重量比混合的提取物。此外，當(dāng)本發(fā)明的組合物進(jìn)一步含有山茱萸提取物、山楂提取物、桑葉提取物或者它們的混合物時(shí)，這些附加的組分的含量以本發(fā)明組合物的總重量計(jì)可以為1重量％～20重量％，優(yōu)選為5重量％～10重量％。
魚腥草是三白草屬(Saururus chinensis)多年生草本植物，廣泛分布于亞洲的東南部。已知魚腥草具有減輕發(fā)燒以及治療腫脹和直腸突出的效果，并具有排除毒物和中和重金屬的活性。
插田泡(Rubus coreanus Miq.)是薔薇科(Rosaceae)落葉闊葉灌木，原生于中國，并分布在韓國的濟(jì)州島(Jejudo)、韓國南部和中部、日本、美國、歐洲等。在中藥中，使用插田泡的未熟果實(shí)。已知插田泡的藥效包括通過保護(hù)肝臟免于因疲勞而受損來防止視力的下降；促進(jìn)排尿；改善由于精力(陽氣、腎氣)不足所致的遺精、精液不足、陽痿和性功能；使身體發(fā)熱；增強(qiáng)精力；促進(jìn)頭發(fā)生長；和預(yù)防白發(fā)。
所述山茱萸是屬山茱萸科(Cornus officinalis)的落葉樹的山茱萸樹的果實(shí)。它對(duì)各種成人疾病有效，所述成人疾病例如腎病、糖尿病、高血壓、關(guān)節(jié)炎和婦科病，并具有營養(yǎng)、收斂、抗細(xì)菌和抗真菌活性。它含有莫諾苷、馬錢素、sworoside、山茱萸苷、沒食子酸、酒石酸和蘋果酸等。
所述山楂是薔薇科植物的果實(shí)，含有杏苷、熊果酸、綠原酸、檸檬酸、外消旋酸、類黃酮和維生素C等。在山楂的藥效中，它降低了心臟和血管的緊張度并具有強(qiáng)心作用。此外，它還具有改善血液循環(huán)、促進(jìn)消化和降低膽固醇含量的效果。
桑葉是桑樹的葉子，并已知具有補(bǔ)血和健體的功效(神農(nóng)本草經(jīng)(ShenNong′s Materia Medica))。此外，已知它還對(duì)糖尿病、神經(jīng)痛和高血壓有效，具有減少休克和降低發(fā)熱的效果，并對(duì)耳鳴和頭痛有效(中藥大字典(Chinese Material medica))。根據(jù)日本最近的研究發(fā)現(xiàn)，桑葉具有抑制血液葡萄糖水平上升和預(yù)防糖尿病的效果。
用于本發(fā)明的魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉可從自然界收集或商購獲得。本發(fā)明的組合物可以含有通過混合所述混合草藥原料然后一起提取該混合草藥原料而獲得的混合物或者通過根據(jù)各所述草藥原料的藥效組分的物理化學(xué)性質(zhì)而對(duì)其進(jìn)行提取，然后相互混合各提取物而獲得的混合物。本發(fā)明的草藥提取物可以通過本領(lǐng)域已知的溶劑提取方法進(jìn)行制備。例如，提取可采用選自以下物質(zhì)的一種來進(jìn)行水、醇(例如乙醇和甲醇)、有機(jī)溶劑(例如丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二乙基醚、丙酮或苯)以及它們的混合物。當(dāng)提取物是利用溶劑提取方法制得時(shí)，可以采用熱水提取方法、超聲提取方法和回流提取方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，熱水提取物通過將純凈水加入到所述草藥原料中，加熱并提取一定的時(shí)間，然后過濾而制得(見實(shí)施例1)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，甲醇提取物通過將70％甲醇加入到所述草藥原料中，對(duì)所得材料提取一定的時(shí)間，然后過濾而制得(見實(shí)施例2)。測定熱水提取物和甲醇提取物對(duì)化合物40/80誘導(dǎo)的大鼠的肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用，結(jié)果表明，所述熱水提取物和甲醇提取物在抑制肥大細(xì)胞脫顆粒上沒有明顯的差異(見測試?yán)?)。
同時(shí)，本發(fā)明的具有預(yù)防或治療過敏性疾病效果的藥物組合物可以僅含有所述草藥提取物或者可以通過加入至少一種藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或稀釋劑而配制。本文使用的術(shù)語“藥學(xué)可接受的”是指所述組合物在生理學(xué)上是可接受的，并且當(dāng)施用于人體時(shí)，其劑量不會(huì)引發(fā)諸如胃腸病和頭暈等過敏反應(yīng)或類似反應(yīng)。而且，為預(yù)防或治療過敏性疾病，可以通過適當(dāng)?shù)耐緩绞┯萌缟纤雠渲频谋景l(fā)明的藥物組合物。適當(dāng)?shù)氖┯猛緩桨诜緩健⒀蹆?nèi)途徑、透皮途徑、皮下途徑、靜脈內(nèi)途徑和肌肉內(nèi)途徑。
本發(fā)明的藥物組合物可制成口服制劑或腸胃外制劑，這取決于所選擇的施用途徑。在腸胃外制劑的情況下，本發(fā)明的藥物組合物可由本領(lǐng)域已知的方法制成粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖衣片劑、膠囊、液劑、凝膠、糖漿、膏劑和懸浮液等。例如，口服制劑可通過使活性組分與固體賦形劑混合，粉碎該混合物，加入合適的輔劑，然后將該混合物加工成顆粒混合物而作為片劑或糖衣片劑獲得。適當(dāng)?shù)馁x形劑的例子包括糖類，所述糖類包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚醇和麥芽糖醇；淀粉類，例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素類，例如纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基甲基纖維素；和填料，例如明膠和聚乙烯基吡咯烷酮。如果需要，可使用崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或海藻酸鈉。而且，本發(fā)明的藥物組合物可另外含有抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、香料、乳化劑和/或防腐劑。在腸胃外制劑的情況下，本發(fā)明的藥物組合物可由本領(lǐng)域已知的任意方法制成注射劑、乳膏、洗劑、外用軟膏、油即、保濕劑和經(jīng)鼻吸入劑。例如，在注射劑的情況下，本發(fā)明的組合物可通過將本發(fā)明的草藥提取物溶解在生理可接受的緩沖液(如Hanks溶液，林格氏溶液或生理緩沖鹽水)中而配制。
