專(zhuān)利名稱(chēng)：方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中記載了疫苗接種方法，例如可參見(jiàn)Prayaga et al((1997)Vaccine 15(12-13)1349-1352)，Kilpatrick et al(1997)Hybridoma 16381-389，Kilpatrick et al(1998)Hybridoma 17569-576，Pertmer et al(1995)Vaccine 13；1427-1430以及Olsen et al(1997)Vaccine 15；1149-1156。然而，仍需對(duì)核酸給藥方案進(jìn)行優(yōu)化，包括可特異性誘導(dǎo)增強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)應(yīng)答的核酸給藥方案。這對(duì)于預(yù)防和治療很大范圍的免疫、炎性和感染性疾病和障礙特別有益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種誘發(fā)(或增強(qiáng))體內(nèi)CMI應(yīng)答的方法。具體地說(shuō)，該方法誘發(fā)(或增強(qiáng))體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答。
因此，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物宿主受試者中誘發(fā)針對(duì)T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括(i)第一次免疫，包括對(duì)受試者進(jìn)行相隔1到14天的至少兩次給藥，其中每次給藥包括給予編碼T細(xì)胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任選地，(ii)第二次免疫，包括給予受試者至少一次(a)編碼T細(xì)胞表位的NOI，或者(b)包含T細(xì)胞表位的蛋白，其中-第一次免疫的第一次給藥與-第二次免疫的第一次給藥的時(shí)間間隔為21到365天。
本發(fā)明概述以下公開(kāi)內(nèi)容討論了由所給予的NOI編碼的序列，如表位或抗原。應(yīng)該理解，在第二次以及隨后免疫的情形下，可給予包含相同表位或抗原的蛋白代替所述NOI。
本發(fā)明涉及一種誘發(fā)針對(duì)所研究的T細(xì)胞表位(EOI)的T細(xì)胞應(yīng)答的方法。如上所述，該方法包括給予編碼EOI的NOI。在該方法中，可給予至少2、4、6、10或20或更多(高達(dá)并且包括例如40)種不同的NOI，其中每種NOI編碼相同的表位。或者每次給予NOI時(shí)均給予相同的NOI。類(lèi)似地，在給予包含EOI的蛋白的實(shí)施方案中，應(yīng)該理解，可給予包含該表位的至少2、4、10或更多(高達(dá)并且包括例如20)種不同的蛋白。或者每次給予蛋白時(shí)，給予相同的蛋白(它包含該表位)。
本發(fā)明一方面提供了一種誘發(fā)針對(duì)哺乳動(dòng)物宿主受試者中的至少一種靶抗原(TA)的增強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)應(yīng)答的方法；其中該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物宿主受試者給予至少兩次編碼TA中的一種或多種所研究表位(EOI)的所研究的核苷酸序列(NOI)；其中每次給予NOI的時(shí)間間隔從約48小時(shí)到約144小時(shí)；并且該方法可有效提供針對(duì)哺乳動(dòng)物宿主受試者中的所述或每種表達(dá)的EOI的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答。
本發(fā)明可用于預(yù)防性和/或治療性地免疫調(diào)節(jié)對(duì)靶抗原(TA)的所研究的一個(gè)或多個(gè)表位(EOI)的CMI應(yīng)答。所誘導(dǎo)的應(yīng)答的時(shí)程使得可以開(kāi)發(fā)對(duì)已經(jīng)存在的T細(xì)胞介導(dǎo)障礙進(jìn)行免疫治療，以及幫助較寬地保護(hù)免受隨后遇到的抗原的傷害的有效方案。
本發(fā)明該方面的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠在不使用相關(guān)的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑和/或佐劑的前提下增強(qiáng)CMI應(yīng)答。
本發(fā)明方法可導(dǎo)致產(chǎn)生活化T細(xì)胞?；罨疶細(xì)胞可有多種潛在用途。例如，在人類(lèi)治療的情況下，可考慮分離活化T細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后給予宿主受試者，以治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫障礙和/或病毒感染或癌癥患者。T細(xì)胞可由下列過(guò)程制備體內(nèi)給予NOI，然后分離T細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)纳飸?yīng)答調(diào)節(jié)劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑和/或佐劑(例如但不限于肽、細(xì)胞因子和抗原呈遞細(xì)胞)的存在下進(jìn)行體外擴(kuò)增。
用于本發(fā)明方法的NOI包括但不限于調(diào)節(jié)序列控制下的DNA序列，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)DNA序列的表達(dá)。所述NOI編碼T細(xì)胞表位，因而通常編碼包含該表位的蛋白。因此，所述NOI優(yōu)選能夠在受試者細(xì)胞中表達(dá)所述表位(包括包含該表位的蛋白)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞表位可為輔助T細(xì)胞和/或CD8+T淋巴細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)表位。因而，由本發(fā)明方法誘發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答可為輔助和/或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。該應(yīng)答更優(yōu)選為CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，如細(xì)胞毒應(yīng)答。
給藥方案本發(fā)明方法包括多組給藥，這里稱(chēng)為“免疫”。因而，該方法可包括1、2、3、4、5或更多(例如高達(dá)并包括10)組免疫，這里稱(chēng)為“第一次免疫”“第二次免疫”等。
任何一次免疫(例如第一次和/或第二次或所有的免疫)的一次或多次或所有的給藥可進(jìn)行2到14天(即該次免疫的第一次和最后一次給藥相互間隔2到14天以?xún)?nèi))，如3到12天或4到8天。第一次免疫優(yōu)選進(jìn)行2到14天，如3到12天或4到8天。
一次或多次或所有的免疫可包括2到50(如5到40或10到30)次給藥。因而，通常在一次或多次或所有的免疫中，可進(jìn)行至少2次，如至少3、5、10、30、50或更多次(例如高達(dá)并且包括100次給藥)給藥。第一次免疫優(yōu)選(并且隨后視情況進(jìn)行一次或多次免疫)包括3到20次給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法(即所有的免疫總共)包括3到50次，如5到40次或10到30次給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一次以上的給藥(通常2到5次給藥)可在相同時(shí)間點(diǎn)(如同一天，或者相互之間在一天內(nèi)、相互之間在12小時(shí)內(nèi)、相互之間在2小時(shí)內(nèi)或相互之間在1小時(shí)內(nèi))進(jìn)行。如下文所述，在相同時(shí)間點(diǎn)的給藥可給予至相同或不同的部位。
一次或多次或所有的免疫可包括在2到10個(gè)，如3到5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)給藥，其中所述時(shí)間點(diǎn)優(yōu)選在不同的天。因而，一次或多次或所有的免疫可包括在2到10個(gè)，如3到5個(gè)不同的天中給藥。在第一次和第二次免疫中，優(yōu)選在3或4個(gè)不同的天中給藥。
在一次或多次或所有的免疫情況下，該次免疫的2、3、4或更多次給藥可相隔2到14天，如相隔3到10天或4到8天。對(duì)于一次或多次或所有的免疫，該次免疫的2、3、4或更多次給藥優(yōu)選相隔2到6天。
兩次免疫之間的時(shí)間在這里限定為兩次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間。通常第一次和第二次免疫之間的時(shí)間(優(yōu)選所有免疫之間的時(shí)間)為21到365天，如28到300天、50到250天或者100到200天。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法所有免疫進(jìn)行21到365天，如28到300天、50到250天或者100到200天。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，NOI通常給予2到5次(在2到5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn))，如2、3或4次(分別在2、3或4個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn))。通常所述給藥進(jìn)行2到14天，例如4到12天或6到10天。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少2、3或4次給予NOI可間隔3天或少于3天進(jìn)行，如間隔2天或少于2天。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一次和第二次給藥之間的時(shí)間少于4天，通常少于3.5天，如3天或少于3天，或者2天或少于2天。
優(yōu)選地，在本文所述的給藥之間不將NOI給予受試者，通常在所述的NOI給藥之間不給予可激發(fā)免疫應(yīng)答的其他制品(如多肽抗原)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文所提及的任何給藥方案中，在第一次NOI給藥前至少7天，如至少14天或至少28天，不將NOI或可激發(fā)免疫應(yīng)答的其他制品(如多肽抗原)給予受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文所提及的任何給藥方案中，在最后一次NOI給藥后至少7天，如至少14天或至少28天，不將NOI或可激發(fā)免疫應(yīng)答的其他制品(如多肽抗原)給予受試者。
在給予NOI的各次給藥中(或者在各個(gè)時(shí)間點(diǎn))，通常為受試者提供約1pg至約5mg NOI，優(yōu)選約10pg至約100μg，如25pg至1μg或50pg至約500pg。如上所述，在第二次以及隨后的(如果可用)免疫中可給予蛋白。在各次給藥(或者在各時(shí)間點(diǎn))通常給予約0.1μg至20mg蛋白，優(yōu)選1μg至5mg，如10μg至500μg。
如上所述，在本發(fā)明方法中，給予NOI，以及任選地還給予蛋白。在某些實(shí)施方案中，將NOI或蛋白與佐劑或編碼該佐劑的NOI同時(shí)給藥。在該實(shí)施方案中，佐劑優(yōu)選為無(wú)毒性形式的大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)或者霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)霍亂毒素(CT)。佐劑可包括LT腸毒素的A或B亞基(LTB)，或者CT霍亂毒素的B亞基(CTB)。
加入佐劑，特別是加入基因佐劑可用于進(jìn)一步增強(qiáng)或調(diào)節(jié)CMI應(yīng)答。因此，用于增強(qiáng)CMI應(yīng)答的本發(fā)明方法可通過(guò)在NOI或蛋白(或者包括NOI或蛋白的組合物)中加入佐劑來(lái)改進(jìn)，這樣可產(chǎn)生可誘發(fā)長(zhǎng)期存在并持續(xù)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答的特別有效的組合物和方法。
NOI或蛋白優(yōu)選以粒子形式給藥。在本發(fā)明方法中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI或蛋白透皮給藥。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，粒子通過(guò)粒子加速設(shè)備給予哺乳動(dòng)物宿主受試者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行給藥方案之后，確定該方案是否導(dǎo)致激發(fā)CMI(如CTL應(yīng)答)。這可通過(guò)例如測(cè)定來(lái)自受試者的樣本中的T細(xì)胞(如CTL)的存在或者水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。所檢測(cè)的T細(xì)胞通常對(duì)于由NOI編碼的表位具有特異性。
本發(fā)明的其他方面在所附的權(quán)利要求書(shū)以及下面的敘述和附圖中提出。這些方面在不同的小節(jié)標(biāo)題下進(jìn)行說(shuō)明。然而，應(yīng)該理解，各小節(jié)中的教導(dǎo)無(wú)需限制于具體的小節(jié)標(biāo)題。
定義應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于具體的實(shí)例性分子或工藝參數(shù)，因?yàn)樗鼈兝硭?dāng)然地可以變化。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述本發(fā)明具體的實(shí)施方案的目的，并非意在限定。另外，除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施采用病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)中的常規(guī)方法，它們都是本領(lǐng)域中的普通技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見(jiàn)例如Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(第2版，1989)；DNA CloningA Practical Approach，第I和II卷(D.Glover編著)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編著，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；以及Fundamental Virology，第2版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編著)。
本文引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，不論出現(xiàn)于上文還是下文，均通過(guò)援引的方式全文納入本文中。必須注意，在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式“一”“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)的指代對(duì)象，除非內(nèi)容中另有明確說(shuō)明。本申請(qǐng)中使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域中的通用含義，除非另有限定。本申請(qǐng)中使用的下列詞語(yǔ)或短語(yǔ)具有限定的含義。
免疫應(yīng)答免疫系統(tǒng)控制疾病的機(jī)理包括通過(guò)體液免疫誘導(dǎo)中和抗體，以及通過(guò)細(xì)胞免疫產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。本文使用的術(shù)語(yǔ)——針對(duì)靶抗原(TA)(包括EOI)的“免疫應(yīng)答”是指在哺乳動(dòng)物宿主受試者中產(chǎn)生針對(duì)該TA的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“體液免疫應(yīng)答”是指由抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。由體液免疫產(chǎn)生的抗體主要對(duì)細(xì)胞外傳染物有效。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答”是由T淋巴細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。CMI免疫機(jī)制通常對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染和疾病更加有效，這是因?yàn)镃MI機(jī)制中T細(xì)胞的作用方式為，當(dāng)TA出現(xiàn)于晚期時(shí)，記憶T細(xì)胞被活化，產(chǎn)生CMI應(yīng)答，破壞細(xì)胞表面上具有相應(yīng)TA或其部分的靶細(xì)胞，從而殺滅感染性病原體。CMI應(yīng)答由效應(yīng)細(xì)胞(它通過(guò)直接的細(xì)胞間接觸破壞感染的宿主細(xì)胞)和/或釋放分子(如細(xì)胞因子，它具有抗病毒活性)介導(dǎo)，致力于破壞感染源。這樣，以特異性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答為特征的CMI應(yīng)答，在產(chǎn)生針對(duì)由癌癥、病毒、病原微生物和其他細(xì)胞內(nèi)微生物引起的疾病的抗性中至關(guān)重要。
CMI應(yīng)答涉及的T細(xì)胞至少需要兩類(lèi)專(zhuān)門(mén)的T細(xì)胞來(lái)起始和/或增強(qiáng)CMI和體液應(yīng)答。表達(dá)CD4輔助受體的特定T細(xì)胞亞類(lèi)上的抗原受體可為T(mén)輔助(Th)細(xì)胞或CD4T細(xì)胞(下文稱(chēng)T輔助細(xì)胞)，它們識(shí)別與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的抗原肽。與之相比，表達(dá)CD8輔助受體的特定T細(xì)胞亞類(lèi)上的抗原受體稱(chēng)為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)或者CD8+T細(xì)胞(下文稱(chēng)CD8+T細(xì)胞)，它們與展示于MHC I類(lèi)分子上的抗原反應(yīng)。
輔助T細(xì)胞輔助T細(xì)胞或CD4+細(xì)胞可進(jìn)一步分為功能上不同的兩個(gè)亞類(lèi)Th1和Th2，它們?cè)诩?xì)胞因子和效應(yīng)物功能上不同。Th1和Th2應(yīng)答不僅可正向調(diào)節(jié)還可負(fù)向調(diào)節(jié)，使得Th1細(xì)胞應(yīng)答通過(guò)Th1細(xì)胞因子如IL-2、IL-12和IFN-γ增強(qiáng)，通過(guò)Th2細(xì)胞因子如IL-4和IL-10減弱。與之相比，抗體應(yīng)答通過(guò)Th2細(xì)胞因子如IL-4和IL-10增強(qiáng)，但通過(guò)Th1細(xì)胞因子如IFN-γ，以及由單核細(xì)胞產(chǎn)生的、可增強(qiáng)IFN-γ的另一種細(xì)胞因子IL-12下調(diào)。因此，Th1類(lèi)細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2和IL-12可看作誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答的免疫輔助因子。相反，Th2類(lèi)細(xì)胞因子如IL-4和IL-10可看作在某些情況下抑制嚴(yán)重的炎癥應(yīng)答的細(xì)胞因子。
CD8+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞可以多種方式作用。CD8+T細(xì)胞的最熟知的作用是在MHC I類(lèi)分子的存在下殺傷或溶解荷肽抗原的靶細(xì)胞。這就是這些細(xì)胞為什么常被稱(chēng)為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的原因。然而，也許在某些感染的保護(hù)中具有更大關(guān)聯(lián)性的另一種作用是CD8+T細(xì)胞能夠分泌干擾素-γ(IFN-γ)。因此，溶解活性試驗(yàn)和IFN-γ釋放試驗(yàn)在測(cè)量CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答中都有價(jià)值(如下文所述的ELISPOT試驗(yàn))。在感染性疾病中，有證據(jù)顯示，在疾病的早期，疾病癥狀產(chǎn)生之前，CD8+T細(xì)胞可通過(guò)殺傷包含傳染性抗原的傳染物來(lái)起到保護(hù)作用。
增強(qiáng)的CMI應(yīng)答本發(fā)明涉及一種能夠在宿主受試者中增強(qiáng)和/或調(diào)節(jié)針對(duì)靶抗原的CMI應(yīng)答的方法。本文使用的術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”涵蓋了CMI應(yīng)答在所有方面的提高，它包括但不限于對(duì)重復(fù)給予NOI(它編碼TA的EOI)產(chǎn)生的CMI應(yīng)答的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間和/或質(zhì)量受到激發(fā)和/或增加和/或加強(qiáng)和/或上調(diào)。舉例來(lái)說(shuō)，CMI應(yīng)答可通過(guò)下列途徑增強(qiáng)(i)增強(qiáng)可識(shí)別靶抗原的CD8+T細(xì)胞的活化和/或產(chǎn)生和/或增殖；和/或(ii)將CMI應(yīng)答從Th2型變?yōu)門(mén)h1型應(yīng)答。這種增強(qiáng)Th1相關(guān)的應(yīng)答對(duì)響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)感染來(lái)說(shuō)有特別重要的價(jià)值，這是因?yàn)?，如上所述，CMI應(yīng)答通過(guò)活化的Th1(例如IFN-γ誘導(dǎo)的)細(xì)胞增強(qiáng)。
通常，這種增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的特征在于，產(chǎn)生干擾素的CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞的效價(jià)提高，抗原特異性CD8+T細(xì)胞活性提高，以及針對(duì)所研究的抗原的T輔助細(xì)胞1樣免疫應(yīng)答(Th1)(其特征在于，一般與細(xì)胞免疫相關(guān)的亞類(lèi)(例如IgG2a)的抗原特異性抗體效價(jià)提高，通常伴隨著一般與體液免疫相關(guān)的亞類(lèi)(例如IgG1)的抗體效價(jià)降低)而不是T輔助細(xì)胞2樣免疫應(yīng)答(Th2)。
由本發(fā)明方法誘發(fā)的應(yīng)答(如CMI應(yīng)答的增強(qiáng))可通過(guò)多種已知的測(cè)定法來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)淋巴增生(淋巴細(xì)胞活化)測(cè)定、CD8+T細(xì)胞測(cè)定，或者通過(guò)測(cè)定對(duì)致敏受試者中的表位具有特異性的T淋巴細(xì)胞來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如Erickson et al.(1993)J.Immunol.1514189-4199；以及Doe et al.(1994)Eur.J.Immunol.242369-2376)或者可測(cè)量干擾素γ產(chǎn)量的CD8+T細(xì)胞ELISPOT測(cè)定(Miyahara et alPNAS(USA)(1998)953954-3959)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法誘發(fā)調(diào)節(jié)性或抑制性T細(xì)胞應(yīng)答。誘發(fā)這樣一種應(yīng)答可用于例如預(yù)防或治療自身免疫性疾病。
增強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答在本公開(kāi)中，誘發(fā)應(yīng)答通常在誘發(fā)CMI應(yīng)答方面進(jìn)行討論。誘發(fā)CMI應(yīng)答被理解為包括誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。由本發(fā)明方法誘發(fā)的應(yīng)答可以是“增強(qiáng)的”應(yīng)答。如果由本發(fā)明方法誘發(fā)的應(yīng)答強(qiáng)于由對(duì)照方法誘發(fā)的應(yīng)答，其中在對(duì)照方法中給予NOI(如果可用，還可為等量的蛋白)的量與本發(fā)明方法相同，就可以說(shuō)存在“增強(qiáng)的”應(yīng)答。此類(lèi)對(duì)照方法例如可以由在一次給藥中給予NOI(如果可用，還可以是蛋白)構(gòu)成?；蛘撸瑢?duì)照方法可以由在相隔28天的兩次給藥中給予NOI(如果可用，還可以是蛋白)構(gòu)成。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答”涵蓋了T細(xì)胞應(yīng)答在所有方面的提高，它包括但不限于對(duì)重復(fù)給予NOI(它編碼靶抗原的EOI)產(chǎn)生的T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間和/或質(zhì)量受到激發(fā)和/或增加和/或加強(qiáng)和/或上調(diào)。舉例來(lái)說(shuō)，T細(xì)胞應(yīng)答可通過(guò)下列途徑增強(qiáng)增強(qiáng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞的活化和/或產(chǎn)生和/或分布和/或增殖，和/或延長(zhǎng)對(duì)誘導(dǎo)/調(diào)節(jié)T細(xì)胞的NOI(它編碼來(lái)自TA的EOI)的T細(xì)胞應(yīng)答的壽命。宿主受試者中T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)可與宿主受試者中Th1免疫應(yīng)答的增強(qiáng)和/或調(diào)節(jié)有關(guān)。
T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)可通過(guò)多種已知的測(cè)定法來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)淋巴增生(淋巴細(xì)胞活化)測(cè)定、CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性細(xì)胞測(cè)定，或者通過(guò)測(cè)定對(duì)致敏受試者中的表位具有特異性的T淋巴細(xì)胞來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如Erickson et al.(1993)J.Immunol.1514189-4199；以及Doe etal.(1994)Eur.J.Immunol.242369-2376)或者可測(cè)量干擾素γ產(chǎn)量的CD8+T細(xì)胞ELISPOT測(cè)定(Miyahara et al PNAS(USA)(1998)953954-3959)。
抗原每種引發(fā)疾病的媒介物或疾病狀態(tài)都與抗原或者抗原上的免疫顯性表位相關(guān)，在宿主中，這些抗原或者抗原上的免疫顯性表位在免疫識(shí)別中以及最終消除或控制引發(fā)疾病的媒介物或疾病狀態(tài)中是十分重要的。為了增強(qiáng)對(duì)特定疾病的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，宿主免疫系統(tǒng)必須與和該疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原或者抗原上的免疫顯性表位接觸。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指在個(gè)體中可誘發(fā)免疫應(yīng)答的任何媒介物，通常是大分子。免疫應(yīng)答可為B和/或T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。該術(shù)語(yǔ)可用于指代單個(gè)大分子或者同質(zhì)或異質(zhì)的一組抗原性大分子。本文使用的“抗原”用于指代包含一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇或表位的蛋白分子或其部分。
靶抗原本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶抗原(TA)”是指所研究的包含一個(gè)或多個(gè)表位的免疫原性肽或蛋白，所述表位能夠誘導(dǎo)針對(duì)感染性病原體的CMI應(yīng)答，所述感染性病原體例如但不限于細(xì)菌、病毒、真菌、酵母、寄生蟲(chóng)以及能夠感染哺乳動(dòng)物種類(lèi)的其他微生物。靶抗原包括但不限于自身抗原、自體抗原、交叉反應(yīng)抗原、異型抗原、耐受原、變應(yīng)原、半抗原、免疫原或者其部分，以及它們的任何組合。因此，EOI可來(lái)自本文提及的任何類(lèi)型的抗原或蛋白，或者來(lái)自本文提及的任何具體的抗原或蛋白。
表位本文使用的術(shù)語(yǔ)“表位”通常指位于靶抗原上可由T細(xì)胞受體和/或抗體識(shí)別的位點(diǎn)。它優(yōu)選為來(lái)自蛋白抗原的短肽或者作為蛋白抗原一部分的短肽。然而該術(shù)語(yǔ)還意在包括帶有糖肽和糖類(lèi)表位的肽。單個(gè)抗原分子可包括幾個(gè)不同的表位。術(shù)語(yǔ)“表位”還包括能夠激發(fā)可識(shí)別整個(gè)有機(jī)體的應(yīng)答的修飾的氨基酸或糖類(lèi)序列。所選表位最好是引起感染性疾病的傳染物(如細(xì)菌或病毒)的表位。
本文使用的術(shù)語(yǔ)所研究的表位(EOI)是指可用于本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)EOI。本發(fā)明方法可用于誘發(fā)針對(duì)1、2、3、4、5到10個(gè)或者更多不同的表位的T細(xì)胞應(yīng)答。因此，本方法可包括給予一種或多種NOI，它們總共編碼1、2、3、4、5到10個(gè)或者更多不同的表位，和/或給予一種或多種蛋白，它們總共編碼1、2、3、4、5到10個(gè)或者更多不同的表位。
在一個(gè)實(shí)施方案中，采用本發(fā)明方法誘發(fā)針對(duì)預(yù)定(或預(yù)先確定)和/或已知表位的T細(xì)胞應(yīng)答，該表位通常來(lái)自預(yù)定和/或已知蛋白。
表位來(lái)源EOI可根據(jù)肽或多肽的氨基酸序列以及相應(yīng)的DNA序列的知識(shí)產(chǎn)生，也可從具體氨基酸的性質(zhì)(如大小、電荷等)和密碼子字典產(chǎn)生，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)例如Ivan Roitt，Essential Immunology，1988；Kendrew，同上；Janis Kuby，Immunology，1992例如pp.79-81。決定所研究的蛋白或表位是否可激發(fā)應(yīng)答的一些指標(biāo)包括肽長(zhǎng)度——肽應(yīng)該至少8或9氨基酸長(zhǎng)以適合MHC I類(lèi)復(fù)合物，至少8～25，例如至少13～25氨基酸長(zhǎng)以適合II類(lèi)MHC復(fù)合物。此長(zhǎng)度是使肽與MHC復(fù)合物結(jié)合的最小長(zhǎng)度。因?yàn)榧?xì)胞可切割肽，所以肽優(yōu)選大于這些長(zhǎng)度。肽應(yīng)該包含適當(dāng)?shù)腻^定基序(anchor motif)，它可使肽與各種I類(lèi)或II類(lèi)分子以足夠高的特異性結(jié)合，以產(chǎn)生免疫應(yīng)答(參見(jiàn)Bocchia，M.et al，Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion ProteinPentides to HLA Class I Molecules，Blood 852680-2684；Englehard，VH，Structure of peptides associated with class I and class II MHCmolecules Ann.Rev.Immunol.12181(1994))。這可通過(guò)將所研究的蛋白序列與公開(kāi)的MHC分子相關(guān)肽的結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)實(shí)現(xiàn)，而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。因此，技術(shù)人員可通過(guò)對(duì)比蛋白序列與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中所列序列來(lái)確定所研究的表位。
本發(fā)明方法通常用于增強(qiáng)針對(duì)編碼任何來(lái)源(如來(lái)自病原體)的EOI的NOI的CMI應(yīng)答，所述EOI包括來(lái)自于多種傳染物如病毒或寄生蟲(chóng)的EOI。舉例來(lái)說(shuō)，EOI可來(lái)自來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的致病體，所述腫瘤細(xì)胞可在有機(jī)體中無(wú)限制地增殖，因而可導(dǎo)致病理性生長(zhǎng)。此類(lèi)致病體的實(shí)例記載于Davis，B.D.et al(Microbiology，第3版，Harper International Edition).
