專利名稱：基于nsp4基因的輪狀病毒基因疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型疫苗的研制。具體而言，本發(fā)明涉及基于NSP4基因的輪狀病毒基因疫苗及其應用。
背景技術：
A組輪狀病毒(Rotavirus，RV)是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒急性腹瀉的最主要病原。最新數(shù)字表明，在發(fā)展中國家，輪狀病毒引起的兒童嚴重腹瀉占腹瀉住院病例的1/3，每年引起5歲以下兒童死亡的人數(shù)為87.3萬人，相當于每天死亡2000-2400人。我國多次流行病學調(diào)查表明，秋冬季嬰幼兒腹瀉有大約50％是由A組輪狀病毒引起的。輪狀病毒腹瀉關系到國家的公共安全、社會穩(wěn)定以及人口素質(zhì)。鑒于輪狀病毒危害嚴重且缺乏有效治療手段，世界衛(wèi)生組織將輪狀病毒疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項目之一。
RV的基因組由11個雙鏈RNA節(jié)段組成，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白和5個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5)。RV的衣殼分為3層，其外殼由VP7和VP4組成，內(nèi)殼由VP6和VP2組成。RV的外殼蛋白中含有中和抗原表位。但是與其它RNA病毒相似，RV外殼蛋白的變異性很強，根據(jù)VP7的變異性可將RV分為至少14個不同的血清型，根據(jù)VP4的變異可將其分為至少20個亞型，目前RV疫苗中一般只包含了一個血清型，最多不超過4個血清型，而自然界中流行的輪狀病毒是錯綜復雜、不斷變換的，因此現(xiàn)有RV疫苗沒有解決輪狀病毒基因變異的有效對抗問題，嚴重影響了免疫效果。因此如何應對病毒變異是RV疫苗研制中必須要考慮的問題。
傳統(tǒng)的病毒疫苗設計(滅活疫苗或減毒活疫苗)主要是模擬病毒自然感染過程，疫苗成分進入體內(nèi)，被機體免疫系統(tǒng)識別的主要是病毒的外殼蛋白，其非結(jié)構(gòu)蛋白和病毒內(nèi)部抗原往往不能被免疫系統(tǒng)高效遞呈，誘導的免疫反應很弱或不能誘導免疫反應，并且這種疫苗誘導產(chǎn)生的免疫反應以針對表面抗原的中和抗體為主，多為型特異性免疫反應，保護范圍比較局限，往往不能形成對病毒變異株的保護。針對HIV、人丙型肝炎病毒以中和抗原為免疫原的疫苗沒有達到預期效果的原因可能也與此有關(參見http://www.genetide.com/news/shownews.asp？id＝120088)。篩選具有交叉保護性的病毒抗原無疑是解決病毒變異的一條重要途徑。由于病毒的大部分非結(jié)構(gòu)蛋白或內(nèi)部抗原保守性較強，病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白在交叉免疫保護性及病毒疫苗設計中的地位逐漸受到重視。作為病毒復制過程中產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白，也會引起機體產(chǎn)生相應的免疫反應，如免疫缺陷病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶便具有CTL表位(參見De Berardinis P，et al.Phage display of peptide epitopesfrom HIV-1 elicits strong cytolytic responses.Nat Biotechnol，2000；18(8)873-876.)，而且非結(jié)構(gòu)蛋白較為保守，針對非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫反應可能具有更為廣泛的交叉免疫保護性。在病毒自然過程中，非結(jié)構(gòu)蛋白或內(nèi)部蛋白(非中和抗原)未充分暴露于免疫系統(tǒng)之下，產(chǎn)生的免疫反應較弱，但是經(jīng)過人為改造，可以大大增強其免疫原性，產(chǎn)生較強的免疫保護反應。例如，丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3蛋白可誘導特異性的細胞免疫反應；含有HIV非結(jié)構(gòu)蛋白Tat的疫苗能在恒河猴引起高滴度的交叉免疫保護反應；流感病毒的非中和抗原NP在小鼠可以同時引起CD4+T細胞分泌細胞因子及CD8+CTL反應，并能誘發(fā)針對異型病毒的保護作用(參見Brinster C，et al.Hepatitis C virusnon-structural protein 3-specific cellular immune responses followingsingle or combined immunization with DNA or recombinant SemlikiForest virus particles.J Gen Virol，2002，83(Pt 2)369-81.Cafaro A，et al.Control of SHIV-89.6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tatprotein vaccine.Nat Med，1999，5(6)5643-5650.Richardson MW，et al.Immunogenicity of HIV-1 IIIB and SHIV 89.6P Tat and Tat toxoids inrhesus macaquesinduction of humoral and cellular immune responses.DNA Cell Biol，2002，21(9)637-651.Ulmer JB，Influenza DNA vaccines.Vaccine，2002，20S74-S76)。這些非結(jié)構(gòu)蛋白或非中和抗原已經(jīng)成為相應病毒的重要疫苗候選基因，并顯示出良好的應用前景，成為疫苗研制中新的亮點和突破點。