本文使用的術(shù)語″有效量″是指藥物組合物在施用于患者時(shí)顯示出預(yù)防或治療效果的量。以魚腥草和插田泡的提取物的量計(jì)，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的有效量優(yōu)選為約1毫克/千克體重/天～100毫克/千克體重/天，更優(yōu)選為約10毫克/千克體重/天～30毫克/千克體重/天。然而，本發(fā)明的藥物組合物的劑量可以根據(jù)諸如施用途徑、患者的年齡、性別、體重和疾病嚴(yán)重程度等各種因素而進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可在其有效量的優(yōu)選范圍內(nèi)施用一次或多次。然而，可以根據(jù)施用途徑和受試對(duì)象、以及患者的年齡、性別、體重和疾病情況對(duì)本發(fā)明所述的提取物的劑量進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。在含有本發(fā)明的提取物的組合物顯示出本發(fā)明的效果的情況下，對(duì)該組合物的制劑、施用途徑和施用方式?jīng)]有特別的限制。
本文使用的術(shù)語″受試對(duì)象″是指哺乳動(dòng)物，尤其是包括人在內(nèi)的動(dòng)物。受試對(duì)象也可以是需要治療的患者。
本發(fā)明的藥物組合物可與任意的對(duì)過敏性疾病具有預(yù)防或治療效果的已知物質(zhì)或草藥提取物組合施用，所述已知物質(zhì)例如免疫調(diào)節(jié)劑或抗組胺藥，所述草藥提取物例如桑根提取物。
此外，魚腥草和插田泡的提取物可以以用于預(yù)防或治療過敏性疾病的食品組合物的形式提供。而且，所述食品組合物可進(jìn)一步含有選自山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物的至少一種提取物。另外，所述食品組合物可以還含有現(xiàn)有技術(shù)中已知可以預(yù)防或改善過敏性疾病的草藥提取物，例如桑根提取物。本發(fā)明的食品組合物可以包括所有可能的形式，例如功能性食品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、健康食品和食品添加劑。這些形式的食品組合物可由本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法制備。
例如，在健康食品的情況下，本發(fā)明的草藥提取物本身可制成茶、果汁或飲料以供飲用，或者為攝取而進(jìn)行顆粒化、膠囊化或粉末化。
此外，功能食品可以通過將本發(fā)明的草藥提取物加入到下列物質(zhì)中而制得飲料(包括酒精飲料)；水果和它們的加工食品(如罐裝水果、瓶裝水果、果醬、甜果醬(marmalade)等)；魚、肉和它們的加工食品(例如，火腿、香腸、咸牛肉等)；面包和面條(例如日本面條、蕎麥面條、拉面、意大利面條、通心面等)；果汁、各種飲料；小甜餅；小麥面筋；奶制品(例如黃油和奶酪)、可食用的植物脂肪和油、人造黃油；植物蛋白質(zhì)；干餾食品(retort food)、冷凍食品和各種調(diào)味料(例如味噌、醬油和沙司等)。
此外，為了用作食品添加劑，本發(fā)明的草藥提取物可制成粉末或濃縮物。
本發(fā)明的草藥提取物在本發(fā)明食品組合物的含量以該組合物的總重量計(jì)，優(yōu)選為1重量％～90重量％，更優(yōu)選為10重量％～50重量％。而且，本發(fā)明的食品組合物含有魚腥草和插田泡的混合提取物，其中魚腥草和插田泡優(yōu)選以1∶4至4∶1的重量比混合。
而且，本發(fā)明提供魚腥草和插田泡的提取物的治療用途。具體地，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療過敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)所需要的受試對(duì)象施用有效量的魚腥草和插田泡的提取物的步驟。此外，本發(fā)明提供抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的方法，該方法包括對(duì)所需要的受試對(duì)象施用有效量的魚腥草和插田泡的提取物的步驟。
本發(fā)明提供用作藥物的所述草藥提取物以及該草藥提取物在制備治療過敏性疾病的藥劑或者抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的藥劑中的用途。
除了魚腥草和插田泡的提取物以外，治療過敏性疾病的藥劑或者抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的藥劑還可以進(jìn)一步含有藥學(xué)可接受的載體。藥學(xué)可接受的載體的例子如上所述。此外，本發(fā)明的用于治療過敏性疾病的藥劑可以口服施用或腸胃外施用，口服施用或腸胃外施用的例子如上所述。


圖1為光學(xué)顯微照片，顯示用本發(fā)明的草藥提取物和化合物48/80(組胺釋放誘導(dǎo)劑)處理的大鼠腹膜肥大細(xì)胞形態(tài)變化的觀察結(jié)果。(A未處理組；B用化合物48/80處理的組；C用魚腥草和插田泡的混合提取物處理的組；和D用魚腥草和插田泡的混合提取物和化合物48/80處理的組。
圖2顯示了對(duì)魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物進(jìn)行細(xì)胞毒性測試的結(jié)果。
圖3是顯示對(duì)過敏性皮膚病患者施用含有本發(fā)明的魚腥草和插田泡提取物的制劑進(jìn)行治療前和治療后的病變的照片(A對(duì)特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行治療前；B對(duì)特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行治療后；C對(duì)特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行治療前；和D對(duì)特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行治療后)。
圖4是顯示對(duì)過敏性皮膚病患者施用現(xiàn)有技術(shù)的治療劑進(jìn)行治療前和治療后的病變的照片(A對(duì)特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行治療前；B對(duì)特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行治療后)。
具體實(shí)施例方式
下文將通過以下實(shí)施例來詳細(xì)描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不應(yīng)理解為是用于限制本發(fā)明的范圍。在下述實(shí)施例中，固體/固體混合物、液體/液體混合物和液體/固體混合物的百分比分別以重量/重量、體積/體積和重量/體積計(jì)，而且除非有其它的指示，否則所有的反應(yīng)都在室溫進(jìn)行。
