專利名稱：從生物材質去除病毒活性的方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種從生物材質去除病毒活性的方法，特別是關于一種利用高壓流體從生物材質去除病毒活性的方法。
背景技術：
物質具有固相、液相、氣相三種形態(tài)，當系統(tǒng)溫度及壓力達到某一特定點時，氣-液兩相密度趨于相同，兩相合并為一均勻相。該特定點即為該物質的臨界點，所對應的溫度、壓力和密度則分別為該純物質的臨界溫度(Tc)、臨界壓力(Pc)和臨界密度(ρc)。一旦超過此點，無論壓力如何增加都無法使之液化，溫度如何升高也無法使之返回氣相，該物質即進入超臨界狀態(tài)，高于臨界溫度及臨界壓力的均勻相即為超臨界流體。
超臨界流體的物性均在氣體與液體之間，具有類似氣體的擴散性及液體的溶解能力，尤其是溶解能力可隨溫度、壓力、極性而變化，同時兼具低粘度、低表面張力的特性，能夠通過滲透進入微孔隙的物質，使得超臨界流體非常適用于無水洗凈、萃取、染整等用途。
超臨界流體技術的應用領域相當廣泛，多達數(shù)十種，最早的工業(yè)化應用為天然物的萃取，例如德國利用超臨界二氧化碳萃取咖啡因及植物香精等；接下來擴展到染整、工業(yè)洗凈等領域。未來隨著技術發(fā)展及追求高品質、節(jié)能、環(huán)保的要求，它還能應用在納米、化工、石化、制藥、生物、半導體等其它產業(yè)。
二氧化碳由于其易于達到臨界點，臨界溫度約攝氏31.1℃，與一般室溫相近，臨界壓力則為72.9巴(bar)，本身無毒、無色、無臭、不具自燃性、不產生光化學反應、不破壞臭氧層、不產生煙霧。使用時，其溶解力隨溫度與壓力條件而變，且易于回收再利用，加上易于取得、便宜又安全，因此很適合進行超臨界流體的各項應用。
有鑒于二氧化碳本身是一種惰性(inert)的酸性氣體，在槽體真空密閉空間，灌注二氧化碳進行洗凈時，過程中二氧化碳會穿透細菌的細胞膜，此時其具有酸性氣體的特質，會使得細胞死亡，因此二氧化碳本身就具有殺菌效果。然而，超臨界二氧化碳殺死細菌及清洗效能到何種程度，還需要進一步檢測；殺菌環(huán)境條件也仍有待研究，例如各菌種適應溫度不同，有些必須在高溫環(huán)境進行，有些則可能在低溫進行即可；或是需加裝其它設備，如紫外線設備等等。
再有一般常用的高溫或高壓滅菌方式，也不適用于對熱不穩(wěn)定的材料。因此，仍需要一種能夠在較低溫度條件下進行的滅菌方法。

發(fā)明內容
為克服上述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的主要目的在于提供一種能夠無毒地去除病毒活性的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種能夠簡單地去除病毒活性的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種能夠在較低的溫度條件下去除病毒活性的方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種適用于對熱不穩(wěn)定材料進行滅菌以去除病毒活性的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種適用于對敏感蛋白質材料進行滅菌以去除病毒活性的方法。
為達上述及其它目的，本發(fā)明提供一種從生物材質去除病毒活性的方法包括下列步驟(a)在雷諾數(shù)小于或等于2000的非湍流條件下，將高壓流體導入含有待處理物的容器進行滅菌，該待處理物是可能帶有病毒且具有生物活性的物質；以及(b)從該待處理物移除該高壓流體，使該可能存在于待處理物的病毒失去活性。
本發(fā)明的方法可使用超臨界二氧化碳或液態(tài)二氧化碳作為高壓流體去除可能存在于醫(yī)療物品或材料的病毒活性，不需額外添加具有毒性或可能致癌的添加劑進行滅菌，由于超臨界二氧化碳及液態(tài)二氧化碳具有無色、無毒、無味、不易燃、具有化學惰性、價格便宜、以及易制成高濃度液體等特點，因此得以免除后續(xù)移除有毒物質的步驟，同時具有簡化制程與降低成本的優(yōu)點。另一方面，由于二氧化碳的臨界溫度接近室溫且臨界壓力不高，相較于一般的高溫、高壓滅菌方式，本發(fā)明的方法可以在較低的溫度條件下進行滅菌，去除冠狀病毒、豬生殖與呼吸綜合癥病毒、日本腦炎病毒、以及假性狂犬病病毒等病毒的活性，特別適合用于對熱不穩(wěn)定的材料以及敏感的蛋白質材料進行滅菌。
具體實施例方式
以下通過具體實例說明本發(fā)明的實施方式。
