專利名稱：一種枳殼藥材的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言是涉及枳殼提取、分離標準化。
背景技術(shù)：
目前，在全球范圍內(nèi)，中草藥都有一定的市場，隨著人們對健康要求認識水平的增高以及人口的老齡化，亞健康狀態(tài)化，人們更加渴望回歸自然，利用純天然程度高的藥物治療、預防一些化學合成藥物所不能解決得問題，因此天然植物藥的應用超出它原來民族傳統(tǒng)文化的背景。從天然藥物中尋求副作用小、且物美價廉的藥物成為世界各國醫(yī)藥企業(yè)所追逐的目標。歐共體對草藥進行了統(tǒng)一立法，加拿大和澳大利亞等國草藥地位已經(jīng)合法化，美國政府也已起草了植物藥管理辦法，開始接受天然藥物的復方混合制劑作為治療藥，這些為中藥作為治療藥進入國際醫(yī)藥市場提供了良好的國際環(huán)境。另一方面，隨著全球經(jīng)濟一體化進程的加快，特別是我國正式加入WTO，中國醫(yī)藥市場融入國際醫(yī)藥大市場的廣度和深度將進一步加劇。面臨強大跨國醫(yī)藥集團的激烈競爭以及日本、韓國、印度、泰國等亞洲國家傳統(tǒng)醫(yī)藥產(chǎn)品和德國、法國等歐洲國家植物藥的巨大沖擊，我國傳統(tǒng)中藥產(chǎn)生的眾多產(chǎn)品由于尚不能符合國際醫(yī)藥市場的標準和要求而被拒之門外。
中藥材提取的標準化和中藥制備方法的標準化是中成藥走向國際市場或者真正實現(xiàn)大工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是中國醫(yī)藥工作者和國外研究天然植物藥的科研人員一直努力研究的方向。目前關(guān)于中藥的提取方法是中藥領(lǐng)域研究的重點，科研人員一直將研究的目光著重于采用何種方法才能從中藥材中獲得的更多的有效成分，因此目前的中藥材提取的局面是針對不同的中藥材其有效成分的提取方法也不同，而針對不同的中藥材采用不同的提取方法需要有大量不同的提取設(shè)備用于支持中藥材的提取，這不適于中藥材提取的標準化。
枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實。中醫(yī)認為，其味苦、辛、酸，性溫，歸脾、胃經(jīng)。具有理氣寬中，行滯消脹之功效，適用于治療胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停，胃下垂，脫肛，子官脫垂?，F(xiàn)代研究表明，枳殼中主要含橙皮甙(hesperidin)、柚皮甙(naringin)、新橙皮甙(meohesperidin)，以及苦味成分苦橙甙(aurantiamrin)，苦橙酸(aurantiamaric acid)，苦味樹脂，對羥福林(辛弗林，synephrine)及N-甲基酪胺(N-methyltyramine)等。
如何確定一種提取、分離標準化方法，使枳殼中的藥物活性成分不僅能夠提取完全，還可以通過分離方法進一步分離所獲得的藥物活性成分。該提取、分離標準化的確立是目前中藥實現(xiàn)現(xiàn)代化的關(guān)鍵因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種枳殼提取、分離標準化。具體的說就是將枳殼提取物分成若干組分，每個組分包含幾個主要化合物，由這些藥材組分構(gòu)成了一個藥材組分庫。對藥材組分庫能夠進行藥物篩選，從而發(fā)現(xiàn)新藥。
為了實現(xiàn)枳殼提取的現(xiàn)代化、標準化，本發(fā)明人通過大量的試驗，對目前枳殼的有效成分的提取方法進行歸納和整理，以尋求一種可標準化的提取方法，即在該提取條件下采用該標準提取方法對枳殼進行提取，可以最大限度的獲得中藥中的有效成分。
本發(fā)明所采用的枳殼提取、分離標準化是本發(fā)明人通過試驗，對同一味中藥材采用不同的提取方法進行比較后，所得到的可適于工業(yè)化生產(chǎn)的枳殼提取、分離標準化。
本發(fā)明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1。在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱提取得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝用制備液相色譜繼續(xù)分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經(jīng)過了進一步分離的各個組分。
優(yōu)選的本發(fā)明可以通過下列步驟實施
(1)提取工藝稱取枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用2～10％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝用制備液相色譜繼續(xù)分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為3ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經(jīng)過進一步分離的各個組分。
最佳的本發(fā)明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏，用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發(fā)明中為了從步驟(2)中獲得枳殼提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續(xù)分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為95％的水，流動相B為5％的乙腈溶液；30min時，流動相A為35％的水，流動相B為65％的乙腈溶液；
35min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；40min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結(jié)果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間10.4-16.2min；組分fr.52，收集時間16.2-19.6min；組分fr.53，收集時間19.6-23.9min；組分fr.54，收集時間23.9-31.0min；組分fr.55，收集時間31.0-36.8min；組分fr.56，收集時間36.8-44.7min；組分fr.57，收集時間44.7-50.0min；fr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的水，流動相B為15％的乙腈溶液；5min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；20min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；28min時，流動相A為72％的水，流動相B為28％的乙腈溶液；40min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結(jié)果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-8.2min；組分fr.82，收集時間8.2-12.6min；組分fr.83，收集時間12.6-18.6min；組分fr.84，收集時間18.6-20.2min；組分fr.85，收集時間20.2-25.5min；組分fr.86，收集時間22.5-35.4min；組分fr.87，收集時間35.4-43.5min。
