專(zhuān)利名稱(chēng)：黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃芩甙(苷)的用途，尤其是黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃芩甙(苷)為黃酮類(lèi)化合物，目前尚無(wú)國(guó)家藥監(jiān)局正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的黃芩甙(苷)液用于臨床，而黃芩甙(苷)藥理活性是多方面的，它在清除氧自由基，減輕組織缺血再灌注損傷，調(diào)節(jié)免疫功能，保肝利膽，抗感染，抗腫瘤等方面均有一定的作用，是多種中藥注射液、口服液、膠囊、飲片、丸散、膏丹的組成成分，黃芩甙(苷)溶解度好，毒性小，具有潛在的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供黃芩甙(苷)的新用途，即在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案。黃芩甙(苷)在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用，通過(guò)靜推或是靜滴方式治療急性胰腺炎。
本發(fā)明的有益效果如下重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，為臨床常見(jiàn)急腹癥之一。SAP是急性胰腺炎(acute pancreatjtis，AP)的重型，起病急，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展快，病死率高，其治療一直是當(dāng)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的攻關(guān)難題之一。近年來(lái)，因生長(zhǎng)抑素施他寧及其類(lèi)似物善寧對(duì)SAP具有良好的療效，已受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的普遍重視，但因其價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用難以普及。所以尋找其它價(jià)廉、效好的藥物已成為當(dāng)前重要的研究方向。申請(qǐng)者對(duì)祖國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中治療SAP的代表性方劑“清胰湯”進(jìn)行了開(kāi)發(fā)，從中選出了黃芩，并首次將其主要有效單體黃芩甙(又名黃芩苷)制成注射液用于治療SAP。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，屬于急性胰腺炎的重型，為臨床常見(jiàn)急腹癥之一。SAP是急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的重型，起病急，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展快，病死率高，其治療一直是當(dāng)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的攻關(guān)難題之一。近年來(lái)，因生長(zhǎng)抑素施他寧及其類(lèi)似物善寧對(duì)SAP具有良好的療效，已受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的普遍重視，但因其價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用難以普及。所以尋找其它價(jià)廉、效好的藥物已成為當(dāng)前重要的研究方向。申請(qǐng)者對(duì)祖國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中治療SAP的代表性方劑“清胰湯”進(jìn)行了開(kāi)發(fā)，從中選出了黃芩，并首次將其主要有效單體黃芩甙(又名黃芩苷)制成注射液用于治療SAP?，F(xiàn)將部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果敘述如下實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組取健康雄性Sprague-Dawley大鼠(購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)90只，體重250-300g，隨機(jī)分為SAP模型組(A組)、5％黃芩甙注射液治療組(B組)，每組45只，另選45只作為假手術(shù)組(IS組)。上述各組再隨機(jī)分為3、6、12小時(shí)組，每組15只。于術(shù)后3、6、12小時(shí)各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，觀(guān)察各組大鼠的死亡率，隨后分批處死大鼠，觀(guān)察腹水量及多臟器的大體病理變化，收集血液并取胰腺組織標(biāo)本按相應(yīng)要求進(jìn)行固定，在HE染色下進(jìn)行胰腺病理組織學(xué)評(píng)分；取血檢測(cè)血淀粉酶、內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。
