專利名稱：日本血吸蟲雙價dna疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人獸共患寄生蟲病核酸疫苗，特別是針對血吸蟲病的核酸疫苗。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是危害人類健康，影響國家經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患寄生蟲病，據(jù)1990年WHO資料，血吸蟲病呈全球分布，在74個國家大約6億人受到威脅，2億人受到不同程度的感染，其中約1.2億是現(xiàn)癥患者，0.2億出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。WHO/TDR在上世紀70年代將血吸蟲病列為六大熱帶病之一。我國為日本血吸蟲病(schistosomiasis japonica)流行區(qū)，是日本血吸蟲病4個流行國(中國、菲律賓、印尼、日本)中最嚴重的國家，也是全球血吸蟲病危害最嚴重的4個國家(埃及、蘇丹、中國、巴西)之一。我國的血吸蟲病主要流行于長江流域及以南的江蘇、浙江、安徽、江西、福建、上海、湖南、湖北、廣東、廣西、云南、四川等12個省、自治區(qū)、直轄市的370個縣市，累計感染者達1160萬人，釘螺面積為143億m2，受威脅人群在1億以上。
目前我國防治血吸蟲病的基本方針是“積極防治、綜合措施、因時因地制宜”。指積極治療病人和開展各種預(yù)防措施，采取治療病人、病畜、滅螺、防護、糞管、水管及宣傳教育同時進行的措施，因時因地制宜是指在不同類型流行區(qū)，根據(jù)不同的流行因素，采取不同的防治策略。雖然已取得顯著的成效，但仍然未能完全控制。究其原因主要是日本血吸蟲是一種人獸共患寄生蟲，保蟲宿主繁多，且釘螺廣泛存在，使該病難以徹底阻斷傳播；此外，盡管吡喹酮反復(fù)群體化療是安全、有效的防治手段，但是，藥物對已經(jīng)形成的蟲卵肉芽腫沒有作用，且疫水接觸者可重復(fù)感染。重復(fù)化療和長期的監(jiān)測措施需要昂貴的費用和大批專業(yè)技術(shù)人員，且不能排除血吸蟲有潛在的抗藥性的危險。所有這些因素促使人們研究控制日本血吸蟲病的輔助或替代方法。
自從30年代采用成蟲或尾蚴乳劑作人工免疫研究以來，血吸蟲疫苗研究已有70多年歷史，經(jīng)歷了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗。減毒活疫苗雖可刺激機體產(chǎn)生細胞毒性T細胞(CTL)和輔助性T細胞(Th)及增強體液免疫等多種保護性反應(yīng)，但接種時可引起免疫抑制，減毒不充分可導(dǎo)致臨床感染，減毒過強又可使疫苗效價降低，且有回復(fù)為有毒株的潛在危險，還受到疫苗抗原材料來源的限制。死疫苗和基因工程疫苗比較安全，但免疫原性較低，只能產(chǎn)生Th和體液免疫應(yīng)答，不能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，而且基因工程疫苗要經(jīng)過基因克隆、表達和蛋白純化等復(fù)雜過程，技術(shù)難度大，成本較高。因此，需要尋找一種更好的可以彌補現(xiàn)有疫苗缺點的新方法，核酸疫苗應(yīng)運而生。
自1990年Wolff等首次報道了小鼠肌肉注射質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒及其攜帶的基因可被肌細胞攝取并進行表達，人們陸續(xù)制備出許多單價DNA疫苗，盡管可以產(chǎn)生特異性抗體，但與致弱尾蚴產(chǎn)生的高保護力相比，單價DNA疫苗的免疫保護效果并不令人滿意。血吸蟲是一種多細胞生物，抗原成分復(fù)雜，在長期與宿主共同進化的過程中產(chǎn)生了多種免疫逃避機制，單一抗原分子很難產(chǎn)生針對不同蟲期的完全免疫力；為了提高疫苗的免疫保護性，人們逐漸開始研究抗血吸蟲多價DNA疫苗。白細胞介素12(IL-12)以其對免疫系統(tǒng)獨特的調(diào)節(jié)作用，尤其受到DNA疫苗研究者的重視，目前已有IL-12作為血吸蟲DNA疫苗佐劑的研究報道，均不同程度地增強了疫苗誘導(dǎo)的免疫力。但外源IL-12與人體內(nèi)產(chǎn)生的IL-12有較高的同源性，會干擾人體自身的免疫調(diào)控系統(tǒng)，增加DNA疫苗的不安全因素。日本血吸蟲23KD抗原(Sj23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(SjFABP)都是有希望的疫苗候選分子，以Sj23和SjFABP基因為目的片段構(gòu)建的單價DNA疫苗都有較好的免疫保護力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供日本血吸蟲雙價DNA疫苗及其制備方法，以獲得安全、高效、制備簡單、性能穩(wěn)定、不需冷藏系統(tǒng)，利于儲存運輸和使用方便，一次免疫能產(chǎn)生較為持久的免疫保護效果的血吸蟲雙價DNA疫苗。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是日本血吸蟲雙價DNA疫苗，包括真核表達載體和插入到真核表達載體的多克隆位點上的目的基因，目的基因為Sj23和SjFABP(其核苷酸序列見Mol.Biochem.Parasitol.1991，48(1)67-75.“Further characterisation of theSchistosoma japonicum protein Sj23 a target antigen of an immunodiagnostic monoclonalantibody”和《中國人獸共患病雜志》2005，2114-17..“日本血吸蟲Sj14FABP與細胞因子IL-12重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達”)，真核表達載體為具有兩套翻譯單位的真核表達載體，Sj23和SjFABP分別插入到具有兩套翻譯單位的真核表達載體的多克隆位點上，構(gòu)建日本血吸蟲雙價DNA疫苗。