一般而言，所謂的“臨界流體(critical fluid)”是指溫度與壓力分別為臨界溫度或超過臨界壓力以及臨界壓力或超過臨界壓力，處于臨界狀態(tài)的流體。另一方面，所謂的“近臨界流體(near critical fluid)”是指溫度與壓力分別為臨界溫度或接近臨界溫度以及臨界壓力或接近臨界壓力。在本說明書中，“高壓流體”一詞包括超臨界流體以及液態(tài)流體，“超臨界流體(supercritical fluid，SCF)”一詞包括溫度與壓力分別為臨界溫度、接近臨界溫度或超過臨界溫度，以及臨界壓力、接近臨界壓力或超過臨界壓力的臨界、近臨界及超臨界流體。同樣地，本說明書中，所謂的“超臨界二氧化碳”包括溫度與壓力分別為臨界溫度(31.1℃)、接近臨界溫度或超過臨界溫度，以及臨界壓力(72.9bar)、接近臨界壓力或超過臨界壓力的臨界、近臨界及超臨界二氧化碳。
在本說明書中，所謂的“待處理物”包括可能帶有冠狀病毒、豬生殖與呼吸綜合癥病毒、日本腦炎病毒或假性狂犬病病毒等病毒且具有生物活性的物質，實例包括但不限于生物材料，例如蛋白質、核酸、生物活性分子、血小板、血液因子等。
本發(fā)明的從生物材質去除病毒活性的方法，是在雷諾數(shù)小于或等于2000的非湍流條件下，先將高壓流體導入含有待處理物的容器進行滅菌；接著，從該待處理物移除該高壓流體，使該可能存在于待處理物的病毒失去活性，或同時移除可能存在的病毒。
一般而言，雷諾數(shù)(Reynold number，Re)是判斷流體流動形態(tài)的指標。雷諾數(shù)小于2,100則稱為層流(laminar flow)，即當流體流動時，各質點間互相平行，互不干擾；雷諾數(shù)大于4,000則稱為湍流(turbulentflow)，即流體除了向前流動外，并碎成許多漩渦，與側邊的流體混合；雷諾數(shù)界介于2,100至4,000則稱為過渡流(transition flow)，即從層流過渡至湍流的中間狀態(tài)，流體行為不穩(wěn)定，時而層流時而湍流。雷諾數(shù)的定義如下式(I)所示Re=Du‾ρμ---(I)]]>其中，D表示管內直徑，單位為米；u表示平均速度，單位為米/秒；ρ表示密度，單位為公斤/立方米；以及μ表示粘度，單位為公斤/米·秒。
本發(fā)明的方法是在雷諾數(shù)小于或等于2000的非湍流條件下，將高壓流體導入含有待處理物的容器進行滅菌，適用于液態(tài)或固態(tài)的待處理物。由于該高壓流體是以雷諾數(shù)小于或等于2000的非湍流條件下導入，因此可確定病毒的去活是因流體達到超臨界而不是由流體的湍流導致的。就該高壓流體的導入比例而言，以每克待處理物計，該高壓流體的導入比例優(yōu)選是100至500克范圍；更優(yōu)者，以每克待處理物計，該高壓流體的導入比例是300克，但并非局限于此。
在本發(fā)明的方法中，以超臨界二氧化碳作為高壓流體為例，該超臨界二氧化碳的壓力是以60至240巴(bar)的范圍較佳，以100至200巴(bar)的范圍更佳，以150至190巴(bar)的范圍又更佳，以160巴(bar)為最佳；該超臨界二氧化碳的溫度是以40至80℃的范圍較佳，以40至60℃的范圍更佳，以40至50℃的范圍又更佳，但并非局限于此。再者，根據(jù)實際導入的超臨界二氧化碳的溫度而定，滅菌時間是以2小時或2小時以內的時間進行，較佳是1小時以內；然而，熟習該項技術者可視需要，根據(jù)待處理物的特性加以調整。除了二氧化碳外，本發(fā)明的方法中使用的高壓流體也可以是水、丙烷、氙氣、笑氣、氫氣或氯氣。
在本發(fā)明的一具體實例中，可進一步在該高壓流體中加入輔溶劑進行流體助溶。該輔助溶劑的實例包括機溶劑，例如丙酮、己烷、二氧雜環(huán)己烷、苯、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇1)、乙腈、二甲基甲酰胺、環(huán)己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、吡啶、乙醚、硝基甲烷及苯甲醚；以及生物制劑，例如過氧化物(如，過乙酸、過氧化氫)、醛類(如，甲醛、戊二醛、鄰苯二甲醛)、鹵素試劑(如，碘)、Sterilox、乙醇、酸及堿等。該輔溶劑的添加時間與添加量是熟習該項技術者視需要加以決定，并無特別限制。
本發(fā)明的方法不但可以去除病毒的活性，更能夠從待處理物移除可能存在的病毒。另一方面，本發(fā)明的方法也可用于使酵素或與病毒有關的生物物質去活性，進而借由抑制蛋白脢的途徑達到抑制病毒散播及繁殖的目的。
實施例1至17以及對照例1至4材料使用ST細胞株(來源ATCC CRL-1746)-第114代，冠狀病毒屬的傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)臺灣野外分離株(TFI)進行測試。
實施方法取病毒效價TCID50為108/ml的TGEV解凍后，加入等量含8％(W/V，無菌蒸餾水配制)的明膠(gelatin)，平均分裝至玻璃小瓶，待明膠凝固后，密封保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 接著，在雷諾數(shù)為2000的非湍流條件下，根據(jù)表1記載的處理條件導入超臨界二氧化碳，該超臨界二氧化碳的導入比例以每克樣品計是300克。
