專(zhuān)利名稱(chēng)：溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用作蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑的溴酚類(lèi)化合物(和它們的藥學(xué)上可接受的鹽、酯、醚和其它明顯的化學(xué)等價(jià)物)及其制備和應(yīng)用。這些化合物及它們的衍生物是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶的抑制劑，能夠用于治療和預(yù)防糖尿病及肥胖癥。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式，細(xì)胞通過(guò)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化可調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。酪氨酸磷酸化是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)過(guò)程，受作用相反的一對(duì)酶即蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)和蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTP)所調(diào)節(jié)。PTK，PTP及各自相應(yīng)底物共同組成一個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移及基因轉(zhuǎn)錄、離子通道活動(dòng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程。這些信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)不協(xié)調(diào)，都有可能導(dǎo)致異常的酪氨酸磷酸化，最終引起包括癌癥和糖尿病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。
由于多種PTK與疾病的發(fā)生和疾病的發(fā)展有關(guān)，因此常作為新的藥物發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)。很多針對(duì)特定PTK的小分子抑制劑，已處于不同的臨床開(kāi)發(fā)階段。盡管PTP也是信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的組成成份，但直到最近，人們才逐漸認(rèn)識(shí)到它在人類(lèi)健康中的重要性。生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，PTP在信號(hào)途徑中具有雙向作用，在多種哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞的生理活動(dòng)中扮演重要角色。更重要的是，PTP功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的病理改變，因此，可以將PTP作為一種新的靶點(diǎn)，用以開(kāi)發(fā)具特異性作用模式的藥物。
最近完成的人類(lèi)基因組初步序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)共有112種PTP。迄今為止，很多PTP的晶體結(jié)構(gòu)得以確定。PTP1B是第一個(gè)被鑒定的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(Protein tyrosine phosphatase)。遺傳學(xué)及生化研究表明，PTP1B可作為胰島素信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，參與糖代謝。II型糖尿病的主要表現(xiàn)是嚴(yán)重的胰島素抵抗和胰島素受體信號(hào)受損，PTP1B活性的增高可能是它的一個(gè)致病因素。進(jìn)一步的研究表明，在PTP1B摘除鼠的骨骼肌和肝臟中，胰島素受體的自身磷酸化增加，而且對(duì)胰島素的敏感性也提高。無(wú)PTP1B鼠的肥胖傾向明顯降低，而且免患飲食誘導(dǎo)性肥胖癥。另外也發(fā)現(xiàn)，PTP1B功能缺乏的小鼠發(fā)育良好，且具有正常的繁殖能力，癌癥的發(fā)生率也未見(jiàn)提高。因此，PTP1B作為胰島素信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，其小分子抑制劑可能是有效的抗糖尿病和肥胖癥制劑，而且不產(chǎn)生副作用。這些研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)以PTP1B為靶點(diǎn)的治療藥物提供了理論依據(jù)。
松節(jié)藻科(Rhodomelaceae)海藻富含溴酚類(lèi)物質(zhì)，廣泛分布于中國(guó)、日本、朝鮮半島及大西洋北岸。關(guān)于其中的溴酚類(lèi)化合物的報(bào)道，早期的研究較多，主要涉及了溴酚化合物的抗微生物活性、抗附生作用和抗拒食性。松節(jié)藻Rhodomela confervoides為紅藻門(mén)松節(jié)藻科松節(jié)藻屬海藻，廣泛分布于我國(guó)北方沿海。二十世紀(jì)六十年代人們對(duì)同屬海藻Rhodomela larix中的溴酚類(lèi)化合物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在隨后的20余年里，很少有該屬海藻化學(xué)成份的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種作為蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑的溴酚類(lèi)化合物及其制備，，以及能夠用于治療和預(yù)防糖尿病及肥胖癥的用途。