實(shí)施例1制備草藥原料的熱水提取物為了選擇具有抗過敏活性的草藥提取物，分別制備了桑葉、牛蒡、五味子、枸杞、肉桂、山茱萸、山楂、柳根皮、黑芝麻、魚腥草和插田泡的熱水提取物。上述制備所用的草藥原料全部以干燥狀態(tài)購自韓國農(nóng)業(yè)合作社(Korean Agriculture Cooperative)。
首先，將草藥原料洗滌干凈，并切成小于1cm×1cm×1cm的一致尺寸。將所述草藥原料以每一種300g分別加入到3升的純凈水中，并在加壓下于100℃提取4小時(shí)。提取完成后，將各提取物濾過100目的過濾膜，并用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA，Tokyo，Rikakikai Co.Ltd.)將濾液濃縮至25白利(brix)。在真空下干燥濃縮物并將其粉碎成80目的尺寸。將干燥粉末用鹽水稀釋為各種濃度以用于測試。
實(shí)施例2制備草藥原料的甲醇提取物分別將桑葉、牛蒡、五味子、枸杞、肉桂、山茱萸、山楂、柳根皮、黑芝麻、魚腥草和插田泡洗滌干凈，并切成小于1cm×1cm×1cm的固定尺寸。將所述草藥原料以每一種500g分別加入到5升70％的甲醇中，并在50℃提取72小時(shí)。提取完成后，過濾，并以與實(shí)施例1相同的方式真空干燥，以獲得甲醇提取物。
測試?yán)?選擇具有抗過敏活性的草藥提取物分別測定桑葉、牛蒡、五味子、枸杞、肉桂、山茱萸、山楂、柳根皮、黑芝麻、魚腥草和插田泡各自的熱水提取物和甲醇提取物的抗過敏活性。
為此目的，從大鼠腹腔獲得肥大細(xì)胞。該肥大細(xì)胞用所述草藥提取物和化合物48/80(組胺釋放誘導(dǎo)劑)處理。然后觀察肥大細(xì)胞的形態(tài)，并測量肥大細(xì)胞的組胺釋放量。
1-1)從大鼠腹腔獲得肥大細(xì)胞肥大細(xì)胞由根據(jù)本領(lǐng)域已知方法(Cochrane DE和Douglas WW，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71，408，1974)進(jìn)行改進(jìn)和補(bǔ)充的下述方法獲得。用乙醚麻醉重約為250g～300g的健康成熟的Sprague-Dawley雄性大鼠并重?fù)纛^后部以殺死所述大鼠。然后將約10ml的HEPES-Tyrode緩沖液注射入大鼠腹腔，并對(duì)腹壁輕微按摩90秒。沿腹壁中心線切開，用玻璃吸管(spoid)收取腹腔灌洗液并在200×g離心10分鐘。棄去上清液，并將留下物質(zhì)于HEPES-Tyrode緩沖液中重新懸浮成1×106個(gè)細(xì)胞/毫升。將該肥大細(xì)胞懸浮液用于對(duì)肥大細(xì)胞進(jìn)行觀察。采用已知的方法(Hachisuka等，Arch.Dermatol.Res.，280358，1988)從腹膜肥大細(xì)胞懸浮液中純化分離肥大細(xì)胞。將3.5ml的percoll(硅石膠態(tài)懸浮液)等滲溶液(isotonicpercoll solution，1ml的10×Hank′s溶液和9ml的percoll)加入到15ml離心試管中。將0.75ml的肥大細(xì)胞懸浮液小心地置于percoll等滲液上，并將0.5ml的HEPES-Tyrode緩沖液加入到試管的上層。然后，將試管中的內(nèi)容物靜置約10分鐘，接著以125×g離心15分鐘。離心后，用吸液管取出2ml的上清液，并用4℃的HEPES-Tyrode緩沖液洗兩次，從而制得純的肥大細(xì)胞懸浮液。利用錐蟲藍(lán)和Kimura染色液測定肥大細(xì)胞的存活率和純度，只有存活率和純度大于90％的肥大細(xì)胞懸浮液才被用于測試。
1-2)觀察大鼠腹膜肥大細(xì)胞受到草藥提取物處理的形態(tài)以25μl的桑葉、牛蒡、五味子、枸杞、肉桂、山茱萸、山楂、柳根皮、黑芝麻、魚腥草、插田泡的熱水提取物或甲醇提取物與25μl的HEPES-Tyrode緩沖液分別對(duì)200μl的在測試?yán)?-1)中獲得的腹部肥大細(xì)胞懸浮液進(jìn)行處理，并37℃于培養(yǎng)箱中反應(yīng)30分鐘。此外，為了測定所述草藥提取物是否具有抑制由化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的活性，分別將所述草藥提取物的熱水提取物或甲醇提取物25μl加入到肥大細(xì)胞懸浮液中，并在37℃于培養(yǎng)箱中反應(yīng)10分鐘。然后，將25μl的化合物48/80加入到反應(yīng)物質(zhì)中，并在37℃于培養(yǎng)箱中反應(yīng)20分鐘。
對(duì)于為與測試組比較而使用的陽性對(duì)照組，用25μl的HEPES-Tyrode緩沖液和25μl(5μl/ml)的化合物48/80對(duì)200μl的肥大細(xì)胞懸浮液進(jìn)行處理，并在37℃于培養(yǎng)箱中反應(yīng)30分鐘。作為陰性對(duì)照組，使用未處理的肥大細(xì)胞懸浮液。
反應(yīng)結(jié)束后，將200μl的肥大細(xì)胞培養(yǎng)物滴到置于倒置顯微鏡臺(tái)的載波片上(22mm×60mm)，接著在室溫靜置10分鐘，以使肥大細(xì)胞能夠沉淀。接著在×1,000的放大倍數(shù)觀察肥大細(xì)胞。
通常，正常的肥大細(xì)胞大多呈圓形或橢圓形，輪廓清楚并在細(xì)胞質(zhì)中填充有許多的顆粒。肥大細(xì)胞的直徑約為10μm～20μm，比其它細(xì)胞(淋巴細(xì)胞或嗜中性白細(xì)胞)大兩倍以上。因而，呈圓形或橢圓形、輪廓清楚并在細(xì)胞質(zhì)中填充有高光學(xué)折射率的顆粒的肥大細(xì)胞被歸為正常肥大細(xì)胞。另一方面，細(xì)胞輪廓不清楚并且細(xì)胞質(zhì)中的顆?；蛘咄怀黾?xì)胞表面或者分散在細(xì)胞周圍的肥大細(xì)胞被歸為脫顆粒的肥大細(xì)胞。
由測試結(jié)果可以看出，在未處理的陰性對(duì)照組的情況下，肥大細(xì)胞的尺寸約比懸浮液中的淋巴細(xì)胞大兩倍，而且肥大細(xì)胞呈圓形或橢圓形。而且，正常肥大細(xì)胞的觀測結(jié)果顯示出清晰的輪廓，并且細(xì)胞質(zhì)填充有高光學(xué)折射率的顆粒，以至于不能清楚地觀察到細(xì)胞核(見圖1A)。
在用化合物48/80溶液處理的陽性對(duì)照組的情況下，可以觀察到脫顆?，F(xiàn)象，其中細(xì)胞質(zhì)中的顆粒的光學(xué)折射率在數(shù)分鐘內(nèi)降低，細(xì)胞逐漸膨脹，以至于細(xì)胞膜變得不規(guī)則，同時(shí)，具有降低的折射率的顆粒突出于細(xì)胞表面(見圖1B)。
在僅用各所述草藥原料的熱水提取物處理肥大細(xì)胞的情況下，肥大細(xì)胞的形態(tài)、尺寸和表面輪廓與正常肥大細(xì)胞的觀測結(jié)果沒有明顯差異，而且在加入熱水提取物的30分鐘的過程中，沒有觀察到其它變化(圖1C)。