然后，回收樣品，進行離心，取上清液，以96孔盤ST細胞株進行TCID50檢定，重復進行六次，并依細胞是否受到病毒感染與否的細胞病變(CPE，cytopathic effects)有無，決定病毒是否存活，再以Reed-Muench法計算樣品中病毒的效價。
最后，重復進行上述實驗步驟以獲得實施例1至17以及對照例1至4的TCID50值，測定病毒含量，紀錄病毒效價，根據(jù)下列公式計算幾何平均數(shù)GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>表1

病毒效價測定極限100.69/0.1ml
*重復六次測定CPE的有無，并以Reed-Muench法計算所得的數(shù)據(jù)實施例18至32以及對照例5至9材料使用MARC-104細胞株，豬生殖與呼吸綜合癥病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV MD006 strain)進行測試。
實施方法取病毒效價TCID50為107.5/ml的PRRSV解凍后，加入等量含8％(W/V，無菌蒸餾水配制)的明膠(gelatin)，平均分裝至玻璃小瓶，待明膠凝固后，密封保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 接著，在雷諾數(shù)為2000的非湍流條件下，根據(jù)表2記載的處理條件導入超臨界二氧化碳，該超臨界二氧化碳的導入比例以每克樣品計是300克。
然后，回收樣品，進行離心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盤MARC-104細胞株進行TCID50檢定，重復進行六次，并依CPE的有無，決定病毒是否存活，再以Reed-Muench法計算樣品中病毒的效價。
最后，重復進行上述實驗步驟獲得實施例18至32以及對照例5至9的TCID50值，測定病毒含量，紀錄病毒效價，根據(jù)下列公式計算幾何平均數(shù)GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>表2


病毒效價測定極限101/0.1ml*重復六次測定CPE的有無，并以Reed-Muench法計算所得的數(shù)據(jù)實施例33至47以及對照例10至14材料使用Vero細胞株，日本腦炎病毒(Japan encephalitis virus，JEV)AT疫苗株進行測試。
實施方法取病毒效價TCID50為107.1/ml的JEV解凍后，加入等量含8％(W/V，無菌蒸餾水配制)的明膠(gelatin)，平均分裝至玻璃小瓶，待明膠凝固后，密封保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 接著，在雷諾數(shù)為2000的非湍流條件下，根據(jù)表3記載的處理條件導入超臨界二氧化碳，該超臨界二氧化碳的導入比例以每克樣品計是300克。
然后，回收樣品，進行離心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盤Vero細胞株進行TCID50檢定，重復進行六次，并依細胞CPE的有無，決定病毒是否存活，再以Reed-Muench法計算樣品中病毒的效價。
最后，重復進行上述實驗步驟以獲得實施例33至47以及對照例10至14的TCID50值，測定病毒含量，紀錄病毒效價，根據(jù)下列公式計算幾何平均數(shù)GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>
表3

病毒效價測定極限101/0.1ml*重復六次測定CPE的有無，并以Reed-Muench法計算所得的數(shù)據(jù)實施例48至62以及對照例15至19材料使用RK細胞株，假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)臺灣野外分離株進行測試。
實施方法取病毒效價TCID50為106.3/ml的PRV解凍后，加入等量含8％(W/V，無菌蒸餾水配制)的明膠(gelatin)，平均分裝至玻璃小瓶，待明膠凝固后，密封保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 接著，在雷諾數(shù)為2000的非湍流條件下，根據(jù)表4記載的處理條件導入超臨界二氧化碳，該超臨界二氧化碳的導入比例以每克樣品計是300克。
然后，回收樣品，進行離心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盤RK細胞株進行TCID50檢定，重復進行六次，并依細胞CPE的有無，決定病毒是否存活，再運用Reed-Muench法計算樣品中病毒的效價。