申請(qǐng)人在對(duì)山東沿海海藻抗腫瘤活性篩選中發(fā)現(xiàn)，松節(jié)藻提取物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和抗菌活性，表明其體內(nèi)可能存在某種具有重要生物活性的物質(zhì)，于是采集了這種海藻，進(jìn)行了一系列的分離純化及多種活性跟蹤篩選。經(jīng)活性篩選研究表明，松節(jié)藻提取物除具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒和抗菌活性外，還在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制模型試驗(yàn)中表現(xiàn)驚人的活性，這就提示說(shuō)松節(jié)藻中存在高活性的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑。進(jìn)一步分離純化，從中得到4個(gè)溴酚化合物，分別為I式為雙-(2，3-二溴-4，5-二羥基卞基)-醚(Bis(2，3-dibromo-4，4-dihydroxybenzyl)ether；II式為2，2’，3，3’-四溴-4，4’，5，5’-四羥基二苯甲烷(2，2’，3，3’-tetrabromo-4，4’，5，5’-tetrahydroydiphenyl methane)；III式為2，2’，3-三溴-3’，4，4’，5-四羥基-6’-乙氧甲基二苯甲烷(2，2’，3-tribromo-3’，4，4’，5-tetrahydroxy-6’-ethyloxymethyldiphenylmethane)；IV式為3-溴-4，5-雙-(2，3-二溴-4，5-二羥基卞基)-鄰苯二酚(3-bromo-4，5-bis(2，3-dibromo-4，5-dihydroxubenzyl)-pyrocatechol)。其中后兩者為新化合物。
溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，以上列四個(gè)溴酚類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物(鹽、酯、醚和其它等價(jià)化合物)之一種或一種以上的混合物為活性成份，上列四個(gè)溴酚類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)式如下
上述溴酚類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物的任一單體或其混合物可作為蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑，可用于制備治療和預(yù)防糖尿病或肥胖癥的醫(yī)學(xué)藥物中；其可與醫(yī)藥上可接受的藥物載體混合制成片劑、膠囊劑、口服液、栓劑、注射劑等各類(lèi)制劑。
上述溴酚類(lèi)化合物可從海洋紅藻松節(jié)藻中(Rhodomela confervoides)分離獲得(上述溴酚類(lèi)化合物以混合物形式存在)；也可以利用化學(xué)方法人工合成其單體、混合物及它們的衍生物。
從海洋紅藻松節(jié)藻中分離獲得上述溴酚類(lèi)化合物的具體操作過(guò)程為1.采集松節(jié)藻原料，風(fēng)干后，用95％乙醇提取三次，每次72小時(shí)；提取液40℃下減壓干燥，得到乙醇提取物；提取物溶于水中，用乙酸乙脂萃取，得到乙酸乙酯相和水相；乙酸乙脂相減壓干燥后進(jìn)行硅膠柱分離，先用石油醚洗脫，然后在洗脫液中逐漸增加丙酮的含量，一直到兩者的比例為1∶1，然后改用氯仿∶甲醇(5∶1)洗脫，逐漸增加甲醇的量，一直到純甲醇。
2.石油醚∶丙酮為1∶1洗脫部分，放置后有大量結(jié)晶體析出，將晶體濾出，母液凝膠柱分離，制備型液相純化后得化合物I，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為雙-(2，3-二溴-4，5-二羥基卞基)-醚(Bis(2，3-dibromo-4，4-dihydroxybenzyl)ether)。
3.氯仿∶甲醇(5∶1)洗脫部分，進(jìn)一步硅膠柱分離，用氯仿∶甲醇為10∶1洗脫，薄層跟蹤鑒別，得到一純化合物2，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為2，2’，3，3’-四溴-4，4’，5，5’-四羥基二苯甲烷(2，2’，3，3’-tetrabromo-4，4’，5，5’-tetrahydroydiphenyl methane)。
4.氯仿∶甲醇為3∶1洗脫部分，進(jìn)一步硅膠柱層析，然后純結(jié)晶去除晶體，母液用制備型高效液相分離得到化合物3，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為一新的化合物2，2’，3-三溴-3’，4，4’，5-四羥基-6’-乙氧甲基二苯甲烷(2，2’，3-tribromo-3’，4，4’，5-tetrahydroxy-6’-ethyloxymethyldiphenylmethane)。
5.氯仿∶甲醇為3∶1的第二個(gè)部分，進(jìn)一步硅膠柱層析及Bio-BeadsSX(200～400目)色譜分離，然后用制備型液相分離獲得化合物4，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為一新的化合物3-溴-4，5-雙-(2，3-二溴-4，5-二羥基卞基)-鄰苯二酚(3-bromo-4，5-bis(2，3-dibromo-4，5-dihydroxubenzyl)-pyrocatechol)。
6.體外抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶活性試驗(yàn)PTP1B是從大腸桿菌中表達(dá)并純化的GST融合蛋白。采用紫外底物PNPP，觀察上述不同化合物對(duì)重組酶的活性抑制，以初步評(píng)價(jià)化合物的藥用效果。PTP1B水解底物PNPP的磷脂得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此可以直接檢測(cè)410nm處吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對(duì)其的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果提示這些化合物有極強(qiáng)的抑制PTP1B活性，即有促進(jìn)胰島素受體磷酸化、增強(qiáng)胰島素敏感性的作用。
本發(fā)明所述溴酚類(lèi)化合物的體外抑制PTP1B酶試驗(yàn)及體內(nèi)降糖試驗(yàn)研究表明，上述化合物不論是單體或它們的混合物均表現(xiàn)明顯的體外抑制PTP1B活性及體內(nèi)降低模型高血糖動(dòng)物血糖水平，為證明可將該類(lèi)化合物用于治療和預(yù)防糖尿病及肥胖癥提供了堅(jiān)實(shí)的理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。通過(guò)本發(fā)明，不僅充分證明了PTP1B可作為篩選治療糖尿病治療藥物的新的作用靶點(diǎn)，也證實(shí)了松節(jié)藻中的溴酚類(lèi)化合物是理想的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑，是潛在的新的治療和預(yù)防糖尿病及肥胖癥的藥物。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明可通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步證實(shí)實(shí)施例1溴酚化合物的提取取風(fēng)干后的松節(jié)藻15kg，用95％乙醇室溫浸泡提取3次，每次72小時(shí)；減壓回收溶劑后，將提取物(723g)懸浮于蒸餾水(1.5L)中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，先用石油醚-丙酮(100∶0～1∶1)和氯仿-甲醇(100∶0～0～100)梯度洗脫，薄層色譜檢查合并相同部分。氯仿∶甲醇5∶1洗脫部分、氯仿∶甲醇3∶1洗脫部分、石油醚∶丙酮2∶1洗脫部分、石油醚∶丙酮1∶1洗脫部分分別經(jīng)過(guò)硅膠柱反復(fù)層析得化合物I(1082mg)、II(1171mg)、III(2644mg)、IV(776mg)。