1.模型組(A組) 模型制備后除給予頸外靜脈維持輸液(1ml/h/100g體重)外無(wú)其他任何治療。
2.治療組(B組) 模型制備后通過(guò)頸外靜脈給予黃芩甙首次劑量(10mg/100g體重)，然后再以微量輸液泵靜脈維持給藥(1ml/h/100g體重)[注5％黃芩甙用量計(jì)算方法大鼠體重(g)×0.2ml/100g體重×12＝12小時(shí)需要的5％黃芩甙注射液總的體積數(shù)，然后用生理鹽水稀釋至12ml]3.假手術(shù)組(IS組) 進(jìn)腹后僅翻動(dòng)胰腺和十二指腸后關(guān)腹，除給予頸外靜脈維持輸液(1ml/h/100g體重)外無(wú)其他任何治療。
模型制作簡(jiǎn)要過(guò)程術(shù)前12小時(shí)禁止進(jìn)食，不禁水。2.5％戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉(0.25ml/100g體重)，平臥固定，備皮消毒鋪巾。首先建立右側(cè)頸外靜脈輸液通道，用微量輸液泵維持輸液(1ml/h/100g體重)，然后以3.5％?；悄懰徕c制備SAP模型。模型組經(jīng)上腹劍突下正中切口進(jìn)腹，顯露肝下間隙，確認(rèn)膽胰管及肝門(mén)部肝總管，暴露胰腺頭部，用左手食指墊起中段十二指腸，辨認(rèn)腸管上十二指腸乳頭位置后用5號(hào)注射針頭于十二指腸外側(cè)壁無(wú)血管區(qū)戳一小孔，硬膜外導(dǎo)絲(斜行截去頭部側(cè)孔)從小孔進(jìn)入腸管后沿乳頭方向插入膽胰管(應(yīng)無(wú)阻力感)，并與膽胰管呈平行方向順行推入1.0左右，并用顯微血管鑷夾管固定，同時(shí)于肝門(mén)下肝管匯合處用另一顯微血管鑷夾閉肝總管。硬膜外導(dǎo)絲末端連接輸液轉(zhuǎn)換器后用微泵(浙江大學(xué)醫(yī)療儀器公司制造)逆行注入3.5％?；悄懰徕c(Sigma產(chǎn)品)0.1ml/100g體重，以0.2ml/分鐘速度注射畢，停留4分鐘。移去硬膜外導(dǎo)絲，用1-0無(wú)損傷縫線(xiàn)縫閉小孔后逐層關(guān)腹。
血漿淀粉酶測(cè)定 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿淀粉酶水平，單位U/L。
血漿內(nèi)毒素水平測(cè)定檢測(cè)步驟1.取樣品0.1ml與鱟試劑0.05ml輕輕混勻，置于37℃水浴25分鐘2.加入鱟三肽0.05ml，置于于水浴中37℃3分鐘。
加入亞硝酸鈉溶液0.5ml，混勻后加入氨基磺酸銨0.5ml，加入萘乙二胺0.5ml混勻，后于波長(zhǎng)545nm比色讀取數(shù)值，單位EU/L。
血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)定操作步驟(1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中加入樣品稀釋液100微升，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品100微升，混勻后用加樣器吸出100微升，移至第二孔。如此反復(fù)做對(duì)倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100微升棄去，使之體積均為100微升，第八孔為空白對(duì)照。
(2)加樣 待測(cè)品孔中每孔各加入待測(cè)樣品100微升，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
(3)洗板 用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，在濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液50微升，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。再次洗板，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100微升。將反應(yīng)板置37℃60分鐘。洗板同前。每孔加入底物工作液100微升，置暗處反應(yīng)5-10分鐘。每孔加入1滴終止液混勻，在492nm處測(cè)吸光度值。
(4)結(jié)果計(jì)算與判斷 所有OD值都應(yīng)減去空白值后再進(jìn)行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62.5、32、16、OPG/ml之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)OD值在該曲線(xiàn)圖上查出相應(yīng)的TNF-α、IL-6值，TNF-α及IL-6含量的計(jì)算單位pg/ml。
胰腺組織病理學(xué)檢查應(yīng)用HE染色，光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分，其標(biāo)準(zhǔn)參照我方自己制定的標(biāo)準(zhǔn)，由兩位病理科主任醫(yī)師采用盲法評(píng)定。觀(guān)察指標(biāo)、評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)下文。
