專利名稱：一種注射型組織工程骨修復(fù)材料及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法構(gòu)建人工器官技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種注射型組織工程骨及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
目前，組織工程骨大多構(gòu)建為支架材料負載細胞生長因子再復(fù)合種子細胞的模式。支架材料和生長因子的選擇是組織工程學(xué)研究的重點內(nèi)容。支架材料作為種子細胞載體，有負載細胞和緩釋生長因子的作用，目前常用的支架材料多為固體類材料，其在組織工程骨的構(gòu)建中已取得了令人矚目的效果。但是，也不同程度地存在難以塑形、負載生長因子和種子細胞操作復(fù)雜、負載率不高、細胞易流失等缺陷。因此，注射型或水凝膠類材料是目前骨組織工程研究的熱點。生長因子在組織工程骨構(gòu)建與應(yīng)用中的作用是明顯確切的。以往多采用單一的生長因子進行研究，但單一的生長因子無法發(fā)揮多因子的協(xié)同作用，其效果也是較為有限的。采用多因子聯(lián)合應(yīng)用較單一的生長因子的成骨效果更佳，但不同生長因子之間如何匹配，不同生長因子之間的最佳比例都有待研究，而且純化的生長因子在不同程度上都存在制備復(fù)雜、成本高、具有一定免疫原性等缺點。因此雖然生長因子在骨科基礎(chǔ)研究領(lǐng)域雖已取得大量研究成果，但在臨床上仍無法得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種注射型組織工程骨修復(fù)材料，該骨修復(fù)材料為可注射性材料負載自體PRP再復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細胞構(gòu)成，可任意塑形且復(fù)合細胞簡便，且使用自體細胞生長因子，不存在免疫排斥問題，在一定時間內(nèi)可完全降解吸收，誘導(dǎo)成骨效應(yīng)明顯，成本較低廉。
本發(fā)明所述的一種注射型組織工程骨修復(fù)材料，包括載體支架和種子細胞，種子細胞附著于載體支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，以可注射性材料殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物作為載體支架，復(fù)合富血小板血漿PRP以及種子細胞；所述的種子細胞為骨髓基質(zhì)干細胞。
所述的可注射材料殼聚糖-β-磷酸三鈣優(yōu)選為將殼聚糖與β-磷酸三鈣按1ml∶0.6g的比例于體外復(fù)合形成的殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物。
所述的殼聚糖優(yōu)選是用檸檬酸作為交聯(lián)劑處理后形成有機網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的殼聚糖。
所述的骨髓基質(zhì)干細胞優(yōu)選為經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細胞。
所述的PRP是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種注射型組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，包括以下步驟A.材料準(zhǔn)備(1)種子細胞抽取骨髓，以全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞，所用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細胞經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級；(2)自體RPR取自體靜脈血，以二次離心法提取富血小板血漿即PRP，置-70℃保存?zhèn)溆茫?3)氯化鈣-凝血酶混合溶液配制1ml 10％氯化鈣內(nèi)含1000U凝血酶；B.殼聚糖-β-磷酸三鈣可注射材料的制備將殼聚糖與β-TCP按1ml∶0.6g的比例于體外復(fù)合形成殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物；C.種子細胞與PRP的復(fù)合將培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細胞加入PRP，混合均勻；D.注射型組織工程骨修復(fù)材料的制備殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合8分鐘后立即加入步驟C的種子細胞與PRP的復(fù)合物，以及氯化鈣-凝血酶混合溶液，加入量比例為殼聚糖、β-TCP、PRP、氯化鈣-凝血酶按3ml∶1.8g∶0.3ml∶0.1ml，充分混勻，即獲得所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料。
所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法中，優(yōu)選的殼聚糖是用檸檬酸作為交聯(lián)劑處理后形成有機網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的殼聚糖。
本發(fā)明所采用的PRP是自體全血提取物，內(nèi)含多種生長因子，這些生長因子濃度配比與體內(nèi)正常比例相似，并且PRP制備簡便，價格低廉，自體PRP無毒、無免疫原性，是較為理想的符合臨床應(yīng)用需要的生長因子來源。