實(shí)施例2溴酚類(lèi)化合物體外抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶活性試驗(yàn)PTP1B為大腸桿菌中表達(dá)并純化的GST融合蛋白；底物PNPP陽(yáng)性參照物正釩酸鈉(2μM)試驗(yàn)原理PTP1B水解底物PNPP的磷脂得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此可以直接檢測(cè)410nm處吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對(duì)其的抑制作用。
試驗(yàn)方法取上述4種溴酚類(lèi)化合物，分別用磷酸鹽緩沖液配制200μM和20μM2個(gè)供試品溶液。
表1 體外抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶活性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明樣品在抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶活性方面明顯高于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑正釩酸鹽。
實(shí)施例3 松節(jié)藻總溴酚化合物的體內(nèi)降低血糖試驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠40只。
模型鏈脲霉素所致小鼠糖尿病模型具體操作如下取體重20～24g昆明種小白鼠40只，分為正常對(duì)照組、供試品1(4.0g/kg)、供試品2(2.0g/kg)組。正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射鏈脲素(130mg/kg)，48小時(shí)后從小鼠眼眶靜脈取血，分離血清，測(cè)定血清葡萄糖水平。然后給藥組每天灌胃給藥1次，正常對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)10天。于第11天禁食16小時(shí)后，從小鼠眼眶靜脈叢取血，離心取血清，按臨床試劑盒方法測(cè)定血糖水平，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 松節(jié)藻總溴酚化合物對(duì)鏈脲素所致糖尿病小鼠血糖的影響(X±S，n＝10)

與對(duì)照組比較**P＜0.001；與模型組比較*P＜0.05由表2可見(jiàn)，與模型組比較，松節(jié)藻總溴酚化合物大小劑量組對(duì)鏈脲霉素所致的糖尿病小鼠血糖升高具有明顯的抑制作用，具有較好的降血糖治療作用。
權(quán)利要求
1.溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于以下列四個(gè)溴酚類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物之一種或一種以上的混合物為活性成份，四個(gè)溴酚類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)式如下
2.按照權(quán)利要求1所述溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于所述四個(gè)溴酚類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物的任一單體或混合物用于制備治療和預(yù)防糖尿病或肥胖癥的醫(yī)學(xué)藥物中。
3.按照權(quán)利要求2所述溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于所述四個(gè)溴酚類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物可與醫(yī)藥上可接受的藥物載體混合制成片劑、膠囊劑、口服液、栓劑或注射劑。
4.按照權(quán)利要求1所述溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于所述溴酚類(lèi)化合物是從海洋紅藻中分離獲得。
5.按照權(quán)利要求4所述溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于溴酚類(lèi)化合物從海洋紅藻中分離的具體操作過(guò)程如下，取風(fēng)干后的松節(jié)藻，用95％乙醇室溫浸泡提??；減壓回收溶劑后，將提取物懸浮于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃?。灰宜嵋阴ポ腿∥镞M(jìn)行硅膠柱層析，先用石油醚—丙酮體積比100∶0～1∶1和氯仿—甲醇體積比100∶0～0∶100梯度洗脫，薄層色譜檢查合并相同部分；氯仿∶甲醇5∶1洗脫部分、氯仿∶甲醇3∶1洗脫部分、石油醚∶丙酮2∶1洗脫部分、石油醚∶丙酮1∶1洗脫部分分別經(jīng)過(guò)硅膠柱反復(fù)層析得權(quán)利要求1中化合物I、II、III和IV。
全文摘要
本發(fā)明涉及溴酚類(lèi)化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑中的應(yīng)用，以下列四個(gè)溴酚類(lèi)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物之一種或一種以上的混合物為活性成份，I為雙－(2，3－二溴－4，5－二羥基卞基)－醚；II為2，2’，3，3’－四溴－4，4’，5，5’－四羥基二苯甲烷；III為2，2’，3－三溴－3’，4，4’，5－四羥基－6’－乙氧甲基二苯甲烷；IV為3－溴－4，5－雙－(2，3－二溴－4，5－二羥基卞基)－鄰苯二酚。本發(fā)明證明了PTP1B可作為篩選治療糖尿病治療藥物的新的作用靶點(diǎn)，也證實(shí)了溴酚類(lèi)化合物是理想的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶抑制劑，是潛在的治療和預(yù)防糖尿病及肥胖癥的藥物。
文檔編號(hào)A61K9/02GK1853618SQ20051004629
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者范曉, 馬成俊, 韓麗君, 史大永, 柳全文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所