上述Sj23插入到真核表達載體的強表達多克隆位點上，SjFABP插入到真核表達載體的弱表達多克隆位點上。
或者，上述SjFABP插入到真核表達載體的強表達多克隆位點上，Sj23插入到真核表達載體的弱表達多克隆位點上。
所說的真核表達載體為pVIVO2-mcs。
日本血吸蟲雙價DNA疫苗的制備方法以上游P1CGG GAT CCA ATG GCG ACT TTGGGT ACT、下游P2CGCGAA TTCTTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG為引物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對Sj23雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對真核表達載體pVIVO2-mcs進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-Sj23質(zhì)粒；以上游P3GCATCA TGAATG TCT TCT TTC TTG G、下游P4CGTCCT AGG TGACCA GTC TATCAG T為引物，用限制性內(nèi)切酶BspH I和AvRII對SjFABP雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BspH I和AvR II對pVIVO2-mcs-Sj23質(zhì)粒進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP質(zhì)粒即為日本血吸蟲雙價DNA疫苗；或者以上游P1CGTGGATCCATG TCT TCT TTC TTG、下游P2GACGAA TTCTGA CCA GTC TAT CAG T為引物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對SjFABP雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoRI對真核表達載體pVIVO2-mcs進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-SjFABP質(zhì)粒；以上游P3CGT CAT GAA ATG GCG ACT TTG GGT A、下游P4CCGCCT AGGTTA AACATT CTG ATA ATC GTG為引物，用BspH I和AvRII對sj23雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BspH I和AvR II對pVIVO2-mcs-SjFABP質(zhì)粒進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-sjFABP-Sj23質(zhì)粒即為日本血吸蟲雙價DNA疫苗；其中引物的下劃線表示對應(yīng)的酶切位點。
日本血吸蟲Sj23的核苷酸序列長度656bp分子類型cDNA來源日本血吸蟲大陸株atggcgact ttgggtactg ggatgaggtg tctgaagagt tgtgtgttca tattgaacattatctgtctg ttatgttccc ttgtattaat aggcgctggt gcatatgtag aagttaaattcagccagtat gaggctaatt tacataaagt ctggcaggcg gctcccatcg caattattgtggttggagtg gtaattctca tagtaagctt cttgggctgt tgtggagcta taaaggaaaacgtctgcatg ctttacatgt atgcattttt ccttattgtc cttctgattg ctgagttggtcgccgccatt gttgcggtgg tgtacaagga taaaatcgat gacgaaatta atacactaatgactggtgct ctggaaaatc caaacgagga aataacggca accatggata agatacaaacatcattccat tgttgtggag tcaaaggtcc agacgattat aaagggaatg tgccagcatcatgtaaagaa gggcaagaag tttatgttca gggttgtcta tctgtcttta gtgcattcttaaaacgcaac ttaataattg ttgcctgtgt ggcattcggt gtatgcttct tccaactgctaagcatcgtt atagcttgtt gtttgggtca acgaatacac gattatcaga atgtttaa日本血吸蟲SjFABP的核苷酸序列長度398bp分子類型cDNA來源日本血吸蟲大陸株atg tcttctttct tgggaaagtggaaactaagc gaatcacaca acttcgatgc tgttatgtca aagctcggtg tctcgtgggcgacccgacaa attgggaaca cagtgacgcc aactgtcact ttcacaatgg atggggatacgatgaccatg ctgacagagt cgactttcaa gaacctctca gtcacgttca aatttggtgaggaatttgac gagaaaacca gtgatggcag aagcgttaag tcagtcgtta ccaaagattcagagtcaaag ataactcaca ctcaaaagga tagtaagaac acaactgtaa tcgttcgtgaaatagtaggt gatactatga aaactactgt aactgtcgat gatgttacgg ctattcggaattacaaacga ttgtaa