本發(fā)明利用RV基因10編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4研制了基因疫苗，有望在輪狀病毒腹瀉預防中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征是利用表達人RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或其免疫原性片段的不同表達載體作為新型輪狀病毒基因疫苗。
NSP4基因全長750或751個核苷酸，編碼175個氨基酸，含有2個糖基化位點。NSP4是重要的RV調(diào)節(jié)蛋白，在RV的復制成熟過程中發(fā)揮重要作用。
NSP4可作為新型輪狀病毒疫苗的候選基因，是因為它與輪狀病毒其它抗原相比，具有以下優(yōu)點(1)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4較為保守，除了其主要集中于131-145位氨基酸的“高變區(qū)”，其它區(qū)域即使在不同血清型間仍然較為保守，我國不同地區(qū)A組輪狀病毒不同血清型間全長NSP4基因(包括高變區(qū))的同源性均高于80％，并且NSP4的變異與病毒分布地區(qū)無關，不同地區(qū)間NSP4氨基酸序列的同源性可高達99％(參見王大燕，王健偉，于修平等.中國輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4基因變異特征的分析.中華實驗和臨床病毒學雜志，2003，17(1)10-14)。因此有可能產(chǎn)生較好的交叉免疫保護作用，有助于解決病毒的高變異問題；(2)NSP4在病毒復制過程中發(fā)揮關鍵作用，它作為跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜糖蛋白，可作為胞漿中單殼顆粒的細胞內(nèi)受體，NSP4與單殼顆粒結(jié)合促使其以出芽方式進入ER腔。NSP4還與病毒的外殼蛋白VP4和VP7結(jié)合，促進外殼蛋白的獲得。因而針對NSP4的免疫反應有可能在病毒復制的早期階段便可發(fā)揮作用；(3)NSP4在輪狀病毒致病中發(fā)揮重要作用，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與輪狀病毒腹瀉發(fā)生直接相關的輪狀病毒蛋白。近年來，人們發(fā)現(xiàn)輪狀病毒NSP4在病毒致腹瀉的機制中扮演重要角色，最近在禽RV NSP4的研究中也發(fā)現(xiàn)其有致腹瀉作用(Mori Y，et al.Diarrhea-inducing activity ofavian rotavirus NSP4 glycoproteins，which differ greatly from mammalianrotavirus NSP4 glycoproteins in deduced amino acid sequence in sucklingmice.J Virol，2002，76(11)5829-34.)。現(xiàn)有的研究表明，NSP4可激活某些信號傳導通路，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+向胞漿轉(zhuǎn)運而導致細胞內(nèi)Ca2+濃度增高，Ca2+濃度增高將引發(fā)腸粘膜細胞內(nèi)Cl-外泌而導致腹瀉。NSP4這種導致腹瀉的機制類似于細菌腸毒素，目前看來這可能是輪狀病毒導致腹瀉的主要原因之一，因此抗輪狀病毒腹瀉藥物和疫苗應當考慮NSP4的作用；(4)已有的研究表明，RV自然感染后有針對NSP4蛋白的免疫反應，在血清中可以檢測到抗NSP4抗體，并且NSP4蛋白具有T、B細胞表位，因此有望成為疫苗設計的靶位，通過人為改造，可以使針對NSP4的免疫反應增強。
要研制輪狀病毒的疫苗必須要考慮病毒的感染特征，由于輪狀病毒主要感染腸道并在局部繁殖，因此粘膜免疫以及細胞免疫等對于病毒清除可能發(fā)揮重要作用。要利用NSP4誘導有效的免疫反應，還必須要考慮疫苗的實現(xiàn)形式。NSP4作為單一病毒成分，只能研制基因工程疫苗。作為基因工程病毒疫苗，目前主要包括亞單位疫苗、多肽疫苗、活載體(病毒或細菌)疫苗、DNA疫苗(采用質(zhì)粒載體)、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等，其中載體疫苗和DNA疫苗均屬于基因疫苗范疇。