同時(shí)，在分別用魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的熱水提取物處理肥大細(xì)胞，然后加入化合物48/80溶液的情況下，可看出肥大細(xì)胞脫顆粒受到抑制，使得它們的形態(tài)、尺寸和表面輪廓與正常肥大細(xì)胞相同(見圖1D)。另外，在分別用魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的甲醇提取物處理的情況下，可以發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞脫顆粒受到抑制(數(shù)據(jù)未示出)。另一方面，當(dāng)用牛蒡、五味子、枸杞、肉桂、柳根皮和黑芝麻的熱水提取物或甲醇提取物處理肥大細(xì)胞培養(yǎng)物，然后加入化合物48/80溶液時(shí)，肥大細(xì)胞脫顆粒未受到抑制(見表1)。
由以上結(jié)果可以看出，魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉各自的熱水提取物或甲醇提取物都沒有影響肥大細(xì)胞的形態(tài)，但是抑制了化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒并使肥大細(xì)胞形狀保持為正常肥大細(xì)胞的形狀。
表1用草藥提取物的熱水提取物或甲醇提取物處理對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用

+觀察到肥大細(xì)胞脫顆粒。
-沒有觀察到肥大細(xì)胞脫顆粒。
測試?yán)?魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物的細(xì)胞毒性對(duì)測試?yán)?-2)中已經(jīng)證實(shí)具有抗過敏活性的魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)行測定。
向225μl(7×105個(gè)細(xì)胞/0.225ml)由實(shí)施例1-1)獲得的含有肥大細(xì)胞和其它細(xì)胞的小白鼠腹腔懸浮液中，分別加入25μl的魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物(各提取物的濃度為100mg/ml)。然后，使肥大細(xì)胞懸浮液在37℃于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)，測定細(xì)胞存活率。作為所用的對(duì)照組，以緩沖液代替提取物來處理肥大細(xì)胞懸浮液。在4℃以400×g對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行離心，棄掉上清液。向留下的細(xì)胞中加入50μl的MTT(1mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-溴化四唑，Sigma-Aldrich)，并在37℃于培養(yǎng)箱中反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，加入100μl的DMSO(二甲亞砜，C2H6SO，Sigma-Aldrich)。然后，用分光光度計(jì)測量混合物在570nm處的光學(xué)密度(O.D.)，細(xì)胞存活率計(jì)算如下存活率(％)＝(測試組的光學(xué)密度/對(duì)照組的光學(xué)密度)×100在測試結(jié)果中，魚腥草提取物、插田泡提取物、山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物沒有顯示出細(xì)胞毒性(見圖2)。
實(shí)施例3制備魚腥草和插田泡的混合提取物以1∶1的重量比混合魚腥草和插田泡，以下述方式由混合的魚腥草和插田泡制備混合提取物。將干燥的魚腥草和插田泡洗滌干凈，并切成小于1cm×1cm×1cm的固定尺寸。然后按每一種原料150g的量混合切過的草藥原料。將300g的混合草藥原料放在3升純凈水中，并在加壓下于100℃提取4小時(shí)。
測試?yán)?測定魚腥草和插田泡的混合提取物抑制大鼠腹膜肥大細(xì)胞釋放組胺的效果為了測定在實(shí)施例3制備的魚腥草和插田泡的混合提取物是否具有抑制由化合物48/80誘導(dǎo)的腹部肥大細(xì)胞釋放組胺的效果，進(jìn)行了下述測試。利用測試?yán)?-1)中獲得的大鼠腹膜肥大細(xì)胞測量抑制組胺釋放的效果。首先，為了測量正常肥大細(xì)胞的組胺釋放量，用50μl的鹽水處理200μl的腹膜肥大細(xì)胞。此外，為了測量化合物48/80所致的組胺釋放量，向腹膜肥大細(xì)胞中加入25μl的鹽水，10分鐘后，加入25μl的化合物48/80溶液(5μg/ml)。為了測定魚腥草提取物、插田泡提取物以及魚腥草和插田泡的混合提取物是否可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺，分別向肥大細(xì)胞中加入25μl的各提取物(濃度為1mg/ml)，10分鐘后，加入25μl的鹽水(最終濃度為0.1mg/ml)。而且，為了測定草藥提取物是否可以抑制由化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞的組胺釋放，以如上所述相同的方式用各提取物處理肥大細(xì)胞，10分鐘后，加入25μl的化合物48/80溶液(5μg/ml)。
反應(yīng)完成后，在4℃以400×g對(duì)所述反應(yīng)溶液進(jìn)行離心，收集上清液，并用按已知方法(Harvima等，Clinica Chimica Acta.171247，1988)進(jìn)行了改進(jìn)的方法測量肥大細(xì)胞的組胺釋放量。換句話說，使10μl所收集的上清液、1.5μl的S-腺苷(甲基-14C)甲硫氨酸(2μCi(居里)/ml)、40μl的Tris-甘氨酸緩沖液(300mM，pH 8.3)和5μl的組胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶在37℃于培養(yǎng)箱中相互反應(yīng)90分鐘，加入20μl的3N高氯酸中止反應(yīng)。為了中和高氯酸，加入20μl的10N NaOH，并加入1ml甲苯-異戊醇，提取該混合物而獲得700μl的上清液。向該上清液中加入3ml的混合溶液(Cocktail solution，ULTIMA GOLDTM，Packard Bioscience Company，美國)。接著使用β-計(jì)數(shù)器(liquid scintillation Analyzer，Acanberra company，澳大利亞)測量每分鐘的計(jì)數(shù)(CPM)，并采用組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線測定組胺的量。組胺量以組胺的總量計(jì)采用百分比表示。組胺的總量按如下方法進(jìn)行確定通過用50μl的鹽水處理200μl的腹部肥大細(xì)胞，獲得250μl的肥大細(xì)胞懸浮液，在100℃對(duì)該肥大細(xì)胞懸浮液加熱10分鐘，離心經(jīng)加熱的懸浮液，將經(jīng)測得的上清液的組胺量確定為100。