專利名稱：腦苷肌肽凍干粉及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療急性顱腦損傷、急性腦卒中和腦出血的腦苷肌肽凍干粉及其制備方法。
背景技術：
腦苷肌肽中含有神經節(jié)苷酯和小分子多肽物質，臨床上用于治療急性顱腦損傷、急性腦卒中和腦出血。具有較好催醒作用，提高患者生存質量，降低死亡率，促進和改善腦功能的預后效果。臨床上常用的是腦苷肌肽注射液，在貯存過程中易產生聚合物，引起一些過敏反應。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種腦苷肌肽凍干粉及制備工藝，以提高腦苷肌肽藥物的穩(wěn)定性和臨床用藥的安全性。
本發(fā)明腦苷肌肽凍干粉含有有效成分唾液酸神經節(jié)苷酯鈉GM1和兔肌肉提取物的小分子多肽以及藥物制劑上可接受的賦型劑，唾液酸神經節(jié)苷酯鈉與小分子多肽的重量配比為50～100∶1～10，賦型劑添加量是小分子多肽溶液和唾液酸神經節(jié)苷酯鈉混合液總體積的20％～70％，所說的賦型劑選自甘露醇、聚乙二醇、葡聚糖或乳糖中的一種或一種以上。
腦苷肌肽凍干粉 按如下步驟制備將唾液酸神經節(jié)苷酯鈉GM1與兔肌肉提取物的小分子多肽按比例組合，添加適量的賦型劑，經除菌、除熱源處理，制成腦苷肌肽溶液，將該溶液按成品規(guī)定量(即內含兔肌肉提取多肽5～50mg唾液酸神經節(jié)苷酯50～500μg)進行分裝，將上述分裝好的腦苷肌肽溶液冷凍至-20℃～-40℃，當溫度冷卻至-35℃時，真空度達1～10Pa抽真空，保溫4小時后；在4Pa的真空度下，逐漸以每小時1℃提高溫度。當到達5℃～40℃即可。凍干完畢，開啟凍干機的升降機將膠塞完全壓入西林瓶中，然后通入無菌空氣，開箱取出凍干好的產品。所得的凍干粉為白色或為淡黃色疏松塊狀物。本品溶解后成無色或淡黃色澄明液體。
本發(fā)明腦苷肌肽凍干粉，能提高神經節(jié)苷酯和小分子多肽物質的藥物穩(wěn)定性，確保臨床用藥的療效，同時也有利于藥品的貯藏、運輸。
具有制備工藝簡單，所提取的兔肌肉多肽成分活性高、唾液酸神經節(jié)苷酯的純度高，通過有效成分的定量檢測，可有效地控制產品質量，保證臨床的有效性和安全性。
具體實施例方式
實施例1 腦苷肌肽凍干粉的制備①制備唾液酸神經節(jié)苷酯鈉GM1按重量取動物腦組織，組織搗碎，加入2～8倍量的丙酮(0℃以下)攪拌，0～-10℃放置12～20小時，收取沉淀，置40℃～60℃真空干燥，得丙酮粉。取丙酮粉，加入4～10倍量的氯仿、甲醇和水的混合液(比例為1∶2∶1.3)，攪拌6～10小時，然后離心、過濾，收集濾液，加入適量水，使溶液變?yōu)槿闋钜?，靜置分層，取上清，此上清液于40℃～45℃減壓濃縮至原液體積的1/3，得神經節(jié)苷酯濃縮液。按100ml加0.2mg的比例向該濃縮液中加入氫氧化鈉，加熱至60℃，水解45～60分鐘，冷卻，即得單唾液酸神經節(jié)苷脂鈉的水解液。取D101型大孔樹脂，填柱，將水解液上樣，依次用20倍柱體積水、2倍柱體積20％甲醇洗脫，收集洗脫液。將洗脫液減壓蒸餾除去甲醇，濃縮至原體積的1/2，冷卻，靜置過夜，過濾，得沉淀物。再將沉淀物用8～10倍水溶解，經冷凍干燥，得唾液酸神經節(jié)苷脂鈉，以唾液酸計算含量不得低于18％。