為了獲得具體的枳殼有效成分，最佳的本發(fā)明提取分離方法為(1)提取工藝稱取枳殼藥材250g，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得41.8g浸膏，取fr.1浸膏15.2g用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得2.4g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得60.2g浸膏，取10.0g浸膏用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得5.4g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發(fā)明中為了從步驟(2)中獲得枳殼提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續(xù)分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為95％的水，流動相B為5％的乙腈溶液；30min時，流動相A為35％的水，流動相B為65％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；40min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結(jié)果取組分fr.5共1.6g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，111.2mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，40.4mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，77.4mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，189.9mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，104.5mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，39.7mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，115.8mg。
fr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的水，流動相B為15％的乙腈溶液；5min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；
20min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；28min時，流動相A為72％的水，流動相B為28％的乙腈溶液；40min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結(jié)果取組分fr.8共1.8g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，153.6mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，137.1mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，98.8mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，35.8mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，362.9mg；組分fr.86，收集時間36.0-45min，287.3mg；組分fr.87，收集時間36.0-45min，37.9mg。
本發(fā)明中，枳殼各組分中所含化合物見表1，其分析鑒定方法參見實施例三。
表1.枳殼各組分中所含化合物

以上枳殼及其提取溶液在工業(yè)化提取時可按照相應的比例增大或減少，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以公斤或以噸為單位，小規(guī)模生產(chǎn)也可以以克為單位，重量可以增大或減小，但其重量配比比例不變。
本發(fā)明所建立的提取、分離標準化可以適用于目前中藥中的任何一種中藥材，例如可用于阿魏、艾葉、安息香、柏子仁、鱉甲、檳榔、薄荷、蓖麻子、蓄、補骨脂、板藍根、蓽茇、巴豆、巴戟天、北豆根、北沙參、白及、白頭翁、白芍、白芷、白附子、白茅根、白果、白前、白扁豆、白蘞、白鮮皮、白薇、半邊蓮、半枝蓮、半夏、百合、冰片、柴胡、蟬蛻、楮實子、常山、椿皮、穿山甲、穿心蓮、赤小豆、赤石脂、赤芍、蒼術(shù)、蒼耳子、沉香、垂盆草、側(cè)柏葉、草烏、草烏葉、草豆蔻、草果、川貝母、川牛膝、川烏、川芎、川楝子、車前子、淡豆豉、黨參、淡竹葉、杜仲、獨活、膽南星、大薊、大腹皮、牡丹皮、煅石膏、冬瓜皮、冬蟲夏草、地龍、地膚子、地骨皮、熟地黃、地錦草、地榆、當歸、燈心草、丁香、刀豆、大青葉、大棗、大黃、鵝不食草、莪術(shù)、兒茶、榧子、浮萍、萆解、覆盆子、佛手、附子、茯苓、防己、防風、番瀉葉、蜂蜜、蛤蚧、桂枝、葛根、藁本、高良姜、骨碎補、谷芽、谷精草、狗脊、枸杞子、枸骨葉、鉤藤、甘松、甘草、甘遂、瓜蔞、瓜蔞子、瓜蔞皮、關(guān)木通、干姜、炮姜、干漆、鶴虱、黃芪、黃精、海藻、槐花、海風藤、荷葉、黃芩、黃連、黃柏、花椒、何首烏、虎杖、胡黃連、厚樸、化橘紅、火麻仁、合歡皮、合歡花、紅大戟、紅花、黑芝麻、菊花、僵蠶、桔梗、橘核、姜黃、雞血藤、雞冠花、金果欖、金沸草、金蕎麥、金錢草、金銀花、降香、荊芥、韭菜子、決明子、款冬花、訶子、苦杏仁、苦參、苦楝皮、萊菔子、雷丸、凌霄花、鹿銜草、漏蘆、路路通、蓮子、絡(luò)石藤、蘆薈、蘆根、兩頭尖、兩面針、連翹、靈芝、羅布麻葉、羅漢果、荔枝核、龍膽、龍眼肉、老鸛草、墨旱蓮、麻黃、蔓荊子、滿山紅、滿山紅油、密蒙花、梅花、麻黃、麥冬、麥芽、玫瑰花、明黨參、馬鞭草、馬兜鈴、馬錢子、馬錢子粉、馬勃、馬齒莧、木瓜、木香、木賊、南沙參、女貞子、牛蒡子、牛膝、藕節(jié)、蒲黃、蒲公英、枇杷葉、佩蘭、片姜黃、瞿麥、秦皮、拳參、芡實、羌活、青木香、青風藤、青皮、青葙子、青蒿、青黛、茜草、牽牛子、前胡、千年健、千金子、秦艽、蕤仁、肉豆蔻、肉蓯蓉、肉桂、人參、人參葉、石菖蒲、鎖陽、桑葉、商陸、桑椹、蛇床子、桑白皮、桑枝、桑枝、桑寄生、娑羅子、酸棗仁、射干、蘇合香、沙苑子、使君子、柿蒂、砂仁、山豆根、山茱萸、山藥、山慈菇、山楂、小薊、升麻、水牛角、水牛角濃縮粉、石韋、石決明、石斛、石榴皮、生姜、絲瓜絡(luò)、三七、三棱、葶藶子、菟絲子、桃仁、通草、檀香、天花粉、天竺黃、天南星、天麻、天葵子、太子參、土荊皮、土茯苓、吳茱萸、威靈仙、王不留行、五加皮、五味子、五倍子、瓦楞子、烏藥、烏梅、夏天無、續(xù)斷、旋覆花、豨薟草、薤白、夏枯草、辛夷、香加皮、香附、香櫞、香薷、小茴香、仙茅、仙鶴草、玄參、玄明粉、西洋參、血余炭、血竭、徐長卿、淫羊藿、益母草、銀杏葉、薏苡仁、銀柴胡、遠志、芫花、郁李仁、郁金、魚腥草、茵陳、鴉膽子、月季花、玉竹、延胡索、浙貝母、豬牙皂、紫蘇子、紫菀、紫花地丁、紫草、豬苓、皂角刺、知母、澤蘭、澤瀉、珍珠母、枳實、梔子。
按照本發(fā)明方法所獲得的枳殼有效成分可以制成藥劑學上任何一種形式，包括針劑和口服制劑。其中針劑包括注射液、滴注液、粉針劑；口服制劑包括顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它實施方案，本發(fā)明實施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種改變和改進，例如所選用的溶液可以是其他低級醇或者是其他有機溶劑，但只要使用本發(fā)明所述的提取方法，均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。