實(shí)驗(yàn)性重癥急性胰腺炎的胰腺病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)一、觀(guān)察指標(biāo)1.小葉間及小葉內(nèi)水腫；2.間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，其均值＞5個(gè)炎細(xì)胞/HPF)3.腺泡細(xì)胞壞死(隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，其均值＜5個(gè)高倍視野小壞死灶)4.間質(zhì)出血(隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，其均值＜5個(gè)高倍視野小出血灶＝5.間質(zhì)出血加壞死(腺泡細(xì)胞、脂肪壞死)(隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，其中有1個(gè)/＞1個(gè)病灶呈大片壞死或出血)二、評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)1.①+②＜5個(gè)中性粒細(xì)胞/HPF 0分2.①+②＞5個(gè)中性粒細(xì)胞/HPF 1分3.①+②+③+④ 2分4.①+②+③＞5個(gè)高倍視野+④＞5個(gè)高倍視野3分5.①+②+③大片壞死/④大片出血 4分6.①+②+③+④+⑤ 5分注①.僅有間質(zhì)水腫，無(wú)/或＜5個(gè)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)/HPF不算炎癥，評(píng)0分。
②.大片病灶是指一個(gè)高倍視野包括不了的病灶。
③.高倍視野出血灶或壞死灶是指1個(gè)高倍視野能包括的小病灶。
④.大片壞死/大片出血，是指只要有其中一項(xiàng)(即大片出血或大片壞死)即評(píng)4分。
統(tǒng)計(jì)方法將各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果整理后應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示有顯著性差異。
結(jié)果一、SD大鼠存活情況模型組3、6、12小時(shí)各組大鼠死亡數(shù)分別為0只、2只、5只，死亡率分別為0％(0/15)、13.33％(2/15)、33.33％(5/15)，術(shù)后12小時(shí)生存率為66.67％(10/15)。
治療組 3、6、12小時(shí)各組大鼠死亡數(shù)分別為0只、0只、0只，死亡率分別為0％(0/15)、0％(0/15)、0％(0/15)，治療組的生存率為100％，顯著高于模型組(P＜0.05)。
二、腹水量測(cè)定(單位mL)表1各組腹水量(M(QR))

三組總的比較(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))*χ2＝42.164，P＝0.000；**χ2＝48.563，P＝0.000；#χ2＝37.452，P＝0.000；三組間的兩兩比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))各時(shí)間點(diǎn)A、B＞IS，P＜0.001；各時(shí)間點(diǎn)B＜A，P＜0.001三、血漿淀粉酶的測(cè)定表2各組淀粉酶的含量(M(QR))

三組總的比較(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))*χ2＝36.289，P＝0.000；**χ2＝35.502，P＝0.000；#χ2＝34.040，P＝0.000；三組間的兩兩比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))各時(shí)間點(diǎn)A、B＞IS，P＜0.001；6、12小時(shí)點(diǎn)，B與A無(wú)差別；3小時(shí)點(diǎn)B＜A，P＜0.05四、血清IL-6和TNF-α含量的變化1.IL-6含量的變化表3各組IL-6的含量(M(QR))

三組總的比較(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))*χ2＝41.123，P＝0.000；**χ2＝43.511，P＝0.000；#χ2＝27.285，P＝0.000；三組間的兩兩比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))3、6小時(shí)點(diǎn)A、B＞IS，P＜0.00112小時(shí)點(diǎn)A、B＞IS，P＜0.01；各時(shí)間點(diǎn)B＜A，P＜0.001；2.TNF-α含量的變化表4各組TNF-α的含量(M(QR)))

三組總的比較(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))*χ2＝33.787，P＝0.000；**χ2＝47.198，P＝0.000；#χ2＝33.188，P＝0.000；三組間的兩兩比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))各時(shí)間點(diǎn)A、B＞IS，P＜0.001；3、12小時(shí)點(diǎn)A、B組間無(wú)差別；6小時(shí)點(diǎn)B＜A，P＜0.001五、血漿內(nèi)毒素含量的變化表5各組內(nèi)毒素的含量(M(QR))

