專利名稱：一類三萜皂苷化合物、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新三萜皂苷化合物、其制備方法及其在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
兩頭尖為毛茛科植物多被銀蓮花(Anemone raddeana Regel.)的根莖，始載于明代劉文泰所著《本草品匯精要》。臨床上具有祛風(fēng)濕、消癰腫的作用，用于治療風(fēng)濕寒痹，四肢拘攣，癰腫潰爛等疾病，是著名中成藥“活絡(luò)丹”和“再造丸”的主要原料。新華本草綱要記載，中藥兩頭尖多分布于山東、遼寧、吉林、黑龍江等地區(qū)。該植物的化學(xué)成分有三萜、有機(jī)酸類化合物，近年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從兩頭尖中分離出多種三萜皂甙成分，藥理實驗顯示，兩頭尖總皂甙具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用。
對其進(jìn)行進(jìn)一步研究以期開發(fā)出具有活性的新化合物一直是本領(lǐng)域的技術(shù)人員著力解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了如分子式(I)的一類新化合物、其溶劑化物、立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體及前藥
(I)其中R1為 或-ara2-1rha或-ara2--1rha3--1ara，R2為-glc6--1glc4--1rha。
注ara為α-L-阿拉伯糖；glc為β-D-葡萄糖；rha為α-L-鼠李糖。
上述的化合物不僅是化合物本身，適當(dāng)時也可以是立體異構(gòu)體(包括光學(xué)異構(gòu)體，例如對映體和外消旋體)。
下文中為簡便起見，本發(fā)明限定的任何化合物、其溶劑化物及其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體及前藥都簡稱為本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明還公開了如分子式(I)的這類新化合物的制備方法，包括干燥的兩頭尖藥材粉碎后，用乙醇回流提取，提取液減壓回收溶劑得乙醇提取浸膏。將其懸浮于水中，分別以等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別回收各部分溶劑后得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。正丁醇萃取物經(jīng)AB-8大孔樹脂柱，依次用水、不同濃度的乙醇梯度洗脫并減壓回收乙醇后得浸膏，再反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH20柱層析和HPLC制備得化合物1、2、3。
本發(fā)明還公開了含有上述化合物的藥物組合物，其包括上述式(I)化合物作為活性成分和可藥用載體。藥物組合物的制備方法為本領(lǐng)域常用方法。
本發(fā)明的活性化合物可以本身形式給藥的，或者以藥物組合物形式給藥，其中活性化合物是與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑混合的。按照本發(fā)明使用的藥物組合物通常是按常規(guī)方式配制的，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，包含賦形劑和助劑，它們有利于將活性化合物加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的給藥途徑。
本發(fā)明還公開了涉及上述化合物和藥物組合物用于制備治療抗腫瘤藥物中的用途。


附圖1化合物1的1H-NMR圖譜附圖2化合物1的13C-NMR圖譜附圖3化合物1的DEPT圖譜附圖4化合物1的ESI-MS圖譜附圖5化合物1的COSY圖譜附圖6化合物1的HSQC圖譜附圖7化合物1的HMBC圖譜附圖8化合物1的TOCSY圖譜附圖9化合物2的1H-NMR圖譜附圖10化合物2的13C-NMR圖譜附圖11化合物2的DEPT圖譜附圖12化合物2的ESI-MS圖譜附圖13化合物2的COSY圖譜附圖14化合物2的HSQC圖譜附圖15化合物2的HMBC圖譜附圖16化合物2的TOCSY圖譜附圖17化合物3的1H-NMR圖譜附圖18化合物3的13C-NMR圖譜附圖19化合物3的ESI-MS圖譜附圖20化合物3的COSY圖譜附圖21化合物3的HSQC圖譜附圖22化合物3的HMBC圖譜附圖23化合物3的TOCSY圖譜附圖24化合物3的NOESY圖譜