表位可來(lái)自非哺乳動(dòng)物、非小鼠或者非人類(lèi)蛋白。表位可來(lái)自細(xì)胞內(nèi)蛋白或細(xì)胞外蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，表位來(lái)自分泌型蛋白，例如由病原體分泌的蛋白。表位可以也可以不來(lái)自于正在誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的受試者的蛋白。表位可來(lái)自于能夠感染受試者的病原體。表位可為天然存在的表位，或者非天然存在的人工表位。
然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)增強(qiáng)針對(duì)HIV病毒家族的成分的CMI應(yīng)答來(lái)實(shí)施本發(fā)明?？僧a(chǎn)生針對(duì)位于任何病毒基因(例如gag、pol、nef和env基因)產(chǎn)物內(nèi)的EOI的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答，env基因產(chǎn)物為優(yōu)選靶標(biāo)。
因而在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法誘發(fā)針對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答，以治療和/或預(yù)防HIV感染和/或由HIV感染所引發(fā)或加重的任何疾病，如AIDS。
T細(xì)胞表位在本發(fā)明方法或過(guò)程之中，TA的EOI可包含一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位。本文使用的術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞表位”通常指能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的肽結(jié)構(gòu)特征。關(guān)于這一點(diǎn)，本領(lǐng)域中普通認(rèn)為，T細(xì)胞表位包括線性的肽決定簇，它在MHC分子的肽結(jié)合缺口內(nèi)呈現(xiàn)出延伸的構(gòu)象(Unanue et al.(1987)Science 236551-557)。本文使用的T細(xì)胞表位通常是具有至少約3～5個(gè)氨基酸殘基的肽，優(yōu)選至少5～10個(gè)或更多氨基酸殘基，例如8到25個(gè)氨基酸殘基。然而，本文使用的術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞表位”涵蓋了任何MHC I類(lèi)或MHC II類(lèi)限制性肽。特定的T細(xì)胞表位激發(fā)/增強(qiáng)CMI應(yīng)答的能力可由多種已知的試驗(yàn)測(cè)定，例如通過(guò)淋巴增生(淋巴細(xì)胞活化)試驗(yàn)、CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性細(xì)胞試驗(yàn)，或者通過(guò)測(cè)定對(duì)致敏受試者中的表位具有特異性的T淋巴細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。參見(jiàn)例如Erickson et al.(1993)J.Immunol.1514189-4199；以及Doe et al.(1994)Eur.J.Immunol.242369-2376或者可測(cè)量干擾素γ產(chǎn)量的CD8+T細(xì)胞ELISPOT試驗(yàn)(Miyahara et al PNAS(USA)(1998)953954-3959)。
CD8+T細(xì)胞表位EOI優(yōu)選為CD8+T細(xì)胞EOI?？烧T導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的EOI是在給予宿主受試者之后能夠激發(fā)特定CD8+T細(xì)胞形成，或者增強(qiáng)其活性的表位。CD8+T細(xì)胞表位可以多種不同的形式提供，例如一個(gè)或兩個(gè)或更多表位的重組串。多種不同疾病的CD8+T細(xì)胞表位已被識(shí)別，并可在文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。可以設(shè)計(jì)表位串以產(chǎn)生針對(duì)包含此類(lèi)CD8+T細(xì)胞EOI的任何所選TA的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在NOI中，CD8+T細(xì)胞EOI最好以多個(gè)EOI串的形成提供，它們相互連接在一起，沒(méi)有插入序列，以避免不必要的核酸物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，NOI還編碼可作為蛋白酶切割位點(diǎn)的序列，以使表位從表達(dá)的蛋白上切割下來(lái)。
T輔助細(xì)胞表位EOI優(yōu)選為輔助T淋巴細(xì)胞EOI。多種識(shí)別T輔助細(xì)胞EOI的方法適用于本發(fā)明。例如，已知肽序列的兩親性可影響它作為T(mén)輔助細(xì)胞誘導(dǎo)物的能力。關(guān)于可誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞的表位的詳細(xì)討論在美國(guó)專(zhuān)利5,128,319中給出，該專(zhuān)利通過(guò)援引納入本文。
B細(xì)胞表位EOI優(yōu)選為CD8+T細(xì)胞EOI和B細(xì)胞EOI的混合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“B細(xì)胞表位”通常指特異性抗體分子可結(jié)合的TA上的位點(diǎn)?？衫帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)容易地識(shí)別能夠誘發(fā)抗體應(yīng)答的表位。參見(jiàn)例如Geysen et.al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(快速合成肽以測(cè)定給定抗原中免疫原性表位位置的一般方法)；美國(guó)專(zhuān)利4,708,871(識(shí)別和化學(xué)合成抗原表位的方法)；以及Geysen et al.(1986)Molecular Immunology 23709-715(識(shí)別對(duì)給定抗體具有高親和力的肽的技術(shù))。
表位的組合在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，EOI是可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的EOI和可誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞的EOI的混合物。
本領(lǐng)域公知，誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的表位通常彼此不同，可包括不同的肽序列。因而蛋白質(zhì)肽鏈上的某些區(qū)域可具有T細(xì)胞或B細(xì)胞表位。因此，除了CD8+T細(xì)胞表位，還優(yōu)選包括可被T輔助細(xì)胞識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)表位，以增強(qiáng)由CD8+T細(xì)胞表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
T輔助細(xì)胞誘導(dǎo)物增強(qiáng)體內(nèi)CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)的應(yīng)答的機(jī)制還不完全清楚。然而，在并非與理論結(jié)合的前提下，可能由于增強(qiáng)劑能夠誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞，因而它導(dǎo)致在特定的CD8+T細(xì)胞的克隆性增殖和擴(kuò)散中必需的細(xì)胞因子水平升高。不管基本的機(jī)制如何，可以預(yù)見(jiàn)在本發(fā)明方法中使用可誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的EOI的混合物有助于增強(qiáng)CMI應(yīng)答。特別適當(dāng)?shù)腡輔助細(xì)胞表位是在不同的HLA型個(gè)體中均有活性的表位，例如來(lái)自破傷風(fēng)(多數(shù)個(gè)體已經(jīng)對(duì)其有了初次免疫)的T輔助細(xì)胞表位。包括B細(xì)胞EOI也可有助于激發(fā)B細(xì)胞應(yīng)答和抗體產(chǎn)生。還可構(gòu)建合成NOI以產(chǎn)生兩類(lèi)免疫應(yīng)答只有T細(xì)胞應(yīng)答，以及T細(xì)胞應(yīng)答與B細(xì)胞應(yīng)答的組合。
免疫顯性表位當(dāng)個(gè)體使用編碼TA上的多個(gè)EOI的NOI免疫時(shí)，在許多情況下，多數(shù)答應(yīng)的T淋巴細(xì)胞針對(duì)來(lái)自該TA的一個(gè)或多個(gè)線性EOI具有特異性，和/或多數(shù)應(yīng)答的B淋巴細(xì)胞針對(duì)來(lái)自該TA的一個(gè)或多個(gè)線性或構(gòu)象EOI具有特異性。對(duì)于本發(fā)明目的而言，此類(lèi)EOI被稱(chēng)為“免疫顯性表位”。在具有幾個(gè)免疫顯性EOI的抗原中，某一個(gè)EOI在引發(fā)特異性T或B細(xì)胞應(yīng)答方面可為最強(qiáng)顯性。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法或過(guò)程可有效增強(qiáng)針對(duì)一個(gè)或多個(gè)HSV-2表位的CMI應(yīng)答。優(yōu)選地，本發(fā)明方法或過(guò)程可有效增強(qiáng)針對(duì)一個(gè)或多個(gè)免疫顯性HSV-2表位的CMI應(yīng)答。優(yōu)選地，本發(fā)明方法可有效產(chǎn)生/增強(qiáng)針對(duì)一個(gè)或多個(gè)HbsAg表位的CMI應(yīng)答。優(yōu)選地，本發(fā)明方法可有效產(chǎn)生/增強(qiáng)針對(duì)一個(gè)或多個(gè)免疫顯性HbsAg表位的CMI應(yīng)答。
如實(shí)施例所示，針對(duì)HSV-2和HbsAg EOI獲得增強(qiáng)的CMI應(yīng)答說(shuō)明，本發(fā)明方法對(duì)來(lái)自多種感染性病原體的EOI通常都有效。而且，對(duì)病毒激發(fā)的防護(hù)作用表明，產(chǎn)生強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答在開(kāi)發(fā)預(yù)防性和治療性接種方案中是有價(jià)值的。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法或過(guò)程可有效誘發(fā)針對(duì)與腫瘤相關(guān)抗原(TAA)有關(guān)的一種或多種EOI的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答。來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的EOI最好可作為宿主免疫系統(tǒng)的靶標(biāo)誘發(fā)應(yīng)答，致使腫瘤破壞。此類(lèi)TAA的實(shí)例包括但不限于MART-1(被T細(xì)胞1識(shí)別的黑素瘤抗原)、MAGE-1、MAGE-3、5T4、gp100、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、MUCIN(MUC-1)、酪氨酸酶。其他的TAA可由本領(lǐng)域公知的方法，如美國(guó)專(zhuān)利4,514,506中公開(kāi)的方法來(lái)識(shí)別、分離和克隆。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI編碼至少兩個(gè)HIV抗原。NOI可包括編碼HIV gag蛋白的序列，或者它的包含一個(gè)表位的片段，以及一種或多種其他HIV抗原或者它的包含一個(gè)表位的片段?？乖蓙?lái)自任何可用的HIV分離株(通常為HIV-1)，如HXB2?？乖砂╣ag抗原(或者它的包含一個(gè)表位的片段)，如p24gag和p55gag，以及來(lái)自HIV的pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu和LTR區(qū)的蛋白(或者它們的包含一個(gè)表位的片段)。
在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI編碼至少三個(gè)HIV抗原，優(yōu)選為Gag、nef和RT(或者，不是整個(gè)蛋白，而是這些蛋白之一的包含一個(gè)表位的片段)。這些編碼序列可為任何順序，但優(yōu)選的順序?yàn)镹ef-RT-Gag、RT-Nef-Gag或RT-Gag-Nef。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的HIV表位/蛋白為融合蛋白，如含有來(lái)自(包括上述的片段)Nef、RT和Gag的序列的融合蛋白。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，gag基因不編碼gag p6肽。優(yōu)選截短N(yùn)OI中的nef基因以去掉編碼N末端81個(gè)氨基酸的序列。
由NOI編碼的gag或者任何其他HIV抗原(如nef或RT)的片段通常包括一個(gè)表位。由NOI編碼的蛋白(包括所述片段)通常至少8個(gè)氨基酸長(zhǎng)，例如8～10個(gè)氨基酸或者最高達(dá)20、50、60、70、80、100、150或200個(gè)氨基酸長(zhǎng)。任何此類(lèi)蛋白可經(jīng)密碼子優(yōu)化，例如使得該片段的密碼子選擇模式與高水平表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因的模式相似。
在一個(gè)實(shí)施方案中，NOI編碼下列多肽組合之一I.p17、p24，融合于截短的NEF(缺少編碼末端氨基酸1～85的核苷酸)。
II.p17、p24、RT、截短的NEF(缺少編碼末端氨基酸1～85的核苷酸)。
III.p17、p24(優(yōu)化的gag)、截短的NEF(缺少編碼末端氨基酸1～85的核苷酸)。
IV.p17、p24(優(yōu)化的gag)、RT(優(yōu)化的)、截短的NEF(缺少編碼末端氨基酸1～85的核苷酸)。
V.p17、p24、RT(優(yōu)化的)、截短的NEF(缺少編碼末端氨基酸1～85的核苷酸)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI包括失活的密碼子優(yōu)化的RT，截短的Nef和密碼子優(yōu)化的gag基因的p17/p24部分(例如如WO 03/025003中所公開(kāi))，任選地與愛(ài)荷華長(zhǎng)度(Iowa length)HCMV啟動(dòng)子+外顯子1下游有效連接，和/或與兔珠蛋白多腺苷酸化信號(hào)的上游有效連接。多腺苷酸化信號(hào)可為兔β珠蛋白基因中的信號(hào)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI包括圖18至22所示的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列，或者這樣一個(gè)序列的編碼至少一個(gè)表位(優(yōu)選T細(xì)胞表位)的片段；或者圖18至22中任何序列的同源體(homologue)或者所述片段的同源體。此類(lèi)片段或同源體通常至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)，例如至少100、200、500或1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，NOI是如圖17或20至22之一所示的質(zhì)粒形式，或者此類(lèi)質(zhì)粒的片段或衍生物(包括同源體)形式。質(zhì)粒的構(gòu)建在WO 03/080112中記載(通過(guò)援引納入本文)。
優(yōu)化的密碼子在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)化NOI的編碼序列，使其密碼子選擇與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的基因相似。DNA密碼有4個(gè)字母(A、T、C和G)，使用它們拼寫(xiě)三字母“密碼子”，這些密碼子代表了有機(jī)體的基因編碼的蛋白中的氨基酸。沿著DNA分子的線性的密碼子序列被翻譯成由這些基因編碼的蛋白中的線性的氨基酸序列。密碼高度簡(jiǎn)并，61個(gè)密碼子編碼20種天然氨基酸和3個(gè)代表“終止”信號(hào)的密碼子。因此，多數(shù)氨基酸由一個(gè)以上的密碼子編碼——實(shí)際上，有幾種氨基酸由四種或者更多種不同的密碼子編碼。
當(dāng)有一種以上密碼子可用于編碼給定的氨基酸時(shí)，已觀察到有機(jī)體的密碼子選擇模式具有高度的非隨機(jī)性。不同的物種在其密碼子選擇上顯示出不同的偏愛(ài)，而且，在同一物種中的高水平和低水平表達(dá)的基因之間，其密碼子選擇也顯著不同。這種偏愛(ài)在病毒、植物、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均不同，有些物種比其他物種顯示出更強(qiáng)的遠(yuǎn)離隨機(jī)密碼子選擇的偏愛(ài)。
例如，人和其他哺乳動(dòng)物不如某些細(xì)菌或病毒的偏愛(ài)程度強(qiáng)烈。由于這些原因，哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)或者病毒基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，極有可能會(huì)由于具有不適當(dāng)?shù)拿艽a子分布而無(wú)法高效表達(dá)。人們相信，當(dāng)在異源DNA序列中存在在要表達(dá)的宿主中極少發(fā)現(xiàn)的密碼子組時(shí)，可以預(yù)見(jiàn)在該宿主中的異源表達(dá)水平較低。
在NOI中，可將密碼子選擇模式從天然狀態(tài)變?yōu)楦咏咏从嘲杏袡C(jī)體(如哺乳動(dòng)物，特別是人)的密碼子偏愛(ài)的狀態(tài)。“密碼子選擇系數(shù)”是給定的多核苷酸序列的密碼子模式與靶物種的相似程度的量度。密碼子頻率可從許多物種的高水平表達(dá)的基因的文獻(xiàn)來(lái)源獲得(參見(jiàn)例如Nakamura et.al.Nucleic Acids Research 1996，24214-215)。61種密碼子中的每一種的密碼子頻率(以所選類(lèi)別的基因中每1000個(gè)密碼子中每種密碼子的出現(xiàn)次數(shù)來(lái)表示)對(duì)20種天然氨基酸中的每一種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將每種氨基酸的最常用的密碼子的值設(shè)置為1，較少使用的密碼子的頻率在0和1之間。這樣，對(duì)于靶物種中高水平表達(dá)的基因，61種密碼子中的每一種都分配了等于或小于1的數(shù)值。為了計(jì)算特定多核苷酸的密碼子選擇系數(shù)，相對(duì)于該物種的高水平表達(dá)的基因，標(biāo)出特定多核苷酸中的每一密碼子的換算值，取所有值的幾何平均數(shù)(這些值的自然對(duì)數(shù)的和，除以密碼子總數(shù)，取反對(duì)數(shù))。系數(shù)的值在0和1之間，系數(shù)值越高就表明在多核苷酸中有越多的密碼子為常用密碼子。如果多核苷酸序列的密碼子選擇系數(shù)為1，則所有密碼子均為靶物種中的高水平表達(dá)的基因的“最常用”密碼子。
根據(jù)本發(fā)明，NOI的密碼子選擇模式優(yōu)選排除在靶有機(jī)體的高水平表達(dá)的基因中RSCU值小于0.2的密碼子。同義密碼子相對(duì)使用度(RSCU)值是密碼子的實(shí)測(cè)數(shù)目除以如果該氨基酸的所有密碼子的使用頻率均相等時(shí)的預(yù)期數(shù)目。NOI對(duì)高水平表達(dá)的人類(lèi)基因的密碼子選擇系數(shù)通常大于0.3，優(yōu)選大于0.4，最優(yōu)選大于0.5。人類(lèi)的密碼子選擇表還可在GenBank中發(fā)現(xiàn)。比較起來(lái)，高水平表達(dá)的β肌動(dòng)蛋白基因的RSCU為0.747。人類(lèi)(homo sapiens)的密碼子選擇表如下所示人類(lèi)[gbpri]27143個(gè)CDS(12816923個(gè)密碼子)字段[三聯(lián)體][頻率每一千]([數(shù)目])
UUU 17.0(217684) UCU 14.8(189419) UAU 12.1(155645) UGU 10.0(127719)UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470) UAC 15.8(202481) UGC 12.3(157257)UUA 7.3( 93924) UCA 11.9(152074) UAA 0.7( 9195) UGA 1.3( 16025)UUG 12.5(159611) UCG 4.5( 57572) UAG 0.5( 6789) UGG 12.9(165930)CUU 12.8(163707) CCU 17.3(222146) CAU 10.5(134186) CGU 4.6( 59454)CUC 19.3(247391) CCC 20.0(256235) CAC 14.9(190928) CGC 10.8(137865)CUA 7.0( 89078) CCA 16.7(214583) CAA 12.0(153590) CGA 6.3( 80709)CUG 39.7(509096) CCG 7.0( 89619) CAG 34.5(441727) CGG 11.6(148666)AUU 15.8(202844) ACU 12.9(165392) AAU 17.0(218508) AGU 12.0(154442)AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805) AAC 19.8(253475) AGC 19.3(247583)AUA 7.2( 92133) ACA 14.9(191518) AAA 24.0(308123) AGA 11.5(147264)AUG 22.3(285776) ACG 6.3( 80369) AAG 32.6(418141) AGG 11.3(145276)GUU 10.9(139611) GCU 18.5(236639) GAU 22.4(286742) GGU 10.8(138606)GUC 14.6(187333) GCC 28.3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7(290904)GUA 7.0( 89644) GCA 15.9(203310) GAA 29.1(373151) GGA 16.4(210643)GUG 28.8(369006) GCG 7.5( 96455) GAG 40.2(515485) GGG 16.4(209907)編碼GC 52.51％第一字母GC 56.04％第二字母GC 42.35％第三字母GC 59.13％佐劑本發(fā)明方法或過(guò)程不需要佐劑的存在即可顯示增強(qiáng)的CMI應(yīng)答。然而，加入佐劑特別是基因佐劑有助于進(jìn)一步增強(qiáng)或調(diào)節(jié)CMI應(yīng)答。佐劑可通過(guò)下列途徑增強(qiáng)CMI應(yīng)答增強(qiáng)免疫的受試者中同時(shí)給予的抗原的免疫原性，以及誘導(dǎo)針對(duì)同時(shí)給予的抗原的Th1樣免疫應(yīng)答，其中抗原為疫苗制品中的有益成分。