本發(fā)明采用基因疫苗的形式，是因為其具有以下優(yōu)點(1)基因疫苗可以采用黏膜免疫途徑。研制輪狀病毒基因工程疫苗必須考慮輪狀病毒的生物學與免疫學特點，即輪狀病毒經(jīng)腸道感染且繁殖局限在腸道，因此粘膜免疫起主要保護作用。理論上講，腺病毒、皰疹病毒、EB病毒、腺病毒伴隨病毒(AAV)、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦病毒、登革病毒、噬菌體等多種病毒、細菌載體或各種質(zhì)粒載體均可作為NSP4的表達載體，通過滴鼻、口服、透皮、噴霧等免疫途徑，誘導黏膜免疫，不經(jīng)過包裝處理或輔以佐劑，由于過敏、降解等原因，重組蛋白、多肽或從轉(zhuǎn)基因植物提取的蛋白很難直接誘導較強的粘膜免疫反應；(2)基因疫苗可激發(fā)多種免疫反應。目前研究表明，病毒載體或質(zhì)粒載體疫苗可在細胞內(nèi)表達抗原，從而不僅可誘導體液免疫、黏膜免疫，而且可誘導細胞免疫，后者在疫苗保護中往往具有更重要的作用。而亞單位疫苗、多肽疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗往往只能誘導以體液免疫為主的反應。
(3)基因疫苗免疫效率高。目前病毒載體疫苗等本身就有良好的免疫刺激作用，不需要添加佐劑，而亞單位疫苗、多肽疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗往往需要有佐劑才能激發(fā)有效的免疫反應，但是目前廣泛使用的鋁佐劑并不適用于黏膜免疫，其它佐劑尚無廣泛使用，并且絕大部分尚未用于人體，因此疫苗可能因無合適佐劑而失敗。
(4)生產(chǎn)成本低，容易制備。由于基因疫苗是以重組病毒、細菌或質(zhì)粒的形式體現(xiàn)的，其制備相對容易，尤其是作為口服疫苗，無須純化，因此成本較低。而亞單位疫苗需要復雜的純化過程；合成肽成本高，本身免疫原性很弱，需要偶聯(lián)擔體；轉(zhuǎn)基因植物目的抗原的表達量低，提取困難，其致敏性、安全性目前尚無定論。
縱上所述，本發(fā)明利用輪狀病毒NSP4研制基因疫苗，具有可有效應對病毒變異、針對病毒致病環(huán)節(jié)、給藥方便、可有效誘導體液免疫、黏膜免疫和細胞免疫、制備方便等優(yōu)點。
本發(fā)明一方面提供了一種輪狀病毒基因疫苗，其中含有輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因，所述NSP4或者其免疫原性片段的基因插入病毒、細菌或者質(zhì)粒中，并能夠在體內(nèi)表達相應多肽從而誘導免疫反應。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的疫苗中所述病毒選自以下腺病毒、皰疹病毒、EB病毒、腺病毒伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦病毒、登革病毒、噬菌體或者其任何組合。更優(yōu)選的實施方案中，所述病毒為腺病毒。最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的基因疫苗為rvAdEasyNSP4。
本發(fā)明所述基因疫苗中，質(zhì)?？梢詾閺椭菩突蚍菑椭菩唾|(zhì)粒。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的基因疫苗為pCI-NSP4。
本發(fā)明的基因疫苗可以制成注射劑、口服劑、滴鼻劑、噴霧劑或透皮劑形式，以合適的方式給藥。
基于本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領域技術人員可以利用輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因來開發(fā)各種用于預防或者治療由輪狀病毒引起的疾病。因此，本發(fā)明也公開了輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因作為疫苗的用途。
本發(fā)明的基因疫苗可以用于免疫動物，制備預防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體制劑。
本發(fā)明也公開了預防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體的生產(chǎn)方法，包括用本發(fā)明中公開的基因疫苗免疫動物，在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體并分離出該抗體。所述動物可以是本領域技術人員熟知的可以用來制備抗體的動物，例如牛、馬、兔、羊、鼠或者禽類。


圖1為重組腺病毒的PCR檢測結(jié)果。
1野生型腺病毒Ad52rvAdEasyNSP4(全長基因)3DL2000 DNA分子量標記4rvAdEasyNSP4(編碼區(qū)基因)圖2為重組腺病毒rvAdEasyNSP4中特異性NSP4基因片段Southernblot檢測。
1Ad5/BamH I陰性對照2rvAdEasyNSP4/BamH I圖3為重組腺病毒中NSP4基因RT-PCR檢測結(jié)果。
1陰性對照
2DL2000 DNA分子量標記3rAdEasyNSP4圖4為rAdEasyNSP4表達產(chǎn)物的Western blot分析。
1rAdEasyNSP4(293細胞沉淀)2野生型Ad53rAdEasyNSP4(293細胞培養(yǎng)上清)圖5為重組腺病毒rvAdEasyNSP4免疫小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ的測定。