三組間比較(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))*χ2＝43.361，P＝0.000，**χ2＝36.640，P＝0.000，#χ2＝37.062，P＝0.000三組間的兩兩比較(Mann-Whithey檢驗(yàn))各時(shí)間點(diǎn)A、B＞IS，P＜0.001；3小時(shí)點(diǎn)B＜A，P＜0.001；6小時(shí)點(diǎn)B＜A，P＜0.05；12小時(shí)點(diǎn)B＜A，P＜0.001。
六、組織病理學(xué)變化對(duì)SAP模型誘導(dǎo)后模型組及治療組3、6、12小時(shí)胰腺大體肉眼觀(guān)及光鏡下胰腺組織病理改變進(jìn)行觀(guān)察比較。
大體肉眼觀(guān) 模型組模型誘導(dǎo)后5分鐘胰腺呈現(xiàn)廣泛被膜下出血水腫，以胰腺體尾部為明顯；3小時(shí)后胰腺充血水腫明顯，部分呈粘凍狀出血壞死改變，腹水呈淡紅色；6、12小時(shí)組胰腺組織大范圍淤血壞死，胰腺質(zhì)地變薄，胰腺周?chē)缶W(wǎng)膜及腹膜有較多皂化斑點(diǎn)，腹腔內(nèi)大量血性腹水。治療組3小時(shí)后胰腺組織呈充血水腫改變，出血情況較模型組輕；6、12小時(shí)組胰腺組織輪廓完整，無(wú)廣泛淤血壞死，范圍相對(duì)局限；腹腔內(nèi)為淡血性腹水，腹水量與模型組比較明顯減少，皂化斑點(diǎn)分布較模型組少且面積較小。胰腺壞死較模型組輕，胰腺整體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。
光鏡下胰腺病理改變 模型組胰頭部間質(zhì)水腫，有少量灶性壞死及溶解性壞死，腺泡細(xì)胞間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；胰腺體尾部間質(zhì)水腫明顯，部分或大片腺葉出血性壞死或溶解性壞死，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死面積和程度較胰頭部明顯，病變嚴(yán)重度隨造模后時(shí)間延長(zhǎng)而加重。治療組胰腺組織內(nèi)仍可見(jiàn)片狀凝固性壞死，但面積較小，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較模型組為清晰，胰腺間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出減少，腺泡細(xì)胞間中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)較少，相同倍數(shù)的鏡下胰腺細(xì)胞的數(shù)量較模型組為多。
表6各組胰腺病理學(xué)評(píng)分結(jié)果

三組間的兩兩比較(Mann-Whitney檢驗(yàn))各時(shí)間點(diǎn)A、B組分別與IS組比較，P＜0.001；B與A組比較△P＜0.05，△△P＜0.01討論一、SAP大鼠血漿淀粉酶的變化血漿淀粉酶應(yīng)用于臨床診斷急性胰腺炎已有近60年的歷史，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，文獻(xiàn)報(bào)道統(tǒng)計(jì)大約90％的胰腺炎患者其體內(nèi)血漿淀粉酶的水平是升高的，但具有一定的局限性。在人體內(nèi)除胰腺以外的許多臟器和組織如唾液腺、近端十二指腸、肝臟、橫紋肌、輸卵管上皮細(xì)胞及腸道細(xì)菌均可分泌和產(chǎn)生一定數(shù)量的淀粉酶，當(dāng)并發(fā)此類(lèi)器官和組織發(fā)塵病變時(shí)，也可使血漿、尿液中的淀粉酶水平含量升高，目前尚無(wú)區(qū)分胰腺和其他組織來(lái)源分泌的淀粉酶。臨床的實(shí)際觀(guān)察中某些SAP患者的胰腺組織出血壞死病理改變很?chē)?yán)重，而血漿淀粉酶的水平并不一定升高，反而下降，這與SAP患者胰腺組織的腺泡細(xì)胞大量破壞有關(guān)，因此認(rèn)為血漿淀粉酶水平判斷急性胰腺炎的嚴(yán)重度應(yīng)結(jié)合CT掃描等影像學(xué)檢查手段更有臨床意義。
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，模型組和治療組的血漿淀粉酶水平均顯著升高，與假手術(shù)組比較有顯著性差異。但6、12小時(shí)點(diǎn)模型組和治療組相比兩者的血漿淀粉酶水平比較并沒(méi)有顯著性差異，與黃芩甙治療對(duì)SAP胰腺組織病理嚴(yán)重度改善程度并不一致，因此血漿淀粉酶水平作為診斷SAP的一項(xiàng)常規(guī)檢查，其水平的高低并不反映胰腺炎的嚴(yán)重程度，因而在臨床中不宜將血漿淀粉酶水平變化作為SAP預(yù)后判斷的指標(biāo)和/或SAP的臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。