因此，本發(fā)明的增強(qiáng)CMI應(yīng)答的方法或過(guò)程可如下改進(jìn)在NOI或蛋白，或者含NOI或蛋白的組合物中加入佐劑，這樣可形成可誘發(fā)長(zhǎng)期存在并持續(xù)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答的特別有效的組合物和方法。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指能夠特異性或非特異性改變、增強(qiáng)、指導(dǎo)、更改、加強(qiáng)或引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)或組合物。
術(shù)語(yǔ)“佐劑”包括但不限于細(xì)菌ADP核糖基化外毒素，生物活性因子，免疫調(diào)節(jié)分子，生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑或者免疫激發(fā)分子如細(xì)胞因子、白介素、趨化因子或者配體或者表位(如輔助T細(xì)胞表位)以及它們?nèi)芜x的組合，當(dāng)它們與NOI一起給藥時(shí)，與單獨(dú)給予NOI或單獨(dú)給予蛋白產(chǎn)生的CMI應(yīng)答相比，可增強(qiáng)或加強(qiáng)或調(diào)節(jié)CMI應(yīng)答。佐劑可為本領(lǐng)域已知的適于人或動(dòng)物使用的任何佐劑。
免疫調(diào)節(jié)分子如細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-2)以及輔助激發(fā)分子和輔助分子(B7-1、B7-2)可以各種組合用作佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給藥方案之前、之中或之后，不將GM-CSF給予受試者。在EOI的表達(dá)部位同時(shí)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)分子和EOI可增強(qiáng)特異性效應(yīng)物的產(chǎn)生，以幫助增強(qiáng)CMI應(yīng)答。CMI應(yīng)答增強(qiáng)的程度要依賴(lài)于具體使用的免疫激發(fā)分子和/或佐劑，這是因?yàn)椴煌拿庖呒ぐl(fā)分子可誘發(fā)不同的可增強(qiáng)和/或調(diào)節(jié)CMI應(yīng)答的機(jī)制。舉例來(lái)說(shuō)，不同的效應(yīng)物機(jī)理/免疫調(diào)節(jié)分子包括但不限于增強(qiáng)求助信號(hào)(helpsignal)(IL-2)，募集專(zhuān)職APC(GM-CSF)，增加T細(xì)胞頻率(IL-2)，作用于抗原加工途徑和MHC的表達(dá)(IFN-γ和TNF-α)，以及使免疫應(yīng)答從Th1應(yīng)答向Th2應(yīng)答轉(zhuǎn)換(LTB)(見(jiàn)WO 97/02045)。含寡核苷酸的未甲基化CpG(見(jiàn)WO 96/02555)也是Th1應(yīng)答的優(yōu)選誘導(dǎo)物，適用于本發(fā)明。
在不受理論約束的前提下，加入佐劑是有益的，因?yàn)樽魟┛蓭椭鰪?qiáng)針對(duì)NOI或蛋白的CMI應(yīng)答，這通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)使Th2應(yīng)答轉(zhuǎn)向Th1應(yīng)答，和/或使特異性效應(yīng)物相關(guān)的機(jī)制轉(zhuǎn)向表達(dá)的EOI，并且隨后產(chǎn)生和維持增強(qiáng)的CMI應(yīng)答(參見(jiàn)例如WO 97/02045中的教導(dǎo))。
在NOI或蛋白中加入佐劑是有益的，還因?yàn)樗墒沟迷诮o予NOI或蛋白的受試者中，只需較低劑量或較少劑量的NOI或蛋白即可實(shí)現(xiàn)預(yù)期的CMI應(yīng)答，或者它可導(dǎo)致受試者中質(zhì)量上和/或數(shù)量上不同的免疫應(yīng)答。佐劑的效果可通過(guò)如下方式測(cè)定將佐劑與NOI或蛋白給予動(dòng)物，與只給予動(dòng)物NOI或蛋白的實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行，使用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定法比較這兩組中的抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，所述標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定法例如放射免疫測(cè)定、ELISA、CD8+T細(xì)胞測(cè)定等等，均為本領(lǐng)域所熟知。通常，佐劑是與抗原相獨(dú)立的部分，但單個(gè)分子也可同時(shí)具有佐劑和抗原屬性。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因佐劑”是指由NOI編碼的佐劑，并且當(dāng)將其與編碼EOI或蛋白(包含一個(gè)表位)的NOI一起給藥時(shí)，相對(duì)于只給予NOI或蛋白而產(chǎn)生的CMI應(yīng)答來(lái)說(shuō)，該佐劑可增強(qiáng)CMI應(yīng)答。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因佐劑為細(xì)菌ADP核糖基化外毒素。ADP核糖基化細(xì)菌毒素是相關(guān)的細(xì)菌外毒素家族，包括白喉毒素(DT)、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、大腸桿菌不耐熱毒素(LT1和LT2)、假單胞桿菌(Pseudomonas)內(nèi)毒素A、假單胞桿菌外毒素S、仙人掌桿菌(B.cereus)胞外酶、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)毒素、肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素、泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶，以及來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、螺狀梭菌(C.spiriforma)和艱難梭菌(C.difficile)的毒素，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EDIN，以及ADP核糖基化細(xì)菌毒素突變株，如CRM197，一種非毒性的白喉毒素突變株(參見(jiàn)例如Bixler et al.(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251175；以及Constantino et al.(1992)Vaccine)。多數(shù)ADP核糖基化細(xì)菌毒素以A:B多聚體的形式構(gòu)成，其中A亞基包含ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，B亞基作為結(jié)合部分。用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選的ADP核糖基化細(xì)菌毒素包括霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱毒素。
霍亂毒素(CT)和相關(guān)的大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)是其相應(yīng)的腸毒性細(xì)菌菌株的分泌產(chǎn)物，當(dāng)全身、口服或粘膜給藥時(shí)，它們是有效的免疫原，并顯示強(qiáng)烈的毒性。已知當(dāng)通過(guò)肌內(nèi)或口服途徑給藥時(shí)，CT和LT均可為抗原提供佐劑作用。已經(jīng)在低于毒性所需的劑量下觀察到這些佐劑作用。這兩種毒素是極其相似的分子，在氨基酸水平上具有至少約70～80％的同源性。
基因佐劑優(yōu)選霍亂毒素(CT)、腸毒性大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，或者保留佐劑性的CT或LT的衍生物、亞基或片段。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因佐劑為L(zhǎng)T。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因佐劑可為CTB或LTB。
腸毒素優(yōu)選為非毒性腸毒素。舉例來(lái)說(shuō)，可將至少一個(gè)腸毒素亞基編碼區(qū)在基因上進(jìn)行修飾，以去除它所編碼的亞基肽的毒性，例如其中，已將截短的A亞基編碼區(qū)在基因上進(jìn)行修飾，以使亞基肽表達(dá)產(chǎn)物中的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶破壞或失活(見(jiàn)WO 03/004055)。
在下述實(shí)施例中，由質(zhì)粒載體表達(dá)的包含天然A亞基和B亞基的LT全毒素用作基因佐劑，將其與表達(dá)HSV-2/HbsAg抗原的NOI同時(shí)給藥，以獲得增強(qiáng)的CMI應(yīng)答。結(jié)果表明，在產(chǎn)生全身T細(xì)胞應(yīng)答方面，與給予不含佐劑的NOI或蛋白相比，加入佐劑可顯著提高誘發(fā)CMI應(yīng)答的能力。
因此，這些結(jié)果表明，當(dāng)需要更加增強(qiáng)的CMI應(yīng)答時(shí)，該基因佐劑特別理想。其他理想的基因佐劑包括但不限于編碼IL-10、IL-12、IL-13、干擾素(IFN)(如IFN-α、IFN-ss和IFN-γ)的NOI，以及其優(yōu)選的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇其他可增強(qiáng)CMI應(yīng)答的此類(lèi)生物活性因子，含有這些因子的適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體可由已知技術(shù)構(gòu)建。
NOI本發(fā)明的EOI可以編碼該EOI的核苷酸序列的形式給藥。本文使用的術(shù)語(yǔ)所研究的核苷酸序列(NOI)是指編碼一種或多種可用于本發(fā)明方法的EOI的一種或多種NOI。術(shù)語(yǔ)“所研究的核苷酸序列(NOI)”與術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”同義。NOI可為基因組或合成來(lái)源的、或者重組來(lái)源的DNA或RNA。NOI可為雙鏈或單鏈，代表有義鏈或反義鏈或其結(jié)合。對(duì)于某些應(yīng)用，NOI優(yōu)選為DNA。對(duì)于某些應(yīng)用，NOI優(yōu)選通過(guò)使用重組DNA技術(shù)制備(如重組DNA)。對(duì)于某些應(yīng)用，NOI優(yōu)選為cDNA。對(duì)于某些應(yīng)用，NOI優(yōu)選與天然存在的形式相同。NOI可為分離或純化形式，如非細(xì)胞形式。
載體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將NOI直接給予宿主受試者。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將包含NOI的載體給予宿主受試者。NOI優(yōu)選使用基因載體制備和/或給藥。本領(lǐng)域中熟知，載體是允許或幫助實(shí)體從一個(gè)環(huán)境向另一個(gè)環(huán)境轉(zhuǎn)移的工具。根據(jù)本發(fā)明，舉例來(lái)說(shuō)，用于重組DNA技術(shù)的某些載體可使實(shí)體，如DNA片段(如異源DNA片段，如異源cDNA片段)，轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主和/或靶細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)復(fù)制包含本發(fā)明NOI的載體，和/或表達(dá)由該NOI編碼的本發(fā)明EOI的目的。用于重組DNA技術(shù)的載體的實(shí)例包括但不限于質(zhì)粒、染色體、人工染色體或病毒。術(shù)語(yǔ)“載體”包括表達(dá)載體和/或轉(zhuǎn)化載體。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指能夠體內(nèi)或體外/離體表達(dá)的構(gòu)建體。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化載體”是指能夠從一個(gè)物種轉(zhuǎn)移至另一物種的構(gòu)建體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用病毒啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)NOI的表達(dá)。啟動(dòng)子可為巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子元件(特別是在NOI編碼HIV抗原的情況下)為缺少內(nèi)含子A但包括外顯子1的CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子。這樣，NOI的表達(dá)可處于HCMV IE早期啟動(dòng)子的調(diào)控之下。
裸露DNA包含本發(fā)明的NOI的載體可以“裸露核酸構(gòu)建體”的形式直接給藥，優(yōu)選進(jìn)一步包含與宿主細(xì)胞基因組同源的側(cè)翼序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“裸露DNA”是指包含本發(fā)明的NOI以及調(diào)控其產(chǎn)生的短啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒。稱(chēng)之為“裸露”DNA的原因是該質(zhì)粒沒(méi)有攜帶于任何傳送媒介物中。當(dāng)這種DNA質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞如真核細(xì)胞時(shí)，它所編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
病毒載體或者，包含本發(fā)明NOI的載體可使用本領(lǐng)域已知的各種病毒技術(shù)引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，所述病毒技術(shù)例如使用重組病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒進(jìn)行感染。載體可為重組病毒載體。適當(dāng)?shù)闹亟M病毒載體包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、痘病毒載體或者細(xì)小病毒載體(參見(jiàn)Kestler et al 1999 Human GeneTher 10(10)1619-32)。在病毒載體的情況下，給予NOI通過(guò)病毒感染靶細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。
靶向載體術(shù)語(yǔ)“靶向載體”是指感染或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力或者在宿主和/或靶細(xì)胞中表達(dá)的能力局限于宿主受試者中特定細(xì)胞類(lèi)型的載體，通常局限于具有共同或相似的表型的細(xì)胞中。
表達(dá)載體插入載體中的本發(fā)明NOI優(yōu)選與調(diào)控序列有效連接，所述調(diào)控序列能夠由宿主細(xì)胞提供EOI的表達(dá)，也就是說(shuō)，該載體為表達(dá)載體。由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物可分泌出來(lái)或者包含在細(xì)胞內(nèi)，這取決于所用的NOI和/或載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，包含NOI的表達(dá)載體可設(shè)計(jì)成帶有信號(hào)序列，所述信號(hào)序列可指導(dǎo)EOI穿過(guò)特定的原核或真核細(xì)胞膜而分泌。
融合蛋白本發(fā)明NOI可以融合蛋白的形式表達(dá)，所述融合蛋白包括與EOI融合的佐劑和/或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑，以進(jìn)一步增強(qiáng)和/或提高所獲得的CMI應(yīng)答。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑可用作佐劑，也就是說(shuō)，它可為CMI應(yīng)答提供泛發(fā)性刺激。EOI可附著于生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的氨基或羧基末端。
包含表位的蛋白蛋白序列可與表位序列相同(即在N或C末端不添加任何序列)。蛋白通常為分離或純化形式，如非細(xì)胞形式。蛋白通常為8到400個(gè)氨基酸長(zhǎng)，如10到300或者15到150個(gè)氨基酸。
NOI和蛋白的給藥NOI或蛋白可通過(guò)多種不同途徑，單獨(dú)或作為組合物的一部分給藥。對(duì)于某些組合物來(lái)說(shuō)，某些途徑較為適合，因?yàn)樗鼈兛蓪?dǎo)致產(chǎn)生更加有效的CMI應(yīng)答，或者誘導(dǎo)副作用的可能性較小，或者方便給藥。疫苗組合物的給藥途徑可根據(jù)待預(yù)防或治療的病原體或感染而變化。
NOI或蛋白可通過(guò)全身途徑或粘膜途徑或經(jīng)皮途徑給藥，或者，將其直接給予至特定的組織如肝、骨髓，或者在癌癥治療的情況下，直接給予至腫瘤。本文使用的術(shù)語(yǔ)“全身給藥”包括但不限于任何腸胃外給藥途徑。具體地說(shuō)，腸胃外給藥包括但不限于皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)或者胸骨注射，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或者腎透析輸注技術(shù)。全身、腸胃外給藥優(yōu)選為肌內(nèi)注射。
在本方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NOI或蛋白通過(guò)皮膚，例如通過(guò)經(jīng)皮途徑給藥。根據(jù)本發(fā)明，相信可以采用任何可接受的實(shí)施方式和免疫途徑，并且仍然獲得一些優(yōu)點(diǎn)，但是下述實(shí)施例表明，使用經(jīng)皮NOI給藥具有特別的優(yōu)點(diǎn)。在這點(diǎn)上，在并非受理論約束的前提下，相信經(jīng)皮給藥是優(yōu)選的，因?yàn)樗筛佑行У鼗罨?xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)武裝(arm)。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)皮”給藥意指皮內(nèi)(如進(jìn)入真皮或表皮)、經(jīng)皮(如“經(jīng)由皮膚”)和穿粘膜給藥，也就是說(shuō)，使藥劑進(jìn)入或穿過(guò)皮膚或粘膜組織而給藥。參見(jiàn)例如Transdermal Drug DeliveryDevelopmental Issuesand Research Initiatives，Hadgraft和Guy(編著)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications，Robinson和Lee(編著)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；以及TransdermalDelivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(編著)，CRC Press，(1987)。因此，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了使用粒子給藥裝置(如無(wú)針注射器)給藥，如美國(guó)專(zhuān)利5,630,796所述，以及使用粒子介導(dǎo)的給藥裝置給藥，如美國(guó)專(zhuān)利5,865,796所述。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“粘膜給藥”包括但不限于口服、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腸內(nèi)和眼部給藥。
粘膜途徑，特別是鼻內(nèi)、氣管內(nèi)和眼部給藥，優(yōu)選適用于防護(hù)自然暴露于環(huán)境中的病原體如RSV、流感病毒和感冒病毒，或者變應(yīng)原如禾草和豕草花粉以及房塵螨。增強(qiáng)CMI應(yīng)答可增強(qiáng)對(duì)隨后遇到的靶抗原如變應(yīng)原或微生物媒介的防護(hù)作用。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一次和/或第二次和/或隨后的免疫中的所有給藥的部位，均通向相同的淋巴結(jié)。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將NOI或蛋白給予至從宿主受試者分離的細(xì)胞。在該優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選將編碼來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的EOI的NOI給予至專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞。
APC可來(lái)自宿主受試者，經(jīng)離體修飾可表達(dá)EOI，然后轉(zhuǎn)移回宿主受試者中誘導(dǎo)針對(duì)TAA的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答，以誘發(fā)抗腫瘤應(yīng)答。樹(shù)突細(xì)胞被認(rèn)為是激發(fā)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答的最有效APC，因?yàn)楸磉_(dá)的EOI必須由專(zhuān)職APC獲得、加工并呈遞至T細(xì)胞(Th1和Th2輔助細(xì)胞，以及CD8+T細(xì)胞)，以誘導(dǎo)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自宿主受試者的癌細(xì)胞可經(jīng)原位或體外修飾。
NOI粒子給藥使用粒子介導(dǎo)的方法給予NOI或蛋白制劑已為本領(lǐng)域所知。為此，上述NOI一經(jīng)制備并適當(dāng)純化后，可使用多種本領(lǐng)域已知的技術(shù)包被于核心載體粒子上。載體粒子選自在一般用于從基因槍設(shè)備進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)傳送時(shí)的粒子大小范圍內(nèi)具有適當(dāng)密度的材料。最佳載體粒子大小當(dāng)然取決于靶細(xì)胞直徑。