圖1為本發(fā)明所用載體pVIVO2-mcs的質(zhì)粒譜圖。
圖2為本發(fā)明PCR產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。
圖3(A)為本發(fā)明兩種雙價DNA疫苗雙酶切(Avr II+BspH I)圖。
圖3(B)為本發(fā)明兩種雙價DNA疫苗雙酶切(EcoR I+BamH I)圖。
圖4熒光顯微鏡下觀察雙價DNA疫苗在HEK-293細胞胞膜和胞漿中的表達(間接免疫熒光法×400)。
具體實施例方式
實施例1單價DNA疫苗的制備1.PCR引物設(shè)計與合成根據(jù)Sj23、SjFABP基因序列各設(shè)計2對引物(引物長度范圍15-30個核苷酸)，每條引物的5端分別引入下列酶切位點(下劃線表示)，引物由上海生工公司代為合成Sj23(1)上游P1CGG GAT CCA ATG GCG ACT TTG GGT ACTBamH I下游P2CGCGAA TTCTTA AAC ATT CTG ATA ATC GTGEcoR ISjFABP(1)上游P1CGTGGA TCCATG TCT TCT TTC TTG BamH I下游P2GACGAA TTCTGA CCA GTC TAT CAG TEcoR I2.SjFABP和Sj23目的基因的制備1)PCR總反應(yīng)體系為50μl，反應(yīng)體系如下10×DNA聚合酶緩沖液 5.0μl10mM單核苷酸 4.0μlpVIVO2-Sj23(pVIVO2-SjFABP)1.0μl(約0.5μg)引物P1(20μM) 1.0μl引物P2(20μM) 1.0μlDNA多聚酶(5U/μl) 1μl雙蒸水37μl總體積50.0μlpVIVO2-Sj23參見《中華醫(yī)學(xué)雜志》2005，85193-197.甘燕等“重組核酸疫苗誘導(dǎo)小鼠抗血吸蟲感染的免疫學(xué)研究”；pVIVO2-SjFABP參見《中國人獸共患病雜志》2005，2114-17“日本血吸蟲Sj14FABP與細胞因子IL-12重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達”。
PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為95℃變性5分鐘，以94℃(90-97℃)變性1分鐘(5秒-1.5分鐘)，55℃(30-60℃)復(fù)性1分鐘(10秒-1.5分)，72℃延伸2分鐘(30秒-5分鐘)，循環(huán)35(20-40)次，最后72℃10分鐘終止反應(yīng)。取5ul反應(yīng)液經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。
2)Sj23(或SjFABP)目的片段的酶切回收Sj23(或SjFABP)的兩次RT-PCR產(chǎn)物合并于1.5ml Ep管中，加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積無水乙醇，-20℃過夜；室溫下14000rpm離心10min，棄上清，沉淀物用70％乙醇洗滌一次；室溫干燥后，加入48μl ddH2O溶解DNA沉淀。雙酶切反應(yīng)體系如下BamH I(10U/μl) 3.0μlEcoR I(10U/μl) 3.0μl10×K緩沖液 6.0μlSj23(或SjFABP) 48.0μl總體積60μl，37℃水浴酶切2h。
產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用潔凈的手術(shù)刀片切下大小約670bp和440bp的DNA條帶，按膠回收試劑盒操作說明回收Sj23(或SjFABP)片段，具體步驟如下①切下的凝膠放入EP管，體積約200μl，加入3倍體積Binding Buffer，55～65℃孵育7min，每2～3min振蕩一次使膠溶解。
②將柱子接在一潔凈2ml收集管中，加750ulDNA/凝膠混合液，10000g，室溫離心1min，棄掉液體。如果混合液的體積大于800ul，應(yīng)分次離心，每次為750ul。
③加入300ul Binding Buffer洗柱。即10000g，室溫離心1min。
④在柱子中加入750ul乙醇稀釋的Wash Buffer，室溫靜置2～3min。10000g，室溫離心1min洗柱。
⑤棄掉液體，重復(fù)第④步再洗一次。
⑥棄掉液體，10000g，室溫離心空柱1min。
⑦將柱子接在一潔凈1.5ml EP，加入50ul ddH2O，10000g，室溫離心1min洗脫DNA，于-20℃保存。
⑧取2ul樣品測定DNA含量。
3.單價DNA疫苗的構(gòu)建和鑒定1)pVIVO2-mcs載體的制備pVIVO2-mcs購自Invitrogen公司(序列和物理譜圖見該公司的產(chǎn)品目錄)，為5.8kb，是具有兩套翻譯單位的多基因表達載體，可以在同一個載體上非融合表達兩個目的基因(參見圖1，其中MCS2為強表達多克隆位點，MCS1為弱表達多克隆位點)。
將含有pVIVO2-mcs的GT110菌種分別接種至5ml TB(LB，100μg/ml潮霉素)培養(yǎng)基中，37℃，180rpm振搖培養(yǎng)過夜，按E.Z.N.A.Plasmid Miniprep Kit操作說明提取質(zhì)粒pVIVO2-mcs。具體步驟如下①取約0.5ml菌液保種，剩下菌液轉(zhuǎn)移入Ep管中，10000rpm，離心2min。小心吸去上清。