②制備小分子多肽物質按重量取合格兔肉，剪去脂肪和結締組織，用注射用水洗凈，經組織搗碎，搗碎時加注射用水勻漿，將勻漿組織液置-25℃～-35℃下冰凍10～20小時。然后將凍結的組織液于常溫下解凍，再放置-35℃以下冰藏10～20小時。取出凍結的組織液于30℃～40℃水浴融化，用適量NaOH調PH6.0～7.0，加熱至90℃以上變性，保溫30min，冰水冷卻。將組織液在4℃下高速離心，時間15min/次，收集上清液，用3000～10000道爾頓分子篩截留，收集超濾液，即得兔肌肉提取的小分子多肽溶液，其多肽含量不得低于3.5mg/ml。
③制備腦苷肌肽凍干粉將以上制得的唾液酸神經節(jié)苷酯鈉GM1溶液與兔肌肉提取的小分子多肽溶液按比例組合，并按二溶液總體積20～70％的量添加賦型劑，本例中選用賦型劑為葡聚糖和乳糖，經除菌、除熱源處理，制成腦苷肌肽溶液，將該溶液按成品規(guī)定量(即內含兔肌肉提取多肽5～50mg∶唾液酸神經節(jié)苷酯50～500μg)進行分裝，將上述分裝好的腦苷肌肽溶液冷凍至-20℃～-40℃，抽真空達1～10Pa，保溫4小時后，逐漸以每小時1℃提高溫度。當到達室溫即可。凍干完畢，開啟凍干機的升降機將膠塞完全壓入西林瓶中，然后通入無菌空氣，開箱取出凍干好的產品。所得的凍干粉為白色或為淡黃色疏松塊狀物。本品溶解后成無色或淡黃色澄明液體。其產品規(guī)格有①每瓶6.4mg多肽∶100μg唾液酸；②16mg多肽∶250μg唾液酸；③32mg多肽∶500μg唾液酸。
實施例2腦苷肌肽凍干粉特殊安全性試驗按上述工藝制備的產品，進行動物安全性試驗，其試驗方法和結果如下①受試藥物注射用腦苷肌肽，淡黃色粉末，規(guī)格每瓶含6.4mg(多肽)、100μg(唾液酸)。由海南惠普森醫(yī)藥生物技術有限公司提供。
②試驗動物大耳白兔3只，♀/♂皆用，體重2.0～2.5kg，一級，由四川省醫(yī)學實驗動物管委會試驗動物養(yǎng)殖中心提供并提供全價顆粒飼料。動物合格證號川質動管14號。豚鼠60只，♀/♂各半，體重200～250g，一級，由四川省醫(yī)學實驗動物管委會試驗動物養(yǎng)殖中心提供并提供全價顆粒飼料。動物合格證號川質動管14號。試驗條件合格證三級，室溫18～24℃，相對濕度60～68％。
③安全性實驗方法與結果a.溶血試驗取兔心血10ml，去纖維蛋白，置刻度離心管加入適量的生理鹽水，2000rpm/min離心，10min/次，棄上清液，生理鹽水洗滌5次，至離心后上清液無色為止，將所得紅細胞用生理氯化鈉溶液配成2％混懸液。取試管7支，按規(guī)定配比量依次加入2％紅細胞混懸液和生理氯化鈉溶液，混勻后，于37℃恒溫箱中放置30min，分別加入不同量的藥液，搖勻后，置37℃恒溫箱中，開始分別于30、60min，2、3、4h觀察各管有無溶血及RBC凝集現象。
表1 試劑與試管名稱標號

表2 注射用腦苷肌肽體外對紅細胞的溶血作用


注“+”表示溶血；“-”表示不溶血。
結果如表為陰性，不溶血。
b.靜脈血管刺激試驗家兔3只，♀/♂均可，固定于兔箱內，左側耳緣靜脈滴注N.S(對照組)，右側耳緣靜脈滴注0.21mg(多肽計)腦苷肌肽，滴注量均為4.07mg(多肽計)/kg，速度為20滴/min。1次/日，連續(xù)5天。末次給藥24h后，解剖左右側兔耳，肉眼及病理觀察耳緣靜脈注射部位有無刺激反應。
結果肉眼觀察對照組和實驗組左右兩耳滴注部位未見明顯的血管擴張、紅腫等刺激反應現象；病理組織學檢查也未見異常。表明注射用腦苷肌肽對家兔靜脈血管無明顯的刺激性。
c.家兔肌肉刺激試驗家兔3只，♀/♂均可，分別在其左右大腿外側四頭肌部位剪毛，用記號筆畫一直徑1cm的圓標記，無菌操作，在各兔圈內右側注射3.2mg(多肽計)/ml的腦苷肌肽1.0ml/只，左側注射N.S1.0ml/只，連續(xù)3天，末次給藥24h后，處死動物。觀察注射部位四頭肌有無紅腫、充血、肌肉變性等刺激反應癥狀；取注射部位肌肉作組織病理學檢查。