Ein滴鼻實驗組Eis灌胃實驗組Cin滴鼻對照組Cis灌胃對照組對照組野生型5型腺病毒圖6為重組腺病毒rvAdEasyNSP4各次免疫后血清IgG抗體的陽轉(zhuǎn)率。
1vacc第1次免疫2vacc第2次免疫3vacc第3次免疫Ad5野生型腺病毒rvAdEasyNSP4重組腺病毒圖7為輪狀病毒SA11病毒攻擊后乳鼠的腹瀉百分率。
Control對照組Ein滴鼻實驗組Eis灌胃實驗組橫坐標數(shù)字代表病毒攻擊后的天數(shù)圖8為SA11病毒攻毒后灌胃組的腹瀉評分。
Control對照組Eis灌胃實驗組橫坐標數(shù)字代表病毒攻擊后的天數(shù)圖9為SA11病毒攻毒后滴鼻組的腹瀉評分。
Control對照組Ein滴鼻實驗組橫坐標數(shù)字代表病毒攻擊后的天數(shù)圖10為pCI-NSP4在293細胞表達的間接免疫熒光檢測。
ApCI質(zhì)粒對照轉(zhuǎn)染293細胞BpCI-NSP4轉(zhuǎn)染293細胞圖11為DNA疫苗pCI-NSP4免疫后血清特異性抗NSP4 IgG抗體的平均滴度。
系列1pCI系列2pCI-NSP具體實施方式
下面結(jié)合優(yōu)選實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體的實驗方法，通常按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實驗室手冊(Sambrook，et al.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。
實施例1本實施例的內(nèi)容是以腺病毒為載體，表達人輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4，在小鼠模型上對重組腺病毒的免疫效果進行了研究，在動物水平上證明該重組腺病毒有望作為新型輪狀病毒疫苗。具體步驟如下1.將NSP4基因克隆入穿梭載體pShuttle-CMV用內(nèi)切酶Sal I和Not I(New England Biolabs)分別雙酶切pGEM-11zf-NSP4質(zhì)粒(參見王大燕，王健偉等.人輪狀病毒NSP4蛋白的表達及其致小鼠腹瀉模型的初步建立.中國病毒學，2003，18(3)217-220；王大燕，王健偉，于修平等.中國輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4基因變異特征的分析.中華實驗和臨床病毒學雜志，2003，17(1)10-14)和穿梭質(zhì)粒pAdShuttle-CMV(參見He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system for generating recombinantadenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，952509-14)pShuttle-CMV 1μl，NSP4片段14μl，10×連接酶緩沖液2μl，DNA連接酶1μl，補水至20μl，12-16℃連接過夜。取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH10B(Invitrogen)。挑取氨芐青霉素(Amp)抗性克隆，用含Amp的LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)后，以堿裂解法小量制備質(zhì)粒，用Sal I和Not I雙酶切鑒定，得到插入有NSP4的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-NSP4。
2.重組腺病毒的獲得用堿裂解法小量制備上述克隆有外源基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-NSP4及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，并溶解于70μlddH2O中備用。取約500ng重組穿梭質(zhì)粒，用Pme I單酶切以線性化，無水乙醇沉淀，溶解于6μl無菌去離子中，與約100ng pAdEasy-1(見He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplifiedsystem for generating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，952509-14)轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183(Stratagen)，取細菌懸液分別涂入含50μg/ml卡那霉素(Kan)的培養(yǎng)板中，于37℃培養(yǎng)16-20小時，挑選單菌落，接種至2ml含有Kan(25μg/ml)的培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃搖床培養(yǎng)10-15小時，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，獲得了重組腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasyNSP4。所得重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過瓊脂糖電泳初篩后用Pac I(New England Biolabs)酶切進一步鑒定，可產(chǎn)生4.5Kb左右的片段。將所得重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以氯化鈣法制備的宿主菌DH10B(rec A1，endA1)感受態(tài)細胞，在此宿主菌中可產(chǎn)生高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，挑取目的克隆，經(jīng)酶切鑒定后，-70℃保存菌種備用。