傳統(tǒng)的生物材料與生長因子復(fù)合，多是采用材料與生長因子直接浸泡的方法，采用這種方法構(gòu)建的材料上雖然含有生長因子，但生長因子與材料附著不牢固，易流失。將藥物控釋技術(shù)引入組織工程后，即在骨支架材料內(nèi)采用緩釋載體負載生長因子，這種方法雖可以達到生長因子緩慢釋放，增強生長因子的有效作用，但這種負載生長因子的組織工程骨體系構(gòu)建較為復(fù)雜。在固態(tài)材料與PRP復(fù)合上也存在如此問題，通常的制備方法是先將PRP與凝血酶復(fù)合制成凝膠后再與固態(tài)支架復(fù)合，這種方法PRP與材料間復(fù)合不是很牢固，復(fù)合的PRP在體內(nèi)也難以避免因血液的沖刷而流失。本發(fā)明所采用的殼聚糖與β-TCP混和后最初為液態(tài)，并逐漸凝固為固態(tài)。在材料為液態(tài)時加入PRP，將PRP與材料混合均勻，復(fù)合PRP的材料立即與含有氯化鈣的凝血酶混合，材料內(nèi)的氯化鈣、凝血酶與PRP混合后可以促進血小凝集，使血小板釋放PDGF、IGF等多種生長因子?？勺⑸涞臍ぞ厶桥cβ-TCP復(fù)合PRP的優(yōu)點在于在材料為液態(tài)時復(fù)合PRP簡便易行，PRP在材料內(nèi)復(fù)合均勻，且材料凝固后材料與PRP混為一體，材料內(nèi)的PRP不易流失，確保了材料植入體內(nèi)后PRP能在骨缺損處局部釋放較高濃高的生長因子。
本發(fā)明所采用的PPR是經(jīng)二次離心法制備出來的，其血小板濃度較全血提高了4倍多，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合PRP的材料在第4天時已明顯促進BMSCs的增殖。實驗結(jié)果表明PRP這種復(fù)合方式可以促使PRP內(nèi)生長因子的釋放，并起到促進BMSCs的增殖作用，這說明PRP作為可注射性材料殼聚糖-β-TCP中的生長因子是可行的。采用這種方式復(fù)合的PRP在體內(nèi)具有促進骨再生的效果，以這種復(fù)合材料構(gòu)建的可注射組織工程骨具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1為空白對照組BMSCs復(fù)合培養(yǎng)第6天倒置顯微鏡觀察(×100)照片。
圖2為殼聚糖-β-TCP與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)第6天倒置顯微鏡觀察(×100)照片。
圖3為殼聚糖-β-TCP/PRP與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)第6天倒置顯微鏡觀察(×100)照片。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的一種注射型組織工程骨修復(fù)材料，包括載體支架和種子細胞，種子細胞附著于載體支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，以可注射性材料殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物作為載體支架，復(fù)合富血小板血漿PRP以及種子細胞；所述的種子細胞為骨髓基質(zhì)干細胞。
所述的可注射材料殼聚糖-β-磷酸三鈣優(yōu)選為將殼聚糖與β-磷酸三鈣按1ml∶0.6g的比例于體外復(fù)合形成的殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物。
所述的殼聚糖優(yōu)選是用檸檬酸作為交聯(lián)劑處理后形成有機網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的殼聚糖。
所述的骨髓基質(zhì)干細胞優(yōu)選為經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細胞。
所述的PRP是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
實施例一種子細胞的培養(yǎng)取5月齡健康中國青山羊(體重35.0～40kg，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，麻醉后無菌操作下用16號骨穿針行髂骨穿刺，多點穿刺抽取骨髓10mL，離心并用100目鋼網(wǎng)過濾后接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)，置于CO2孵箱(美國Harris公司)內(nèi)進行培養(yǎng)，每3天換液，待原代細胞長滿瓶底，用0.25％胰酶-0.02％DMEM液將貼壁細胞消化分離，加完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天換液。
實施例二富血小板血漿(PRP)的制備用裝有1ml 10％枸櫞酸鈉抗凝劑的注射器抽取羊靜脈血10ml，搖勻，置入離心管中，采用二次離心法制備PRP(黃愛文，金丹，裴國獻，陳書軍，胡稷杰，林海寧，曾憲利，復(fù)合富血小板血漿(PRP)的可注射型組織工程骨的構(gòu)建及其修復(fù)兔橈骨缺損的放射學(xué)評估，中華創(chuàng)傷骨科雜志，2005，7(4)363-367.)。每10ml全血約制成1ml PRP，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 實施例三注射型組織工程骨修復(fù)材料的制備取第3代BMSCs(種植密度2×104/孔)接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加入培養(yǎng)基0.6ml。
可注射型殼聚糖、β-磷酸三鈣(β-TCP)材料由暨南大學(xué)材料科學(xué)與工程系提供。將3ml殼聚糖、1.8gβ-TCP于體外復(fù)合8min后，依次將0.3mlPRP，0.1ml凝血酶(10％氯化鈣內(nèi)含100U凝血酶)加入液態(tài)的殼聚糖-β-TCP中，充分混勻，制備成殼聚糖-β-TCP/PRP復(fù)合物。
注射型組織工程骨修復(fù)材料的制備實驗分為3組，即殼聚糖-β-TCP/PRP組、單純殼聚糖-β-TCP組和空白對照組。其中殼聚糖-β-TCP/PRP組、單純殼聚糖-β-TCP組每孔加5mm×5mm×3mm的固化成形的殼聚糖-β-TCP/PRP或單純殼聚糖-β-TCP與細胞混合培養(yǎng)，對照組單純接種細胞，每個時間點每組各5孔，于不同時間進行倒置顯微鏡觀察(Nikon公司)及MTT(Sigma公司)檢測。
實施例四倒置顯微鏡觀察逐日使用倒置顯微鏡觀察各組細胞生長情況。
細胞接種后(1)空白對照組4小時后細胞有部分貼壁，12小時后完全貼壁，細胞呈多角形、梭形，散在分布；空白對照組BMSCs復(fù)合培養(yǎng)第6天的結(jié)果如圖1所示。
(2)殼聚糖-β-TCP/PRP組材料周邊細胞生長較快，6～7天時匯合成單層；殼聚糖-β-TCP與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)第6天的結(jié)果如圖2所示。