下面給出枳殼指紋圖譜，枳殼水溶性各組分紫外光譜圖、枳殼水溶性各組分質(zhì)譜圖、枳殼脂溶性各組分紫外光譜圖、枳殼脂溶性各組分質(zhì)譜圖，旨在進一步說明本發(fā)明，但對本發(fā)明并不構(gòu)成限制。
圖1枳殼指紋圖譜圖2枳殼水溶性各組分紫外圖譜圖3枳殼水溶性各組分質(zhì)譜4枳殼脂溶性各組分紫外圖譜圖5枳殼脂溶性各組分質(zhì)譜圖具體實施方式
實施例一(1)提取工藝稱取250g枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1。在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱提取得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得40.1g浸膏，取fr.1浸膏15g用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得2.2g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得56.3g浸膏，取10.0g浸膏用甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得4.8g樣品，最后用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝用制備液相色譜繼續(xù)分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經(jīng)過了進一步分離的各個組分。
fr.5分離結(jié)果取組分fr.5共1.5g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，108.2mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，37.4mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，72.8mg；
組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，182.5mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，98.2mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，36.1mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，111.3mg。
fr.8分離結(jié)果取組分fr.8共2.0g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，148.8mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，132.6mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，91.4mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，32.2mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，352.7mg；組分fr.86，收集時間36.0-45min，277.7mg；組分fr.87，收集時間36.0-45min，34.5mg。
實施例二(1)提取工藝稱取500g枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得78.9g浸膏，取fr.1浸膏30g用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得4.6g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得114.8g浸膏，取20.0g浸膏用2～10％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得9.9g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝用制備液相色譜繼續(xù)分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為3ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經(jīng)過進一步分離的各個組分。
fr.5分離結(jié)果取組分fr.5共3g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下
組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，206.3mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，73.9mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，142.8mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，366.4mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，199.5mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，74.1mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，216.7mg。
fr.8分離結(jié)果取組分fr.8共3.5g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，298.8mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，262.4.1mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，190.1mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，62.3mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，716.9mg；組分fr.86，收集時間36.0-45min，566.4mg；組分fr.87，收集時間36.0-45min，72.2mg。
實施例三一、枳殼藥材的提取分離(1)提取工藝稱取枳殼藥材250g，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2。