組胺釋放(％)由下式計(jì)算組胺釋放(％)＝(測試組中的組胺釋放量/組胺釋放總量)×100根據(jù)如上所述計(jì)算的組胺量，由下式計(jì)算用草藥提取物處理的肥大細(xì)胞的組胺釋放抑制率組胺釋放抑制率(％)＝[1-(草藥提取物和化合物48/80處理的組胺釋放量-草藥提取物處理的組胺釋放量)/(化合物48/80處理的組胺釋放量-鹽水處理的組胺釋放量)]×100在測試結(jié)果中，在僅用鹽水處理的肥大細(xì)胞懸浮液的情況下，組胺釋放為2.7％。在用魚腥草提取物、插田泡提取物或魚腥草和插田泡的混合提取物處理肥大細(xì)胞的情況下，組胺釋放類似于僅用鹽水處理的情況。另一方面，在僅用化合物48/80處理的肥大細(xì)胞的情況下，組胺釋放高達(dá)60.2％。而在用草藥原料的熱水提取物處理肥大細(xì)胞，然后用化合物48/80處理的情況下，可以發(fā)現(xiàn)由化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞的組胺釋放受到抑制。
換句話說，在用魚腥草和插田泡的混合提取物處理肥大細(xì)胞，然后用化合物48/80處理的情況下，組胺釋放為9.4±1.6％，組胺釋放抑制率為88％。另一方面，在單獨(dú)用魚腥草提取物處理肥大細(xì)胞，然后用化合物48/80處理的情況下，組胺釋放為41.0±2.1％，組胺釋放抑制率為33％。在單獨(dú)用插田泡提取物處理肥大細(xì)胞，然后用化合物48/80處理的情況下，組胺釋放為37.4±3.2％，組胺釋放抑制率為39％(見表2)。
由上述測試結(jié)果可以看出，與單獨(dú)用魚腥草提取物進(jìn)行處理或者單獨(dú)用提取物進(jìn)行處理的情況相比，魚腥草和插田泡的混合提取物在抑制化合物48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺中具有良好的效果。
表2魚腥草和插田泡的混合提取物處理對(duì)化合物48/80-誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺的抑制作用

+處理，-未處理1)各個(gè)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝10)測試?yán)?用過敏性休克小鼠模型測定魚腥草和插田泡的混合提取物的抗過敏活性用過敏性休克小鼠模型測定魚腥草和插田泡的混合提取物的抗過敏活性。過敏性休克小鼠模型通過對(duì)ICR小鼠的腹腔施用化合物48/80以誘導(dǎo)過敏性休克而獲得。在本測試中，根據(jù)小鼠的死亡率和小鼠腸系膜的肥大細(xì)胞脫顆粒，測定本發(fā)明魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)過敏性休克模型的處理效果。
4-1)測定魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)因過敏性休克引起的小鼠死亡率的效果小鼠過敏性休克由已知的利用化合物48/80的方法(Byoung-Duek，Jeon等，The Korean Journal of Biological Response Modifier，2，169，1992)引發(fā)。選擇重約20g～30g的健康的ICR小鼠，以15微克/克體重的量對(duì)小鼠的腹腔施用一次化合物48/80。作為對(duì)照組，以鹽水代替化合物48/80進(jìn)行注射。在施用化合物48/80之前24小時(shí)、12小時(shí)和1小時(shí)，分3次對(duì)小鼠的腹腔分別施用300μl的10mg/ml或1mg/ml魚腥草提取物、插田泡提取物以及魚腥草和插田泡的混合提取物。另外還對(duì)小鼠僅施用化合物48/80而未以提取物進(jìn)行預(yù)處理，然后觀察至少3天，直至小鼠死亡。通過將由于過敏性休克而死亡的小鼠數(shù)量除以測試中使用的小鼠總數(shù)量，計(jì)算魚腥草提取物、插田泡提取物、魚腥草和插田泡的混合提取和化合物48/80的小鼠死亡率。而且，測量注射化合物48/80后小鼠因過敏性休克而死亡所需的平均時(shí)間(分鐘)。
在測試結(jié)果中，僅用施用鹽水而沒有施用化合物48/80的小鼠均得以存活。此外，施用鹽水和化合物48/80的小鼠全部死亡(100％死亡率)，死亡所需的平均時(shí)間為17.8分鐘。
在施用化合物48/80前施用魚腥草提取物的小鼠的情況下，死亡率為30％(魚腥草提取物的濃度為10mg/ml)或70％(魚腥草提取物的濃度為1mg/ml)，死亡所需的平均時(shí)間為57.4分鐘(魚腥草提取物的濃度為10mg/ml)或42.3分鐘(魚腥草提取物的濃度為1mg/ml)。
此外，在施用化合物48/80前施用插田泡提取物的小鼠的情況下，小鼠死亡率為30％(插田泡提取物的濃度為10mg/ml)或80％(插田泡提取物的濃度為1mg/ml)，死亡所需的平均時(shí)間為53.4分鐘(插田泡提取物的濃度為10mg/ml)或39.8分鐘(插田泡提取物的濃度為1mg/ml)。
同時(shí)，在施用化合物48/80前施用魚腥草和插田泡的混合提取物的小鼠的情況下，小鼠死亡率為0％(全部存活；混合提取物的濃度為10mg/ml)或10％(混合提取物的濃度為1mg/ml)，死亡所需的平均時(shí)間為65.5分鐘(見表3)。
由上述測試結(jié)果可以看出，即使在單獨(dú)使用魚腥草提取物或插田泡提取物時(shí)，由化合物48/80誘導(dǎo)的過敏性休克引發(fā)的小鼠死亡也能夠得到抑制，不過在使用魚腥草和插田泡的混合提取物時(shí)，小鼠死亡能夠得到有效的抑制。而且，提取物的治療濃度越高，對(duì)由化合物48/80誘導(dǎo)的過敏性休克引發(fā)的小鼠死亡的抑制效果越好。
表3魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)過敏性休克引發(fā)的小鼠死亡的抑制作用

+處理，-未處理4-2)測定魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)小鼠腸系膜肥大細(xì)胞因過敏性休克引發(fā)的脫顆粒的效果按照實(shí)施例4-1)所述的相同方法，僅注射化合物48/80到小鼠的腹腔中，或者分別用魚腥草提取物、插田泡提取物以及魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)小鼠進(jìn)行三次預(yù)處理，然后施用化合物48/80。15分鐘后，通過頸脫臼殺死小鼠。
