專利名稱：系列單抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，主要是HAb18G/CD147功能表位區(qū)的臨床及制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前全世界每年新增1000萬癌癥患者，而且癌癥的發(fā)病率呈急劇上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年全世界死于癌癥患者約600萬.我國1995年主要疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成中，惡性腫瘤排列第2位，占死亡總?cè)藬?shù)的21.85％。其中發(fā)病率較高的腫瘤有胃癌(占癌總死亡率21.76％)、肝癌(17.83％)、肺癌(15.19％)、食管癌(15.02％)等。長期以來，由于腫瘤高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的惡性特點(diǎn)，一直是治療療效亟待解決的問題。目前國內(nèi)外抗癌治療關(guān)注的熱點(diǎn)之一是抗腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移規(guī)律極其復(fù)雜，涉及諸多因素，如(1)蛋白水解酶；(2)血管生成因子；(3)粘附因子，如整合素，選擇素，鈣粘合素等；(4)相關(guān)運(yùn)動因子；(5)瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞分泌蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)最為重要，目前已發(fā)現(xiàn)了20余種，它們幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。MMPs的作用可概括為(1)降解間質(zhì)，破壞膠原限制腫瘤生長的機(jī)械屏障作用；(2)破壞基底膜完整性，利于癌細(xì)胞穿過血管壁進(jìn)入血流；(3)通過對細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進(jìn)腫瘤新生血管或轉(zhuǎn)移灶的形成。由于MMPs在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用，因而腫瘤組織中MMPs的來源一直是人們研究的重點(diǎn)問題。近年來多個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，CD147分子與腫瘤細(xì)胞膜有關(guān)，可刺激腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌MMPs，且最近的一篇文獻(xiàn)報(bào)道，CD147分子不僅能刺激MMPs的產(chǎn)生，而且還與MMPs在腫瘤細(xì)胞表面形成復(fù)合物，這種復(fù)合物的形成相當(dāng)于將MMPs濃縮在腫瘤細(xì)胞周圍，有利于腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)的降解，使腫瘤細(xì)胞易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。目前，抗間質(zhì)降解多采用酶抑制劑，如天然酶抑制劑—組織型金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)，能夠與MMPs結(jié)合并抑制酶活性，但TIMPs在組織中含量極微且難于提取，人工重組TIMPs是大分子蛋白質(zhì)，存在降解和口服吸收不良等問題。人工合成的擬肽類金屬蛋白酶抑制劑，如Batimastat(BB-94)，只能抑制早期腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMPs的活性，幾乎不能抑制晚期腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量MMPs的活性，導(dǎo)致III期臨床實(shí)驗(yàn)的停止。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)在我國患病人數(shù)達(dá)300余萬。發(fā)病年齡輕，致殘率高。其臨床特點(diǎn)為累及到周身關(guān)節(jié)的增殖性和侵蝕性滑膜炎，呈進(jìn)行性病變終生反復(fù)不斷，被認(rèn)為是類似“局限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性病變，自發(fā)性緩解極為罕見。晚期由于關(guān)節(jié)軟骨及骨的損傷而導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形和功能障礙，病變亦可侵犯漿膜、心肺、動脈、神經(jīng)及眼等結(jié)締組織。RA組織病理學(xué)特征是滑膜襯里過度增生和襯里下層大量炎性單個(gè)核細(xì)胞浸潤。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和滑膜組織巨噬細(xì)胞在關(guān)節(jié)損傷中起最重要的作用。這兩種細(xì)胞均能大量產(chǎn)生MMPs。此外，骨關(guān)節(jié)炎與老齡化密切相關(guān)，隨著人類壽命的延長發(fā)病率增高，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，亦在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。這些酶以協(xié)同作用方式能夠消化滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的所有主要的細(xì)胞外基質(zhì)組分。RA滑膜中EMMPRIN(CD147)的表達(dá)上調(diào)，可誘導(dǎo)局部產(chǎn)生MMPs 1、2、3等蛋白水解酶，且可導(dǎo)致MMPs和TIMPs的不平衡最終引起RA關(guān)節(jié)的破壞。此病至今尚無特效治療。90年代以來，國內(nèi)外學(xué)者采用仿效結(jié)核病和惡性腫瘤的聯(lián)合療法，是此類疾病治療學(xué)上的一大突破，使部分患者病情得到較長期緩解，生活質(zhì)量得到提高，但并未治愈疾病。抑制軟骨和骨侵蝕仍是此病治療亟待解決的問題。但迄今有關(guān)應(yīng)用酶抑制劑抗間質(zhì)降解的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療一樣令人失望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供CD147家族成員HAb18G/CD147功能表位區(qū)氨基酸序列，及其做為抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用及治療性藥物的靶位。