在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得41.8g浸膏，取fr.1浸膏15.2g用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得2.4g樣品，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得60.2g浸膏，取10.0g浸膏用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得5.4g樣品，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)制備分離工藝本發(fā)明中為了從步驟(2)中獲得牡丹皮提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用制備液相色譜繼續(xù)分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為95％的水，流動相B為5％的乙腈溶液；30min時，流動相A為35％的水，流動相B為65％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；40min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結(jié)果取組分fr.5共1.6g，用乙醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，111.2mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，40.4mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，77.4mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，189.9mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，104.5mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，39.7mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，115.8mg。
fr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的水，流動相B為15％的乙腈溶液；5min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；20min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；28min時，流動相A為72％的水，流動相B為28％的乙腈溶液；40min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結(jié)果取組分fr.8共1.8g，用20％的甲醇溶解進樣，由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，153.6mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，137.1mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，98.8mg；
組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，35.8mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，362.9mg；組分fr.86，收集時間36.0-45min，287.3mg；組分fr.87，收集時間36.0-45min，37.9mg。
二、分析2.1試劑與儀器Agilent 1100高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，配在線真空脫氣機、四元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、1946D電噴霧四級桿質(zhì)譜檢測器、Chemstation色譜工作站；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；飛鴿牌TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；METTLER-AE240型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。
乙腈為色譜純試劑(MERCK)，水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團)，乙酸為分析純(杭州試劑廠)。
2.2分析方法樣品來源枳殼組分fr.51 1.07mg、fr.52 1.18mg、fr.53 1.11mg、fr.54 1.13mg、fr.551.16mg、fr.56 1.14mg、fr.57 1.13mg。
樣品制備樣品用1ml乙醇溶解，超聲，離心(10000r/min)，備用。
色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相A相為0.2％冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為10％的0.2％冰醋酸乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為30％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為70％的0.2％冰醋酸乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為95％的0.2％冰醋酸乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；柱溫30℃；DAD檢測在190-400nm范圍內(nèi)掃描；進樣量5μL。
質(zhì)譜條件正負離子掃描模式，掃描范圍100-2000；干燥氣(N2氣)流速10L/min，霧化溫度350℃，毛細管電壓3500V，裂解電壓100V。
ELSD條件氮氣1.4l/min，漂移管溫度100℃。
樣品來源枳殼組分fr.81 1.17mg、fr.82 1.16mg、fr.83 1.19mg、fr.84 1.16mg、fr.851.09mg、fr.86 1.16mg、fr.87 1.08mg。
樣品制備樣品用1ml 50％甲醇水溶解，超聲，離心(10000r/min)，備用。
色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相A相為0.2％冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為95％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為5％的0.2％冰醋酸乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為70％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為30％的0.2％冰醋酸乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為50％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為50％的0.2％冰醋酸乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；柱溫30℃；DAD檢測在190-400nm范圍內(nèi)掃描；進樣量5μL。
質(zhì)譜條件正負離子掃描模式，掃描范圍100-2000；干燥氣(N2氣)流速10L/min，霧化溫度350℃，毛細管電壓3500V，裂解電壓100V。
ELSD條件氮氣1.8l/min，漂移管溫度105℃。
2.3分析結(jié)果分析結(jié)果圖2是枳殼水溶性各組分紫外圖譜，圖3是枳殼水溶性各組分質(zhì)譜圖，圖4是枳殼脂溶性各組分紫外圖譜，圖5是枳殼脂溶性各組分質(zhì)譜圖。
枳殼組分中化合物的鑒定結(jié)果見表2。
表2.枳殼組分化合物鑒定結(jié)果

注[參考文獻]1、X.G.He，L.Z.Lian，L.Z.Lin，et al.High-performance liquid chromatography-electrospraymass spectrometry in phytochemical analysis of sour orange(Citrus aurantium L.)J.ofChromatogr.A，791(1997)，127-134.