二、黃芩甙對(duì)SAP重要炎癥介質(zhì)的影響急性胰腺炎(AP)病程多數(shù)具有自限性的特點(diǎn)，但部分患者炎癥可持續(xù)發(fā)展并最終發(fā)展為重癥急性胰腺炎(SAP)，后者的死亡率可達(dá)到30％左右，早期的死亡原因主要是全身多器官功能衰竭(MOF)。隨著全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammation reaction syndrome，SIRS)觀(guān)點(diǎn)的提出，人們認(rèn)識(shí)到炎癥介質(zhì)引發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)使SAP從局部的炎癥發(fā)展為多臟器的損害過(guò)程中起著重要的作用。SAP病程中起作用的炎癥介質(zhì)大致可以分為兩大類(lèi)，即與SAP病情加重有關(guān)的炎癥介質(zhì)和對(duì)SAP病情發(fā)展具有保護(hù)作用的炎癥介質(zhì)。前者主要有細(xì)胞因子(TNF、IL-1、IL-6、IL-8等)、血小板活化因子(PAF)、磷脂酶A2(PLA2)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素等；后者包括IL-10、IL-2、可溶性腫瘤壞死因子受體(Soluble tumor necrosisfactor receptor，STNFR)、前列環(huán)素(PGI2)等。上述炎癥介質(zhì)的釋放失控，造成了機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的紊亂，機(jī)體抗炎因子和促炎因子的比例失調(diào)，使其從局部病變發(fā)展為SIRS及MOF，加劇胰腺炎病情。
腫瘤壞死因子(TNF)主要有單核細(xì)胞產(chǎn)生，在正常情況下，低水平的TNF可起到生長(zhǎng)因子的作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)。而TNF水平的異常升高則提示有炎癥反應(yīng)存在。TNF可直接作用與細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生溶解，同時(shí)其可以作為重要的炎癥始發(fā)因子作用于多種細(xì)胞，促進(jìn)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)。在SAP病程中的作用主要作用表現(xiàn)在增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化作用，促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，刺激中性粒細(xì)胞脫顆粒并生成自由基，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而造成局部組織損傷和毛細(xì)血管通透性的增加，最終加重胰腺組織的出血壞死。實(shí)驗(yàn)研究表明，應(yīng)用抗TNF抗體能夠減輕胰腺水腫，壞死及炎癥程度，而且治療性應(yīng)用TNF拮抗劑比預(yù)防性應(yīng)用更加有效。
白細(xì)胞介素6(IL-6)主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，在SAP中胰腺腺泡旁成纖維細(xì)胞也可產(chǎn)生。IL-6可與其他因子協(xié)同作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化、增殖和抗體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞合成和調(diào)節(jié)4期蛋白釋放，改變細(xì)胞內(nèi)G蛋白活性，上調(diào)中性粒細(xì)胞的功能等作用。SAP的嚴(yán)重程度與IL-6水平的升高程度以及持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，當(dāng)IL-6水平高于140U/L時(shí)常提示為SAP，因此IL-6水平的檢測(cè)可以早期判斷重型或致死性SAP的指標(biāo)，其靈敏性、特異性分別為80％、92％，因此認(rèn)為是判斷SAP預(yù)后的一個(gè)最有用的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示細(xì)胞因子IL-6的水平在模型組均有不同程度的升高，且升高水平與SAP胰腺組織病理嚴(yán)重度評(píng)分水平呈明顯的相關(guān)性；相對(duì)于模型組，治療組IL-6在3、6、12小時(shí)段均低于SAP組，兩組比較有顯著性差異，而TNF-α僅在6小時(shí)點(diǎn)低于模型組，因此，實(shí)驗(yàn)性SAP中監(jiān)測(cè)IL-6的變化比TNF-α更能有利于提示胰腺炎的嚴(yán)重度。由于IL-6、TNF等是與胰腺炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)的炎癥介質(zhì)，因此從這個(gè)角度講中藥單體黃芩甙可降低SAP大鼠胰腺炎的嚴(yán)重程度。