結果3只家兔兩側注射部位肌肉均無肉眼可見異常；組織病理學檢查，肌纖維未見充血、水腫、炎細胞浸潤。表明腦苷肌肽對家兔肌肉無刺激性。
d.豚鼠全身過敏試驗豚鼠60只，隨機分為3.2mg(多肽)/ml腦苷肌肽組、10％卵白蛋白陽性對照組、N.S陰性對照組3組，20只/組，♀/♂各半。腦苷肌肽組豚鼠間日腹腔注射(i.p)給藥0.5ml/只，連續(xù)3次。10％卵白蛋白陽性對照組、N.S陰性對照組相同方法注射。第1次給藥后14天、21天各組各取10只，♀/♂各半。由后肢足背靜脈注射(i.v)本組受試液1ml/只，參考中國藥典，觀察給藥后15min內有無豎毛、噴嚏、干嘔、咳嗽、呼吸困難、顫音、抽搐或死亡等過敏反應。
表3 注射用腦苷肌肽對豚鼠全身過敏作用


結果腦苷肌肽組和N.S組于末次給藥14天和21天i.v.給藥后15min內除14天出現2只豎毛、1只咳嗽、21天3只豎毛、1只呼吸急促外，其余均未出現豎毛、噴嚏、干嘔、咳嗽、呼吸困難、顫音、抽搐或死亡等過敏反應現象，而陽性組動物在注射卵蛋白液體后2～3min內均出現上述癥狀。表明豚鼠全身過敏性試驗結果為陰性，無明顯致敏性。
結論根據上述實驗結果表明，注射用腦苷肌肽無溶血和RBC聚集作用。多次靜脈滴注未見對家兔靜脈血管的明顯刺激作用。多次肌肉注射也未見對家兔肌肉的明顯刺激作用。對豚鼠全身過敏試驗結果證明，注射用腦苷肌肽無致敏性。
權利要求
1.腦苷肌肽凍干粉，含有效成分唾液酸神經節(jié)苷酯鈉、兔肌肉提取的小分子多肽，以及藥物上可接受的賦型劑，其特征是唾液酸神經節(jié)苷酯鈉與小分子多肽的重量配比為50～100∶1～10，賦型劑添加量是兔肌肉組織提取的多肽溶液液和唾液酸神經節(jié)苷酯混合液總體積的20％～70％，所說的賦型劑包括甘露醇、聚乙二醇、葡聚糖、乳糖。
2.一種權利要求1的腦苷肌肽凍干粉的制備方法，其特征是按如下步驟制備將唾液酸神經節(jié)苷酯鈉與兔肌肉提取的小分子多肽按比例組合，添加適量的賦型劑，經除菌、除熱源處理，制成腦苷肌肽溶液，將該溶液按成品規(guī)定量分裝，將分裝好的腦苷肌肽溶液冷凍至-20℃～-40℃，真空度達1～10Pa抽真空，保溫4小時后，逐漸以每小時1℃提高溫度，當到達5℃～40℃即可，凍干完畢，開啟凍干機的升降機將膠塞完全壓入西林瓶中，然后通入無菌空氣，開箱取出凍干好的產品。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于一種治療急性顱腦損傷、急性腦卒中和腦出血的藥物腦苷肌肽凍干粉，含有效成分唾液酸神經節(jié)苷酯鈉、兔肌肉提取的小分子多肽，以及藥物上可接受的賦型劑，唾液酸神經節(jié)苷酯鈉與小分子多肽的重量配比為50～100∶1～10，賦型劑添加量是兔肌肉組織提取的多肽溶液液和唾液酸神經節(jié)苷酯混合液總體積的20％～70％，包括甘露醇、聚乙二醇、葡聚糖、乳糖。本劑能提高神經節(jié)苷酯和小分子多肽物質的藥物穩(wěn)定性，確保臨床用藥的療效，同時也有利于藥品的貯藏、運輸。
文檔編號A61P43/00GK1733293SQ20051009404
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月26日 優(yōu)先權日2005年8月26日
發(fā)明者李志林, 黃瑤, 蔡鶴其 申請人:李志林