2、賈強，白楊，馬燕，等.枳殼和枳實化學成分的HPLC-ESI-MS分析.中草藥，36(2005)，169-172。
三、枳殼組分藥效篩選實驗3.1藥理模型乳鼠心肌細胞缺血缺氧模型原代心肌細胞培養(yǎng) 出生1～3天SD乳鼠處死后，取心臟，經(jīng)PBS液清洗后剪成1mm3左右的碎塊。用0.125％胰蛋白酶(Sigma，USA)+0.05％膠原酶II(Gibco，USA)于37℃消化3～4次。差速貼壁法分離成纖維細胞1.5小時后，細胞懸液轉(zhuǎn)移至48孔板中(每孔約4×105細胞)。經(jīng)DMEM(Gibco，USA)加10％胎牛血清(Falcon，USA)培養(yǎng)3～6天的細胞供藥效篩選。篩選前1天替換為無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)3～6天的心肌細胞，PBS洗滌后加入含藥培養(yǎng)液。置于95％N2和5％CO2培養(yǎng)箱中缺氧6小時。然后在CO2培養(yǎng)箱中復氧3小時。取細胞上清液測定LDH含量。
給藥方案 提取得到的枳殼提取物用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在培養(yǎng)液中的終濃度控制在10-5g/mL。
乳酸脫氫酶含量測定 細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶含量能夠表示細胞損傷程度。漏入上清液中的乳酸脫氫酶含量越高，表明細胞損傷也顯著。乳酸脫氫酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定方法為取30μl細胞上清液，加入50μl基質(zhì)緩沖液及10μl乳酸脫氫酶輔酶，37℃振蕩15分鐘，再加入50μl 2，4-二硝基苯肼，37℃振蕩15分鐘。平行空白。取反應液50μl加入200μl 0.4mol/L氫氧化鈉溶液，靜置3～4分鐘后，用酶標儀于450nm測定光度值。
藥效結(jié)果 所有數(shù)據(jù)用均值±方差表示。采用單邊方差分析和T檢驗進行統(tǒng)計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效篩選結(jié)果見表3。根據(jù)心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)篩選結(jié)果，枳殼組分fr.51，fr.52，fr.53，fr.54，fr.82，fr.83對降低LDH釋放有非常顯著效果。
表3.心肌細胞篩選結(jié)果

3.2臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧復氧模型原代臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 取健康新生兒臍帶，用30～50ml Hanks液洗凈靜脈血管內(nèi)的殘留血跡。視臍帶長度加入相應量的0.1％膠原酶I，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱消化15～20分鐘。隨后將臍帶內(nèi)消化液小心收集到燒杯中，并用Hanks液將燒杯潤洗兩次，一并收集到燒杯中分裝于離心管，900rpm離心10分鐘。吸去上清液，用M199培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，100U/ml雙抗，0.15mg/ml Heparin，10μM VC)充分溶解沉淀。將所得細胞懸液分裝于5cm2培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第二天換成采用含30μg/ml ECGS的M199培養(yǎng)液，之后每三天換一次培養(yǎng)液直至細胞鋪滿底面。所用細胞均為原代內(nèi)皮細胞。造模前將培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞接種至96孔板并培養(yǎng)一天，所用細胞量為3.5～4萬/孔。造模時，吸棄舊的M199培養(yǎng)液，加入含藥無酚紅M199培養(yǎng)液，每孔總量為100μl。置于95％N2和5％CO2培養(yǎng)箱中缺氧12小時，然后在CO2培養(yǎng)箱中復氧2小時。取細胞上清液測定LDH含量和NO含量。
給藥方案 提取得到的枳殼提取物用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在無酚紅M199培養(yǎng)液中的終濃度控制在10-5g/mL。
NO含量測定 采用Greiss試劑法測定，取90μl細胞上清液，加入等量Greiss試劑，室溫下靜置10分鐘，用酶標儀于550nm測定吸光度值。
藥效結(jié)果 所有數(shù)據(jù)用均值±方差表示。采用單邊方差分析和T檢驗進行統(tǒng)計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效篩選結(jié)果見表4。枳殼7個組分具有抑制內(nèi)皮細胞缺氧-復氧后NO過度表達的效果，fr.51、fr.52、fr.54、fr.85非常顯著有效，fr.55、fr.82、fr.84顯著有效。
表4.內(nèi)皮細胞篩選結(jié)果

以上試驗結(jié)果說明，采用本發(fā)明中藥材標準化提取方法獲得的中藥材有效成分可以用作制備藥物。
權(quán)利要求
1.枳殼提取、分離標準化方法，包括以下步驟(1)提取工藝稱取枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1；在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱提取得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)制備分離工藝用制備液相色譜分離fr.5和fr.8；色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經(jīng)過了進一步分離的各個組分。