具體實施例方式
下面的實施例、實驗例將對本發(fā)明做更詳細(xì)的說明，它們并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。除非特別言明，本發(fā)明中所有百分比均為體積百分比。
實施例中藥兩頭尖購自石家莊樂仁堂有限公司AB-8大孔樹脂南開大學(xué)化工廠柱層析硅膠青島海洋化工廠Sephadex LH-20安瑪西亞公司薄層層析用硅膠板及色譜純乙腈默克公司熔點儀BüCHI B-540HPLCWaters 996HPLC色譜柱Phenomenex 250×21.2mm，10umINVOA 500型核磁共振波譜儀(Volian公司)，TMS為內(nèi)標(biāo)。
ZMD Micromass型質(zhì)譜儀(英國Micromass公司)。
實施例1化合物的制備干燥的兩頭尖藥材4.5Kg粉碎后，用80％乙醇(乙醇/水，以下同)回流提取2次，每次3小時，合并提取液，減壓回收溶劑得乙醇提取浸膏580g。將其懸浮于5L水中，分別以等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別回收各部分溶劑后得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。正丁醇萃取物經(jīng)AB-8大孔樹脂柱，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，40％乙醇洗脫液減壓回收乙醇后干燥得干膏，再經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇-水(8∶2∶1，6∶4∶1體積比)洗脫，薄層層析檢測合并成5份，第2份高效液相制備，色譜條件30％乙腈-水，檢測波長203nm，得到化合物2(15mg)；第3份再經(jīng)硅膠柱層析(氯仿-甲醇-水7∶3∶1體積比)，薄層層析檢測合并成4份，其中第2份經(jīng)Sephadex LH20柱層析(60％甲醇-水)得化合物1(50mg)，第3份經(jīng)硅膠柱層析(氯仿-甲醇-水7∶3∶1體積比)得化合物3(30mg)。
實施例2化合物的波譜解析根據(jù)理化性質(zhì)與波譜數(shù)據(jù)確定化合物結(jié)構(gòu)。
化合物1白色粉末，mp.228-230℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均為陽性，提示分子可能為三萜化合物。酸水解檢出阿拉伯糖，鼠李糖，葡萄糖及一苷元。13C-NMR譜中給出δ95.8，101.8，102.8，104.9，104.9，106.4六個糖的端基C信號，與1H-NMR譜給出六個端基質(zhì)子δ4.71(d，J＝5.0Hz)，4.98(d，J＝7.5Hz)，5.11(d，J＝8.0Hz)，5.83(brs)，6.14(brs)，6.23(d，J＝8.0Hz)一致，提示化合物含有六個糖。苷元部分給出30個C信號，故確定該化合物為含有六個單糖的三萜皂苷。苷元部分的C信號與齊墩果酸比較，少了一個C-27的甲基信號，多了一個δ64.5連氧碳信號，同時C-8，12，13，14，15位信號都發(fā)生了一定變化。C-3位信號也向低場位移至δ88.8，C-28位向高場位移至176.8，其他C信號與齊墩果酸一致，故推測苷元部分可能是C-27位為一個羥甲基的齊墩果酸，并且在C-3，C-28位成苷，是一個含有六個糖的雙糖鏈皂苷。ESI-MS給出m/z1381[M-1]-，1401[M+H2O-1]+的準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合H譜、C譜可推測分子式為C65H106O31。
糖鏈連接位置和連接順序的確定該化合物堿水解液減壓蒸干后再酸水解只檢出葡萄糖及鼠李糖，并且存在負(fù)離子碎片峰m/z911[M-rha-glc-glc-1]-，說明該化合物的28位糖鏈由兩個葡萄糖和一個鼠李糖組成。通過與標(biāo)準(zhǔn)糖的甲基糖苷信號對比，并根據(jù)苷化位移規(guī)律，可推知可能含有一個末端鼠李糖，一個4位取代的內(nèi)側(cè)葡萄糖和一個6位取代的內(nèi)側(cè)葡萄糖，HMBC譜中可以看到δ6.23(1H，d，J＝8.0Hz，內(nèi)側(cè)葡萄糖H-1)，4.98(d，1H，J＝7.5Hz，中間葡萄糖H-1)，5.83(brs，1H，末端鼠李糖H-1)分別與δ176.8(苷元C-28)，69.2(內(nèi)側(cè)葡萄糖H-6)，78.6(中間葡萄糖H-4)有遠(yuǎn)程相關(guān)峰，證明28位酯糖鏈的連接順序為rha1-4glc1-6glc-苷元?