②加入250ul溶液I/核糖核酸酶A懸浮細菌，輕輕吹打，使沉淀充分重懸。
③加入250ul溶液II，輕輕顛倒并旋轉(zhuǎn)試管4～6次至溶液變?yōu)槌吻?，室溫靜置2min。避免劇烈振搖。
④加入350ul溶液III，輕輕顛倒數(shù)次直至白色絮狀沉淀出現(xiàn)。10000g，室溫離心10min。
⑤將柱子接在2ml收集管上，小心吸取上清加入蘭色柱子。確保沒有沉淀和細胞碎片加入柱子。10000g，室溫離心1min使溶菌液經(jīng)過柱子。
⑥棄掉液體，加入500ul HB緩沖液，10000g室溫離心1min洗柱。這一步可確保去掉殘余的污染蛋白以得到高純度的DNA。
⑦棄掉液體，加入750ul洗劑/乙醇，室溫離心1min，棄掉液體。用750ul洗劑重復(fù)洗一次。
⑧10000g室溫離心空柱1min使柱子干燥。
⑨將柱子接在潔凈1.5ml EP管上，加入50ul ddH2O，室溫離心1min洗脫DNA，于-20℃保存。
⑩取2ul測定DAN含量。
2)雙酶切反應(yīng)以限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對提取質(zhì)粒pVIVO2-mcs進行雙酶切，37℃水浴反應(yīng)2h，1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大片段，方法同上，測定含量后-20℃保存。
3)連接反應(yīng)體系1pVIVO2-mcs+Sj23溶液I 10.0μlpVIVO2-mcs(0.04μg/μl)6.0μlSj23(0.04μg/μl) 4.0μl體系2pVIVO2-mcs+SjFABP溶液I 10.0μlpVIVO2-mcs(0.04μg/μl)6.0μlSjFABP(0.04μg/μl)4.0μl分別混勻后，于16℃水浴連接過夜，然后置-20℃保存。
4)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli GT110的制備參見《分子克隆》(科學(xué)出版社，2002年三版)。取6μl連接產(chǎn)物加至50μl感受態(tài)細胞中，輕柔混勻，冰浴30min，42℃熱休克90s，立即置冰上2min，加入450μl 37℃預(yù)熱的無抗菌素的LB培養(yǎng)基，置37℃150rpm振搖培養(yǎng)1h，取50-200μl菌液涂于TB平板，37℃培養(yǎng)過夜。
5)重組子的篩選從平板上挑取單個轉(zhuǎn)化子菌落接種至含潮霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，小量快速提取質(zhì)粒，用BamH I和EcoR I進行雙酶切后電泳鑒定，同時酶切空載體質(zhì)粒作對照。以重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-SjFABP和pVIVO2-mcs-Sj23為模板，按前述擴增條件進行PCR擴增，鑒定有無陽性擴增條帶。
6)Sj23和SjFABP核苷酸序列測定以重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-SjFABP為測序模板，用Sj23和SjFABP特異性引物，經(jīng)上海生工生物技術(shù)公司用ABI PRISMTM377 DNA測序儀測序。
實施例2雙價DNA疫苗的制備1.PCR引物設(shè)計與合成根據(jù)Sj23、SjFABP基因序列各設(shè)計2對引物，每條引物的5′端分別引入下列酶切位點(下劃線表示)，引物由上海生工公司代為合成Sj23(2)上游P3CGT CAT GAA ATG GCG ACT TTG GGT ABspH I下游P4CCGCCT AGGTTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG AvR IISjFABP(2)上游P3GCATCA TGAATG TCT TCT TTC TTG G BspH I下游P4CGTCCT AGGTGA CCA GTC TAT CAG T AvR II引物長度范圍10-35個核苷酸2.SjFABP和Sj23目的基因的制備1)PCR總反應(yīng)體系為50μl，反應(yīng)體系如下10×DNA多聚緩沖液5.0μl10mM單核苷酸 4.0μlpVIVO2-Sj23(pVIVO2-SjFABP) 1.0μl(約0.5μg)引物P3(20μM)1.0μl引物P4(20μM)1.0μlDNA多聚酶(5U/μl)1.0μl雙蒸水 37μl總體積 50.0μlPCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為95℃變性5分鐘，以94℃(90-97℃)變性1分鐘(5秒-1.5分鐘)，55℃(30-60℃)復(fù)性1分鐘(10秒-1.5分)，72℃延伸2分鐘(30秒-5分鐘)，循環(huán)35(20-40)次，最后72℃10min終止反應(yīng)。取5ul反應(yīng)液經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。