沿死亡小鼠的腹壁中心線切開，直接將甲醇注入腹腔中，然后固定20分鐘。取出經(jīng)固定的腸系膜并將其放到玻片上。然后用水洗滌，用0.1％甲苯胺藍(lán)(pH 4.0)染色1分鐘，用水洗滌，脫水并密封。為每只動(dòng)物制備兩個(gè)玻片。在×400光學(xué)顯微鏡下觀察肥大細(xì)胞的脫顆粒現(xiàn)象，肥大細(xì)胞可分為正常肥大細(xì)胞、中等脫顆粒肥大細(xì)胞和嚴(yán)重脫顆粒肥大細(xì)胞。對(duì)肥大細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以計(jì)算肥大細(xì)胞的脫顆粒指數(shù)。在此情況下，未脫顆粒的肥大細(xì)胞歸為正常肥大細(xì)胞，周圍存在一些顆粒的肥大細(xì)胞歸為中等脫顆粒，周圍分散有許多顆粒的肥大細(xì)胞歸為嚴(yán)重脫顆粒。對(duì)每一腸系膜部分(segment)的肥大細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行兩次隨機(jī)計(jì)數(shù)，每次10個(gè)視域(field)，并取平均值。為了減少個(gè)體誤差，結(jié)合兩個(gè)人對(duì)同一樣品所觀察的結(jié)果并計(jì)算平均值。脫顆粒指數(shù)(％)和脫顆粒抑制率(％)通過下式計(jì)算脫顆粒指數(shù)(％)＝[(正常肥大細(xì)胞的數(shù)量×0)+(中等脫顆粒肥大細(xì)胞的數(shù)量×50)+(嚴(yán)重脫顆粒肥大細(xì)胞的數(shù)量×100)]/肥大細(xì)胞的總數(shù)脫顆粒抑制率(％)＝[1-(魚腥草和插田泡的混合提取物和化合物48/80所致的脫顆粒指數(shù)/化合物48/80所致的脫顆粒指數(shù))]×100在測試結(jié)果中，在僅施用鹽水的對(duì)照組中的肥大細(xì)胞脫顆粒指數(shù)為6.3，而在僅施用化合物48/80的小鼠組中的肥大細(xì)胞脫顆粒指數(shù)為92.7。
在施用化合物48/80前施用魚腥草提取物的小鼠的情況下，肥大細(xì)胞脫顆粒指數(shù)為42.0(魚腥草提取物的濃度為10mg/ml)或82.1(魚腥草提取物的濃度為1mg/ml)。同樣在此情況下，肥大細(xì)胞脫顆粒抑制率為54.6％(魚腥草提取物的濃度為10mg/ml)或11.4％(魚腥草提取物的濃度為1mg/ml)。
在施用化合物48/80前施用插田泡提取物的小鼠組的情況下，肥大細(xì)胞脫顆粒指數(shù)為42.7(插田泡提取物的濃度為10mg/ml)或80.6(插田泡提取物的濃度為10mg/ml)，而且肥大細(xì)胞脫顆粒抑制率為53.9％(濃度為1mg/ml)或13％(濃度為1mg/ml)。
在施用化合物48/80前施用魚腥草和插田泡的混合提取物的小鼠組的情況下，肥大細(xì)胞脫顆粒指數(shù)為9.1(混合提取物的濃度為10mg/ml)或27.2(混合提取物的濃度為1mg/ml)，而且肥大細(xì)胞脫顆粒抑制率分別為90.1％或70.6％(見表4)。
從上述測試結(jié)果可以看出，即使在單獨(dú)使用魚腥草提取物或插田泡提取物時(shí)，也能抑制化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒，不過在使用魚腥草和插田泡的混合提取物時(shí)，肥大細(xì)胞脫顆?？梢缘玫接行У囊种?。
表4魚腥草和插田泡的混合提取物抑制小鼠腸系膜肥大細(xì)胞的脫顆粒的效果

+處理，-未處理1)各個(gè)值由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n＝10)測試?yán)?使用皮膚反應(yīng)大鼠模型測定魚腥草和插田泡的混合提取物的抗過敏活性將化合物48/80施用于重為250g～300g的健康而成熟的Sprague-Dawley大鼠的真皮中，以引發(fā)皮膚反應(yīng)。然后測定本發(fā)明的魚腥草和插田泡的混合提取物是否可以抑制皮膚反應(yīng)和皮膚血管透過性。
引發(fā)大鼠皮膚反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)是利用對(duì)已知方法(Byoung-Duek，Jeon等，The Korean Journal of Biological Response Modifier，2，169，1992)改進(jìn)和補(bǔ)充的下述方法來進(jìn)行的。除去雄性大鼠背部的毛，然后在乙醚麻醉下，分別將50μl的鹽水(濃度0.9％)、以及50ml的魚腥草提取物、插田泡提取物以及魚腥草和插田泡的混合提取物(提取物的濃度分別為10mg/ml)注入至背部皮膚的真皮中。10分鐘后，注射50μl的化合物48/80(濃度5μg/ml)。作為對(duì)照組，注射50μl的鹽水代替化合物48/80溶液。在注射化合物48/80后20分鐘，將400μl的0.5％依文思藍(lán)(Evan’s blue)溶液注入大鼠陰莖背側(cè)的靜脈中。在用依文思藍(lán)溶液注射后30分鐘，切開背部的皮膚，然后觀察真皮上是否出現(xiàn)藍(lán)斑以確定是否產(chǎn)生皮膚反應(yīng)以及陽性反應(yīng)。切下顯示出藍(lán)斑的皮膚部分并稱量其重量。然后，細(xì)致地將皮膚部分切成約3mm～4mm的小片，放入2ml甲酰胺溶液中，并在80℃烘箱中反應(yīng)3小時(shí)，以釋放依文思藍(lán)溶液。用分光光度計(jì)(spectraMAX plus，Molecular Devices，美國)測定所釋放的依文思藍(lán)溶液在620nm處的密度，根據(jù)依文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算依文思藍(lán)的濃度。此外，根據(jù)所算出的依文思藍(lán)濃度，通過下式計(jì)算血管透過性抑制率(％)血管透過性抑制率(％)＝[1-(施用草藥提取物和化合物48/80的依文思藍(lán)濃度-施用草藥提取物的依文思藍(lán)濃度)/(僅施用化合物48/80的依文思藍(lán)濃度-僅施用鹽水的依文思藍(lán)濃度)]×100在測試結(jié)果中，僅施用鹽水的對(duì)照組在皮膚上沒有出現(xiàn)藍(lán)斑，但僅施用化合物48/80的組顯現(xiàn)藍(lán)斑，表明引發(fā)了皮膚反應(yīng)。此外，僅分別施用魚腥草提取物、插田泡提取物以及魚腥草和插田泡的混合提取物的組沒有顯現(xiàn)藍(lán)斑。因此可以看出，鹽水和各提取物在皮膚上不引發(fā)皮膚反應(yīng)，而化合物48/80在皮膚上引發(fā)皮膚反應(yīng)。同時(shí)，與僅施用相同濃度的化合物48/80的組相比，分別魚腥草提取物、插田泡提取物以及魚腥草和插田泡的混合提取物而后施用化合物48/80的組出現(xiàn)的藍(lán)斑減少了。
對(duì)皮膚反應(yīng)引發(fā)位點(diǎn)的皮膚血管透過性進(jìn)行定量分析，結(jié)果，在僅施用化合物48/80的情況下，依文思藍(lán)濃度顯示為36.7±2.7μg/g。施用魚腥草提取物然后施用化合物48/80的組所顯示的依文思藍(lán)濃度為25.8±1.7μg/g，對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)的血管透過性的抑制率為37％。在施用插田泡提取物然后施用化合物48/80的組中，依文思藍(lán)濃度為23.3±1.5μg/g，抑制了45％由化合物48/80誘導(dǎo)的血管透過性。在施用魚腥草和插田泡的混合提取物然后施用化合物48/80的組中，依文思藍(lán)濃度為8.7±0.8μg/g，抑制了93％由化合物48/80造成的血管透過性(見表5)。