；衔锏?H-NMR中只給出兩個特征的鼠李糖上的CH3信號δ1.62(d，3H)，1.67(d，3H)，表明該化合物總共含有兩個鼠李糖，去掉C-28位糖鏈上的一個鼠李糖證明苷元C-3位糖鏈上只有一個鼠李糖。推測苷元C-3位的3個糖中含有一個鼠李糖、一個阿拉伯糖和一個葡萄糖。三個糖的C信號與標(biāo)準(zhǔn)糖的甲基苷信號對比，并根據(jù)苷化位移規(guī)律，可知該化合物存在一個末端鼠李糖，一個末端葡萄糖和一個2，4位取代的阿拉伯糖。在HMBC中可看到δ4.71(d，J＝5.0Hz，2，4位取代的阿拉伯糖H-1)，6.14(brs，末端鼠李糖H-1)，5.11(d，J＝8.0Hz，末端葡萄糖H-1)分別與δ88.8(苷元C-3)，76.3(阿拉伯糖C-2)，79.6(阿拉伯糖C-4)存在遠(yuǎn)程相關(guān)峰，進(jìn)一步證明糖連接順序為阿拉伯糖接在苷元3位，鼠李糖與葡萄糖分別接在內(nèi)側(cè)阿拉伯糖的2，4位。根據(jù)糖的端基H的偶合常數(shù)和C譜數(shù)據(jù)判斷糖的端基構(gòu)型分別為葡萄糖β型，阿拉伯糖α型，鼠李糖α型。因此最終確認(rèn)該化合物為3-O-α-L-鼠李糖(1-2)-[β-D-葡萄糖(1-4)]-α-L-阿拉伯糖-27-羥基齊墩果酸28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。
化合物2白色粉末，mp.234-236℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均為陽性，提示分子可能為三萜化合物。酸水解檢出阿拉伯糖，鼠李糖，葡萄糖及一苷元。13C-NMR譜中給出δ95.8，101.7，102.8，104.8，104.8五個糖的端基C信號，與1H-NMR譜給出5個端基質(zhì)子δ4.58(d，J＝6.0Hz)，4.98(d，J＝7.5Hz)，5.82(brs)，6.08(brs)，6.22(d，J＝8.0Hz)一致，提示化合物含有5個糖。苷元部分給出30個C信號，故確定該化合物為含有5個單糖的三萜皂苷。苷元與化合物1水解得到的苷元共薄層斑點與Rf值一致且13C-NMR數(shù)據(jù)與化合物1的苷元13C-NMR數(shù)據(jù)也一致，確定該化合物苷元為27-羥基齊墩果酸。C-3位信號向低場位移至δ88.6，C-28位向高場位移至176.7，說明在C-3，C-28位成苷，是一個含有5個糖的雙糖鏈皂苷。ESI-MS給出m/z1239[M+H2O+1]+，1219[M-1]-的準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合H譜、C譜可推測分子式為C59H96O26。
糖鏈連接位置和連接順序的確定該化合物堿水解液減壓蒸干后再酸水解只檢出葡萄糖及鼠李糖，并且存在負(fù)離子碎片峰m/z749[M-rha-glc-glc-1]-，說明該化合物的28位糖鏈由兩個葡萄糖和一個鼠李糖組成。通過與標(biāo)準(zhǔn)糖的甲基糖苷信號對比，并根據(jù)苷化位移規(guī)律，可推知可能含有一個末端鼠李糖，一個4位取代的內(nèi)側(cè)葡萄糖和一個6位取代的內(nèi)側(cè)葡萄糖。HMBC譜中可以看到δ6.22(1H，d，J＝8.0Hz，內(nèi)側(cè)葡萄糖H-1)，4.98(d，1H，J＝7.5Hz，中間葡萄糖H-1)，5.82(brs，1H，末端鼠李糖H-1)分別與δ176.7(苷元C-28)，69.9(內(nèi)側(cè)葡萄糖H-6)，78.8(中間葡萄糖H-4)有遠(yuǎn)程相關(guān)峰。推斷苷元C-28位酯糖鏈的連接為rha1-4glc1-6glc-苷元。化合物的1H-NMR中只給出兩個特征的鼠李糖上的CH3信號δ1.60(d，3H)，1.66(d，3H)，表明該化合物總共含有兩個鼠李糖，去掉C-28位糖鏈上的一個鼠李糖證明苷元C-3位糖鏈上只有一個鼠李糖。推測苷元C-3位的2個糖中含有一個鼠李糖和一個阿拉伯糖。通過與標(biāo)準(zhǔn)糖的甲基糖苷信號對比，并根據(jù)苷化位移規(guī)律，確認(rèn)化合物3位存在一個末端Rha，一個2位被取代的內(nèi)側(cè)Ara。HMBC譜中可看到δ4.81(d，J＝6.0Hz，阿拉伯糖H-1)，6.08(brs，鼠李糖H-1)分別與δ88.9(苷元C-3)，75.9(阿拉伯糖C-2)有遠(yuǎn)程相關(guān)峰，進(jìn)一步證實了苷元C-3位糖的連接為Rha1-2Ara-苷元。根據(jù)糖的端基H的偶合常數(shù)和C譜數(shù)據(jù)判斷糖的端基構(gòu)型分別為葡萄糖β型，阿拉伯糖α型，鼠李糖α型。因此最終確認(rèn)該化合物為3-O-α-L-鼠李糖(1-2)-α-L-阿拉伯糖-27羥基齊墩果酸28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。