2)Sj23(或SjFABP)目的片段的酶切回收Sj23(或SjFABP)的兩次RT-PCR產(chǎn)物合并于1.5ml Ep管中，加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積無水乙醇，-20℃過夜；室溫下14000rpm離心10min，棄上清，沉淀物用70％乙醇洗滌一次；室溫干燥后，加入51μl ddH2O溶解DNA沉淀。單酶切反應(yīng)體系如下AvR II(10U/μl) 3.0μl10×K緩沖液 6.0μlSj23(或SjFABP)51.0μl總體積60μl，37℃水浴酶切2h。在此酶切體系中加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積無水乙醇，-20℃過夜；室溫下14000rpm離心10min，棄上清，沉淀物用70％乙醇洗滌一次；室溫干燥后，加入51μl ddH2O溶解DNA沉淀。再次進行單酶切BspH I(10U/μl) 3.0μl10×O+緩沖液 6.0μlSj23(或SjFABP) 51.0μl產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用潔凈的手術(shù)刀片切下大小約670bp和440bp的DNA條帶，按膠回收試劑盒操作說明回收Sj23(或SjFABP)片段，具體步驟如下①切下的凝膠放入EP管，體積約200μl，加入3倍體積Binding Buffer，55～65℃孵育7min，每2～3min振蕩一次使膠溶解。
②將柱子接在一潔凈2ml收集管中，加750ulDNA/凝膠混合液，10000g，室溫離心1min，棄掉液體。如果混合液的體積大于800ul，應(yīng)分次離心，每次為750ul。
③加入300ul Binding Buffer洗柱。即10000g，室溫離心1min。
④在柱子中加入750ul乙醇稀釋的洗液，室溫靜置2～3min。10000g，室溫離心1min洗柱。
⑤棄掉液體，重復(fù)第④步再洗一次。
⑥棄掉液體，10000g，室溫離心空柱1min。
⑦將柱子接在一潔凈1.5ml EP，加入50ul ddH2O，10000g，室溫離心1min洗脫DNA，于-20℃保存。
⑧取2ul樣品測定DNA含量。
3.雙價DNA疫苗的構(gòu)建1)雙酶切反應(yīng)以限制性內(nèi)切酶BspH I和AvRII對提取質(zhì)粒pVIVO2-mcs和Sj23(SjFABP)的連接產(chǎn)物pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-SjFABP進行雙酶切，37℃水浴反應(yīng)2h，1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大片段，方法同上，測定含量后-20℃保存。
2)連接反應(yīng)體系1pVIVO2-mcs-Sj23+SjFABP溶液I 10.0μlpVIVO2-mcs-Sj23(0.04μg/μl)6.0μlSjFABP(0.04μg/μl) 4.0μl體系2pVIVO2-mcs-SjFABP+Sj23溶液I 10.0μlpVIVO2-mcs-SjFABP(0.04μg/μl) 6.0μlSj23(0.04μg/μl) 4.0μl分別混勻后，于16℃水浴連接過夜，然后置-20℃保存。
3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli GT110的制備參見前述《分子克隆》。取6μl連接產(chǎn)物加至50μl感受態(tài)細胞中，輕柔混勻，冰浴30min，42℃熱休克90s，立即置冰上2min，加入450μl 37℃預(yù)熱的無抗菌素的LB培養(yǎng)基，置37℃150rpm振搖培養(yǎng)1h，取50-200μl菌液涂于TB平板，37℃培養(yǎng)過夜。
4)重組子的篩選從平板上挑取單個轉(zhuǎn)化子菌落接種至含潮霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，小量快速提取質(zhì)粒，用BspH I和AvR II進行雙酶切后電泳鑒定，同時酶切pVIVO2-mcs-SjFABP和pVIVO2-mcs-Sj23作對照。以重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP為模板，按前述擴增條件進行PCR擴增，鑒定有無陽性擴增條帶。
5)Sj23和SjFABP核苷酸序列測定以重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP為測序模板，用Sj23和SjFABP特異性引物，經(jīng)上海生工生物技術(shù)公司用ABI PRISMTM377 DNA測序儀測序。
4.雙價DNA疫苗構(gòu)建的鑒定1)日本血吸蟲Sj23和SjFABP基因的PCR擴增取5μl的PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳(含0.5μg/μl的EB)，結(jié)果可見兩條清晰的擴增條帶，擴增片段分子大小為與SjFABP和Sj23一致，分別是440bp和670bp，見圖2；圖中1.小Marker；2.SjFABP(以pVIVO2-SjFABP為模板的PCR產(chǎn)物)；3.Sj23(以pVIVO2-Sj23為模板的PCR產(chǎn)物)。
2)質(zhì)粒DNA的鑒定結(jié)果 酶切鑒定及電泳分析取經(jīng)過PCR擴增鑒定的數(shù)個重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP(和pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23)，用雙酶切鑒定，小片段的分子量分別與SjFABP和Sj23相一致，是440bp和670bp。結(jié)果見圖3(A)[其中4.DNA Marker、5.pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23雙酶切(Avr II+BspH I)、6.pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP雙酶切(Avr II+BspH I)]、圖3(B)[其中7.DNA Marker、8.pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23雙酶切(EcoRI+BamH I)、9.pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP雙酶切(EcoR I+BamH I)、10.pVIVO2-mcs-SjFABP雙酶切(EcoR I+BamH I)、11.pVIVO2-mcs-Sj23雙酶切(EcoR I+BamH I)]。