“核心載體”是指這樣一種載體，其上包被有客體核酸(如DNA、RNA)，以使其具有確定的粒子大小以及足夠高的密度，以獲得穿過(guò)細(xì)胞膜所需的動(dòng)量，以便使用粒子介導(dǎo)技術(shù)傳遞客體分子(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,100,792)。核心載體通常包括諸如鎢、金、鉑、鐵氧體、聚苯乙烯和膠乳等材料。參見(jiàn)例如Particle Bombardment Technology forGene Transfer，(1994)Yang，N.編著，Oxford University Press，NewYork，NY第10-11頁(yè)。優(yōu)選鎢和金粒子。鎢粒子很容易制成直徑0.5～2.0微米的平均大小。金粒子或微晶金(如金粉A1570，購(gòu)自EngelhardCorp.，East Newark，NJ)也可用于本發(fā)明。金粒子具有均一的大小(購(gòu)自Alpha Chemicals的粒子大小為1～3微米，購(gòu)自Degussa，SouthPlainfield，NJ的具有一定范圍的粒子大小，包括0.95微米)。微晶金具有各種粒子大小分布，通常在0.5～5微米的范圍內(nèi)。然而，微晶金具有不規(guī)則的表面積，可被核酸高效包被。
已知并且已經(jīng)描述了許多將NOI或蛋白包被或沉淀于金或鎢粒子上的方法。多數(shù)方法通常是將預(yù)定量的金或鎢與質(zhì)粒DNA、CaCl2和亞精胺組合到一起。產(chǎn)生的溶液在包被過(guò)程中不斷攪拌，以確保反應(yīng)混合物的均一性。NOI沉淀后，包被的粒子可轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)哪ど?，使其在使用前干燥，包被于樣品模塊或樣品盒(cassette)表面，或者裝載于用于特定基因槍設(shè)備的傳遞盒上。
“粒子傳送設(shè)備”是指不使用常規(guī)針刺穿皮膚而將粒子組合物經(jīng)皮傳遞的設(shè)備。用于本發(fā)明的粒子傳送設(shè)備在整個(gè)本文件中討論。適用于粒子介導(dǎo)的傳送的各種粒子加速設(shè)備為本領(lǐng)域所公知，并且均可用于實(shí)施本發(fā)明。目前的設(shè)備設(shè)計(jì)采用爆炸、電或氣體放電來(lái)驅(qū)使包被的載體粒子飛向靶細(xì)胞。包被的載體粒子本身可釋放地附著于移動(dòng)的載體片上，或者可除去地附著于有氣流經(jīng)過(guò)的表面，從表面上抬升粒子，使之加速，飛向靶標(biāo)。一種氣體放電設(shè)備的實(shí)例在美國(guó)專(zhuān)利5,204,253中記載。一種爆炸型設(shè)備在美國(guó)專(zhuān)利4,945,050中記載。一種氦放電型粒子加速設(shè)備的實(shí)例為PowderJect XR設(shè)備(PowderJectVaccines，Inc.，Madison)，WI，該設(shè)備在美國(guó)專(zhuān)利5,120,657中記載。適用于本發(fā)明的一種放電設(shè)備在美國(guó)專(zhuān)利5,149,655中記載。所有這些專(zhuān)利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)援引的方式納入本文。
或者，粒子型NOI或蛋白組合物可使用無(wú)針注射器裝置經(jīng)皮給藥。例如，包含本發(fā)明NOI的粒子組合物可使用常規(guī)制藥方法如簡(jiǎn)單蒸發(fā)(結(jié)晶)、真空干燥、噴霧干燥或凍干制得。如果需要，粒子可使用公有的國(guó)際公布WO 97/48485中記載的技術(shù)進(jìn)一步增加密度，該公布的內(nèi)容通過(guò)援引納入本文。然后這些粒子組合物可由無(wú)針注射器系統(tǒng)傳送，所述無(wú)針注射器系統(tǒng)例如在國(guó)際公布WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513和WO 96/20022中所記載，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)援引的方式納入本文。當(dāng)由上述無(wú)針注射器系統(tǒng)傳送包含抗原或變應(yīng)原的粒子時(shí)，粒子大小通常大約在0.1～250微米范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約10～70微米范圍內(nèi)。大于約250微米的粒子仍可由這些設(shè)備傳送，其上限為粒子大小將導(dǎo)致皮膚細(xì)胞不利損傷的點(diǎn)。傳送的粒子穿透靶表面的實(shí)際距離取決于粒子大小(如標(biāo)稱(chēng)粒子直徑，假定粒子大致為球狀)、粒子密度、粒子與表面碰撞時(shí)的初始速度以及靶皮膚組織的密度和運(yùn)動(dòng)粘度。在這點(diǎn)上，用于無(wú)針注射的最佳粒子密度通常在約0.1到25g/cm3的范圍，優(yōu)選在約0.9到1.5g/cm3之間，注射速度通常在約100到3,000m/sec的范圍內(nèi)。在適當(dāng)?shù)臍鈮合拢骄睆綖?0～70Rm的粒子在噴嘴處被加速到接近驅(qū)動(dòng)氣流的超音速的速度。
將粒子組合物或包被的粒子以與藥物制劑相容的方式、以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的有效劑量給予至個(gè)體。所給予組合物的量(例如約0.1mg至1mg，更優(yōu)選1到50μg抗原或變應(yīng)原)取決于待試驗(yàn)的個(gè)體。精確的需要量依據(jù)待治療個(gè)體的年齡和總體狀況而變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本說(shuō)明書(shū)后可容易地確定合適的有效量。
金或鎢微粒還可用作運(yùn)輸物質(zhì)，如WO 93/17706和Tang petal.，Nature(1992)356152中所述。在這種情況下，在氯化鈣和亞精胺存在的條件下，NOI沉淀于微粒上，然后使用無(wú)針的設(shè)備整個(gè)高速射入真皮或表皮中來(lái)進(jìn)行給藥，例如美國(guó)專(zhuān)利4,945,050和5,015,580，以及WO 94/24243所述。用于接種宿主受試者的NOI的數(shù)量取決于多種因素，例如用于表達(dá)抗原的啟動(dòng)子的強(qiáng)度，表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性，欲給藥的哺乳動(dòng)物的狀況(如體重、年齡和總體健康狀況)，給藥方式，以及制劑類(lèi)型。通常，成年人用于預(yù)防或治療的適當(dāng)劑量為約1pg至約5mg，優(yōu)選約10pg至約1mg，最優(yōu)選約25pg至約500pg。粒子介導(dǎo)的傳送技術(shù)與其他的NOI給藥方式相比，發(fā)現(xiàn)具有顯著的優(yōu)越性。Fynan et al.(1995)Int.J.Immunopharmacology 1779-83，F(xiàn)ynan et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011478-11482，以及Raz et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919519-9523。這些實(shí)驗(yàn)研究了將基于核酸的疫苗通過(guò)粒子介導(dǎo)傳送至淺表皮膚和肌肉組織。使用基因槍取得極好效果的一個(gè)可能原因是NOI可傳送至細(xì)胞內(nèi)，而通過(guò)肌內(nèi)注射只能傳送至細(xì)胞外。
靶抗原(TA)給藥之間的時(shí)間間隔優(yōu)選為約48小時(shí)到約192小時(shí)。靶抗原(TA)給藥之間的時(shí)間間隔更優(yōu)選為約72小時(shí)到約168小時(shí)。靶抗原(TA)給藥之間的時(shí)間間隔更加優(yōu)選為約72小時(shí)到約144小時(shí)。
哺乳動(dòng)物宿主受試者本文使用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物宿主受試者”是指脊索動(dòng)物亞門(mén)(subphylum cordata)中的任何成員，包括但不限于人類(lèi)和其他靈長(zhǎng)類(lèi)，包括非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)如黑猩猩和其他類(lèi)人猿和猴子種類(lèi)；家畜，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)動(dòng)物，如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥(niǎo)類(lèi)，包括家禽、野生鳥(niǎo)和獵鳥(niǎo)，如雞、火雞和其他鶉雞類(lèi)、鴨、鵝等等。優(yōu)選的動(dòng)物包括用于體育項(xiàng)目的動(dòng)物，如供賽馬比賽用的馬或者供超越障礙比賽用的馬。
該術(shù)語(yǔ)并不指明特定的年齡。因此，成年和新生個(gè)體均涵蓋于其中。本文所述方法可用于上述任何脊椎動(dòng)物種類(lèi)，這是由于所有這些脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的機(jī)制是類(lèi)似的。如果是哺乳動(dòng)物，受試者優(yōu)選為人類(lèi)，但也可以是家畜、實(shí)驗(yàn)受試者或?qū)櫸飫?dòng)物。
預(yù)防和/或治療本發(fā)明方法或過(guò)程可廣泛應(yīng)用于接種法，并且涉及開(kāi)發(fā)預(yù)防性和/或治療性疫苗(包括免疫治療疫苗)。應(yīng)該理解，本文所有提及的治療包括治愈、緩和和預(yù)防治療。
在本發(fā)明方法中，可單獨(dú)采用本文所述的NOI或蛋白作為組合物的一部分，所述組合物例如但不限于藥物組合物或者疫苗組合物或者免疫治療組合物，用以預(yù)防和/或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫障礙。給予NOI或蛋白或者包含NOI或蛋白的組合物可出于“預(yù)防”或“治療”目的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療性”或“治療”包括以下任意方面預(yù)防感染或再感染；減輕或消除癥狀；減少或完全消除病原體。治療可以起到預(yù)防性作用(感染前)或者治療性作用(感染后)。
預(yù)防或治療包括但不限于誘發(fā)針對(duì)NOI的有效的CMI免疫應(yīng)答，和/或緩和、減少、治愈或至少部分中止由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫障礙的癥狀和/或并發(fā)癥。當(dāng)預(yù)防性給藥時(shí)，通常在任何癥狀出現(xiàn)之前給予本發(fā)明的組合物。預(yù)防性給予本發(fā)明的NOI或者組合物是為了防止或改善任何后來(lái)發(fā)生的感染或疾病。當(dāng)治療性給藥時(shí)，通常在感染或疾病的癥狀的起始時(shí)(或者稍后)給予本發(fā)明的NOI或者組合物。因此，本發(fā)明組合物可在預(yù)期暴露于引起疾病的媒介物或疾病狀態(tài)之前給藥，或者在感染或疾病起始之后給藥。
預(yù)防性還是治療性給予NOI或蛋白(單獨(dú)或者作為組合物的一部分)哪一種更加適合，通常要取決于疾病的性質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的免疫治療組合物可用于免疫治療方案中，通過(guò)使用腫瘤細(xì)胞或其抗原性組分接種，積極地誘導(dǎo)腫瘤免疫。后一種治療形式較為有利，因?yàn)樵撁庖叱掷m(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并且通常認(rèn)為，去除腫瘤的最佳途徑之一是誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性抗腫瘤CTL應(yīng)答。另一方面，疫苗組合物可優(yōu)選而非必要地預(yù)防性應(yīng)用，以誘導(dǎo)針對(duì)隨后遇到的與靶抗原相關(guān)的抗原或其部分(如表位)的有效的CMI應(yīng)答。
預(yù)防或治療有效量在本發(fā)明環(huán)境中，給予宿主受試者的NOI或蛋白的劑量，應(yīng)該足以在受試者中產(chǎn)生一段時(shí)間的有益的預(yù)防性或治療性CMI應(yīng)答。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防或治療有效劑量”是指足以誘發(fā)針對(duì)特異性靶抗原的一個(gè)或多個(gè)EOI的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答，和/或緩和、減少、治愈或至少部分中止由疾病如T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫障礙導(dǎo)致的癥狀和/或并發(fā)癥的劑量。
劑量預(yù)防或治療可通過(guò)在單一時(shí)間點(diǎn)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)單次直接給藥實(shí)現(xiàn)。給藥還可給至單個(gè)或多個(gè)部位。某些給藥途徑，如使用滴眼液進(jìn)行粘膜給藥，可需要較高的劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)整劑量和濃度以適應(yīng)具體的給藥途徑。有利的是，實(shí)施例說(shuō)明NOI或者含NOI的組合物的單次劑量通常足以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答。
病癥和疾病因?yàn)楸景l(fā)明方法誘發(fā)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答，所以本方法可用于防護(hù)免受后來(lái)病原體如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或者其他感染媒介物的感染。靶抗原優(yōu)選為與感染性疾病相關(guān)的病原體或抗原，變應(yīng)原或者癌癥。感染性疾病的實(shí)例包括但不限于病毒、細(xì)菌、分枝桿菌和寄生蟲(chóng)疾病。變應(yīng)原的實(shí)例包括但不限于植物花粉、塵螨蛋白、動(dòng)物皮屑、唾液和真菌孢子。腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的實(shí)例包括但不限于活的或者照射的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞提取物以及腫瘤抗原的蛋白亞基。該抗原還可為用于避孕的精子蛋白。在某些實(shí)施方案中，該抗原為環(huán)境抗原。環(huán)境抗原的實(shí)例包括但不限于呼吸道合胞體病毒(“RSV”)、流感病毒和感冒病毒。經(jīng)粘膜入侵的病原體還包括引起呼吸道合胞體病毒、流感、其他上呼吸道疾病的病原體，以及引起腸感染的媒介物。
還有其他一些疾病，針對(duì)它們的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答也很重要，其中已知的幾個(gè)實(shí)例為由病毒引起的感染和疾病，例如但不限于HIV、單純皰疹、帶狀皰疹、丙型肝炎、乙型肝炎、流行性感冒、非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(Epstein-Barr virus)、麻疹、登革熱(dengue)、HTLV-1和人乳頭瘤病毒(HPV)(如HPV 16)；由細(xì)菌引起的疾病，例如但不限于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和李斯特菌屬種(Listeria sp)、衣原體(Chlamydia)、分枝桿菌(Mycobacteria)、惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)、軍團(tuán)菌(Legioniella)以及致腸病的、腸毒性的、腸侵染性的、致腸出血性的和腸聚集性的大腸桿菌；以及由病原性原生動(dòng)物引起的疾病，包括但不限于瘧疾、巴貝蟲(chóng)(Babesia)、血吸蟲(chóng)(Schistosoma)、Toxiplasma和犬弓蛔蟲(chóng)(Toxocaracanis)，或者由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)弓形蟲(chóng)(Toxoplasma)和錐蟲(chóng)(Trypanosoma)引起的疾病。而且，本文所述的給藥方案預(yù)期在針對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答起保護(hù)作用的癌癥形式的免疫中具有價(jià)值。可使用本發(fā)明方法和組合物治療的哺乳動(dòng)物癌癥的實(shí)例包括但不限于黑素瘤、轉(zhuǎn)移癌(metastases)、腺癌、胸腺癌、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、非霍杰金淋巴瘤、霍杰金淋巴瘤、白血病、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰腺癌等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥為與HPV(如HPV 16)有關(guān)的癌癥，例如由HPV引起的癌癥。此類(lèi)癌癥可以是宮頸癌。
癌癥在本發(fā)明方法中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用編碼來(lái)自腫瘤相關(guān)靶抗原(TAA)的EOI的NOI(或者包含表位的蛋白)，使得可以開(kāi)發(fā)用于癌癥治療的靶抗原特異性疫苗。給予編碼來(lái)自TAA的EOI的NOI，并且任選地給予編碼免疫調(diào)節(jié)分子的NOI，提供了誘發(fā)特異性增強(qiáng)的CMI應(yīng)答的強(qiáng)有力的系統(tǒng)，這體現(xiàn)在以下方面預(yù)防宿主受試者中發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加(預(yù)防性免疫)，預(yù)防首次手術(shù)后疾病復(fù)發(fā)(抗轉(zhuǎn)移接種)，或者作為增加體內(nèi)T細(xì)胞數(shù)目的工具，以提高它們消滅擴(kuò)散腫瘤的效果(治療已發(fā)生的疾病)。而且，本發(fā)明方法可通過(guò)處理離體細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)移回腫瘤載體中，用于在宿主受試者中誘發(fā)增強(qiáng)的CMI應(yīng)答(也稱(chēng)過(guò)繼免疫治療)。使用本發(fā)明方法或過(guò)程將NOI給予宿主受試者，可在癌癥如黑素瘤的任何跡象出現(xiàn)之前進(jìn)行(預(yù)防接種)，或者用于介導(dǎo)患有癌癥如黑素瘤的哺乳動(dòng)物的疾病的消退(治療或免疫治療接種)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，NOI編碼來(lái)自HPV(如HPV 16)的抗原，例如E6或者E7。
活化的T細(xì)胞在其他方面，本發(fā)明涉及一種制備活化的T細(xì)胞的方法。在最一般意義上，該方法包括向宿主受試者給予，優(yōu)選經(jīng)皮給予編碼靶抗原的預(yù)先選擇的EOI的NOI，所述靶抗原能夠以增強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答的方式增強(qiáng)CMI應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，從宿主的淋巴結(jié)中回收T細(xì)胞備用。
可以預(yù)見(jiàn)特異性活化的T細(xì)胞的多種潛在用途。例如，在人類(lèi)治療的情況下，可考慮將特異性活化的T細(xì)胞離體培養(yǎng)，并給予至人體，以治療病毒感染或癌癥患者。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，T細(xì)胞通過(guò)如下過(guò)程制備體內(nèi)給予NOI，然后分離T細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)纳飸?yīng)答調(diào)節(jié)劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑和/或佐劑(例如但不限于肽、細(xì)胞因子和抗原呈遞細(xì)胞)存在的條件下進(jìn)行體外增殖。
同源體本發(fā)明中使用的(由NOI編碼的)蛋白(包括蛋白抗原)，例如Gag、nef和/或RT，可與天然存在的形式具有同源性和/或序列同一性。類(lèi)似地，能夠表達(dá)此類(lèi)蛋白的NOI編碼序列通常與天然存在的序列具有同源性和/或序列同一性。確定核酸和氨基酸“序列同一性”的技術(shù)也為本領(lǐng)域所公知。通常，此類(lèi)技術(shù)包括確定基因的mRNA的核苷酸序列，和/或確定由其編碼的氨基酸序列，并將這些序列與第二條核苷酸或氨基酸序列對(duì)比。
通常，“同一性”是指兩條多核苷酸或多肽序列中，逐個(gè)核苷酸或者逐個(gè)氨基酸相比，分別完全對(duì)應(yīng)。兩條或多條序列(多核苷酸或氨基酸)可通過(guò)測(cè)定其“同一性百分率”來(lái)進(jìn)行比較。兩條序列的同一性百分率，不論是核酸還是氨基酸序列，是兩條比對(duì)的序列之間完全匹配的數(shù)目，除以較短序列的長(zhǎng)度，再乘以100。
Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)的局部同源算法提供了核酸序列的近似比對(duì)方法。使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff編著，5增補(bǔ)本3353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA開(kāi)發(fā)的，并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)分矩陣，可將上述算法應(yīng)用于氨基酸序列。由the Genetics Computer Group(Madison，WI)開(kāi)發(fā)的“BestFit”實(shí)用程序提供了該算法用于確定序列的同一性百分率的示例性實(shí)現(xiàn)。該方法的默認(rèn)參數(shù)記載于Wisconsin Sequence Analysis PackageProgram Manual，Version8(1995)(購(gòu)自Genetics Computer Group，Madison，WI)。在本發(fā)明環(huán)境中，確定同一性百分率的優(yōu)選方法是使用University of Edinburgh擁有版權(quán)的、由John F.Collins和Shane S.Sturrok開(kāi)發(fā)的、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)發(fā)行的MPSRCH軟件包。
由該軟件包可進(jìn)行Smith-Waterman算法，其中評(píng)分表采用默認(rèn)參數(shù)(例如空位開(kāi)放罰分為12，空位擴(kuò)展罰分為1，空位為6)。由該數(shù)據(jù)產(chǎn)生的“匹配”值反映了“序列同一性”。其他適當(dāng)?shù)目捎?jì)算序列之間同一性百分率或相似性的程序?yàn)楸绢I(lǐng)域所公知，例如，另一個(gè)比對(duì)程序是以默認(rèn)參數(shù)使用的BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可以下列默認(rèn)參數(shù)使用genetic code(遺傳密碼)＝standard(標(biāo)準(zhǔn))；filter(過(guò)濾器)＝none(無(wú))；strand(鏈)＝both(兩條)；cutoff(截止值)＝60；expect(預(yù)期值)＝10；Matrix(矩陣)＝BLOSUM62；Descriptions(說(shuō)明)＝50sequences(50條序列)；sort by(排序)＝HIGH SCORE(高分)；Databases(數(shù)據(jù)庫(kù))＝non-redundant(非冗余)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。關(guān)于這些程序的詳細(xì)信息，可參看以下網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