由上述測試結(jié)果可以看出，即使在單獨(dú)使用魚腥草提取物或插田泡提取物時(shí)，也可獲得抑制由化合物48/80誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)和血管透過性的增加的效果。此外還可以看出，當(dāng)使用魚腥草和插田泡的混合提取物時(shí)，皮膚反應(yīng)和血管透過性的增加可以得到更有效的抑制。
表5魚腥草和插田泡的混合提取物對(duì)皮膚反應(yīng)和血管透過性的抑制效果

+處理，-未處理1)各個(gè)值均由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n＝10)。
實(shí)施例4制備魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物除了魚腥草提取物和插田泡提取物以外，還進(jìn)一步加入在測試?yán)?中已證實(shí)對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒具有抑制效果的山茱萸、山楂和桑葉而制備混合提取物。以16∶16∶1∶1∶1的重量比使實(shí)施例1中的魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉相互混合，由此按下述方式制備混合提取物。將測試?yán)?中所選擇的魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉洗滌干凈，并切成小于1cm×1cm×1cm的固定尺寸。然后，將350g由160g魚腥草、160g插田泡、10g山茱萸、10g山楂和10g桑葉組成的草藥混合物放在3升純凈水中，并在加壓下于100℃提取4小時(shí)。
測試?yán)?測定魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物抑制肥大細(xì)胞釋放組胺的效果測定在實(shí)施例4中制備的魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物是否具有抑制肥大細(xì)胞釋放組胺的效果。組胺釋放抑制效果的測定以與測試?yán)?相同的方式進(jìn)行。在此情況下，對(duì)肥大細(xì)胞進(jìn)行處理的混合提取物的最終處理濃度分別為0.01mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、1.0mg/ml和10.0mg/ml。
在測試結(jié)果中，在加有鹽水的肥大細(xì)胞懸浮液的情況下，組胺釋放為3.1％。在僅用魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物處理的肥大細(xì)胞的情況下，組胺釋放類似于僅用鹽水處理的肥大細(xì)胞的情況。另一方面，僅用化合物48/80處理的肥大細(xì)胞顯示出非常高的組胺釋放，為56.7％。此外，在用混合提取物處理然后用化合物48/80處理的肥大細(xì)胞的情況下，由化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞的組胺釋放受到抑制(見表6)。
表6魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物對(duì)組胺釋放的抑制效果

1)各個(gè)值均由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n＝10)。
實(shí)施例5制備含有本發(fā)明的草藥原料的混合提取物的膠囊制備含有作為活性成分的魚腥草和插田泡的混合提取物的膠囊。此外，制備含有作為活性成分的魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物的膠囊。
以下述方式制備包含魚腥草和插田泡的混合提取物的膠囊。準(zhǔn)確稱取在實(shí)施例1中制備的100mg粉末化的魚腥草提取物和100mg粉末化的插田泡提取物以及100mg乳糖，并在攪拌器中均勻混合。然后，用膠囊自動(dòng)填充機(jī)以每個(gè)膠囊300mg將該混合物填入到硬明膠膠囊(Su-Heung Capsule，Co.，Ltd.，韓國)中。
以下述方式制備包含魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物的膠囊。準(zhǔn)確稱取在實(shí)施例1中制備的80mg粉末化的魚腥草、80mg粉末化的插田泡提取物、10mg粉末化的山茱萸提取物、10mg粉末化的山楂提取物和10mg粉末化的桑葉提取物以及110mg乳糖，并在攪拌器中均勻混合。然后，用膠囊自動(dòng)填充機(jī)以每個(gè)膠囊300mg將該混合物填入到硬明膠膠囊(Su-Heung Capsule，Co.，Ltd.，韓國)中。
測試?yán)?通過臨床試驗(yàn)檢驗(yàn)本發(fā)明的草藥提取物制劑的抗過敏效果通過臨床試驗(yàn)檢驗(yàn)在實(shí)施例5中制備的草藥提取物制劑對(duì)過敏性疾病患者的抗過敏效果。
7-1)臨床試驗(yàn)組的分類對(duì)20名10～70歲患有特應(yīng)性皮炎的男性患者和女性患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)。首先，將所述20名患者分成4組一組施用本發(fā)明制劑1(含有魚腥草和插田泡的混合提取物，見表7)，一組施用本發(fā)明制劑2(含有魚腥草、插田泡、山茱萸、山楂和桑葉的混合提取物，見表7)，一組施用常規(guī)治療劑(見表8)，一組施用本發(fā)明制劑1(含有魚腥草和插田泡混合提取物)和常規(guī)治療劑(見表9)，每組由5名患者組成。
作為常規(guī)治療劑，使用以下類固醇藥例如艾維頓(Schering Ltd.)、樂蒂克果酸(lacticare，Stifel Laboratories)、去氧米松凝膠(Handokpharmaceuticals Co.Ltd.)、oradexion(Choong Wae Pharma Corporation)、dexcosil(Yungjin Paramaceutical Co.Ltd.)；抗組胺藥，例如保樂康(plokon，Yungjin Parama.Co.Ltd.)、玻麗瑪朗(primalan，Bukwang pharmaceutical Co.Ltd.)、艾來錠(allegra，Handok pharmaceuticals Co.Ltd.)、噻喘酮(zaditen，Novartis pharmaceuticals)、依美斯汀(remicut，Kolon pharmaceuticals，Inc.)；以及作為輔助治療劑用以抗特應(yīng)性皮炎的月見草油制劑(epogam，Handokpharmaceuticals Co.Ltd.)。