用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)提取重組腺病毒質(zhì)粒，Pac I酶切，無水乙醇沉淀回收片段，溶于無菌去離子水中。在T-12.5培養(yǎng)瓶(Nunc)中培養(yǎng)293細胞(美國ATCC)，轉(zhuǎn)染時細胞的豐度應為50％-70％。將Pac I酶切線性化后的重組腺病毒DNA 20μl及8μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen公司產(chǎn)品)分別與100μl M液(無抗生素、無血清的含有谷氨酰胺及NaHCO3的DMEM培養(yǎng)液)充分混勻，室溫下溫育15分鐘，混合兩種懸液室溫繼續(xù)作用30分鐘。在上述等候的時間里，移去293細胞的原培養(yǎng)液，用2ml M液洗細胞2次。補加800μl M液至Lipofectamine2000-DNA的復合物中，輕輕混勻后接種293細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱，溫育3-5小時。吸棄含DNA/脂質(zhì)體復合物的培養(yǎng)液，補加含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后6-7天，細胞出現(xiàn)腫脹變圓等細胞病變(CPE)，收集細胞與上清液一起-70℃、37℃反復凍融3次(也可以超聲破碎)，取適量的凍溶液接種293細胞，以含2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞病變，按上述方法收病毒傳代一次。所得重組腺病毒命名為rvAdEasyNSP4。
3.重組腺病毒的鑒定(1)形態(tài)學鑒定293細胞培養(yǎng)rvAdEasyNSP4重組腺病毒，待細胞病變完全后，反復凍融3次，15000rpm，離心10分鐘，取上清，磷鎢酸負染后在透射電子顯微鏡下觀察呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為70nm，具有典型的腺病毒形態(tài)。
(2)PCR分析將重組腺病毒rvAdEasyNSP4接種293細胞，約3天后離心收集細胞沉淀，用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)提取DNA，分別用NSP4全長引物和編碼區(qū)引物，對經(jīng)反復凍融后獲得的重組腺病毒模板進行PCR擴增，反應條件為94℃滅活3分鐘，開始PCR循環(huán)，條件為94℃60秒，54℃60秒，72℃60秒，共30次，最后72℃延伸7分鐘。
PCR引物由上海生工生物工程公司合成NSP4全長引物BegRV10F 5’GGCTTTTAAAAGTTCTGTTC3’(SEQ ID NO1)EndRV10R 5’GGTCACGCTAAGACCATTCC3’(SEQ ID NO2)NSP4編碼區(qū)引物
BegRV10F0203 5’TGCGAATTCATGGATAAGCTTGCCGAC3’(SEQ ID NO3)EndRV10R0203 5’AACCTCGAGCATGGATGCAGTCACTTC3’(SEQ ID NO4)分別用NSP4全長引物和編碼區(qū)引物進行PCR擴增，可以檢測到750bp和525bp的特異性擴增條帶，野生型腺病毒Ad5為陰性，說明重組腺病毒基因組中整合有NSP4基因(見圖1)。
(3)Southern Blotting采用Roche公司探針標記與雜交試劑盒，按說明書操作進行。結(jié)果表明在重組腺病毒中確有特異性的RV NSP4基因穩(wěn)定整合。實驗中使用了野生型Ad5作為陰性對照(見圖2)。
(4)外源基因的表達檢測1)RT-PCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄收取重組腺病毒及野生型Ad5感染的293細胞，用800μl Trizol試劑(Invitrogen)處理細胞，按試劑盒說明提取總RNA，溶于20μl DEPC處理水中，用0.5μl DNase I(Takara)處理RNA樣品，除去污染的痕量DNA。加入DMSO 1μl，上下游引物各1μl，RNA 5μl，dNTP 4μl，10×PCRbuffer 5μl，Rnasin 0.5μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)1μl，補加DEPC水至50μl，42℃反應1小時逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后補加1μl Taq酶(TaKaRa公司)進行PCR反應，反應條件同前。用野生型Ad5作為陰性對照，經(jīng)RT-PCR獲得的cDNA，與預計的大小一致，而Ad5則為陰性，表明重組腺病毒在293細胞內(nèi)均能有效轉(zhuǎn)錄(見圖3)。