三、黃芩甙對(duì)血漿內(nèi)毒素水平的影響細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的一種復(fù)合糖脂，其活性成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，在細(xì)菌新陳代謝的的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以胞吐的方式釋放或細(xì)菌在受到補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物及不合理使用殺菌性抗菌素時(shí)造成大量細(xì)菌壞死崩解而釋放。臨床動(dòng)態(tài)觀(guān)察顯示在SAP時(shí)血漿內(nèi)毒素水平與病情的嚴(yán)重程度呈正比，而且以門(mén)靜脈中的水平最高，伴有肝臟功能的損害，因此認(rèn)為血漿內(nèi)毒素水平高低可以作為判斷SAP預(yù)后的一個(gè)有用的指標(biāo)之一。在SAP時(shí)血漿內(nèi)毒素水平的升高與腸道細(xì)菌的移位、完整腸道粘膜屏障破壞、肝臟免疫功能的下降等幾個(gè)方面的因素有關(guān)。
在SAP病程發(fā)展過(guò)程中大量細(xì)菌移位引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥與胰腺組織病損嚴(yán)重程度呈劑量依賴(lài)性，導(dǎo)致胰腺組織的血液灌注、間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、組織中炎癥介質(zhì)的表達(dá)等均呈進(jìn)行性惡化，促使胰腺炎由水腫型、輕型向壞死型、重型轉(zhuǎn)換，最終使機(jī)體出現(xiàn)SIRS及MOF等病理生理改變均與內(nèi)毒素血癥造成的全身過(guò)度炎癥反應(yīng)有關(guān)。內(nèi)毒素在SAP發(fā)病過(guò)程中的機(jī)制可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)(1)加劇微循環(huán)障礙研究認(rèn)為L(zhǎng)PS可以增強(qiáng)SAP大鼠的原生性一氧化氮合酶(cNOS)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)的活性，在保護(hù)劑量以下(1mg/kgI.P)，cNOSmRNA可以在所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中檢測(cè)到，而iNOS只有在大劑量時(shí)才表達(dá)。而NO作為重要的舒血管物質(zhì)，其作用具有雙重性。一方面適當(dāng)劑量的NO可以舒張血管平滑肌，抑制血小板凝聚，抑制白細(xì)胞的粘附和活化，清除氧自由基；而另一方面釋放增多可引起血管的過(guò)度擴(kuò)張，血流淤滯，組織利用氧減少，從而造成組織損傷。絲氨酸蛋白水解酶抑制因子甲磺酸奈莫司他，可以抑制LPS所致的No的過(guò)量合成，以及LPS所致的IL-6、IL-8的分泌，同時(shí)改善SAP胰腺組織的病理嚴(yán)重程度。LPS還可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞粘附、內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時(shí)還可以激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凝血系統(tǒng)活化，纖維蛋白形成增加，微循環(huán)淤滯。提示LPS是引起胰腺微循環(huán)紊亂，病情惡化的促進(jìn)因子，另外LPS還有擬交感作用，使機(jī)體釋放兒茶酚胺，并可以提高血管對(duì)兒茶酚胺的敏感性而致血管收縮。上述的多方面的分子機(jī)制說(shuō)明LPS可以加劇SAP胰腺組織的微循環(huán)障礙。(2)損傷內(nèi)皮細(xì)胞LPS可通過(guò)直接和間接兩條途徑損傷胰腺內(nèi)皮細(xì)胞。一是間接途徑，通過(guò)激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(PMNS)，釋炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，間接引起內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的破壞。PMNS激活后釋放的細(xì)胞因子大部份可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮功能障礙，如TAF-α、PAF等具有明顯增加血管通透性的作用。PMNS的激活還可以引起呼吸爆發(fā)，釋放氧自由基等損傷內(nèi)皮細(xì)胞膜。另外LPS還可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，促使其他炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，如組胺、緩激肽、P物質(zhì)等，從而間接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。二是直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能如粘附分子(ICAM-1)的表達(dá)、細(xì)胞因子的釋放等，通過(guò)激活相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管通透性升高。LPS與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后，通過(guò)一定的信號(hào)機(jī)制引起細(xì)胞骨架蛋白的解聚和重組，細(xì)胞與細(xì)胞間和細(xì)胞與基底膜間的粘連松解，細(xì)胞間隙形成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能受損。