表7施用本發(fā)明制劑的組

表8施用常規(guī)治療劑的組

表9施用本發(fā)明制劑和常規(guī)治療劑的組

7-2)測定過敏性疾病患者血清中的IgE和組胺的水平在治療前和治療后收集測試?yán)?-1)中每個(gè)測試組的患者的血液，測定血清中IgE和組胺的水平。IgE水平的測定通過ECLIA(電化學(xué)發(fā)光免疫測定)進(jìn)行。在測定中使用了含有生物素化的單克隆IgE特異性抗體和釕標(biāo)記的單克隆IgE特異性抗體的復(fù)合物的分析試劑盒。以與測試?yán)?相同的方式對(duì)患者血清的組胺水平進(jìn)行測定。
在測試結(jié)果中，治療后所有測試組都顯示出比治療前較低的血清IgE水平和組胺水平(見表10和11)。此外，在施用本發(fā)明制劑組、施用常規(guī)治療劑組以及施用本發(fā)明制劑和常規(guī)治療劑組之間沒有明顯差異。
表10過敏性疾病患者的血清的IgE水平(IU/ml)

表11過敏性疾病患者的血清的組胺水平(nM)

7-3)過敏性疾病患者的臨床觀察對(duì)測試?yán)?-1)中每個(gè)測試組的患者的病變進(jìn)行臨床觀察。特應(yīng)性皮炎的特征在于各種病變，這些病變包括帶有嚴(yán)重搔癢癥的紅斑性丘疹和小皰的發(fā)生，擦傷所致的滲出性病變的產(chǎn)生，表皮脫落、紅斑性丘疹或鱗屑丘疹和斑點(diǎn)的產(chǎn)生，以及重復(fù)擦傷和摩擦導(dǎo)致的苔蘚樣變的發(fā)生。通過觀察上述特征和癥狀的增加和減少來確定特應(yīng)性皮炎的好轉(zhuǎn)程度。
在測試結(jié)果中，施用發(fā)明制劑1或2的特應(yīng)性皮炎患者顯示出包括手掌裂縫的苔蘚樣病變有了好轉(zhuǎn)(見圖3的A和B)，并顯示出膝后彎凹處的圓形紅斑性斑疹有了好轉(zhuǎn)(見圖3的C和D)。此外，施用常規(guī)治療劑的測試組顯示出前肘凹處的圓形紅斑性斑點(diǎn)和臉部伴隨有鱗屑的濕疹性病變有了好轉(zhuǎn)(見圖4的A和B)。另外，施用常規(guī)治療劑和本發(fā)明制劑的測試組顯示出臉部伴隨有鱗屑的濕疹性病變有了好轉(zhuǎn)。
由此可見，對(duì)于過敏性疾病的治療，含有本發(fā)明的草藥提取物的制劑實(shí)質(zhì)上具有與傳統(tǒng)的類固醇藥相同的效果。
實(shí)施例6制備含有本發(fā)明的草藥提取物的飲料組合物飲料組合物通過混合以下物質(zhì)而制備20％魚腥草提取物，20％的插田泡提取物，0.15％維生素A，0.2％維生素D，0.15％維生素B2，2.0％維生素C，3.0％?；撬?，2.5％聚葡萄糖，余量為純凈水。
于2004年2月5日提出的韓國專利申請(qǐng)?zhí)?004-0007404全部公開內(nèi)容(包括它的說明書、權(quán)利要求書、附圖和摘要)全部引入本文作為參考。
工業(yè)實(shí)用性由前述可見，本發(fā)明的魚腥草和插田泡的混合提取物以及包含該混合提取物的組合物通過抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺而具有預(yù)防和治療過敏性疾病的效果。此外，它們沒有顯示出細(xì)胞毒性，因而可以在體內(nèi)安全使用。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺具有抑制活性的草藥提取物，該草藥提取物通過用水或有機(jī)溶劑對(duì)魚腥草和插田泡進(jìn)行提取而獲得。
2.如權(quán)利要求1所述的草藥提取物，其中所述魚腥草和插田泡以1∶4至4∶1的重量比混合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的草藥提取物，該草藥提取物進(jìn)一步包含選自山茱萸、山楂和桑葉中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述的草藥提取物，該草藥提取物用作藥物。
5.權(quán)利要求1所述的草藥提取物在制備抗過敏性疾病的治療劑中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的草藥提取物在制備抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的抑制劑中的用途。
7.一種用于預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含權(quán)利要求1所述的草藥提取物作為活性成分。
8.一種用于預(yù)防或改善過敏性疾病的食品組合物，該食品組合物包含權(quán)利要求1所述的草藥提取物作為活性成分。
9.如權(quán)利要求7或8所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包含選自山茱萸提取物、山楂提取物和桑葉提取物中的至少一種。
10.如權(quán)利要求7或8所述的組合物，其中所述過敏性疾病選自由過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性耳炎、過敏性休克和過敏性皮膚病組成的組。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述過敏性皮膚病選自由特應(yīng)性皮炎、牛皮癬、接觸過敏性皮炎和蕁麻疹組成的組。
12.一種預(yù)防或治療過敏性疾病的方法，該方法包括對(duì)所需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的草藥提取物的步驟。
13.一種抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的方法，該方法包括對(duì)所需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1所述的草藥提取物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及魚腥草(Houttuynia cordata)和插田泡(Rubus coreanus)的提取物以及包含所述提取物的用于預(yù)防和治療過敏性疾病的組合物。本發(fā)明所述的提取物和包含該提取物的組合物通過抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺而具有預(yù)防和治療過敏性疾病的效果。此外，它們沒有顯示出細(xì)胞毒性，因而可以在體內(nèi)安全使用。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1917895SQ200580004236
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月5日
發(fā)明者宋昌虎, 蔡玉姬, 樸用寅, 李東信 申請(qǐng)人:里根生物技術(shù)有限公司, 宋昌虎