2)Western blotting分析目的蛋白表達待293細胞生長至70％-80％豐度時，接種重組腺病毒，收獲感染的細胞，離心，分別取上清和細胞沉淀，取上清80μl，細胞沉淀用80μl PBS重懸，分別加入20μl 5×上樣緩沖液，15％SDS-PAGE電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，進行Western blotting檢測?？梢娚锨搴统恋碓?0KD附近均檢測到特異的條帶，Ad5對照無特異條帶產(chǎn)生，說明腺病毒攜帶的NSP4基因得到表達(見圖4)。
4.免疫效果觀察(1)免疫方法將6-8周齡雌性BalB/c純系小鼠(購自軍事醫(yī)學科學院動物中心)隨機分組，接種前，通過小鼠尾部采取基礎血，輪狀病毒抗體檢測均為陰性。鼻腔接種時，先用乙醚麻醉小鼠，然將100μl[2×108熒光形成單位(IFU)]的重組腺病毒滴入小鼠鼻腔；口服接種時直接用注射器將200μl(2×108IFU)的重組腺病毒注入小鼠胃內(nèi)。4周和8周后，再次經(jīng)尾部采血，并用與初次免疫時等量的病毒加強免疫，對照組，接種等量的野生型5型腺病毒，其它處理完全相同。
(2)小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ的檢測免疫后小鼠(實驗組和對照組分別滴鼻免疫5只，灌胃免疫5只)摘眼球處死，在75％乙醇中浸泡后，超凈臺中取脾臟，200目篩網(wǎng)研磨，加入5ml 1640無血清培養(yǎng)液中，離心去上清，加入氯化銨輕輕混勻1分鐘后，馬上離心，1500轉(zhuǎn)，6分鐘，去上清，加入4ml無血清1640，1500轉(zhuǎn)，10分鐘，洗滌一次，加入1ml 1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)目，調(diào)整細胞數(shù)，以2×106/ml濃度加入到96孔板中，100μl/孔，5小時后，待細胞貼壁，去上清，每孔再加入①含有NSP4蛋白的1640完全培養(yǎng)液，用量為1μg/孔；②相應的對照孔僅加入1640完全培養(yǎng)液，取培養(yǎng)72小時的上清50μl用于檢測IFN-γ。
使用小鼠IFN-γ檢測試劑盒進行(Amsham Pharmacia公司)進行檢測。根據(jù)系列稀釋的IFN-γ標準品的ELISA 450nm吸光度值(A450)繪制出標準曲線，根據(jù)標準曲線計算出每組小鼠脾細胞IFN-γ的分泌量。發(fā)現(xiàn)滴鼻組能夠產(chǎn)生IFN-γ最高可達138.2pg/ml，平均為57.1pg/ml，而對照組沒有顯著性差別，證明重組腺病毒可誘導針對NSP4的細胞免疫反應。(見圖5)(3)小鼠血清標本中NSP4的特異性IgG抗體檢測用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋純化的GST-NSP4T(見王大燕，王健偉等.人輪狀病毒NSP4蛋白的表達及其致小鼠腹瀉模型的初步建立.中國病毒學，2003，18(3)217-220)蛋白包被96孔平底酶標板(Costar)，每孔100μl(1μg)，4℃過夜，用含0.05％Tween的PBS(PBST)，pH7.4，洗板4次，以PBST配制含1％BSA的封閉液，按350μl/孔，封閉抗原包被孔，37℃1小時，洗板。加入經(jīng)適當稀釋的待檢小鼠血清標本(抗體稀釋液為PBST中加入BSA，終濃度為0.1％)，100μl/孔，做復孔，37℃1小時，洗板5分鐘×4次。加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)，37℃1小時，洗板5分鐘×6次。加入TMB及H2O2底物，37℃作用15分鐘，每孔加入50μl 2mol/L H2SO4終止顯色反應，讀取A450值。以P＞0.1且P/N≥2.1判為陽性。P待測孔A值，N陰性對照組A值(在本實驗中以野生型腺病毒免疫組測得的A值作為N值)。
結(jié)果表明，初次免疫后血清抗體的滴度可達1∶1000，陽轉(zhuǎn)率為28.5％；再次免疫后，最高血清抗體滴度仍為1∶1000，但是血清抗體陽轉(zhuǎn)率有了較大幅度的提高，達到了85.7％；第三次免疫后，血清抗體陽轉(zhuǎn)率達到100％(見圖6)。第三次免疫后42.9％的小鼠血清抗體滴度達到了1∶10,000。證明重組腺病毒可誘導針對NSP4的特異性體液免疫。
(4)小鼠血清中特異性抗NSP4 IgA抗體的檢測方法同上，二抗為1∶2000稀釋的HRP標記的抗鼠IgA抗體(Sigma公司產(chǎn)品)。在第三次加強免疫后，血清IgA的滴度為1∶50-100，陽轉(zhuǎn)率可以達到71.4％，證明重組腺病毒可有效誘導針對NSP4的黏膜免疫。
(5)乳鼠攻毒試驗為了評價針對NSP4免疫的保護效果及其作用機制，我們將小鼠免疫3次后與雄性小鼠(輪狀病毒抗體陰性)合籠，使其懷孕，對生產(chǎn)的乳鼠(4日齡)通過灌胃途徑用SA11株輪狀病毒攻擊，觀察腹瀉的產(chǎn)生情況并進行腹瀉評級，即將腹瀉分為4級，1級為松軟的黃色糞便，4級為完全的水樣便。2級(水樣粘液便帶有固體松軟糞便)以上的才判為腹瀉。為了保證評價標準的一致性，腹瀉的判斷由同一人完成。圖7、圖8、圖9顯示rvAdEasyNSP4免疫組的腹瀉的百分率和腹瀉評分(反應腹瀉嚴重程度)均較對照組低，表明表達NSP4的重組腺病毒免疫小鼠后能產(chǎn)生針對SA11株輪狀病毒的免疫保護作用。