化合物3白色粉末，mp.254-256℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均為陽性，提示分子可能為三萜化合物。TLC酸水解檢出阿拉伯糖，鼠李糖，葡萄糖及一苷元。苷元與化合物1水解得到的苷元共薄層斑點與Rf值一致且13C-NMR數(shù)據(jù)與化合物1的苷元13C-NMR數(shù)據(jù)也一致，確定該化合物苷元為27-羥基齊墩果酸。
糖鏈連接位置和連接順序的確定13C-NMR數(shù)據(jù)顯示苷元3位向低場位移至88.7ppm，28位向高場位移至176.6ppm，說明該化合物含有兩個糖鏈且分別連在3位和28位。13C-NMR譜中給出δ95.7，101.4，102.8，104.8，104.9，105.4六個糖的端基C信號，與1H-NMR譜給出六個端基質(zhì)子δ4.74(d，J＝6.0Hz)，4.99(d，J＝8.0Hz)，5.85(brs)，5.94(d，J＝4.5Hz)，6.24(d，J＝8.0Hz)，6.29(brs)一致，顯示化合物含有六個糖。13C-NMR數(shù)據(jù)與化合物比較，顯示28位也存在相同的三糖鏈(rha1-4glc1-6glc-)，HMBC譜中可以看到δ6.24(1H，d，J＝8.0Hz，內(nèi)側(cè)葡萄糖H1)，4.99(d，1H，J＝8.0Hz，中間葡萄糖H1)，5.85(brs，1H，末端鼠李糖H1)分別與δ176.6(苷元C-28)，69.2(內(nèi)側(cè)葡萄糖H6)，78.8(中間葡萄糖H4)有遠(yuǎn)程相關(guān)峰，也證實了28位酯糖鏈的連接順序為rha1-4glc1-6glc-苷元。1H-NMR中給出兩個特征的鼠李糖上的CH3信號δ1.52(d，J＝6.0Hz)，1.69(d，J＝6.0Hz)表明該化合物總共含有兩個鼠李糖，去掉C-28位糖鏈上的一個鼠李糖證明苷元C-3位糖鏈上只有一個鼠李糖。推測苷元C-3位的3個糖中含有兩個阿拉伯糖和一個鼠李糖。通過與標(biāo)準(zhǔn)糖的甲基糖苷信號對比，并根據(jù)苷化位移規(guī)律，確認(rèn)該化合物存在一個末端Ara，一個3位被取代的Rha和一個2位被取代的Ara，在HMBC中可看到δ4.79(d，J＝6.0Hz，2位取代的阿拉伯糖H-1)，6.29(brs，3位取代的鼠李糖H-1)，5.94(d，J＝4.5Hz，末端阿拉伯糖H-1)分別與δ88.7(苷元C-3)，75.2(內(nèi)側(cè)阿拉伯糖C-2)，81.3(鼠李糖C-3)存在遠(yuǎn)程相關(guān)峰，推斷苷元C-3位糖的連接為Ara1-3Rha1-2Ara-苷元。根據(jù)糖的端基H的偶合常數(shù)和C譜數(shù)據(jù)判斷糖的端基構(gòu)型分別為葡萄糖β型，阿拉伯糖α型，鼠李糖α型。因此最終確認(rèn)該化合物為3-O-α-L-阿拉伯糖(1-3)-α-L-鼠李糖(1-2)-α-L-阿拉伯糖-27-羥基齊墩果酸28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。
化合物1-3的13C-NMR和1H-NMR數(shù)據(jù)如下表1化合物1-3苷元部分的13C-NMR(C5D5N，125MHz)

表2化合物1-3糖部分13CNMR數(shù)據(jù)(C5D5N，125MHz)

表3化合物1-3的1H-NMR(C5D5N，500MHz)

實驗例1、MTT法體外抑瘤實驗實驗儀器CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國SHELLAN公司)，RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)，MTT(Sigma公司)。
實驗材料人紅白血病細(xì)胞K562、人胃癌細(xì)胞BGC-823。