(3)材料組(單純殼聚糖-β-TCP組)細胞生長與對照組相似，8～10天細胞匯合成單層，所有組細胞形態(tài)正常；殼聚糖-β-TCP/PRP與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)第6天的結(jié)果如圖3所示。
實施例五MTT法測定細胞增殖按上述方法接種細胞后，于第2、4、6、8天棄原培養(yǎng)基，加入無血清DMEM 1ml和MTT(5mg/ml)100μl，37℃CO2孵箱內(nèi)孵育4小時后，小心吸去MTT，加入二甲基亞砜0.5ml，振蕩15min，酶標(biāo)儀上選擇波長570nm，測定光吸收值。
隨培養(yǎng)時間的延長，各組D570逐漸增加，到第8天最高，殼聚糖-β-TCP組在各時間點與空白對照組均無顯著性差異(P＞0.05)。殼聚糖-β-TCP/PRP組在第4天時與殼聚糖-β-TCP組和空白對照組已有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。
表1各組MTT法測定吸光度值(n＝5 x±s)Tab 1 absorbance determined by MTT assay in three groups(n＝5，x±s)

*P＜0.05、**P＞0.05 vs空白對照組，#P＜0.05、##P＞0.05 vs殼聚糖-β-TCP組統(tǒng)計方法所測數(shù)據(jù)在SPSS10.0上進行方差統(tǒng)計分析，P值小于0.05時為有統(tǒng)計學(xué)差異。
權(quán)利要求
1.一種注射型組織工程骨修復(fù)材料，包括載體支架和種子細胞，種子細胞附著于載體支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，其特征在于以可注射性材料殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物作為載體支架，復(fù)合富血小板血漿PRP以及種子細胞；所述的種子細胞為骨髓基質(zhì)干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料，其特征在于所述的可注射材料殼聚糖-β-磷酸三鈣為將殼聚糖與β-磷酸三鈣按1ml∶0.6g的比例于體外復(fù)合形成的殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料，其特征在于所述的殼聚糖是用檸檬酸作為交聯(lián)劑處理后形成有機網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料，其特征在于所述的骨髓基質(zhì)干細胞為經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料，其特征在于所述的PRP是取自自體靜脈血，以二次離心法提取而得的富血小板血漿。
6.如權(quán)利要求1所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A.材料準(zhǔn)備(1)種子細胞抽取骨髓，以全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞，所用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細胞經(jīng)傳代增殖培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級；(2)自體RPR取自體靜脈血，以二次離心法提取富血小板血漿即PRP，置-70℃保存?zhèn)溆茫?3)氯化鈣-凝血酶混合溶液配制1ml 10％氯化鈣內(nèi)含1000U凝血酶；B.殼聚糖-β-磷酸三鈣可注射材料的制備將殼聚糖與β-TCP按1ml∶0.6g的比例于體外復(fù)合形成殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合物；C.種子細胞與PRP的復(fù)合將培養(yǎng)至第三代107數(shù)量級的骨髓基質(zhì)干細胞加入PRP，混合均勻；D.注射型組織工程骨修復(fù)材料的制備殼聚糖-β-磷酸三鈣復(fù)合8分鐘后立即加入步驟C的種子細胞與PRP的復(fù)合物，以及氯化鈣-凝血酶混合溶液，加入量比例為殼聚糖、β-TCP、PRP、氯化鈣-凝血酶按3ml∶1.8g∶0.3ml∶0.1ml，充分混勻，即獲得所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的注射型組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法，其特征在于所述的殼聚糖是用檸檬酸作為交聯(lián)劑處理后形成有機網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的殼聚糖。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法制備人工器官技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種注射型組織工程骨修復(fù)材料及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所述的一種注射型組織工程骨修復(fù)材料，包括載體支架和種子細胞，種子細胞附著于載體支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生理活性的復(fù)合體，以可注射性材料殼聚糖－β－磷酸三鈣復(fù)合物作為載體支架，復(fù)合富血小板血漿PRP以及種子細胞；所述的種子細胞為骨髓基質(zhì)干細胞。本發(fā)明還提供一種注射型組織工程骨修復(fù)材料的構(gòu)建方法。本發(fā)明所述的一種注射型組織工程骨修復(fù)材料可任意塑形且復(fù)合細胞簡便，且使用自體細胞生長因子，不存在免疫排斥問題，在一定時間內(nèi)可完全降解吸收，誘導(dǎo)成骨效應(yīng)明顯，成本較低廉。
文檔編號A61L31/00GK1923300SQ20051003696
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者裴國獻, 金丹, 程文俊 申請人:南方醫(yī)院