上述實施實例表明，我們獲得的人輪狀病毒NSP4基因非復制型重組腺病毒rvAdEasyNSP4，能誘導小鼠產(chǎn)生較強的針對輪狀病毒NSP4的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫，滴鼻和灌胃途徑免疫小鼠均能產(chǎn)生針對SA11株輪狀病毒的免疫保護作用，能降低腹瀉的百分率和腹瀉的嚴重程度。由此推之，本發(fā)明的思路也適用于其他的粘膜表達載體。
本發(fā)明證明，在重組腺病毒rvAdEasyNSP4免疫過的母鼠產(chǎn)生免疫反應之后，其產(chǎn)下的乳鼠對輪狀病毒攻擊有抵抗作用，這提示抗NSP4的IgG具有保護作用——因為已知只有IgG可以通過胎盤，活化T細胞、IgA等不能通過胎盤。因此有理由相信，基于NSP4的基因疫苗也可以用于免疫多種動物，如牛、羊、馬、兔、鼠等，或雞等禽類，生產(chǎn)抗NSP4抗體用于預防或治療輪狀病毒腹瀉；也可以通過給動物注射基因疫苗的方式，通過誘導母體的免疫反應來預防幼仔的輪狀病毒腹瀉。
實施例2本實施例中我們構(gòu)建了表達不同基因型NSP4蛋白的真核表達質(zhì)粒，并通過肌肉注射法免疫小鼠，對免疫學效果進行了檢測。本內(nèi)容也適用于其他真核表達載體。具體步驟如下1.真核表達質(zhì)粒pCI-NSP4的構(gòu)建EcoR I和Kpn I分別雙酶切質(zhì)粒pFastBacHTa-NSP4(見王大燕，王健偉等.我國人輪狀病毒不同基因型NSP4的致病性研究，中國病毒學，發(fā)表中)和pCI載體(Promega公司)，經(jīng)T4 DNA連接酶4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，堿裂解法小提質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Kpn I雙酶切鑒定陽性克隆，可以切下約750bp的目的片段。對經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆進行序列測定(由上海生工生物工程公司完成)。
2.NSP4基因在哺乳動物細胞中的表達測試用QIAGEN plasmid Midi Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒DNA，溶于無內(nèi)毒素水中備用。質(zhì)粒提取操作方法按試劑盒說明書進行。在T-25培養(yǎng)瓶(Nunc公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)293細胞(購自美國ATCC)，轉(zhuǎn)染時細胞的豐度應為50％-70％(24小時內(nèi))。pCI-NSP4質(zhì)粒20μl(約5μg)及10μl的Lipofectamine2000(Invitrogen)分別與100μl M溶液(M溶液為無抗生素、無血清的含有谷氨酰胺及NaHCO3的DMEM培養(yǎng)液)充分混勻，室溫下溫育15分鐘，輕輕混合兩種懸液，室溫繼續(xù)作用30分鐘。移去293細胞的原培養(yǎng)液，用2ml M溶液洗細胞2次。補加800μlM溶液至Lipofectamine2000-DNA的復合物中，輕輕混勻后，接種293細胞，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，溫育3-5小時。補加4ml含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，溫育過夜。約24小時后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復合物的培養(yǎng)液，補加5ml DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染3天后刮取293細胞，涂抗原片，用風扇吹干(低倍鏡下觀察是否有足夠的細胞且分布均勻，可保存于-80℃?zhèn)溆?。按常規(guī)方法進行間接免疫熒光試驗(IFA)檢測，用激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)觀察熒光，可以看到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞漿內(nèi)有NSP4抗原的表達，而pCI空載體轉(zhuǎn)染的細胞未見到特異性的熒光(見圖10)，證明我們構(gòu)建的表達質(zhì)粒能夠在真核細胞中有效表達NSP4蛋白，可用于基因免疫。
3.DNA疫苗的制備將800ml含有重組質(zhì)粒的細菌的新鮮培養(yǎng)物利用QIAGENEndofree plasmid Mega kit(Qiagen公司)大量提取DNA，操作按照試劑盒說明進行，DNA溶于試劑盒中提供的無內(nèi)毒素的TE(pH8.0)中。
(1)濃度測定測定核酸溶液在260nm的光密度。1A≈50μg雙鏈DNA。
(2)純度測定1)分光光度法樣品的A260/A280應在1.8～2.0之間。
2)瓊脂糖凝膠電泳法應為單一的條帶，無RNA條帶存在。
3)酶切鑒定法酶切片段與預期的酶切結(jié)果相符。