HAb18G/CD147分子的功能表位區(qū)氨基酸序列，其具有序列表<400>1或<400>2的序列。
上述功能表位區(qū)氨基酸序列在制備用于治療抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了HAb18G/CD147的功能區(qū)，可作為靶向分子，設(shè)計(jì)、篩選并合成它的拮抗劑；阻斷效應(yīng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞)誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能；減少腫瘤組織間質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成；達(dá)到治療肝癌等腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的目的。因此，該功能表位的發(fā)現(xiàn)具新藥開發(fā)的前景。篩選有效的針對此功能區(qū)的治療劑，在高位阻斷效應(yīng)細(xì)胞分泌MMPs，也是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎治療的新途徑和發(fā)展趨勢。


圖1為5株抗體作用下的明膠酶譜。
圖2為5株抗體作用下的肝癌細(xì)胞HHCC的侵襲力實(shí)驗(yàn)結(jié)果直方圖。
圖3為HAb18G/CD147分子模建示意圖。
具體實(shí)施例方式
一、HAb18G/CD147功能區(qū)21AAGTVFTTVEDLG33和39LTCSLNDSATEV50的確定(一)抗體的制備及功能利用HAb18G/CD147的胞外區(qū)免疫Ba1b/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)獲得單抗1B3，3B3，5A12，6H8，這五株單抗都能和HCC結(jié)合。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)(見附圖1)顯示這五株單抗都具有抑制腫瘤細(xì)胞刺激其周圍基質(zhì)細(xì)胞分泌MMPs的作用。侵襲力實(shí)驗(yàn)(見附圖2)表明這些抗體能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
明膠酶譜實(shí)驗(yàn)肝癌細(xì)胞HCC和人胚肺成纖維細(xì)胞各(fb)培養(yǎng)至對數(shù)期用2.5g/L胰酶消化，以105/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)上清，換無血清培養(yǎng)液。加入終濃度為100μg/ml的單抗，并設(shè)立陰性對照孔。37℃培養(yǎng)20小時(shí)后，收集無血清培養(yǎng)細(xì)胞上清。以1％明膠為底物配制一定體積的8％分離膠和5％濃縮膠，取培養(yǎng)上清與樣品緩沖液混合，上樣電泳，電泳停止后，將膠放入Triton X-100溶液中復(fù)性，在明膠酶孵育緩沖液中孵育。染色、脫色、觀察、拍片。圖1中1為單獨(dú)fb培養(yǎng)，2為HCC和fb共培養(yǎng)，3為單獨(dú)HCC，4為HCC和fb共培養(yǎng)，加單抗1B3，5為HCC和fb共培養(yǎng)，加單抗3B3，6為HCC和fb共培養(yǎng)，加單抗HAb18，7為HCC和fb共培養(yǎng)，加單抗5A12，8HCC和fb共培養(yǎng)，加單抗6H8。由圖1可見在抗體的作用下，與對照相比(1，2)MMP-2的分泌明顯降低(4-8)。
Borden Chamber侵襲力實(shí)驗(yàn)在小室(chamber)內(nèi)膜上加入Matrigel膠，放至膠干。用2.5g/L胰酶消化HCC和fb細(xì)胞，離心洗滌。用含0.1％BSA的RPIM-1640懸起，加入上室，同時(shí)在上室加入終濃度為100μg/ml的單抗。在小室的下室24孔板內(nèi)加入500μl趨化劑。將24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)20h。取出小室，棄去培養(yǎng)液，95％乙醇固定25min，濾膜HE染色，梯度酒精脫水，用棉簽擦去上室中的Matrigel膠及細(xì)胞，切下濾膜；透明后封片。在40×光鏡下計(jì)數(shù)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)膜上4個(gè)視野，每細(xì)胞計(jì)數(shù)3份，求出其平均值，測驗(yàn)重復(fù)3次。由圖2可見，與對照相比，5株抗體均能不同程度地抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
(二)抗體的表位作圖將HAb18G/CD147胞外區(qū)分段表達(dá)，應(yīng)用Western-blot和ELISA的方法確定這五株抗體的功能表位。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這五株抗體的表位分別為HAb1839LTCSLNDSATEV503B3，5A1239LTC411B321AAGTVFTTVEDLG336H848TEV50因此認(rèn)為39LTCSLNDSATEV50和21AAGTVFTTVEDLG33為HAb18G/CD147的功能區(qū)。