測序結(jié)果，pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP和pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23中插入Sj23或SjFABP與Mol.Biochem.Parasitol.1991，48(1)67-75.“Furthercharacterisation of the Schistosoma japonicum protein Sj23 a target antigen of animmunodiagnostic monoclonal antibody”和《中國人獸共患病雜志》2005，2114-17..“日本血吸蟲Sj14FABP與細胞因子IL-12重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達”中的Sj23或SjFABP片段大小一致，結(jié)果提示雙價DNA疫苗構(gòu)建成功。
3)重組質(zhì)粒目的基因序列測定及分析測序結(jié)果顯示插入的Sj23目的片段編碼基因全長656bp，SjFABP目的片段編碼基因全長399bp，同文獻報道的序列同源性為100％。結(jié)果提示目的片段插入正確。
實施例3本發(fā)明效果評價實驗1.質(zhì)粒DNA在體外的表達1).質(zhì)粒DNA的制備以O(shè)mega公司質(zhì)粒小量提取試劑盒制備兩種質(zhì)粒pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23及pVIVO2-mcs，方法同前。
2).轉(zhuǎn)染前HEK-293細胞的培養(yǎng)HEK-293細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。待細胞融合度達95％后用0.25％胰蛋白酶消化，1500rpm離心5min，棄上清，用少量無血清培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。取1ml細胞懸液加入細胞培養(yǎng)皿(直徑35mm)，每種質(zhì)粒均設(shè)一放置了蓋玻片的平皿，待細胞爬片生長。培養(yǎng)24h。
3).瞬時轉(zhuǎn)染按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000Reagent操作說明轉(zhuǎn)染細胞①細胞達到90-95％融合。
②各取4.0μg上述制備的3種質(zhì)粒DNA(5μl)分別加至250μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻。
③取lipofectamineTM2000 10μl加至250μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。
④將上述二液輕柔混合后室溫孵育20min。
⑤每個培養(yǎng)皿加入500μl上述混合液，顛倒混勻，37℃，5％CO2培養(yǎng)4-6h。
⑥換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。
⑦取出培養(yǎng)皿中的細胞爬片，加1％多聚甲醛固定20min，待玻片干燥后，置-20℃保存。
4)間接免疫熒光法檢測Sj23和SjFABP蛋白的表達①PBS洗滌細胞爬片3次，每次10min。
②0.2％TritonX-100透化固定后的細胞2min(室溫)。
③PBS洗滌4次，每次10min。
④加入3％BSA于37℃封閉30min。
⑤PBS洗滌3次，加小鼠感染血清(1∶20)至玻片上，4℃孵育過夜。
⑥PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶100)，37℃濕盒孵育2小時。PBS洗滌，適當(dāng)干燥后，以甘油∶PBS(1∶9)封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。
5)結(jié)果體外瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，間接免疫熒光染色顯示pVIVO2-SjFABP-Sj23轉(zhuǎn)染的細胞部分在胞漿和胞膜上有綠色熒光(參見圖4)，pVIVO2-mcs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞則未見熒光。結(jié)果提示雙價疫苗能在哺乳動物細胞內(nèi)合成目的蛋白。
2.質(zhì)粒DNA在小鼠體內(nèi)的表達1)免疫接種BALB/c小鼠6只雄性BALB/c小鼠分成3組，每組2只，注射前一天以0.75％鹽酸布比卡因30μl預(yù)處理，然后分別以pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23及pVIVO2-mcs質(zhì)粒經(jīng)股四頭肌免疫，100μg/只，免疫后14天，將其用4％多聚甲醛灌流固定，取注射部位股四頭肌做冰凍切片，厚度5-7μm，-20℃保存待檢。
2)間接免疫熒光法檢測抗原的表達間接免疫熒光檢測方法同前，以小鼠陽性感染血清作一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作二抗孵育，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