或者，可由以下方法確定同源性在同源區(qū)之間可形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，然后使用單鏈特異性核酸酶消化，確定消化片段的大小。以該方法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)兩條DNA或者兩條多肽序列在確定的長(zhǎng)度上，序列顯示至少約80％～85％，優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％～98％的序列同一性時(shí)，它們相互之間“基本同源”。
本文使用的基本同源或者同源還指與特定的DNA或多肽序列顯示完全同一性的序列。基本同源或同源的DNA序列可通過(guò)DNA印跡雜交實(shí)驗(yàn)，在具體的體系所確定的例如嚴(yán)格條件下進(jìn)行識(shí)別。例如，嚴(yán)格的雜交條件可包括50％甲酰胺、5×登哈特溶液、5×SSC、0.1％SDS和100pg/ml變性的鮭魚(yú)精子DNA，洗滌條件可包括在37℃下，2×SSC、0.1％SDS，隨后在68℃下，1×SSC、0.1％SDS。確定適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。
測(cè)定方法本發(fā)明方法的效果可由以下步驟驗(yàn)證(i)如本文所述將NOI給予宿主受試者，例如人類(lèi)受試者或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、獼猴或者黑猩猩；(ii)然后從宿主受試者的血液、脾臟或淋巴組織中收集細(xì)胞；(iii)測(cè)定組織中是否存在活化的T細(xì)胞，例如已被致敏可殺傷或溶解產(chǎn)生感染媒介物組分的細(xì)胞的T細(xì)胞。
一旦完成NOI給藥，即從宿主受試者的淋巴組織中回收T細(xì)胞。優(yōu)選的淋巴組織是淋巴結(jié)組織，最優(yōu)選接近NOI給藥部位的、藥物所流向的淋巴結(jié)組織。本文使用的詞語(yǔ)“臨近的淋巴結(jié)”意指靠近NOI給藥部位的淋巴結(jié)。
這種淋巴結(jié)在物理上位于NOI給藥部位附近，或者在給藥部位所流向的區(qū)域，還包括那些在物理上與給藥部位相距較遠(yuǎn)的所流向的淋巴結(jié)。
本測(cè)定方法的最后一步包括測(cè)定T細(xì)胞是否被活化。通常，可測(cè)量T細(xì)胞活化水平的測(cè)定方法包括但不限于放射性鉻釋放測(cè)定，或者其他的放射性同位素測(cè)定，或者單細(xì)胞測(cè)定。此外，還可以采用使用活體株和/或細(xì)胞分選儀的單細(xì)胞T細(xì)胞測(cè)定。優(yōu)選的測(cè)量T細(xì)胞活性的方法包括將殺傷有效量的T細(xì)胞與細(xì)胞表面顯示候選EOI的MHC匹配的靶細(xì)胞接觸；使接觸維持一段時(shí)間，以使T細(xì)胞溶解靶細(xì)胞；測(cè)量T細(xì)胞介導(dǎo)的溶解靶細(xì)胞的程度。然而，可以采用能夠檢測(cè)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的任何方法，包括但不限于鉻釋放測(cè)定、單細(xì)胞測(cè)定或者細(xì)胞間綴合物測(cè)定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)試誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的方法的有效性的檢測(cè)方法，其中誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的方法與本文所述的方法相同。因此，該方法包括(i)第一次免疫，包括向受試者進(jìn)行相隔1到14天的至少兩次給藥，其中各次給藥包括給予編碼T細(xì)胞表位的所研究的核酸(NOI)，以及任選地，
(ii)第二次免疫，包括向受試者給予至少一次(a)編碼T細(xì)胞表位的NOI，或者(b)包含該T細(xì)胞表位的蛋白，其中，-第一次免疫的第一次給藥和-第二次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間為21到365天，其中該測(cè)定包括對(duì)于哺乳動(dòng)物受試者進(jìn)行該方法，然后測(cè)量受試者中對(duì)所述表位具有特異性的活化或記憶T細(xì)胞的水平。
若出現(xiàn)以下情況即可認(rèn)為實(shí)現(xiàn)了較高水平的T細(xì)胞應(yīng)答(i)在第一次免疫的所有給藥時(shí)，由首次給藥產(chǎn)生的活化T細(xì)胞水平還未返回至基礎(chǔ)水平，以及(b)第二次免疫時(shí)T細(xì)胞已經(jīng)返回至基礎(chǔ)水平。因而上述測(cè)定可用于確定一種給定的誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的方法相對(duì)于活化T細(xì)胞水平來(lái)講，第一次和第二次免疫的時(shí)間是否合適。在一個(gè)實(shí)施方案中，該測(cè)定包括確定(i)第一次免疫的給藥是否都落在第一次免疫的第一次給藥和活化T細(xì)胞水平下降至基礎(chǔ)水平之間的時(shí)間段內(nèi)，和/或(ii)第二次免疫的第一次給藥是否發(fā)生于活化T細(xì)胞水平下降至基礎(chǔ)水平之后。
其他方面在另一方面，還提供了一種選擇性誘發(fā)增強(qiáng)的體液應(yīng)答而無(wú)需誘發(fā)相關(guān)的CMI應(yīng)答增強(qiáng)的方法，其中該方法包括向宿主受試者給予至少三次編碼TA上的一個(gè)或多個(gè)EOI的NOI，其中各次NOI給藥之間的時(shí)間間隔為約48小時(shí)，并且其中該方法可在哺乳動(dòng)物宿主受試者中有效提供針對(duì)該或各表達(dá)的EOI的增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。
在另一方面，還提供了一種誘發(fā)增強(qiáng)的體液應(yīng)答的方法，其中該方法包括向宿主受試者給予至少三次編碼TA上的一個(gè)或多個(gè)EOI的NOI，其中各次NOI給藥之間的時(shí)間間隔為約28天，并且其中該方法可在哺乳動(dòng)物宿主受試者中有效提供增強(qiáng)的CMI應(yīng)答，該應(yīng)答可幫助增強(qiáng)針對(duì)該或各表達(dá)的EOI的體液免疫應(yīng)答。
組合物本發(fā)明提供了可用于預(yù)防和/或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫障礙的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是藥物組合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物是免疫治療組合物。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物是疫苗組合物。該組合物可包括治療或預(yù)防有效量的、本發(fā)明上述的編碼TA上的EOI的NOI。該組合物還可包括載體，例如制藥上或者免疫學(xué)上可接受的載體。制藥上可接受的載體或者免疫學(xué)上可接受的載體部分由所給予的具體的組合物以及給予該組合物所用的具體的方法確定。因此，有多種本發(fā)明的藥物組合物或者疫苗組合物或者免疫治療組合物的適當(dāng)制劑。
制劑NOI或蛋白可配制成藥物組合物或者免疫治療組合物或者疫苗組合物。這種制劑包括NOI或蛋白，并結(jié)合有制藥上可接受的載體，例如無(wú)菌水或者無(wú)菌等滲鹽水。這種制劑可以適于快速濃注給藥(bolusadministration)或者持續(xù)給藥的形式制備、包裝或者銷(xiāo)售?？勺⑸渲苿┛梢詥挝粍┝康男问街苽洹b或者銷(xiāo)售，例如在含有防腐劑的安瓿或者多劑量容器中。制劑包括但不限于懸浮液、溶液、油性或水性介質(zhì)中的乳濁液、糊劑以及可植入的緩釋或者可生物降解的制劑。這種制劑可進(jìn)一步包括一種或多種附加成分，包括但不限于助懸劑、穩(wěn)定劑或者分散劑。在用于腸胃外給藥的制劑的一個(gè)實(shí)施方案中，活性成分以干燥(例如粉狀或顆粒)的形式提供，首先使用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)(例如無(wú)熱原的無(wú)菌水)復(fù)水(reconstitution)，然后腸胃外給予復(fù)水的組合物。藥物組合物可以無(wú)菌的可注射的水性或油性懸浮液或溶液的形式制備、包裝或者銷(xiāo)售。這種懸浮液或溶液可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)配制，除活性成分外，還可包括附加成分，例如本文所述的分散劑、濕潤(rùn)劑或者助懸劑。這種可注射的無(wú)菌制劑可使用無(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋劑或者溶劑(例如水或1，3-丁二醇)制備。其他可接受的稀釋劑和溶劑包括但不限于林格溶液、等滲氯化鈉溶液以及不揮發(fā)性油如合成的單或二甘油酯。
其他可用于腸胃外給藥的制劑包括包含微晶體形式、脂質(zhì)體制劑形式或者作為可生物降解的聚合物體系的一個(gè)組分的活性成分的制劑。緩釋或植入組合物可包括制藥上可接受的聚合物材料或者疏水材料，例如乳膠、離子交換樹(shù)脂、微溶聚合物或者微溶鹽。
本發(fā)明還包括一種可增強(qiáng)針對(duì)靶抗原上的EOI的CMI應(yīng)答的試劑盒。這種試劑盒包括編碼TA上的EOI的NOI，和/或包含該表位的蛋白。該試劑盒還可包括佐劑，優(yōu)選為與NOI或蛋白一起給藥或者作為其一部分給藥的基因佐劑，以及NOI或蛋白給藥的說(shuō)明書(shū)。其他優(yōu)選的試劑盒組件包括用于NOI或蛋白給藥的用藥器。本文使用的術(shù)語(yǔ)“用藥器”是指用于向宿主受試者全身或粘膜或經(jīng)皮施用NOI的任何裝置，包括但不限于皮下注射器、基因槍、粒子加速裝置、霧化器、滴管、支氣管鏡、栓劑、可放入陰道的浸漬或包被的材料如棉塞、沖洗制劑、用于陰道沖洗的溶液、保留灌腸制劑、栓劑、或者用于直腸或結(jié)腸沖洗的溶液。
實(shí)施例現(xiàn)將以下發(fā)明僅以示例性方式并參考以下附圖進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例僅僅說(shuō)明本發(fā)明，以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員制備和利用本發(fā)明。實(shí)施例并非意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保所使用的有關(guān)數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是理所應(yīng)當(dāng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。


圖1提供了在一周內(nèi)，分別在第7天(D 7)、第0和7天(D 0，7)或者第0、2、4和7天(D 0，2，4，7)經(jīng)1、2或4次NOI給藥后的(CD8+T細(xì)胞)應(yīng)答。每次NOI給藥注射1針或2針，在一組中，LT佐劑與NOI同時(shí)給藥。
圖1A顯示給予ICP27單基因質(zhì)粒后的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
圖1B顯示給予PJV7630多基因質(zhì)粒后的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
圖2顯示使用成組NOI給藥(clusterd NOI adminstration)保護(hù)小鼠免受感染攻擊。
圖3A顯示給予ICP27單基因質(zhì)粒成組給藥的最佳時(shí)間間隔。
圖3B顯示進(jìn)行HbsAg單基因質(zhì)粒的成組NOI給藥后獲得的細(xì)胞應(yīng)答。
圖3C顯示進(jìn)行HbsAg單基因質(zhì)粒的成組NOI給藥后獲得的抗體效價(jià)。
圖4A顯示以0、1、2、4和6天的給藥時(shí)間間隔，進(jìn)行多基因質(zhì)粒(PJV7630)的成組NOI給藥后1周的ELISPOT測(cè)量結(jié)果。
圖4B顯示以0、1、2、4和6天的給藥時(shí)間間隔，進(jìn)行多基因質(zhì)粒(PJV7630)的成組NOI給藥后3周的ELISPOT測(cè)量結(jié)果。
圖5A是顯示每次“給藥”由1到4次XRI給藥以及各次給藥之間的間歇期組成的示意圖。
圖5B顯示基因LT佐劑和成組NOI給藥方案相結(jié)合而獲得的、有關(guān)IFN-γ釋放的CMI應(yīng)答。
圖5C顯示基因LT佐劑和成組NOI給藥方案相結(jié)合而獲得的抗體應(yīng)答。
圖6A顯示家豬經(jīng)第一次成組免疫后獲得的IFN-γELISPOT數(shù)據(jù)。
圖6B顯示經(jīng)pPJV7630免疫的豬(4只)在抗原給藥部位出現(xiàn)的紅斑的平均面積。
圖7顯示家豬中抗HA抗體應(yīng)答。
圖8顯示質(zhì)粒pPJV1671，它是編碼流感A/巴拿馬/2007/99(H3N2)的血凝素(HA)抗原的人DNA疫苗載體。
圖9顯示H3巴拿馬HA天然序列與由pPJV1671編碼的H3巴拿馬HA的比較以及其共有序列。
圖10顯示pPJV2012質(zhì)粒圖。
圖11顯示pPJV7563質(zhì)粒圖。
圖12提供pPJV7563質(zhì)粒的核苷酸序列。
圖13提供構(gòu)建PJV7563的流程圖。
圖14(i)到(viii)提供在構(gòu)建pPJV7563中的關(guān)鍵質(zhì)粒的特征圖。
圖15提供了衍生制備質(zhì)粒WRG7074和WRG7128的流程圖。
圖16(i)到(v)提供其他的關(guān)鍵質(zhì)粒特征圖。
圖17到22涉及表達(dá)HIV抗原的構(gòu)建體以及編碼HIV抗原的序列。
圖23到28涉及使用HPV E6和E7抗原免疫。
圖29到38顯示研究使用本發(fā)明方法所獲得的應(yīng)答的其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
常規(guī)技術(shù)除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中使用的重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)在許多文獻(xiàn)來(lái)源中有所記載和解釋?zhuān)鏙.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)；J.Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(編者)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，第1和2卷，IRLPress(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(編者)，DNA CloningAPractical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)；以及F.M.Ausubel et al.(編者)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括到目前為止的所有更新)，并且通過(guò)援引的方式納入本文。本發(fā)明方法包括將編碼TA上的至少一個(gè)或多個(gè)EOI的NOI直接在體內(nèi)引入受試者的組織中，以由受試者的組織細(xì)胞表達(dá)該EOI。
本發(fā)明的NOI構(gòu)建體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法制備。構(gòu)建DNA質(zhì)?；蛘咧亟M載體的方法在常規(guī)文件中記載，例如Burger etal.，J.Gen.Virol.，72359-367(1991)，且為本領(lǐng)域所公知。另外參見(jiàn)Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York；以及Ausubel et al.，1997，Current Protocols in Molecular Biology，Green & Wiley，New York.
舉例來(lái)說(shuō)，編碼TA上的一個(gè)或多個(gè)EOI或者與TA上的已知EOI的同源性較高，足以誘導(dǎo)CMI應(yīng)答的序列的NOI，可通過(guò)從多種微生物中分離NOI的技術(shù)中記載的下列已知熟知的方法來(lái)獲得?；蛘撸幋aTA上的EOI的NOI可在核酸合成儀中合成。因此，本發(fā)明包括合成形式的編碼TA上的EOI的NOI。包含該分離的NOI的，優(yōu)選在宿主細(xì)胞中能夠指導(dǎo)由NOI編碼的TA上的EOI表達(dá)的其他重組細(xì)菌質(zhì)?；蛘卟《据d體；以及包含該載體的細(xì)胞，不論是真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞，也可由已知技術(shù)制備。為了確保TA上的EOI可由NOI在質(zhì)?；虿《据d體形式中表達(dá)，將NOI有效連接于在宿主細(xì)胞中能夠促使抗原高水平表達(dá)的啟動(dòng)子/調(diào)控區(qū)。本領(lǐng)域中有許多此類(lèi)啟動(dòng)子/調(diào)控序列可用，包括但不限于，例如人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列、SV40早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子以及其他哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子/調(diào)控序列”是指表達(dá)與該啟動(dòng)子/調(diào)控序列有效連接的NOI所需的DNA序列。在某些情況下，該啟動(dòng)子/調(diào)控序列可以組織特異性方式作用，即該啟動(dòng)子/調(diào)控序列只能促使在特定組織類(lèi)型的細(xì)胞中表達(dá)。除非另有說(shuō)明，選擇任何特定的質(zhì)粒載體或者其他的DNA載體或者病毒載體并非本發(fā)明的限制因素，當(dāng)閱讀本文公開(kāi)內(nèi)容后，其他DNA或者病毒載體可代替本文所公開(kāi)的載體。選擇具體的啟動(dòng)子/調(diào)控序列并將該啟動(dòng)子/調(diào)控序列與編碼所需抗原的DNA序列有效連接是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。該技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，并記載于，例如Sambrook(ibis)和Ausubel(ibid)。
使用下列常規(guī)方法進(jìn)行以下實(shí)施例1～5中所述的實(shí)驗(yàn)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，含有EOI的NOI包被于金粒子上，以提供根據(jù)本發(fā)明的示例性組合物。將包被的粒子給予動(dòng)物受試者，然后評(píng)估組合物誘發(fā)抗原特異性T細(xì)胞和/或抗體應(yīng)答的能力。
核心載體粒子包被直接在1.5mL Eppendorf管中稱(chēng)取適當(dāng)重量的金粒子。然后加入大約300μl 0.05M亞精胺溶液使金懸浮，并使用超聲波儀使金分散。然后將含相關(guān)DNA質(zhì)粒的溶液(約50μl)以2μg DNA/mg金的濃度加入金/亞精胺溶液中。DNA溶液中可包含一種類(lèi)型的質(zhì)粒，或者在某些實(shí)驗(yàn)中，兩種或多種質(zhì)粒(例如基因佐劑)可在與金溶液混合之前先相互混合。輕輕攪拌DNA/金混合物，攪拌時(shí)滴加300μl 10％ CaCl2溶液。使DNA/金粒子在室溫下沉淀，然后短暫離心(10～15秒)使金沉淀成團(tuán)。沉淀使用約800μl EtOH洗滌三次。然后將DNA/金粒子懸浮于0.03mg/mL PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的EtOH溶液中，使其濃度達(dá)到每3mL PVP溶液中含有大約1mg DNA/金。然后將該溶液如前所述包被于Tefzel管上。參見(jiàn)例如PCT專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US95/00780以及美國(guó)專(zhuān)利5,733,600；5,780,100；5,865,796和5,584,807，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)援引的方式納入本文。
乙型肝炎表面抗原(HBSAG)構(gòu)建質(zhì)粒(PWRG7128構(gòu)建體)如下構(gòu)建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)載體質(zhì)粒。為了產(chǎn)生HBsAg編碼區(qū)，將pAM6構(gòu)建體(從American Type Culture Collection″ATCC″獲得)使用NcoI切割，并使用綠豆核酸酶處理以去掉X抗原的起始密碼子。然后將產(chǎn)生的DNA使用BamHI切割，并使用T4 DNA聚合酶處理以產(chǎn)生DNA平端，以及建立HBsAg表達(dá)盒。該HBsAg表達(dá)盒為1.2kB的片段。將含有全長(zhǎng)人CMV(Towne株)立即早期啟動(dòng)子(帶有增強(qiáng)子)的質(zhì)粒構(gòu)建體pPJV7077(Schmaljohn et al.(1997)J.Virol.719563-9569)使用HindIII和BglII切割，然后使用T4 DNA聚合酶和小牛堿性磷酸酶處理以產(chǎn)生DNA平端，將HBsAg表達(dá)盒與該質(zhì)粒連接，產(chǎn)生pWRG7128構(gòu)建體。
體外免疫測(cè)定使用ELISA測(cè)定測(cè)試個(gè)體小鼠的血清樣品中，對(duì)HBsAg具有特異性的抗體。為進(jìn)行ELISA，將Falcon Pro Bind微量滴定板在4℃下使用0.1μg/孔、在PBS(磷酸鹽緩沖液，BioWhittaker)中的純化的HBsAg(BioDesing)包被過(guò)夜。該板在室溫(RT)下使用5％奶粉/PBS封閉1小時(shí)，然后使用沖洗緩沖液(10mM Tris緩沖鹽水，0.1％ Brij-35)洗滌3次，將在稀釋緩沖液(2％奶粉/PBS/0.05％吐溫20)中稀釋的血清樣品加入板中，在RT下溫育2小時(shí)。將板洗滌3次，將在稀釋緩沖液中以1∶8000稀釋的生物素化山羊抗小鼠抗體(SouthernBiotechnology)加入板中，RT下溫育1小時(shí)。溫育后，將板洗滌3次，然后加入在PBS中以1∶8000稀釋的鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶綴合物(Southern Biotechnology)，將板在RT下再溫育1小時(shí)。另外洗滌3次后，將板洗滌3次，然后加入TMB底物溶液(BioRad)，30分鐘后以1N H2SO4中止反應(yīng)的進(jìn)行。讀取450nm的吸光度。將樣品與已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，計(jì)算端點(diǎn)效價(jià)(endpoint titer)。
為進(jìn)行細(xì)胞免疫測(cè)定，將取自經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物的脾臟的脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，在對(duì)應(yīng)于Balb/c小鼠中的已知CD8表位的肽存在的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。該肽溶于DMSO(10mg/ml)中，并以10μg/ml稀釋于培養(yǎng)物中。該肽的序列為IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO20)。