4.動物免疫試驗(1)免疫方法選取6周齡BalB/C雌性小鼠，分為2組①pCI(5只)；②pCI-NSP47只)。注射用DNA的濃度為1μg/μl，每只小鼠每次肌肉注射100μg，每間隔4周免疫1次，共免疫5次，在每次免疫前采鼠尾血進行抗體測試，在最后一次免疫后4周將小鼠放血處死。給小鼠注射時在注射器的針頭上加套一個小管，使針頭僅外漏2-3毫米，以保證每次注射時針頭扎入的深度一致，并注射到肌肉中。將針頭垂直扎入脛骨前肌，把100μl 0.25％的無菌蔗糖溶液注射入肌肉內(nèi)。將針頭保持3-5秒，防止泄漏，然后將針拔出。間隔24小時后，在同一部位按照相同方法將100μl濃度為1μg/μl的DNA溶液注射到脛骨前肌內(nèi)。
(2)特異性抗體檢測用ELISA測定抗體的效價，具體方法如下用表達純化的NSP4蛋白(見王大燕，王健偉等.人輪狀病毒NSP4蛋白的表達及其致小鼠腹瀉模型的初步建立.中國病毒學，2003，18(3)217-220)為抗原包被酶標板(Costar公司)，每孔100μl(10ng/μl)，4℃過夜，酶標板用PBS-T洗3×5分鐘后，每孔加入不同稀釋度的待測血清100μl(用含0.1％BSA的PBST作為抗體稀釋液)，37℃反應1小時，PBS-T洗3×5分鐘，加入HRP標記的抗小鼠IgG抗體(用抗體稀釋液作1∶5000稀釋)，每孔100μl，37℃1小時，PBS-T洗5×5分鐘，加入底物TMB溶液，每孔100l，37℃15-30分鐘，加入50μl 2mol/L硫酸作為終止液，在450nm波長讀取吸光度值。以P/N≥2.1為陽性。(P為實驗組血清A值，N為pCI空載體免疫組相應稀釋度血清A值)。
IgG抗體滴度的檢測方法如下第一次免疫后血清樣品從1∶16開始作倍比稀釋，第二次和第三次免疫后從1∶64開始作倍比稀釋，第四次、第五次免疫后從1∶100開始倍比稀釋至1∶800，對陽性血清進一步進行1∶1,000和1∶10,000稀釋。每個稀釋度做兩個復孔，酶標檢測儀測定每孔的吸光度值。結(jié)果取兩個復孔的吸光度值的平均值，空白對照調(diào)零。血清最高稀釋度的倒數(shù)即為免疫小鼠血清IgG抗體滴度。
我們一共進行了5次免疫。以每一組所有小鼠的抗體滴度的幾何平均值作為平均抗體滴度，圖11顯示了免疫小鼠血清的特異性抗NSP4 IgG抗體滴度。免疫前血清為陰性結(jié)果，小鼠第一次免疫后即能檢測到特異性抗體，但是抗體滴度較低，加強免疫后，特異性結(jié)合抗體逐步升高，尤其在第三次免疫后滴度迅速升高。第四次免疫后抗體滴度達到1∶800的比例為85.7％，第五次免疫后滴度達到1∶1000的比例為100％。
由于在實施例1中，我們已證明抗NSP4的IgG具有良好的保護作用，因此我們主要檢測了NSP4 DNA疫苗誘導IgG抗體的情況，結(jié)果表明DNA免疫可以有效誘導針對NSP4的抗體，這提示表達NSP4的DNA疫苗也可以有效激發(fā)免疫反應。
序列表<110>王健偉王大燕洪濤<120>基于NSP4基因的輪狀病毒基因疫苗<130>CP1050016<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1ggcttttaaa agttctgttc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2ggtcacgcta agaccattcc 20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3tgcgaattca tggataagct tgccgac 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4aacctcgagc atggatgcag tcacttc 2權利要求
1.一種輪狀病毒基因疫苗，其中含有輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因，所述基因插入作為疫苗載體的病毒、細菌或者質(zhì)粒中，并能夠在體內(nèi)表達相應多肽而誘導免疫反應。
2.權利要求1的基因疫苗，其中所述病毒選自以下腺病毒、皰疹病毒、EB病毒、腺病毒伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦病毒、登革病毒、噬菌體或其任何組合。
3.權利要求2的基因疫苗，其中所述病毒為腺病毒。
4.權利要求3的基因疫苗，其為rvAdEasyNSP4。
5.權利要求1的基因疫苗，其中所述質(zhì)粒為復制型或非復制型質(zhì)粒。
6.權利要求5的基因疫苗，其為pCI-NSP4。
7.權利要求1-6之一的基因疫苗，其為注射劑、口服劑、滴鼻劑、噴霧劑或透皮劑形式。
8.輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因作為疫苗的用途。
9.權利要求1-7之一的基因疫苗用于免疫動物制備預防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體制劑的用途。
10.預防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體的生產(chǎn)方法，包括用權利要求1-7之一的基因疫苗免疫動物，在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體并分離出該抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型疫苗的研制。具體而言，本發(fā)明涉及基于NSP4基因的輪狀病毒基因疫苗及其應用。
文檔編號A61K31/12GK1663616SQ20051000740
公開日2005年9月7日 申請日期2005年2月5日 優(yōu)先權日2005年2月5日
發(fā)明者王健偉, 王大燕, 洪濤 申請人:王健偉, 王大燕, 洪濤