3)結(jié)果免疫組化反應(yīng)片，置于熒光顯微鏡下觀察可見某些肌細胞橫切面組織中胞膜及胞漿出現(xiàn)強熒光，而周圍肌細胞則未見熒光，陰性對照組未出現(xiàn)特異性熒光。表明有強熒光出現(xiàn)的肌細胞為特異性表達Sj23和SjFABP抗原的細胞。結(jié)果提示雙價DNA疫苗可在小鼠體內(nèi)表達。
3.免疫保護性試驗1)DNA疫苗的大量制備以Promega公司質(zhì)粒DNA提取和純化試劑盒大量制備質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj23-Sj14FABP、pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23、pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP及pVIVO2-mcs方法同前。
2).免疫方案70只雄性BALB/c小鼠隨機分成7組。每鼠經(jīng)股四頭肌內(nèi)側(cè)肌肉注射0.75％鹽酸布比卡因35μl預(yù)處理，隔天在相同部位分別注射A組，生理鹽水100μl/只；B組，pVIVO2-mcs 100μg/只；C組，pVIVO2-mcs-Sj23100μg/只；D組，pVIVO2-mcs-SjFABP 100μg/只；E組，pVIVO2-mcs-Sj23-Sj14FABP 100μg/只；F組，pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23100μg/只。其中，pVIVO2-mcs組為載體質(zhì)粒對照組，生理鹽水組為攻擊感染對照組。另設(shè)立G組pVIVO2-mcs-Sj23-Sj14FABP100μg/只和香菇多糖100μg/只，以觀察多糖佐劑(香菇多糖)與DNA疫苗聯(lián)合免疫能否提高小鼠抵抗日本血吸蟲攻擊感染的免疫保護力。其中，香菇多糖(下同)IR(cm-1)3405(O-H)，116,861(C-O)；UV-VIS(nm)197，MW 3.01×104。
3).攻擊感染免疫后30d，每鼠經(jīng)腹部皮膚感染40±2條日本血吸蟲尾蚴。
4).免疫保護效果的觀察攻擊感染后45d剖殺小鼠，肝門靜脈灌注法和壓片法收集成蟲并計數(shù)。每只小鼠從固定部位取肝組織1g，加入5％的KOH 20ml，于37℃孵箱中消化過夜，計數(shù)每克肝組織蟲卵數(shù)(EPG)。然后按下述公式計算減蟲率和減卵率。
減蟲率(％)＝(攻擊感染對照組平均檢獲成蟲數(shù)-免疫組平均檢獲成蟲數(shù))/攻擊感染對照組平均檢獲成蟲數(shù)×100％減卵率(％)＝(攻擊感染對照組平均EPG-免疫組平均EPG)/攻擊感染對照組平均EPG×100％5).肝臟病理學(xué)觀察攻擊感染后45d剖殺小鼠，觀察A、B、F和G組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫病理學(xué)變化。從固定部位切取小鼠肝組織一塊，用10％福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片，H.E.染色，低倍鏡下觀察其病理學(xué)變化，并用HPLAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行測量。每組隨機觀察50個蟲卵肉芽腫，按垂直方向測量蟲卵及其周圍炎癥反應(yīng)(肉芽腫)截面的兩個直徑(長徑和橫徑)，求出每組鼠肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑的均數(shù)，并測量每個蟲卵肉芽腫的面積。
6).統(tǒng)計方法用SAS軟件包對數(shù)據(jù)進行ANOVA檢驗分析。
7)結(jié)果①各實驗組減蟲減卵率，結(jié)果見表1。各疫苗組減蟲率和減卵率與空質(zhì)粒組相比，均有顯著性差異(P＜0.05)。多價DNA疫苗免疫保護力優(yōu)于同一目的分子構(gòu)建的單價DNA疫苗(P＜0.05)，雙價共表達質(zhì)?？烧T導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的抗血吸蟲免疫保護效果，其中pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23疫苗組減蟲率超過50％。雙價疫苗pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP和多糖佐劑聯(lián)合免疫組獲得68.89％的減蟲率和84.04％的減卵率，顯著高于單價和雙價疫苗單獨免疫組(P＜0.05)，是非常優(yōu)秀的抗血吸蟲病疫苗，具有很大的應(yīng)用價值。
表1實驗組和對照組成蟲數(shù)和每克肝組織蟲卵數(shù)

注*與鹽水對照組比較，P＞0.05；#與pVIVO2-mcs比較，P＜0.05；▲與pVIVO2-mcs-Sj23比較，P＜0.05；★與pVIVO2-mcs-Sj23比較，P＜0.05；◆與pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP比較，P＜0.05。
②肝臟的病理變化小鼠肝臟卵肉芽腫平均直徑和面積見表2，與pVIVO2組相比，pVIVO2-SjFABP-Sj23組和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP與香菇多糖混合組蟲卵肉芽腫面積減小率為33.34％和33.65％，兩實驗組間無顯著性差異(p＞0.05)。結(jié)果提示雙價疫苗在減少蟲卵個數(shù)的同時，還減輕了蟲卵引起的炎癥反應(yīng)，縮小了蟲卵肉芽腫的面積，具有抗病作用。香菇多糖無協(xié)同抗病作用。