為進(jìn)行IFN-γ ELISPOT測(cè)定，將Millipore Multiscreen多孔濾膜板使用50μl 15μg/ml溶于0.1M無(wú)菌碳酸鹽緩沖液(pH9.6)的抗IFN-γ抗血清(Pharmingen)在4℃下包被過(guò)夜。將板使用無(wú)菌PBS洗滌6次，然后使用含10％胎牛血清(FBS)的組織培養(yǎng)基在RT下封閉1～2小時(shí)。除去培養(yǎng)基，將脾細(xì)胞分裝到孔中，每孔共1×106個(gè)細(xì)胞。對(duì)于所加入的經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物的細(xì)胞不足1×106的孔，再加入來(lái)自未免疫動(dòng)物的細(xì)胞，使其總數(shù)達(dá)到1×106。將細(xì)胞在上述肽存在的條件下在培養(yǎng)箱中過(guò)夜培育。然后將板使用PBS洗滌2次，使用蒸餾水洗滌1次，然后再使用PBS洗滌3次。將生物素化抗IFN-γ單克隆抗體(Pharmingen)加入板中(50μl 1μg/ml溶于PBS的溶液)，RT下培育2小時(shí)。將板使用PBS洗滌6次，然后加入50μl鏈霉親和素堿性磷酸酶綴合物(1∶1000溶于PBS，Pharmingen)，RT下培育2小時(shí)。將板使用PBS洗滌6次，加入堿性磷酸酶顯色底物(BioRad)，使反應(yīng)進(jìn)行到出現(xiàn)暗點(diǎn)。用水洗滌3次以中止反應(yīng)進(jìn)行。使板風(fēng)干，在顯微鏡下數(shù)出斑點(diǎn)數(shù)。
HIV-1 GP120抗原構(gòu)建編碼HIV-1 GP120抗原的質(zhì)粒如下構(gòu)建編碼HIV-1 gp120的質(zhì)粒載體。使用Bluescript(Stratagene，La Jolla，CA)質(zhì)粒骨架、人巨細(xì)胞病毒(hCMV)立即早期啟動(dòng)子(Fuller et al.(1994)Aids Res.Hum Retroviruses101433)和SV40病毒晚期多腺苷酸位點(diǎn)開(kāi)始構(gòu)建載體。hCMV啟動(dòng)子包含于619堿基對(duì)(bp)的AccII片段中，并從立即早期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上游延伸522bp，向下游延伸96bp。SV40病毒晚期多腺苷酸序列包含于來(lái)自pSV2dhfr(以前可購(gòu)自Bethesda Research Laboratories，分類(lèi)號(hào)5369SS)的大約800bp的BamHI-BglII片段。首先，構(gòu)建編碼HIV-1gp160的質(zhì)粒，稱(chēng)為“pC-Env”。該質(zhì)粒包含來(lái)自LAV-1BRU(ATCC編號(hào)53069，GenBank編號(hào)K02013)的2565bp的KpnI-XhoI片段，它起始于編碼成熟gp160氨基末端第4位氨基酸的序列。env編碼序列片段被置于緊鄰一個(gè)160bp的合成片段的下游，并與其框內(nèi)融合，該合成片段如上所述編碼單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)信號(hào)肽，沒(méi)有成熟gD氨基末端的氨基酸(Fuller et al.(1994)Aids Res.HumRetroviruses 101433)。
然后如下構(gòu)建編碼HIV-1 gp120的質(zhì)粒，本文稱(chēng)之為“pCIA-Env/T”。pCIA-Env/T質(zhì)粒編碼HIV-1 gp120的截短形式，并且除了env編碼序列在第8188位核苷酸的HindIII位點(diǎn)被截短外，與pC-Env構(gòu)建體是相同的。這樣產(chǎn)生了截短型gp160翻譯產(chǎn)物，截去點(diǎn)位于gp120/gp41加工位點(diǎn)下游128氨基酸殘基處。
體外免疫測(cè)定在第5周和第6.5周(分別為首次免疫后和加強(qiáng)免疫后)采集樣品，使用ELISA檢測(cè)針對(duì)HIV gp120抗原的血清抗體應(yīng)答。為進(jìn)行ELISA，將Costar高結(jié)合性EIA板使用0.3μg/孔的溶于50μl PBS的重組HIV gp120(Intracel)，通過(guò)在4℃下過(guò)夜培育來(lái)進(jìn)行包被。將板洗滌3次，使用溶于PBS的2％BSA在室溫下封閉2小時(shí)。將血清的連續(xù)稀釋液加入包被的板中，37℃下培育1小時(shí)。洗滌后，將板使用與堿性磷酸酶結(jié)合的羊抗小鼠IgG(H+L)(BioRad)的1∶1500的稀釋液培育，然后使用磷酸對(duì)硝基苯酯(PNPP)(BioRad)顯色，在405nm處讀取OD。
使用流式微珠測(cè)定(cytometric bead assay)來(lái)測(cè)量由脾細(xì)胞分泌的抗原特異性IFN-γ的量。96孔板的每個(gè)孔中加入1×106個(gè)脾細(xì)胞，并且在僅有培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)的條件下激發(fā)，或者在含有1μg/ml具有下列序列的HIV gp120肽的培養(yǎng)基中激發(fā)RIQRGPGRAFVITGK(SEQ ID NO21)。在37℃、5％CO2的條件下培育48小時(shí)后，去掉上清液，通過(guò)流式微珠測(cè)定(BD Biosciences)來(lái)測(cè)量IFN-γ的水平。
HSV-2抗原構(gòu)建編碼HSV-2 ICP27的質(zhì)粒構(gòu)建編碼ICP27的DNA疫苗，然后與當(dāng)前各種佐劑質(zhì)粒載體的綴合物相結(jié)合，以提供疫苗組合物。免疫后，經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物使用HSV-2攻擊，測(cè)量各種疫苗組合物的防護(hù)效果。
關(guān)于構(gòu)建DNA抗原質(zhì)粒，可使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行。用于構(gòu)建該載體的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件如下含1.5mM MgCl2的1×PCR核心緩沖液(Promega Corp.，Madison，WI)；每種引物0.400μM；每種dNTP200μM(USB Inc.，Cleveland，OH)；2.5μg Taq聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；1.0ng模板DNA；加水至100μl；以及礦物油(AldrichChemical Inc.，Milwaukee WI)涂層。為PTC-200熱循環(huán)器(MJResearch Inc.，Waltham，MA)設(shè)定程序以運(yùn)行以下規(guī)則95℃4分鐘；30個(gè)循環(huán)(95℃1分鐘/55℃1分15秒/72℃1分鐘)；72℃10分鐘；4℃保持。使用QIAquick7 PCR純化試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)從PCR反應(yīng)中取出擴(kuò)增產(chǎn)物，然后使用限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)切割。
更具體地說(shuō)，按如下方法構(gòu)建編碼HSV-2早期ICP27抗原的DNA疫苗質(zhì)粒載體。HSV是一種雙鏈DNA病毒，其基因組約為150～160kbp。該病毒基因組包裝于二十面體的核殼中，而核殼又以膜包被。膜(包膜)包括至少10種病毒編碼的糖蛋白，其中最為豐富的是gB、gC、gD和gE。病毒基因組另外編碼超過(guò)70種其他的蛋白，包括一組大約五種立即早期抗原。這些早期蛋白在病毒復(fù)制周期的早期被合成，而包膜糖蛋白與之不同，它只在病毒生活史的晚期被合成。有關(guān)HSV的分子結(jié)構(gòu)和組織的綜述，可參見(jiàn)例如Roizman和Sears(1996)″Herpes simplex viruses and their replication″in Fields Virology，第3版，F(xiàn)ields et al.編著，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA。HSV-2ICP27抗原可容易地從HSV-2基因組獲得，例如，HSV-2基因組中大約114589到134980位的核苷酸范圍的基因組區(qū)，或者HSV-2基因組中110931到139697位的核苷酸范圍的EcoRI片段。HSV-2基因組序列可由公開(kāi)來(lái)源獲得，例如GenBank中編號(hào)為NC_001798的序列。
為了構(gòu)建用于本實(shí)驗(yàn)的ICP27載體，使用下列引物5′CGCC ACTCTC TTC CGA CACC3′(SEQ ID NO25)和5′CCAA GAA CATCAC ACG GAA CC3′(SEQ ID NO26)，從HSV-2基因組中對(duì)ICP27編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得含HSV-2的核苷酸序列114523-116179(GenBank)的核苷酸片段，它即對(duì)應(yīng)于ICP27編碼區(qū)。然后將ICP27片段克隆進(jìn)入pTarget載體(Promega Corp.，Madison，WI)的多克隆區(qū)。
構(gòu)建PJV7630質(zhì)粒pPJV7630的抗原基因的來(lái)源是HSV-2毒株MS的基因組片段，它已經(jīng)被克隆進(jìn)入被稱(chēng)為粘粒23的粘粒載體。粘粒23由來(lái)自HSV-2的3個(gè)EcoRI片段組成，該片段在已經(jīng)公開(kāi)的序列(HG52株)中橫跨核苷酸110,931到147,530。粘粒23使用EcoRI部分消化再重新連接，然后選擇只有大約28,000bp片段(110,931-139,697)的構(gòu)建體。該分子命名為OP23。對(duì)該分子進(jìn)行6種修飾，以改變OP23中的序列。該步驟是為了除去HSV-2序列中的非立即早期基因以及骨架DNA序列。最后一步修飾是使用適當(dāng)?shù)目股乜剐曰虼婀羌苄蛄校怪晒┡R床應(yīng)用。這些步驟如下所述。
1.Bst1107I和ScaI消化并重新連接(去掉氨芐西林抗性基因)。生成OP23-1。
2.NsiI消化并重新連接，去掉SV40復(fù)制起點(diǎn)。生成OP23-2。
3.BstXI部分消化并重新連接，去掉ICP27和ICP0之間的區(qū)域，生成OP23-3。
4.使用BspHI完全消化，接著使用BsiWI部分消化，然后重新連接，去掉ICP22基因之后的序列以及某些骨架序列。生成OP23-4。
5.SrfI消化并重新連接生成OP23-5。去掉ICP4和ICP0之間的序列。
6.BstXI完全消化并重新連接，生成OP23-6。去掉ICP27和ICP0之間的小片段。
7.使用含卡那霉素抗性基因的片段代替編碼上述抗生素抗性基因的骨架序列，生成pPJV7630。
構(gòu)建體pPJV7630比較大(19517個(gè)堿基)，包含編碼ICP0、ICP4、ICP22和ICP27立即早期抗原的基因。
體外免疫測(cè)定小鼠由小鼠脾臟獲得單細(xì)胞懸液。將脾臟擠過(guò)篩孔，生成單細(xì)胞懸液，然后使細(xì)胞沉淀，并經(jīng)ACK緩沖液(Bio Whittaker，Walkersville MD)處理以溶解紅細(xì)胞。然后使用添加HEPES、1％谷氨酰胺(BioWhittaker)和5％熱滅活胎牛血清(FCS，Harlan，Indianapolis IN)的RPMI 1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞洗滌2次。細(xì)胞計(jì)數(shù)，并重新懸浮于適當(dāng)濃度的“全”培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由以下成分構(gòu)成含HEPES和1％谷氨酰胺的RPMI 1640，添加有5％熱滅活FCS、50μM巰基乙醇(Gibco-BRL，Long Island NY)、慶大霉素(Gibco-BRL)、1mM MEM丙酮酸鈉(Gibco-BRL)以及MEM非必需氨基酸(Sigma，St.LouisMO)。為進(jìn)行CD8特異性測(cè)定，細(xì)胞在對(duì)應(yīng)于已知CD8表位的肽存在的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。對(duì)于BALB/C小鼠中的ICP27，此肽的序列為HGPSLYRTF(QCB Inc)。肽在DMSO(10mg/ml)中制備，并使用培養(yǎng)基稀釋至10μg/ml。
為進(jìn)行IFN-γ ELISPOT測(cè)定，將Multiscreen多孔濾膜板使用50μl 15μg/ml溶于0.1M無(wú)菌碳酸鹽緩沖液(pH9.6)的抗IFN-γ抗血清(Pharmingen)在4℃下包被過(guò)夜。將板使用無(wú)菌PBS洗滌6次，然后使用含10％胎牛血清(FBS)的組織培養(yǎng)基在RT下封閉1～2小時(shí)。除去培養(yǎng)基，將脾細(xì)胞分裝到孔中，每孔共1×106個(gè)細(xì)胞。對(duì)于所加入的經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物的細(xì)胞不足1×106的孔，再加入來(lái)自未免疫動(dòng)物的細(xì)胞，使其總數(shù)達(dá)到1×106。將細(xì)胞在上述肽存在的條件下在培養(yǎng)箱中過(guò)夜培育。然后將板使用PBS洗滌2次，使用蒸餾水洗滌1次，然后再使用PBS洗滌3次。將生物素化抗IFN-γ單克隆抗體(Pharmingen)加入板中(50μl 1μg/ml溶于PBS的溶液)，RT下培育2小時(shí)。將板使用PBS洗滌6次，然后加入50μl鏈霉親和素堿性磷酸酶綴合物(1∶1000溶于PBS，Pharmingen)，RT下培育2小時(shí)。將板使用PBS洗滌6次，加入顯色底物(BioRad)，使反應(yīng)進(jìn)行到出現(xiàn)暗點(diǎn)。用水洗滌3次以中止反應(yīng)進(jìn)行。使板風(fēng)干，在顯微鏡下數(shù)出斑點(diǎn)數(shù)。
體內(nèi)測(cè)定小鼠使用感染攻擊模型(infectious challenge model)來(lái)驗(yàn)證各種免疫方案保護(hù)小鼠免受HSV-2致死攻擊的能力。攻擊前先免疫小鼠，感染時(shí)進(jìn)行麻醉，鼻內(nèi)給予溶于30μl PBS的致死劑量的HSV-2。感染后跟蹤觀察小鼠20天，記錄疾病和死亡情況。
體外免疫測(cè)定家豬為了分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，全血使用Histopaque-1077cushion(3000rpm，30分鐘)在室溫下離心，從梯度的條帶中回收PBMC。PBMC使用全培養(yǎng)基洗滌3次，重新懸浮于25mL全培養(yǎng)基中用于計(jì)數(shù)，在全培養(yǎng)基中重新懸浮至1×107個(gè)細(xì)胞/ml。按小鼠測(cè)定中所述的方法進(jìn)行ELISPOT測(cè)定，除了抗原由來(lái)自HSV-2抗原的重疊肽文庫(kù)的肽匯集而成，并且使用對(duì)家豬IFN-γ具有特異性的抗IFN抗體對(duì)(R & D systems)進(jìn)行檢測(cè)。
體內(nèi)測(cè)定家豬用于檢查家豬中免疫應(yīng)答的另一種測(cè)定是遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)測(cè)定。該測(cè)定使用DNA質(zhì)粒和蛋白提取物作為抗原來(lái)源，分別使用XR1裝置和針頭注射給予至豬的皮膚中。給藥后48小時(shí)測(cè)量抗原給藥部位周?chē)l(fā)紅的(紅斑)面積，作為DTH反應(yīng)的指標(biāo)。在免疫完成后7天，將抗原給藥至皮膚。
實(shí)施例1使用包含NOI的兩種不同質(zhì)粒免疫小鼠。它們是HSV-2臨床疫苗多基因質(zhì)粒(PJV7630)和單基因質(zhì)粒，它們都包括與HCMV啟動(dòng)子有效連接的ICP27 NOI。ICP27 NOI編碼位于PJV7630中的顯性表位，曲線圖代表對(duì)該蛋白具有特異性的CD8應(yīng)答。
NOI給藥方案在一周內(nèi)，分別在第7天(D 7)、第0和7天(D 0，7)或者第0、2、4和7天(D 0，2，4，7)進(jìn)行1、2或4次NOI給藥。每次NOI給藥注射1針或2針，在一組中，LT佐劑與NOI同時(shí)給藥。
結(jié)果ICP27基因是發(fā)現(xiàn)于PJV7630中的顯性抗原，圖1A和1B代表對(duì)該靶抗原具有特異性的CD8應(yīng)答。
通常質(zhì)粒PJV7630(圖1B)和ICP27(圖1A)在僅一次NOI給藥后產(chǎn)生500 ELISPOT/百萬(wàn)細(xì)胞，兩次NOI給藥后產(chǎn)生1500ELISPOT/百萬(wàn)細(xì)胞。當(dāng)兩次NOI給藥后給予LT基因佐劑時(shí)，可發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大約3500 ELISPOT。即使在沒(méi)有LT佐劑的情況下，四次NOI給藥后也可獲得超過(guò)3500 ELISPOT/百萬(wàn)細(xì)胞，但LT基因佐劑同樣可增強(qiáng)該應(yīng)答。在圖1A中，LT與NOI同時(shí)給藥的應(yīng)答由于超出測(cè)量范圍而未測(cè)量。
小結(jié)根據(jù)在使用PJV7630免疫的小鼠中所測(cè)量的ICP27特異性CD8IFN-γ ELISPOT的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)成組NOI給藥可產(chǎn)生增強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實(shí)施例2以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)估由單基因質(zhì)粒的成組NOI給藥導(dǎo)致的增強(qiáng)的CMI應(yīng)答，是否與致死攻擊中增強(qiáng)的保護(hù)相關(guān)。
方法在一周內(nèi)給予小鼠質(zhì)粒PJV7630。在一周時(shí)間內(nèi)，進(jìn)行1次(第7天)、2次(第0和7天)或者4次(第0、2、4和7天)NOI給藥。有一組在每次免疫時(shí)接受2倍劑量，但多數(shù)小鼠在每次免疫時(shí)接受單劑量PJV7630。
結(jié)果圖中標(biāo)示的是“給藥次數(shù)×每次給藥的劑量數(shù)”，所以4×1表示4次NOI給藥，每次給藥為單劑量的動(dòng)物。為期1周的NOI給藥后，動(dòng)物休息1周或2周，然后進(jìn)行病毒感染。病毒的劑量約為L(zhǎng)D50的5倍。
圖2A顯示C57B1/6小鼠休息2周后的結(jié)果。該結(jié)果清晰地表明，4×1方案(即4次給藥×每次給藥1倍劑量)保護(hù)效果更好。該結(jié)果似乎并非由劑量增加而導(dǎo)致，因?yàn)?×2(即2次NOI給藥×2倍劑量)同樣總共有4倍劑量。
圖2B顯示C57B1/6小鼠休息1周后的結(jié)果。從圖2B中可以明顯看出，該結(jié)果與圖2A所示的休息2周的結(jié)果實(shí)質(zhì)上是相同的。然而，在圖2B中還有一組只進(jìn)行一次NOI給藥。
圖2C顯示Balb/c小鼠休息1周后的結(jié)果。從該結(jié)果可以明顯看出，攻擊劑量不足以在死亡率上造成明顯差異，但在患病情況上有差別。括號(hào)中的數(shù)字表示疾病計(jì)分，數(shù)越大，則動(dòng)物病情越重。該結(jié)果與圖2A和2B中的結(jié)果相一致，均表明4×1(即4次給藥×單劑量)可實(shí)現(xiàn)最佳保護(hù)。
小結(jié)在1周內(nèi)4次給藥×每次給藥量為單劑量的成組給藥方法可快速產(chǎn)生強(qiáng)保護(hù)性CMI應(yīng)答，它比單次給藥或者每次給藥量為多劑量的給藥方法產(chǎn)生的應(yīng)答都要強(qiáng)。
實(shí)施例3本實(shí)驗(yàn)的目的是改變單基因質(zhì)粒的DNA給藥之間的時(shí)間間隔。
方法對(duì)所有小鼠進(jìn)行總共4次給藥，各次給藥的日期以及給藥之間的時(shí)間間隔不同。小鼠在給藥之間有6、4、2、1或0天的時(shí)間間隔(即0表示一天內(nèi)注射4針)。各種方案的最后一次給藥安排在相同的歷法日中，最后一次給藥后7天處死所有動(dòng)物。
結(jié)果圖3A提供了以0、1、2、4和6天的時(shí)間間隔進(jìn)行ICP27單基因質(zhì)粒成組給藥的CD8 ELISPOT結(jié)果。該結(jié)果表明增加給藥間的時(shí)間間隔可提高CD8 ELISPOT結(jié)果，當(dāng)NOI給藥之間的時(shí)間間隔為4天(即96小時(shí))時(shí)，所得結(jié)果最大。
圖3B提供了以0、1、2、4和6天的時(shí)間間隔進(jìn)行HbsAg單基因質(zhì)粒成組給藥的CD8 ELISPOT結(jié)果。該結(jié)果表明增加給藥間的時(shí)間間隔可提高CD8 ELISPOT結(jié)果，當(dāng)NOI給藥之間的時(shí)間間隔為4到6天時(shí)，所得結(jié)果最大。
小結(jié)在小鼠中進(jìn)行成組NOI給藥之間的時(shí)間間隔的實(shí)驗(yàn)表明，在進(jìn)行4次NOI給藥時(shí)，當(dāng)給藥相隔4或6天時(shí)，在CD8+T細(xì)胞應(yīng)答方面，可獲得最佳應(yīng)答。
圖3C提供了來(lái)自HbsAg單基因質(zhì)粒成組給藥的抗體結(jié)果。所得的抗體效價(jià)相當(dāng)弱。這些結(jié)果表明，以0、1、2、4或6天的給藥時(shí)間間隔進(jìn)行成組NOI給藥似乎在增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的同時(shí)并未顯著提高抗體效價(jià)。
實(shí)施例4本實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)估成組的多基因質(zhì)粒(PJV7630)的NOI給藥引發(fā)的與CD8+T細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的CMI應(yīng)答。
方法對(duì)動(dòng)物總共進(jìn)行4次NOI給藥，但NOI給藥之間的時(shí)間間隔不同。每組的最后一次給藥在同一天進(jìn)行(NOI給藥的起始時(shí)間不同)，完成給藥后1周和3周測(cè)量應(yīng)答情況。增加了3周取樣是為了盡量減小不同的方案對(duì)給藥時(shí)間的影響。例如，以6天的給藥時(shí)間間隔進(jìn)行4次NOI給藥的動(dòng)物，第一次和第四次給藥之間的時(shí)間間隔是18天，而給藥時(shí)間間隔為0的動(dòng)物，所有注射均在第18天進(jìn)行。
結(jié)果圖4A和4B的結(jié)果顯示以ICP27特異性CD8IFN-γ ELISPOT測(cè)量的細(xì)胞應(yīng)答。NOI給藥之間的時(shí)間標(biāo)于圖中。所有動(dòng)物總共注射4針。明顯可以看出，多基因質(zhì)粒(PJV7630)的結(jié)果與使用單基因質(zhì)粒(ICP27)的初始實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。關(guān)于這一點(diǎn)，4和6天的給藥時(shí)間間隔可產(chǎn)生以ELISPOT量度的最佳應(yīng)答(見(jiàn)圖3C)，這種情況可以維持3周，但應(yīng)答水平此時(shí)已經(jīng)下降了大約3倍(見(jiàn)圖3D)。
實(shí)施例5本實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)定在使用基因佐劑和成組NOI給藥方案來(lái)增強(qiáng)針對(duì)相對(duì)較弱的抗原(如HIV-1 gp120)的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答時(shí)，是否存在協(xié)同作用。