實驗方法采用常規(guī)MTT法。收集處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后用10％的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100ul，分別加入不同濃度的樣品，陽性對照為濃度20ug/ml的順鉑，陰性對照藥為磷酸鹽緩沖液。每組均設(shè)3個復(fù)孔。置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入10ulMTT(5mg/ml)，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)上清，每孔加入10％的SDS 100ul，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，放置過夜，最后用酶標(biāo)儀于490nm波長處測定各孔OD值，進(jìn)行細(xì)胞增殖分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進(jìn)行t檢驗。結(jié)果見表4表4本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測定結(jié)果

實驗結(jié)果結(jié)果表4所示，三個化合物在100ug/ml劑量以上對K562和BGC-823兩種細(xì)胞生長有明顯的抑制作用。
2、動物實驗實驗材料小鼠S180，河北醫(yī)科大學(xué)。順鉑，山東省德州制藥廠生產(chǎn)，批號030601。清潔級昆明種小鼠，雄性，體重18-20g，購自河北省實驗動物中心，編號DK0402-0007。
實驗方法采用昆明種小鼠皮下接種S-180肉瘤模型。瘤種體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，記數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為6×106個/ml，接種于小鼠右前肢腋下，每只0.2ml，隨機(jī)分成5組，每組動物10只，同時記錄每組小鼠體重。設(shè)正常對照組和順鉑陽性對照組，三個化合物設(shè)5.0mg/Kg劑量組，于接種后次日連續(xù)腹腔注射給藥8天，第9天脫頸椎處死動物，記錄小鼠體重，解剖取出瘤塊，稱重，計算抑瘤率。結(jié)果見表5。
抑瘤率(％)＝(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)×100％/對照組平均瘤重表5本發(fā)明化合物對昆明種小鼠S180肉瘤抑制作用

實驗結(jié)果三個化合物對S-180小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為41.0％，30.4％，32.4％，而對小鼠體重?zé)o明顯影響。
權(quán)利要求
1.如下式(I)的化合物、其溶劑化物、立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體及前藥 其中R1為 或-ara2--1rha或-ara2--1rha3--1ara，R2為-glc6--1glc4--1rha。
2.一種制備權(quán)利要求1化合物的方法，包括將兩頭尖藥材粉碎，用乙醇提取得乙醇提取浸膏；然后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃??；正丁醇萃取物經(jīng)AB-8大孔樹脂柱，依次用水、乙醇梯度洗脫并減壓回收溶劑得浸膏，再經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH20柱層析和HPLC制得。
3.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1化合物作為活性成份和可藥用載體。
4.權(quán)利要求1的化合物或權(quán)利要求3所述的藥物組合物，制備用于抗腫瘤藥物中的用途。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述的腫瘤為以下之一胃癌、白血病。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有通式(I)的一類新三萜皂苷化合物、其制備方法及其在抗癌領(lǐng)域中的應(yīng)用。其中R
文檔編號A61K31/56GK1962684SQ20051001296
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者任風(fēng)芝, 陳書紅, 張麗, 牛桂云, 朱京童, 司文秀, 劉剛?cè)? 白玉, 賀建功 申請人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司