表2各實驗組小鼠肝臟肉芽腫直徑和面積的比較(X±S)肝臟肉芽腫面積的變化

本發(fā)明雙價核酸疫苗的減蟲率為41.2％-53.85％，減卵率為42.65％-45.59％，按照WHO制定的血吸蟲疫苗評價標(biāo)準，本發(fā)明結(jié)果較好。使用本發(fā)明血吸蟲DNA疫苗針劑，進行肌肉免疫或皮下免疫小鼠先后2批共計250余只小鼠觀察，證實疫苗能有效誘導(dǎo)抗血吸蟲的免疫保護力，對動物反復(fù)多次的實驗觀察未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。香菇多糖是良好的佐劑，可以顯著的提高雙價核酸疫苗的免疫保護力(減蟲率68.89％、減卵率84.04％)，但無協(xié)同抗肝臟病理變化的作用，具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明血吸蟲雙價DNA疫苗安全、高效、制備簡單、性能穩(wěn)定、不需冷藏系統(tǒng)，利于儲存運輸和使用方便，一次免疫能產(chǎn)生較為持久的免疫保護效果。
權(quán)利要求
1.日本血吸蟲雙價DNA疫苗，包括真核表達載體和插入到真核表達載體多克隆位點上的目的基因，其特征是目的基因為Sj23和SjFABP，真核表達載體為具有兩套翻譯單位的真核表達載體，Sj23和SjFABP分別插入到具有兩套翻譯單位的真核表達載體的多克隆位點上，構(gòu)建日本血吸蟲雙價DNA疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲雙價DNA疫苗，其特征是Sj23插入到真核表達載體的強表達多克隆位點上，SjFABP插入到真核表達載體的弱表達多克隆位點上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲雙價DNA疫苗，其特征是SjFABP插入到真核表達載體的強表達多克隆位點上，Sj23插入到真核表達載體的弱表達多克隆位點上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的日本血吸蟲雙價DNA疫苗，其特征是所說的真核表達載體為pVIVO2-mcs。
5.權(quán)利要求4所述日本血吸蟲雙價DNA疫苗的制備方法，其特征在于以上游P1CGG GATCCA ATG GCG ACT TTG GGT ACT、下游P2CGCGAA TTCTTA AAC ATT CTG ATAATC GTG為引物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對Sj23雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對真核表達載體pVIVO2-mcs進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-Sj23質(zhì)粒；以上游P3GCATCA TGAATG TCT TCT TTC TTG G、下游P4CGTCCT AGGTGA CCA GTC TAT CAG T為引物，用限制性內(nèi)切酶BspH I和AvR II對SjFABP雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BspH I和AvR II對pVIVO2-mcs-Sj23質(zhì)粒進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP質(zhì)粒即為日本血吸蟲雙價DNA疫苗；或者以上游P1CGTGGA TCCATG TCT TCT TTC TTG、下游P2GACGAA TTCTGA CCA GTC TAT CAG T為引物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對SjFABP雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對真核表達載體pVIVO2-mcs進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-SjFABP質(zhì)粒；以上游P3CGT CAT GAA ATG GCGACT TTG GGT A、下游P4CCGCCT AGGTTA AAC ATT CTG ATA ATC GTG為引物，用BspH I和AvR II對Sj23雙酶切，同時以限制性內(nèi)切酶BspH I和AvR II對pVIVO2-mcs-SjFABP質(zhì)粒進行雙酶切，將以上兩片段連接成pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23質(zhì)粒即為日本血吸蟲雙價DNA疫苗；其中引物的下劃線表示對應(yīng)的酶切位點。
全文摘要
本發(fā)明涉及日本血吸蟲雙價DNA疫苗，包括真核表達載體和插入到真核表達載體的多克隆位點上的目的基因，目的基因為Sj23和SjFABP，真核表達載體為具有兩套翻譯單位的真核表達載體，Sj23和SjFABP分別插入到具有兩套翻譯單位的真核表達載體的多克隆位點上，構(gòu)建日本血吸蟲雙價DNA疫苗。本發(fā)明日本血吸蟲雙價DNA疫苗具有安全、高效、制備簡單、性能穩(wěn)定、不需冷藏系統(tǒng)，利于儲存運輸和使用方便，一次免疫能產(chǎn)生較為持久的免疫保護效果。
文檔編號A61P33/12GK1966081SQ200510019808
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者石佑恩, 胡媛 申請人:華中科技大學(xué)