LPS與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LPS binding protein，LBP)結(jié)合后，與可溶性CD14形成復(fù)合物并再與內(nèi)皮細(xì)胞的一種未知跨膜受體結(jié)合，進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制可以使參與內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜間的粘附蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化而發(fā)揮作用，引起一系列內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)。(3)與炎癥介質(zhì)的相互作用LPS可以結(jié)合在單核細(xì)胞的CD14受體上，從而激活單核巨噬細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，如TNF、PAF、IL-1等。脂多糖結(jié)合蛋白LBP是一種急性期反應(yīng)蛋白，與LPS結(jié)合后形成可溶性復(fù)合體，增強(qiáng)后者與CD14的親合力，使其在nmol/L的水平即可發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明在模型組和治療組內(nèi)毒素水平均較假手術(shù)組明顯升高，3、6、12各時(shí)間段內(nèi)毒素比較均有顯著性差異。但治療組內(nèi)毒素水平較模型組在3、6、12小時(shí)段均顯著下降，兩組比較有顯著性差異，提示黃芩甙治療后可顯著降低血漿中內(nèi)毒素水平。
四、黃芩甙降低SAP大鼠的死亡率，改善胰腺組織病理嚴(yán)重度黃芩甙減少SAP大鼠的腹水量本實(shí)驗(yàn)研究中SAP模型誘導(dǎo)中，我們將1980年Aho首先報(bào)道的經(jīng)十二指腸穿刺胰膽管逆行注射牛磺膽酸鈉SAP大鼠模型制備進(jìn)行了改良，采用硬膜外導(dǎo)管經(jīng)十二指腸乳頭微量輸液泵注射3.5％?；悄懰徕c進(jìn)行SAP模型誘導(dǎo)，制模后5分鐘胰腺組織即出現(xiàn)廣泛彌漫的出血改變，3、6、12小時(shí)后各組肉眼和光鏡下觀(guān)察均出現(xiàn)胰腺組織大面積的出血壞死改變，伴有大量的血性腹水，并隨時(shí)間的推移而加重。治療組各時(shí)間段的腹水量明顯少于模型組，兩者比較有顯著性差異。SAP時(shí)血性腹水的產(chǎn)生原因主要是由于胰酶或炎癥介質(zhì)等釋放入血引起胰腺毛細(xì)血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管的通透性增加，導(dǎo)致大量的體液及血管內(nèi)的細(xì)胞有形成分通過(guò)腹膜外滲至腹腔內(nèi)引起大量的血性腹水。SAP大鼠因大量的體液外滲，致使有效循環(huán)血量的銳減而最終導(dǎo)致胰腺微循環(huán)障礙以及休克等，而后者也是引起大鼠死亡的重要原因。前述的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明黃芩甙作為一種有效的抗氧化劑能夠明顯降低SAP大鼠血清TNF、IL-6等的水平，改善SAP病理生理狀態(tài)，阻斷炎癥介質(zhì)惡性循環(huán)所引起的SAP病程進(jìn)展。另有實(shí)驗(yàn)顯示，內(nèi)皮素(ET)可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞間的細(xì)胞連接增寬，細(xì)胞內(nèi)胞漿疏松、線(xiàn)粒體腫脹以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生脫落現(xiàn)象，而且ET能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白水解酶的釋放和氧自由基的產(chǎn)生，經(jīng)黃芩甙治療后可以在很大程度上保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞間的細(xì)胞連接，以及能部分減輕ET所致的胞漿疏松、線(xiàn)粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等，而且黃芩甙能在一定程度上抑制ET所致的蛋白水解酶的釋放和氧自由基的產(chǎn)生，后者可能是黃芩甙發(fā)揮保護(hù)ET所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞連接損傷的作用的內(nèi)在機(jī)制之一。在我們的相關(guān)課題研究也證實(shí)黃芩甙具有明顯改善SAP的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，改善微循環(huán)的作用。上述的機(jī)制可以部分解釋黃芩甙減少SAP大鼠腹水量的原因。