2.如權(quán)利要求1所述的枳殼提取、分離標準化方法，包括如下步驟(1)提取工藝稱取枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合并濾液得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏后，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏后，用2～10％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)制備分離工藝用制備液相色譜離fr.5和fr.8；色譜柱為半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為3ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經(jīng)過進一步分離的各個組分。
3.如權(quán)利要求2所述的枳殼提取、分離標準化方法，包括如下步驟(1)提取工藝稱取枳殼藥材，將其粉碎后過篩，然后加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.2；在藥渣中最后加入水，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏，用硅膠拌樣，采用正相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然后改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最后用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏，用5％甲醇溶解上樣，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最后用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)制備分離工藝用制備液相色譜離fr.5和fr.8；fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為95％的水，流動相B為5％的乙腈溶液30min時，流動相A為35％的水，流動相B為65％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；40min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；50min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結(jié)果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間10.4-16.2mm；組分fr.52，收集時間16.2-19.6mm；組分fr.53，收集時間19.6-23.9mm；組分fr.54，收集時間23.9-31.0min；組分fr.55，收集時間31.0-36.8min；組分fr.56，收集時間36.8-44.7min；組分fr.57，收集時間44.7-50.0min；fr.8分離條件色譜柱為Agilent制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的水，流動相B為15％的乙腈溶液；5min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；20min時，流動相A為78％的水，流動相B為22％的乙腈溶液；28min時，流動相A為72％的水，流動相B為28％的乙腈溶液；40min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的水，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結(jié)果由制備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-8.2min；組分fr.82，收集時間8.2-12.6min；組分fr.83，收集時間12.6-18.6min；組分fr.84，收集時間18.6-20.2min；組分fr.85，收集時間20.2-25.5min；組分fr.86，收集時間22.5-35.4min；組分fr.87，收集時間35.4-43.5min。
4.如權(quán)利要求3所述的枳殼提取、分離標準化方法，其特征在于組分fr.53中主要化合物為柚皮苷元；組分fr.54中主要化合物為Nobelitin；組分fr.55中主要化合物為Tangeritin。
5.如權(quán)利要求3所述的枳殼提取、分離標準化方法，其特征在于組分fr.84中主要化合物為異柚皮苷，柚皮苷；組分fr.85中主要化合物為柚皮苷，橙皮苷；組分fr.86中主要化合物為柚皮苷，新橙皮苷。
全文摘要
本發(fā)明公開了枳殼標準化提取分離方法，采用該方法可較大程度地將中藥材中化學成分提取出來并進一步分離獲得枳殼中不同極性的化學組分；具體的說就是將枳殼藥材按極性分成若干化學組分，每個組分中僅包含幾個主要化合物，由這些藥材組分構(gòu)成一個藥材組分庫。對藥材組分庫能夠進行藥物篩選，從而發(fā)現(xiàn)新藥。該標準化提取分離方法不需要對每個藥材都建立一套提取分離方法，大大縮短了藥材提取分離的周期，同時也減少人力物力的消耗；該方法簡便、推廣性好，適用大部分藥材。
文檔編號A61P1/14GK1903279SQ20051001227
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者程翼宇, 賀慶, 王毅, 王學偉, 李云飛, 胡興江, 葛志偉 申請人:天津天士力現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司