最后，重復進行上述實驗步驟以獲得實施例48至62以及對照例15至19的TCID50值，測定病毒含量，紀錄病毒效價，根據(jù)下列公式計算幾何平均數(shù)GMGMy‾=y1y2y3···ynn]]>表4

病毒效價測定極限101/0.1ml*重復六次測定CPE的有無，并以Reed-Muench法計算所得的數(shù)據(jù)實施例63至77以及對照例20至24超臨界二氧化碳對于具有生物活性蛋白質的作用材料使用MARC-104細胞株，豬生殖與呼吸綜合癥病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV MD006 strain)，以及抗豬傳染性胃腸炎病毒中和抗體抗血清等，進行測試。
實施方法取病毒效價TCID50為107.5/ml的PRRSV解凍后(20ml)，加入等量含8％(W/V，無菌蒸餾水配制)的明膠(gelatin)(20ml)，再加入1ml抗豬傳染性胃腸炎病毒中和抗體抗血清混和均勻后，平均分裝至玻璃小瓶，待明膠凝固后，密封保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 接著，在雷諾數(shù)為2000的非湍流條件下，根據(jù)表5記載的處理條件導入超臨界二氧化碳，該超臨界二氧化碳的導入比例以每克樣品計是300克。
然后，回收樣品，進行離心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盤MARC-104細胞株進行PRRSV的TCID50檢定，重復進行六次，依細胞CPE的有無，決定病毒是否存活，再以Reed-Muench法計算樣品中病毒的效價。
最后，以TGEV中和抗體檢定方法依照OIE規(guī)范進行，先將試樣取100μl以兩倍連續(xù)稀釋(2-1至2-12)后，加入等量100μl病毒效價為100TCID50的TGEV作用一小時后，再將混和液轉移至已經生長成為平面的細胞株。五天之后判定中和抗體效價。
表5


病毒效價測定極限101/0.1ml*重復六次測定CPE的有無，并以Reed-Muench法計算所得的數(shù)據(jù)實施例78至92以及對照例25至29材料使用RK細胞株，假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)臺灣野外分離株，以及抗豬傳染性胃腸炎病毒中和抗體抗血清等，進行測試。
實施方法取病毒效價TCID50為108/ml的PRV解凍后(20ml)，加入等量含8％(W/V，無菌蒸餾水配制)的明膠(gelatin)(20ml)，再加入1ml抗豬傳染性胃腸炎病毒中和抗體抗血清混和均勻后，平均分裝至玻璃小瓶，待明膠凝固后，密封保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 繼而，在雷諾數(shù)為2000的非湍流條件下，根據(jù)表6記載的處理條件導入超臨界二氧化碳，該超臨界二氧化碳的導入比例以每克樣品計是300克。
然后，回收樣品，進行離心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盤RK細胞株進行PRV TCID50檢定，重復進行六次，依細胞CPE的有無，決定病毒是否存活，再運用Reed-Muench法計算樣品中病毒的效價。
最后，以TGEV檢定方法依照OIE規(guī)范進行，先將試樣以兩倍連續(xù)稀釋(2-1至2-12)后，加入等量的100 TCID50TGEV作用一小時后，再將混和液轉移至已經生長成為平面的細胞株。五天之后判定效價。
表6

病毒效價測定極限101/0.1ml*重復六次測定CPE的有無，并以Reed-Muench法計算所得的數(shù)據(jù)利用超臨界二氧化碳作為高壓流體去除病毒活性時，在160bar的條件下，以40℃或以上溫度處理30分鐘以上即可達到理想的滅菌效果。就冠狀病毒而言，以40℃處理60分鐘或以50℃處理30分鐘，可達更優(yōu)異的滅菌效果。由上述結果可知，將TGEV中和抗體加入病毒中共同進行處理后，中和抗體的效價并未產生大的差異，顯示具有生物活性的中和抗體，不因此處理而失去效價。因此，本發(fā)明的方法特別適合在較低的溫度條件下，針對具有生物活性以及蛋白質等對熱不穩(wěn)定的材料進行病毒不活化處理作業(yè)。
本發(fā)明也可借由其它不同的具體實例加以施行或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可基于不同觀點與應用，在不悖離權利要求所界定范圍內進行各種修飾與變更。
權利要求