(三)合成肽證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對兩段表位功能區(qū)合成多肽，利用ELISA和Western-blot的方法證實(shí)五株抗體的表位確實(shí)在這兩段上。
(四)抗原HAb18G/CD147結(jié)構(gòu)的分子模建使用Modeller 8vl1對HAb18G/CD147胞外段進(jìn)行分子模建，使用WAM2對抗體HAb18可變區(qū)進(jìn)行分子模建，得到兩者最優(yōu)化結(jié)果后，利用ZDOCK 2.33進(jìn)行蛋白—蛋白對接模擬，結(jié)果說明在HAb18G/CD147胞外第二個(gè)loop環(huán)段與抗體重鏈可變區(qū)存在較強(qiáng)的相互作用殘基對，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互吻合。在Chrimera下繪制的HAb18G/CD147分子模型圖見圖3。由圖3可見，HAb18G/CD147分子由兩個(gè)球形部分組成，在第一個(gè)球形部分內(nèi)，有一個(gè)暴露在外的環(huán)形結(jié)構(gòu)(紅色所示)，為5株抗體的識別功能表位。
二、所述的HAb18G/CD147功能區(qū)作為制備抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎治療劑的靶位。
本發(fā)明人在長期從事肝癌免疫導(dǎo)向藥物研究的基礎(chǔ)上，獲得肝癌高親和力單抗HAb18的相應(yīng)膜抗原HAb18G的cDNA全長序列，發(fā)現(xiàn)其與CD147的序列高度同源，通過基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)分析，體外實(shí)驗(yàn)表明HAb18G/CD147與其效應(yīng)細(xì)胞(癌周成纖維細(xì)胞)結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生MMPs，使腫瘤組織中MMPs含量及活性顯著提高，間質(zhì)成分和血管基底膜的膠原蛋白過度降解，癌細(xì)胞穿過基底膜及結(jié)締組織屏障不斷侵襲擴(kuò)散，證實(shí)HAb18G分子在肝癌中發(fā)揮的作用同CD147分子在其它腫瘤上發(fā)揮的作用相同，可大大促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。基于以上研究基礎(chǔ)，以及HAb18G/CD147在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，在肝癌上為高表達(dá)的特點(diǎn)，故可通過阻斷HAb18G/CD147分子的作用來抑制肝癌轉(zhuǎn)移。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子HAb18G/CD147的功能區(qū)，為靶向分子，設(shè)計(jì)、篩選并合成它的拮抗劑；阻斷效應(yīng)細(xì)胞成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能；減少腫瘤組織間質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成；達(dá)到治療肝癌等腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的目的。
鑒于MMPs通過直接降解軟骨、骨組織和間接促進(jìn)血管形成而參與RA關(guān)節(jié)破壞。因此抑制MMPs是治療RA的基本途徑之一。我們經(jīng)免疫組化法證明HAb18G/CD147分子在滑膜細(xì)胞上有明確定位。所以，該功能區(qū)的發(fā)現(xiàn)可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
序列表<110>陳志南<120>系列單抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>13<212>PRT<213>人<400>1Ala Ala Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp Leu Gly5 10 13<210>2<211>12<212>PRT<213>人<400>2Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr Glu Val5 10 1權(quán)利要求
1.系列單抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列，其具有序列表<400>1或<400>2的序列。
2.如權(quán)利要求1所述功能表位區(qū)氨基酸序列在制備用于治療抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供系列單抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列，其具有序列表<400>1或<400>2的序列，以及上述功能表位區(qū)在制備用于治療抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了HAb18G/CD147的功能區(qū)，可作為靶向分子，設(shè)計(jì)、篩選并合成它的拮抗劑；阻斷效應(yīng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞)誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能；減少腫瘤組織間質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成；達(dá)到治療肝癌等腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的目的。因此，該功能表位的發(fā)現(xiàn)具新藥開發(fā)的前景。
文檔編號A61P35/00GK1749268SQ20051009620
公開日2006年3月22日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者陳志南, 庫曉明, 汪莉, 李郁, 楊向民, 楊濱 申請人:陳志南