方法該實(shí)驗(yàn)包括對(duì)小鼠進(jìn)行至少兩次gp120抗原給藥，其中每次“給藥”由1到4次XR1成組給藥組成。參見(jiàn)后文圖5A的示意圖。另外，給藥之間的間歇期為1周。使用LT A+B基因佐劑(pPJV2012)。圖10中提供了pPJV2012的質(zhì)粒圖。pPJV2012質(zhì)粒通過(guò)將編碼LTA和LTB亞基蛋白的LT基因分別克隆進(jìn)入質(zhì)粒pPJV-2004和pPJV-2005來(lái)制備，如WO 03/004055所述。然后將編碼LTA和LTB亞基蛋白的基因從源質(zhì)粒上切下，插入單質(zhì)粒中，生成pPJV2012質(zhì)粒。
結(jié)果圖5B顯示從NOI給藥時(shí)間間隔為7天的動(dòng)物組獲得的數(shù)據(jù)。每次成組給藥中XR1給藥次數(shù)不同，是否存在LT A+B基因佐劑(pPJV2012)的情況也不同。所得數(shù)據(jù)表明，是否存在基因佐劑對(duì)細(xì)胞應(yīng)答(IFN-γ產(chǎn)生)的影響最強(qiáng)。圖5B清楚地表明，當(dāng)NOI給藥為兩次成組給藥時(shí)，LT增強(qiáng)的應(yīng)答最為強(qiáng)烈。這些結(jié)果表明，成組給藥方案對(duì)由基因LT佐劑獲得的總體細(xì)胞應(yīng)答有極大的貢獻(xiàn)。
圖5C表明，與CMI應(yīng)答不同，成組給藥顯示出對(duì)總抗體應(yīng)答強(qiáng)度的影響最大。如圖5C所示，使用每組4次給藥，具有以及沒(méi)有基因佐劑載體誘發(fā)出非常強(qiáng)的gp120特異性效價(jià)(高出前面遇到過(guò)的5～10倍)。更重要的是，存在基因佐劑影響了IgG1到IgG2a亞類(lèi)的平衡，而非誘發(fā)強(qiáng)抗體效價(jià)所必需(未顯示)。
小結(jié)該結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)編碼弱抗原的NOI與編碼佐劑的NOI同時(shí)給藥時(shí)，經(jīng)兩次NOI給藥，可獲得就干擾素γ釋放而言最強(qiáng)的CMI應(yīng)答。與之相比，在給藥時(shí)間間隔約為48小時(shí)的一組四次NOI給藥中，不管有沒(méi)有佐劑，均可獲得強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。
實(shí)施例6本實(shí)驗(yàn)的目的是確定使用pPJV7630免疫家豬可產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，該應(yīng)答由IFN-γ ELISPOT和DTH應(yīng)答確定。
方法為進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，使用XR1設(shè)備給予家豬pPJV7630或者安慰劑(只有金)。每次免疫給予家豬兩倍劑量，一周時(shí)間內(nèi)進(jìn)行一組4次免疫。因此，此組免疫中每只豬給予總共8倍劑量的疫苗。第一組免疫結(jié)束后28天開(kāi)始第二組免疫。
結(jié)果圖6A顯示第一組免疫后從動(dòng)物中獲得的IFN-γ ELISPOT數(shù)據(jù)。數(shù)值是8只免疫動(dòng)物和8只對(duì)照動(dòng)物的平均值。該數(shù)據(jù)顯示成組免疫方案能夠提高家豬中的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而這被認(rèn)為是測(cè)量免疫原性較難獲得的模型。對(duì)照組豬均顯示背景水平的ELISPOT。
圖6B顯示以pPJV7630免疫的豬(4只)中，在抗原給藥部位出現(xiàn)的紅斑的平均面積(對(duì)照動(dòng)物未包括在圖中)。免疫后7天給予抗原，豬已經(jīng)接受了兩組免疫?？乖o藥后48小時(shí)出現(xiàn)紅斑說(shuō)明它是DTH反應(yīng)。結(jié)果表明，DTH應(yīng)答為抗原特異性答應(yīng)，這是因?yàn)榭召|(zhì)粒(N)或者無(wú)關(guān)抗原(sAg)乙型肝炎表面抗原質(zhì)粒不誘導(dǎo)DTH反應(yīng)，而表達(dá)疫苗抗原(0、4、22、27)的質(zhì)粒顯示良好的DTH應(yīng)答。在只給予安慰劑的豬中(數(shù)據(jù)未顯示)，未發(fā)現(xiàn)針對(duì)任何抗原的DTH反應(yīng)，證明圖6B中的應(yīng)答是pPJV7630免疫的結(jié)果。在蛋白提取物的注射部位，對(duì)ICP22和ICP4蛋白來(lái)說(shuō)具有幾個(gè)較好的DTH數(shù)據(jù)，但對(duì)于對(duì)照PBS溶液以及ICP0和ICP27蛋白來(lái)說(shuō)則沒(méi)有。因?yàn)橹挥?μg蛋白提取物可用于注射，最高達(dá)100μg可用于誘發(fā)DTH應(yīng)答，所以低應(yīng)答可能與給藥劑量有關(guān)。
小結(jié)在家豬模型中，發(fā)現(xiàn)成組免疫能夠誘導(dǎo)針對(duì)疫苗抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為家豬并不是提高免疫應(yīng)答的良好模型，但成組免疫能夠提高細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實(shí)施例7進(jìn)行家豬實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證針對(duì)由pPJV1671表達(dá)的ha蛋白的抗體應(yīng)答受劑量和裝置的影響情況，詳細(xì)內(nèi)容列于下表1中。(XR粒子加速設(shè)備在上文中敘述。)表1


*每隔一天2針(第1、3、5和8天)動(dòng)物使用疫苗進(jìn)行首次免疫以及在第4周時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在加強(qiáng)免疫后2周的不同時(shí)間點(diǎn)采血，將抗體效價(jià)列于下圖中。兩組動(dòng)物，每次免疫時(shí)共給予8倍劑量，成組或者一次給予。成組免疫的動(dòng)物血清抗體水平較高。
抗體效價(jià)使用200血凝反應(yīng)單位/孔的溶于磷酸鹽緩沖液的肌氨酰裂解純化的Sw/IN病毒，通過(guò)ELISA以標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量抗體效價(jià)。豬抗體使用羊抗豬免疫球蛋白G堿性磷酸酶綴合物直接測(cè)定。
質(zhì)粒pPJV1671如圖8所示，質(zhì)粒pPJV1671是編碼流感A/巴拿馬/2007/99(H3N2)的血凝素(HA)抗原的人DNA疫苗載體。使用從CDC獲得的A/巴拿馬/2007/99病毒樣本作為模板RNA來(lái)源，以標(biāo)準(zhǔn)的反轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)克隆技術(shù)來(lái)獲得HA編碼序列。采用以下步驟開(kāi)發(fā)最終的pPJV1671 HA DNA疫苗載體。
●RT-PCR制備A/巴拿馬/2007/99(H3N2)的RNA片段#4的dsDNA片段。
●使用標(biāo)準(zhǔn)的基于pUC19的載體在大腸桿菌中增殖RNA片段#4DNA克隆。
●對(duì)在RNA片段4克隆內(nèi)的H3巴拿馬HA編碼序列進(jìn)行序列分析。
●進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，形成含H3巴拿馬編碼序列(無(wú)ATG密碼子)的DNA片段，其末端和pPJV7563 DNA疫苗載體相容(Nhe I和Bsp 120I)，。
將H3巴拿馬HA編碼序列插入pPJV7563，生成與Kozak共有序列一致的最終pPJV1671 H3巴拿馬HA DNA疫苗載體。使用載體提供的ATG密碼子(通過(guò)在Nhe I位點(diǎn)插入)導(dǎo)致在HA基因編碼序列的氨基末端產(chǎn)生2氨基酸的微小插入物，如圖9所示。
小結(jié)該研究表明成組免疫可顯著提高家豬模型中的抗體應(yīng)答。
質(zhì)粒pPJV7563構(gòu)建pPJV7563圖11提供了pPJV7563質(zhì)粒圖。圖12提供了pPJV7563質(zhì)粒的堿基組成。質(zhì)粒pPJV7563中各組件及其位置如下1-44轉(zhuǎn)座子903序列45-860來(lái)自轉(zhuǎn)座子903的卡那霉素抗性編碼序列861-896轉(zhuǎn)座子903序列897-902 Sal1位點(diǎn)903-1587 CMV啟動(dòng)子1588-1718來(lái)自CMV立即早期基因的非翻譯前導(dǎo)序列1719-1724 BamH1和BglII限制酶的融合體1725-1857大鼠胰島素內(nèi)含子A1858-1863 BamH1位點(diǎn)1864-1984 HBV表面抗原5′-非翻譯前導(dǎo)序列1985-1993合成起始密碼子/Nhe1克隆位點(diǎn)1994-2011合成克隆位點(diǎn)2012-2544 HBV增強(qiáng)子2545-2555殘余載體序列。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)命中條目2556-2686兔β-珠蛋白多腺苷酸化區(qū)2687-3759 pUCl9載體序列pPJV7563質(zhì)粒如下制備圖13的描述，構(gòu)建PJV7563的流程圖將pWRG7074中的牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)(BGHpA)替換成兔β-球蛋白多腺苷酸化信號(hào)(RBGpA)，生成pWRG7284。通過(guò)將所有的CMV序列替換成來(lái)自含CMV啟動(dòng)子和外顯子1/2融合體的PCR片段的pWRG7128，將CMV的內(nèi)含子A從pWRG7284中去除。這樣生成pWRG7293。
將CMV和HBV序列從pWRG7284中去除，替換為來(lái)自pWRG7293的CMV和5’-HBV序列以及來(lái)自pWRG7128的3′-HBV序列。在該步驟中去除SIV nef基因，生成pPJV7382。pPJV7382通過(guò)加入大鼠胰島素內(nèi)含子A(RIA)進(jìn)一步改造，生成pPJV7389。將pPJV7389中的卡那霉素抗性(KanR)基因替換為縮短的形式，去掉該基因兩端的非必需序列，生成pPJV7496。對(duì)來(lái)自pPJV7496的RIA中的Nhe1位點(diǎn)進(jìn)行加工處理，生成pPJV7530。
去除pPJV7530中的3′-UTR的5′區(qū)的HBV序列，替換為來(lái)自pPJV7468的HBV 5′-UTR、流感M2基因以及3′-UTR的5′區(qū)，生成PJV7549。PJV已經(jīng)證明，在編碼多種抗原的載體中保留來(lái)自WRG7128的HBVenh和HBV 5′UTR區(qū)可重現(xiàn)地提高抗原表達(dá)和免疫原性?，F(xiàn)在它們已經(jīng)成為PJV的DNA疫苗載體的常規(guī)組件。然后從pPJV7549中去掉M2基因，替換為形成聚合接頭的寡核苷酸。該操作生成pPJV7563，一種能夠接受其他編碼序列的表達(dá)載體。
構(gòu)建質(zhì)粒pWRG7074，即PJV7563的親本載體制備標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒骨架pWRG7074。該骨架用作前體質(zhì)粒，從它可制備出pWRG7128，即用于幾種臨床試驗(yàn)的HBsAg表達(dá)載體。在這部分中，衍生制備該骨架的過(guò)程在文字?jǐn)⑹霾糠钟涊d，并在圖15和16中顯示，其中圖15和16分別為“衍生制備質(zhì)粒PJV7074和PJV7128的流程圖”和“關(guān)鍵質(zhì)粒特征圖”。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)將含有人CMV立即早期啟動(dòng)子和牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化序列的單個(gè)片段插入標(biāo)準(zhǔn)的、較好鑒定的pUC19細(xì)菌質(zhì)粒載體中，來(lái)生成pWRG7074。采用幾步后續(xù)操作，將氨芐西林替換為卡那霉素(KanR)抗性標(biāo)記，并且改變一些限制位點(diǎn)。作為CMV啟動(dòng)子和bGH poly A區(qū)來(lái)源的DNA片段是從質(zhì)粒pJW4303中獲得的，該質(zhì)粒由當(dāng)時(shí)在斯坦福大學(xué)工作的JimMullins贈(zèng)送。
下面給出有關(guān)構(gòu)建質(zhì)粒WRG7074和WRG7128的詳細(xì)敘述。除非另有說(shuō)明，所有克隆均在PowderJect Vaccines，Inc.，Madison，WI(舊稱(chēng)Agracetus，Inc.，Auragen，Inc.或者Geneva，Inc.Middleton，WI)進(jìn)行。構(gòu)建步驟使用斜體字。項(xiàng)目符號(hào)提供與具體序列有關(guān)的說(shuō)明信息。
步驟1通過(guò)HindIII-BamHI消化，去掉包含TPA信號(hào)肽編碼序列的pJW4303(圖譜，圖10.2)的HindIII-BamHI微小片段。將該微小片段替換為HindIII-Not1-BamH1接頭，生成JW4303-Not1。
包含來(lái)自pJW4303的CMV啟動(dòng)子和bGH poly A區(qū)的片段是SalI-Xho I片段，PJV已經(jīng)驗(yàn)證其長(zhǎng)度為2131bp。已經(jīng)得到了來(lái)自pJW4303的SalI-Xho I片段的核苷酸序列。以下項(xiàng)目可在圖10.2中識(shí)別。
●位于該片段第1位核苷酸的Sal I位點(diǎn)●位于第7位核苷酸的CMVIE啟動(dòng)子片段的起點(diǎn)。它對(duì)應(yīng)于GenBank序列編號(hào)M60321(人巨細(xì)胞病毒立即早期蛋白基因5′端)的第451位核苷酸。
●位于第1648位核苷酸的CMVIE啟動(dòng)子片段的終點(diǎn)。它對(duì)應(yīng)于GenBank序列編號(hào)M60321(人巨細(xì)胞病毒立即早期蛋白基因5′端)的第2097位核苷酸。應(yīng)該注意，得到的CMVIE啟動(dòng)子區(qū)和上述的GenBank序列之間觀察到幾個(gè)核苷酸不同。這可能是由于不同的CMV病毒分離株之間的天然多態(tài)性所導(dǎo)致。
●位于第1661位核苷酸的人組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的信號(hào)肽編碼序列的ATG翻譯起始密碼子。TPA信號(hào)肽編碼序列來(lái)自如Lu et al.(J.Virol.703978，1996)所述的合成DNA。Luet al.的出版文獻(xiàn)簡(jiǎn)要地?cái)⑹隽藰?gòu)建pJW4303的方法，但該敘述存在一些錯(cuò)誤，與推導(dǎo)出的序列有一些矛盾。
●分別位于第1649和1724位核苷酸的編碼序列插入位點(diǎn)HindIII和Nhe I。注意SIV nef同源區(qū)顯示為bGHpA區(qū)的一部分。
●位于SIV nef同源區(qū)起點(diǎn)的第1741位核苷酸的Bam HI限制性酶切位點(diǎn)。它對(duì)應(yīng)于GenBank序列編號(hào)M33262(猿猴免疫缺陷病毒，分離株239，完全的原病毒基因組和側(cè)翼序列)的第9444位核苷酸。
●位于SIV nef同源區(qū)終點(diǎn)的第1849位核苷酸的Bgl II限制性酶切位點(diǎn)。它對(duì)應(yīng)于GenBank序列編號(hào)M33262(猿猴免疫缺陷病毒，分離株239，完全的原病毒基因組和側(cè)翼序列)的第9552位核苷酸。
●1999年發(fā)現(xiàn)，該載體中存在與猿猴免疫缺陷病毒nef基因序列同源的109個(gè)堿基對(duì)的序列。如圖10.1所示，該序列在構(gòu)建pWRG7128時(shí)被去掉。然而，它仍保留在pWRG7074中。該序列存在于pWG4303，衍生出pWRG7077和pWRG7074。SIVnef同源性發(fā)現(xiàn)于第77和184位核苷酸之間。因此，將SIV nef片段插入bHG poly A區(qū)附近是一種顯而易見(jiàn)的人工構(gòu)建方法，它在PJV接受源DNA之前即存在。
●位于第1873位核苷酸的牛生長(zhǎng)激素poly A區(qū)同源起點(diǎn)。它對(duì)應(yīng)于GenBank序列編號(hào)M57764(牛生長(zhǎng)激素基因，完全編碼序列)的第2326位核苷酸。
●位于附著點(diǎn)(attachment)4的第2096位核苷酸的牛生長(zhǎng)激素poly A區(qū)同源終點(diǎn)。它對(duì)應(yīng)于GenBank序列編號(hào)M57764(牛生長(zhǎng)激素基因，完全編碼序列)的第2550位核苷酸。
●位于片段終點(diǎn)(第2131位核苷酸)的Xho I限制位點(diǎn)。
步驟2將來(lái)自pJW4303-NotI(SalI-XhoI片段)的CMV啟動(dòng)子和bGH poly A片段插入pUC19的Sal I位點(diǎn)，生成質(zhì)粒pWRG7012(下圖)。
pWRG7012中包含兩個(gè)BamHI位點(diǎn)和兩個(gè)HindIII位點(diǎn)。在以后的步驟中去除這兩種位點(diǎn)中的一個(gè)(見(jiàn)下文)。
步驟3去除pWRG7012的EcoR1-Xbal區(qū)，以去掉pUC19的多克隆位點(diǎn)大片段，產(chǎn)生pWRG7013(圖10.2)。
PWRG7013保留有兩個(gè)HindIII位點(diǎn)但只有一個(gè)BamHI位點(diǎn)。
步驟4從pWRG7012中去除位于CMV啟動(dòng)子5′的HindIII位點(diǎn)，以便更加容易地利用位于內(nèi)含子和下游插入物之間的HindIII位點(diǎn)。這樣生成pWRG7014(圖10.2)。
PWRG7014保留有兩個(gè)BamHI位點(diǎn)但只有一個(gè)HindIII位點(diǎn)。
步驟5為了制備只包含有1個(gè)HindIIl位點(diǎn)和1個(gè)BamHI位點(diǎn)的質(zhì)粒，將來(lái)自pWRG7013的HindIII-EcoR1片段置于被去除HindIII-EcoR1的pWRG7014中，生成pWRG7020，即WRG7077的氨芐西林的抗性形式(圖10.2)。
步驟6去除pUC19中位于Eam1105 1-Pst1側(cè)翼的氨芐西林抗性基因。經(jīng)聚合酶處理，使包含復(fù)制起點(diǎn)的片段產(chǎn)生平端。分離pUC4K中位于Pst1側(cè)翼的氨芐西林抗性基因。該片段經(jīng)聚合酶處理產(chǎn)生平端，連接于復(fù)制片段起點(diǎn)。這樣生成pWRG7072，即一種可以接受來(lái)自pWRG7031(步驟8)的CMV-HBsAg-bGH-pA盒的KanR載體。
步驟7去除pWRG7020中的聚合接頭的Hd3-BamH1序列，使用聚合酶使載體產(chǎn)生平端。分離出pAM6中含有位于BamH1側(cè)翼的1.4KB HBsAg的片段。該片段通過(guò)聚合酶處理產(chǎn)生平端，并與載體連接。這樣生成pWRG7031，一種氨芐西林抗性的HBsAg表達(dá)質(zhì)粒。
步驟8去除pWRG7072中的Pvu2-Sph1序列。使用EcoR1切割pWRG7031，使用聚合酶在該位點(diǎn)產(chǎn)生平端，使用Sph1進(jìn)一步切割該質(zhì)粒，分離出包含CMV、HBV和牛來(lái)源序列的片段。將該片段與已制備好的pWRG7072連接，生成pWRG7074。
步驟9使用Bgl2切割pWRG7074，使用聚合酶產(chǎn)生平端，并使用BstX1進(jìn)一步切割，生成載體片段。使用Nco1切割pWRG7074，使用綠豆核酸酶產(chǎn)生平端，并使用BstX1進(jìn)一步切割，生成含有3′-增強(qiáng)子的插入片段。將這兩個(gè)片段連接，生成pWRG7128，一種HBsAg表達(dá)質(zhì)粒，但缺少pWRG7074中含有的HbxAg和SIV NEF序列的5′-編碼區(qū)。
步驟10構(gòu)建pWRG7077使用Sap1切割pWRG7072，使用聚合酶產(chǎn)生平端，并使用Sph1進(jìn)一步切割，生成包含復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性基因的片段。在WRG7020的EcoR1位點(diǎn)處切割并產(chǎn)生平端，然后使用Sph1部分切割，生成包含CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子A和BGH多腺苷酸化區(qū)的片段。將這些片段連接在一起，生成pWRG7077。最終載體pWRG7077包含了來(lái)自源質(zhì)粒pJW4303的原始的CMV內(nèi)含子A-bGH-pA區(qū)，除了有一點(diǎn)改變，即如步驟1所述將TPA信號(hào)肽編碼序列替換為合有Not I限制位點(diǎn)的接頭。
實(shí)施例8我們從來(lái)自ATCC的HPV 16基因組克隆中，通過(guò)PCR制備E6和E7拷貝。由于全長(zhǎng)質(zhì)粒包含完整的病毒基因組，所以在BSL-2條件下保存。我們通過(guò)分別去除p53和Rb的結(jié)合區(qū)來(lái)使E6和E7脫毒(Sleboset al.，Virol.1995，208，111-120；以及 et al.，Virol.2001，281，231-238)。將PCR片段克隆進(jìn)入PJV7563中，將該基因置于不帶內(nèi)含子A的CMV啟動(dòng)子的調(diào)控之下。
使用不含Qiagen內(nèi)毒素的Mega試劑盒制備質(zhì)粒，并使用標(biāo)準(zhǔn)的亞精胺CaCl2法以2μg DNA/mg金的濃度包被于金粒子上。使用0.05mg/ml PVP制備藥筒(cartridge)。以單一給藥方式免疫B6小鼠，使用XR研究設(shè)備以500psi給予至刮去毛的腹部。
TC-1細(xì)胞來(lái)自Johns Hopkins School of Medicine。將細(xì)胞置于培養(yǎng)基中以最少的傳代次數(shù)增殖，然后將小瓶冷凍并保存于液N2中備用。在PBS中制備注射細(xì)胞。麻醉的小鼠在刮去毛的右側(cè)面皮下注射50到100μl中2×104到2×105個(gè)細(xì)胞。從第7天開(kāi)始，在星期一、星期三和星期五測(cè)量腫瘤。測(cè)量互相垂直的兩個(gè)直徑量度，相乘得到正方形的面積。還監(jiān)控動(dòng)物的健康狀況。如果腫瘤生長(zhǎng)得大于120mm2，如果腫瘤出現(xiàn)壞死，或者小鼠即將死去，則對(duì)小鼠施行安樂(lè)死。
為進(jìn)行ELISPOT測(cè)定，最后一次免疫后一周處死小鼠。無(wú)菌環(huán)境下取出脾臟，制備單細(xì)胞懸液。在BD (-IFN ELISPOT試劑盒中，根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞以1×106或者5×105個(gè)細(xì)胞/孔的濃度置于板上。加入對(duì)E7 CD4和CD8以及E6 CD8有特異性的肽，終濃度為10μM。培養(yǎng)基孔含有等量的DMSO，也含有肽。通過(guò)將肽存在下誘導(dǎo)的斑點(diǎn)數(shù)減去培養(yǎng)基中的斑點(diǎn)，得到特異性斑點(diǎn)。
結(jié)果以E6或者E7DNA免疫B6小鼠可誘導(dǎo)大量的(-IFN分泌細(xì)胞(圖23)。在E6的情況下，僅僅已知CD8特異性表位。在E7的情況下，已經(jīng)識(shí)別了CD4和CD8特異性表位，已經(jīng)在PMED免疫后觀察到強(qiáng)應(yīng)答。試驗(yàn)了在E6或者E7疫苗中加入大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素(LT)或者霍亂毒素(CT)DNA。LT可將針對(duì)E7肽的(-IFN ELISPOT應(yīng)答提高大約2倍(圖23)，但是沒(méi)有觀察到哪種毒素可以增強(qiáng)腫瘤保護(hù)。