1.一種從生物材質去除病毒活性的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(a)在雷諾數(shù)小于或等于2000的非湍流條件下，將高壓流體導入含有待處理物的容器進行滅菌，該待處理物是指可能帶有病毒且具有生物活性的物質；以及(b)從該待處理物移除該高壓流體，使該可能存在于待處理物的病毒失去活性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該高壓流體是選自二氧化碳、水、丙烷、氙氣、笑氣、氫氣以及氯氣所構成的群組的其中一種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該高壓流體是超臨界二氧化碳。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該高壓流體是液態(tài)二氧化碳。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，以每克待處理物計，該超臨界二氧化碳的導入比例是100至500克的范圍。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，以每克待處理物計，該超臨界二氧化碳的導入比例是300克。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的壓力是60至240巴的范圍。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的壓力是100至200巴的范圍。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的壓力是150至190巴的范圍。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的壓力是160巴。
11.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的溫度是40至80℃的范圍。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的溫度是40至60℃的范圍。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，該超臨界二氧化碳的溫度是40至50℃的范圍內。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該步驟(a)還包括進一步將輔溶劑加入該高壓流體。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，該輔溶劑是有機溶劑。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，該有機溶劑是選自由丙酮、己烷、二氧雜環(huán)己烷、苯、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、環(huán)己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、吡啶、乙醚、硝基甲烷及苯甲醚所構成的群組的其中一種。
17.如權利要求14所述的方法，其特征在于，該輔溶劑是生物制劑。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，該生物制劑是選自由過乙酸、過氧化氫、甲醛、戊二醛、鄰苯二甲醛、碘及乙醇所構成的群組的其中一種。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該病毒包括冠狀病毒、豬生殖與呼吸綜合癥病毒、日本腦炎病毒及假性狂犬病病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從生物材質去除病毒活性的方法，其包括下列步驟(a)在雷諾數(shù)小于或等于2000的非湍流條件下，將高壓流體導入含有待處理物的容器進行病毒不活化處理，該待處理物是指可能帶有病毒且具有生物活性的物質；以及(b)從該待處理物移除該高壓流體，使該可能存在于待處理物的病毒失去活性；由于本發(fā)明的方法使用無毒性的高壓流體即能夠使可能存在于醫(yī)療物品或材料的病毒去活性，因此不需額外添加具有毒性或可能致癌的添加劑；另一方面，本發(fā)明的方法可以在較低的溫度條件下進行病毒不活化處理作業(yè)，特別適合用于對具有生物活性以及蛋白質等對熱不穩(wěn)定的材料進行不活化處理。
文檔編號A61L2/20GK1837359SQ20051005695
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月24日 優(yōu)先權日2005年3月24日
發(fā)明者邱永和, 林國靖, 陳毓婷, 林瑞岳, 陳啟銘, 張夢揚 申請人:南緯實業(yè)股份有限公司