黃芩甙減輕SAP大鼠的胰腺組織病理嚴(yán)重度SAP的胰腺組織病理改變是多方面的病理因素作用的結(jié)果，除與腺泡細(xì)胞破壞后胰腺組織“自家消化”作用直接破壞作用相關(guān)以外，炎癥反應(yīng)時(shí)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及此類(lèi)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的大量炎癥介質(zhì)作用；大量體液外滲、有效循環(huán)血容量急劇減少、胰腺微循環(huán)障礙等均有直接關(guān)系。本組實(shí)驗(yàn)的SAP大鼠各時(shí)間段胰腺組織表現(xiàn)為不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、胰腺組織廣泛而彌漫的胰腺組織出血、大量的腺泡細(xì)胞片狀壞死改變，黃芩甙治療后鏡下觀(guān)察各組SAP大鼠胰腺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血明顯減輕、腺泡細(xì)胞壞死面積減小呈點(diǎn)狀和或小片狀壞死改變，顯示靜脈注射黃芩甙治療SAP可以明顯減輕SAP大鼠胰腺組織的病理嚴(yán)重度。我們認(rèn)為黃芩甙之所以能夠減輕SAP大鼠的胰腺組織病理嚴(yán)重度與抑制炎癥介質(zhì)水平、抗內(nèi)毒素、改善胰腺微循環(huán)等多方面的作用機(jī)制有關(guān)。
黃芩甙降低SAP大鼠死亡率對(duì)SAP的最終治療目的在于降低其死亡率。SAP早期死亡原因是由于炎癥介質(zhì)引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征以及出現(xiàn)的多臟器功能衰竭(MOF)發(fā)生有關(guān)。降低和消除血液中的炎癥介質(zhì)可以緩解改善MOF的病情。本研究結(jié)果模型組大鼠3、6、12小時(shí)死亡率分別為0％(0/15)、13.33％(2/15)、33.33％(5/15)，術(shù)后12小時(shí)生存率為66.67％(10/15)；治療組3、6、12小時(shí)各組大鼠死亡率分別為0％(0/15)、0％(0/15)、0％(0/15)，術(shù)后12小時(shí)生存率100％(15/15)，治療組的12小時(shí)生存率顯著高于模型組。治療組大鼠死亡率降低的原因與降低血液中TNF、IL-6、內(nèi)毒素水平，同時(shí)與SAP大鼠的腹水量明顯減少，大鼠胰腺病理組織嚴(yán)重度減輕等有關(guān)。
黃芩甙通過(guò)上述作用最終降低SAP大鼠死亡率。
結(jié)論1.炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素均參與重癥急性胰腺炎疾病的發(fā)生發(fā)展，黃芩甙(苷)可以降低重癥急性胰腺炎大鼠炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素水平，改善胰腺病變，減少腹水的產(chǎn)生，降低死亡率。
2.黃芩甙(苷)對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠具有良好的療效，有望成為治療急性胰腺炎的新藥。
權(quán)利要求
1.黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)靜脈通道給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)靜推或是靜滴方式治療急性胰腺炎。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)頸外靜脈通道給予黃芩甙首次劑量10mg/100g，再以微量輸液泵靜脈維持給藥1ml/h/100g。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用，其特征在于5％黃芩甙用量計(jì)算方法體重×0.2ml/100g.h×12小時(shí)＝12小時(shí)需要的5％黃芩甙注射液總的體積數(shù)，然后用生理鹽水稀釋至12ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃芩甙在急性胰腺炎治療中的應(yīng)用，通過(guò)頸外靜脈通道給予黃芩甙首次劑量10mg/100g，再以微量輸液泵靜脈維持給藥1ml/h/100g。5％黃芩甙用量計(jì)算方法體重×0.2ml/100g.h×12小時(shí)＝12小時(shí)需要的5％黃芩甙注射液總的體積數(shù)，然后用生理鹽水稀釋至12ml。本發(fā)明的有益效果如下SAP是急性胰腺炎的重型，起病急，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展快，病死率高，其治療一直是當(dāng)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的攻關(guān)難題之一。因生長(zhǎng)抑素施他寧及其類(lèi)似物善寧對(duì)SAP具有良好的療效，但因其價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用難以普及。申請(qǐng)者首次將其主要有效單體黃芩甙制成注射液用于治療SAP，是一種價(jià)廉、效好的藥物。
文檔編號(hào)A61P1/18GK1736387SQ20051009123
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日
發(fā)明者張喜平 申請(qǐng)人:張喜平