有趣的是，只注射TC-1細(xì)胞即可誘導(dǎo)針對(duì)E6和E7的(-IFN應(yīng)答(圖24)。其水平比時(shí)間間隔為三天、以三倍劑量進(jìn)行成組PMED免疫中觀察到的結(jié)果要低。將TC-1注射與PMED免疫相結(jié)合會(huì)導(dǎo)致居于中間的結(jié)果。
在未處理的B6小鼠中注射5×104個(gè)TC-1細(xì)胞總是導(dǎo)致快速出現(xiàn)腫瘤。以單劑量這樣少的E6或者E7 DNA進(jìn)行預(yù)防處理可提供明顯的保護(hù)防止出現(xiàn)腫瘤(圖25)。如果從腫瘤注射后3天開(kāi)始，以三倍劑量的一組使用E6或者E7進(jìn)行治療性免疫，也是有效的(圖26)。給藥劑量再少，效果會(huì)變差(數(shù)據(jù)未顯示)。同時(shí)給予E6和E7質(zhì)粒并不比給予任意一種更加有效，但目前為止只進(jìn)行了一次實(shí)驗(yàn)。
在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)E6接種免受首次TC-1攻擊的動(dòng)物(圖26)未經(jīng)進(jìn)一步處理而在50天后進(jìn)行兩次攻擊。如圖27所示，所有動(dòng)物均完全免受該第二次攻擊，而所有年齡匹配的未處理的對(duì)照動(dòng)物則產(chǎn)生腫瘤并被施行安樂(lè)死。
我們嘗試治療較大腫瘤，取得了不同程度的成功。例如，如圖28所示，使用一組三倍劑量的E6 DNA，在20mm2時(shí)開(kāi)始治療導(dǎo)致5只小鼠中的全部5只的腫瘤均消退，而如果在35mm2時(shí)開(kāi)始治療，則只引起腫瘤生長(zhǎng)略微延緩，然后迅速惡化。
上述數(shù)據(jù)表明，當(dāng)將脫毒的E6和E7 DNA給予B6小鼠時(shí)，它們可引發(fā)針對(duì)各自肽表位的強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。而且，這些應(yīng)答在很大程度上與疫苗抑制TC-1腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力有關(guān)。該處理不管作為預(yù)防還是治療均有效。
實(shí)施例9使用ICP27單基因質(zhì)粒，以2天的時(shí)間間隔對(duì)小鼠注射1～8針，并使各組最后一次給藥在同一天進(jìn)行。最后一次給藥后兩周，測(cè)量CD8ELISPOT。結(jié)果如圖29所示，說(shuō)明需要至少3次給藥以獲得接近最佳效果，此時(shí)再進(jìn)行給藥，效果提高很少或者沒(méi)有提高。
為了驗(yàn)證成組給藥在淋巴結(jié)中的累積作用，小鼠注射1、2、3或4針pPJV7630(各次注射之間時(shí)間間隔4天)，8天后取淋巴結(jié)細(xì)胞檢查。結(jié)果如圖30所示。注射次數(shù)增加，淋巴結(jié)大小也明顯增大。當(dāng)注射超過(guò)1針時(shí)，疫苗給藥完成后8天測(cè)量淋巴結(jié)重量和細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果比未免疫小鼠均有提高，注射3次的數(shù)值最大。
實(shí)施例10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究加強(qiáng)接種的效果。對(duì)進(jìn)行了初次給藥的小鼠和進(jìn)行了初次和加強(qiáng)給藥的小鼠進(jìn)行比較。兩組小鼠在同一時(shí)間進(jìn)行初次給藥，使用相同的疫苗接種。第二組在初次給藥后28天進(jìn)行加強(qiáng)給藥。
圖31顯示對(duì)以一組(P)或者相隔28天的兩組(P/B)進(jìn)行pPJV7630給藥的動(dòng)物進(jìn)行的IFN-γ ELISPOT測(cè)定結(jié)果。使用pPJV7630構(gòu)建體表達(dá)的4種立即早期抗原的每一種的肽文庫(kù)，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。最后一次疫苗給藥后2周進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)進(jìn)行加強(qiáng)給藥可導(dǎo)致所激發(fā)的應(yīng)答顯著增加。
實(shí)施例11使用XR1設(shè)備對(duì)家豬進(jìn)行PJV7630給藥。每次免疫給予家豬兩倍劑量，一周內(nèi)進(jìn)行一組共4次免疫。因此，每只豬在一組免疫中給予總共8倍劑量的疫苗。兩組加強(qiáng)免疫均在前一組結(jié)束后21天開(kāi)始。在給藥(PB)開(kāi)始前，以及每次加強(qiáng)免疫(B1和B2)后10天取血液樣品。如所述進(jìn)行IFN-γ ELISPOT測(cè)定，數(shù)值為10只動(dòng)物的平均值±SEM。圖32顯示所獲得的結(jié)果，以及加強(qiáng)接種的效果。
實(shí)施例12使用XR-1單次注射pPJV7630進(jìn)行PMED免疫后2、3和4天取皮膚樣品，冷凍，碾碎，測(cè)定上清液中細(xì)胞因子水平。使用CBA試劑盒評(píng)價(jià)炎性細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α和MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白)有較大提高。它們?cè)诘?天水平最高，并隨時(shí)間而下降。在任何時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)IL-10、IL-12或者IFN-γ的水平提高。增強(qiáng)的細(xì)胞因子通常發(fā)現(xiàn)于傷口愈合過(guò)程中。
為了驗(yàn)證成組給藥在皮膚和淋巴結(jié)中的累積作用，小鼠注射1、2、3或4針pPJV7630(各次注射之間時(shí)間間隔4天)，4和8天后取淋巴結(jié)細(xì)胞檢查。注射次數(shù)增加，淋巴結(jié)大小也明顯增大。當(dāng)注射超過(guò)1針時(shí)，疫苗給藥完成后8天測(cè)量淋巴結(jié)重量和細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果比未免疫小鼠均有提高(見(jiàn)圖30)。
還將淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行染色以顯示MHC-II陽(yáng)性(抗原呈遞細(xì)胞)、CD80陽(yáng)性(活化標(biāo)記)和雙陽(yáng)性細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析(下表)。一般而言，單陽(yáng)性細(xì)胞和雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目隨注射次數(shù)的增加而增加。
第4天-淋巴結(jié)群體(％總細(xì)胞)


第8天-淋巴結(jié)群體(％總細(xì)胞)

對(duì)淋巴結(jié)群體進(jìn)行分析表明，成組免疫可導(dǎo)致淋巴結(jié)中抗原呈遞細(xì)胞數(shù)目增加大約5～10倍。
總之，在PMED后數(shù)天，在注射部位的不同區(qū)域可發(fā)現(xiàn)急性物理變化。我們發(fā)現(xiàn)PMED后2天皮膚中的炎性細(xì)胞因子達(dá)到最高值。同時(shí)，在成組給藥過(guò)程中，在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞，特別是活化的抗原呈遞細(xì)胞的累積作用，說(shuō)明皮膚的應(yīng)答性提高。
實(shí)施例13使用Balb/c小鼠進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。刮凈腹部某一區(qū)域的毛，使用粒子介導(dǎo)的免疫治療給藥(PMID)進(jìn)行DNA的初次免疫。每只動(dòng)物接受總共3μg DNA?？梢栽诘?天或者第4天通過(guò)常規(guī)“脈沖”免疫(3×1μg DNA)給藥，也可以每隔一天(0、2和4)給予1μg DNA來(lái)進(jìn)行“成組”免疫。第一次DNA給藥后10天處死小鼠并采集脾臟。通過(guò)撥開(kāi)脾細(xì)胞，溶解紅細(xì)胞來(lái)收集脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞洗滌并計(jì)數(shù)。使用專(zhuān)門(mén)的ELIspot板(包被有干擾素-γ捕捉抗體并封閉)。將脾細(xì)胞移至這些板上并在特異性肽的存在下在37℃/5％ CO2下培育過(guò)夜。溶解脾細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)方法使板顯影，以顯示存在的干擾素-γ分泌細(xì)胞的數(shù)目。
結(jié)果結(jié)果(圖33所示)顯示，與使用常規(guī)“脈沖”方法接受等量DNA的動(dòng)物相比，從接受“成組”免疫的動(dòng)物中分離的干擾素-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目顯著增加。(*表示差異顯著)通過(guò)“成組”方法，使用表達(dá)來(lái)自HIV的Gag和RT抗原的構(gòu)建體免疫小鼠，產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答比使用常規(guī)“脈沖”方法以等量DNA免疫的動(dòng)物顯著提高。
實(shí)施例14使用Balb/c小鼠進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。刮凈腹部某一區(qū)域的毛，使用粒子介導(dǎo)的免疫治療給藥(PMID)進(jìn)行DNA的初次免疫。每只動(dòng)物總共接受1μg DNA?？梢栽诘?天通過(guò)常規(guī)“脈沖”免疫(2×0.5μg DNA)給藥，也可以在第0和7天每天給予0.5μg DNA來(lái)進(jìn)行“改進(jìn)的成組”免疫。所有小鼠在初次免疫后83天通過(guò)“脈沖”法以1.0μg DNA進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后7天(第90天)處死小鼠并采集脾臟。通過(guò)撥開(kāi)脾細(xì)胞，溶解紅細(xì)胞來(lái)收集脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞洗滌并計(jì)數(shù)。使用專(zhuān)門(mén)的ELIspot板(包被有干擾素-γ捕捉抗體并封閉)。將脾細(xì)胞移至這些板上并在特異性肽的存在下在37℃/5％ CO2下培育過(guò)夜。溶解脾細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)方法使板顯影，以顯示存在的干擾素-γ分泌細(xì)胞的數(shù)目。
結(jié)果結(jié)果(圖34所示)顯示，與使用常規(guī)“脈沖”方法接受等量DNA的動(dòng)物相比，從使用“改進(jìn)的成組”免疫方法免疫的動(dòng)物中分離的干擾素-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目增加。因此，通過(guò)“改進(jìn)的成組”方法，使用表達(dá)來(lái)自HIV的Gag和RT抗原的構(gòu)建體免疫小鼠，產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答比使用常規(guī)“脈沖”方法以等量DNA免疫的動(dòng)物有所提高。
實(shí)施例15所用質(zhì)粒表達(dá)HIV抗原RT、Nef和Gag。制備用于PMID的藥筒的方法已有記載(Eisenbraun et al DNA and Cell Biology，1993第12卷第9號(hào)第791-797頁(yè)；Pertner et al)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將質(zhì)粒DNA包被于2μm金粒子(DeGussa Corp.，South Plainfield，N.J.，USA)上，裝于Tefzel試管中，然后切成1.27cm長(zhǎng)，作為藥筒，4℃下干燥保存?zhèn)溆谩Ｔ谕ǔ５慕臃N中，每只藥筒包含包被有約1μg DNA的0.5mg金。
4只小型豬實(shí)驗(yàn)組在腹部接受PMID初次免疫(在第1天開(kāi)始)，隨后進(jìn)行PMID加強(qiáng)免疫(在第57天開(kāi)始)。對(duì)照動(dòng)物不進(jìn)行免疫。免疫可通過(guò)脈沖給藥(即一次給予4藥筒)或者成組給藥(即相隔48小時(shí)的3次給藥中，每次給予2藥筒)進(jìn)行。初次或者加強(qiáng)免疫后14天，采集外周血樣品，制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
將豬血收集到在PBS中2∶1稀釋的肝素中，置于50ml Falcon管中的Histopaque(Sigma)層之上。將該管以1200g離心30分鐘，從界面處收集豬淋巴細(xì)胞。使用氯化銨溶解緩沖液溶解殘余的紅細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以2×106/ml重新懸浮于完全RPMI培養(yǎng)基中。
為了進(jìn)行Elispot測(cè)定，將板使用8μg/ml(溶于PBS的)(純化的鼠抗豬IFN-γ，Biosource ASC4934)包被。板在4℃下過(guò)夜包被。使用前，以PBS洗板3次，使用完全RPMI培養(yǎng)基封閉2小時(shí)。將PBMC以2×105細(xì)胞/孔的濃度加入板中。各孔的總體積為200μl。加入重組Gag、Nef或RT蛋白(自制)，終濃度為5μg/ml。將板置于保濕37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)。
使用水洗滌1次(浸泡1分鐘確保細(xì)胞溶解)，使用PBS洗滌3次，以便將細(xì)胞從板上除去。加入溶于PBS的0.5μg/ml的與生物素結(jié)合的抗豬IFN-γ。將板在室溫下?lián)u動(dòng)中培養(yǎng)2小時(shí)。然后以PBS將板洗滌3次，加入1/1000稀釋的鏈霉親和素堿性磷酸酶(Caltag)。以PBS洗滌3次，使用BCICP底物(Biorad)培育15～45分鐘，顯示出斑點(diǎn)。用水洗去底物，使板風(fēng)干。使用AID Elispot計(jì)數(shù)器(CadamaBiomedical，UK)為斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。
結(jié)果結(jié)果如圖35所示。初次免疫后，經(jīng)成組免疫的小型豬PBMC中，產(chǎn)生IFN-γ的斑點(diǎn)數(shù)比接受脈沖免疫的小型豬顯著增多(分別為311±96和45±31，平均值±SEM；p＜0.05，Student’s t檢驗(yàn))。而且，脈沖加強(qiáng)免疫后，經(jīng)成組初次免疫的動(dòng)物中，產(chǎn)生IFN-γ的斑點(diǎn)數(shù)比接受脈沖初次免疫的動(dòng)物顯著增多(分別為431±60和186±66，平均值±SEM；p＜0.05，Student’s t檢驗(yàn))。總之，這些結(jié)果表明成組初次免疫具有比常規(guī)脈沖初次免疫更大的優(yōu)點(diǎn)，并且該優(yōu)點(diǎn)可保持到后來(lái)的免疫應(yīng)答的加強(qiáng)階段。
在圖中，組1為對(duì)照，未經(jīng)免疫；組2為脈沖初次免疫脈沖加強(qiáng)免疫組；組3為脈沖初次免疫、成組加強(qiáng)免疫組。
實(shí)施例16使用C57BL/6小鼠進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。刮凈腹部某一區(qū)域的毛，使用粒子介導(dǎo)的免疫治療給藥(PMID)進(jìn)行DNA的初次免疫。每只動(dòng)物可以在第0天接受常規(guī)“脈沖”免疫(1μg DNA卵清蛋白)，或者，每隔一天(0、2)——組2X或第0、2和4天——組3X的每天給予1μgDNA來(lái)進(jìn)行“成組”免疫。第一次DNA給藥后10天處死小鼠并采集脾臟。通過(guò)撥開(kāi)脾細(xì)胞，溶解紅細(xì)胞來(lái)收集脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞洗滌并計(jì)數(shù)。使用專(zhuān)門(mén)的ELIspot板(包被有干擾素-γ或者IL2捕捉抗體并封閉)。將脾細(xì)胞移至這些板上并在特異性肽的存在下在37℃/5％ CO2下培育過(guò)夜。使用預(yù)先確定的卵清蛋白特異性CD4和CD8肽。溶解脾細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)方法使板顯影，以顯示存在的干擾素-γ或IL2分泌細(xì)胞的數(shù)目。
結(jié)果結(jié)果(圖36和37所示)顯示，與使用常規(guī)“脈沖”方法接受等量DNA的動(dòng)物相比，從接受“成組”免疫的動(dòng)物中分離的IFN-γ和IL2斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目顯著增加。圖36中的每個(gè)柱代表個(gè)體小鼠的應(yīng)答。
通過(guò)“成組”方法，使用表達(dá)卵清蛋白的構(gòu)建體免疫小鼠，產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答比使用常規(guī)“脈沖”方法以等量DNA免疫的動(dòng)物顯著提高。
實(shí)施例17使用C57BL/6小鼠進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。刮凈腹部某一區(qū)域的毛，使用粒子介導(dǎo)的免疫治療給藥(PMID)進(jìn)行DNA的初次免疫。每只動(dòng)物總共接受3μg DNA?？梢栽诘?天通過(guò)常規(guī)“脈沖”免疫(3×1μg DNA)給藥，也可以每隔一天(0、2和4)每天給予1μg DNA來(lái)進(jìn)行“成組”免疫。
已經(jīng)以脈沖或成組免疫方法進(jìn)行初次免疫的動(dòng)物，在29天后以1μg DNA的單次脈沖免疫進(jìn)行加強(qiáng)。如上所述，在加強(qiáng)免疫后(第38天)取出脾臟，使用ELISPOT測(cè)定抗原特異性細(xì)胞的頻率。此外，使用肽或IL2體外擴(kuò)增5天后，以基于銪的CTL測(cè)定來(lái)測(cè)量CD8 T細(xì)胞殺傷抗原特異性靶標(biāo)的能力。
結(jié)果圖38所示的結(jié)果表明，以成組方式進(jìn)行初次免疫的動(dòng)物比以相同劑量的DNA但以脈沖方式免疫的小鼠顯示出更強(qiáng)的回憶應(yīng)答。這通過(guò)在ELISPOT測(cè)定中IFNg和IL2產(chǎn)生細(xì)胞的頻率增加來(lái)表現(xiàn)出來(lái)。以成組方式進(jìn)行初次免疫的動(dòng)物比以脈沖方式免疫繼之以脈沖DNA強(qiáng)化免疫的動(dòng)物也顯示出更強(qiáng)的CTL應(yīng)答。
通過(guò)“成組”方法，使用表達(dá)卵清蛋白的構(gòu)建體免疫小鼠，產(chǎn)生的回憶免疫應(yīng)答比使用常規(guī)“脈沖”方法以等量DNA免疫的動(dòng)物顯著提高。
在以上說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物通過(guò)援引的方式納入本文。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以對(duì)本發(fā)明所述的方法和體系進(jìn)行各種修改和變化，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已經(jīng)對(duì)與特別優(yōu)選的實(shí)施方案有關(guān)的內(nèi)容進(jìn)行了敘述，但應(yīng)該理解，如權(quán)利要求書(shū)所述的本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)叵拗朴谶@些具體的實(shí)施方案。實(shí)際上，本發(fā)明具體實(shí)施方式
的各種修改對(duì)于分子生物學(xué)或者相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，應(yīng)該涵蓋于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動(dòng)物宿主受試者中誘發(fā)針對(duì)T細(xì)胞表位的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括(i)第一次免疫，包括對(duì)受試者進(jìn)行相隔1到14天的至少兩次給藥，其中每次給藥包括給予編碼T細(xì)胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任選地，(ii)第二次免疫，包括給予受試者至少一次(a)編碼T細(xì)胞表位的NOI，或者(b)包含T細(xì)胞表位的蛋白，其中-第一次免疫的第一次給藥與-第二次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間間隔為21到365天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第一次和/或第二次免疫的給藥之間相隔2到12天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在第一次和/或第二次免疫中，NOI或蛋白的給藥次數(shù)為2到10次。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中第一次和/或第二次免疫的2、3、4或者更多次給藥之間相隔2到6天。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中第一次免疫的第一次給藥與第二次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間間隔為50到250天。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括第三次免疫，所述第三次免疫包括給予受試者至少一次(a)編碼T細(xì)胞表位的NOI，或者(b)包含T細(xì)胞表位的蛋白，其中-第二次免疫的第一次給藥與-第三次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間間隔為10到365天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在第三次免疫中-NOI或蛋白的給藥次數(shù)為2到5次，和/或-給藥間隔2到6天，和/或-第二次免疫的第一次給藥與第三次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間間隔為50到250天。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述NOI包括在調(diào)控序列控制之下的DNA序列，所述調(diào)控序列能夠在受試者細(xì)胞中指導(dǎo)所述DNA序列的表達(dá)。
9.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述T細(xì)胞表位為CD4+輔助T淋巴細(xì)胞表位和/或CD8+T淋巴細(xì)胞(CTL)表位。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中一次或多次所述NOI給藥包括給予0.1到2μg的NOI。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中一次或多次所述給藥包括向皮膚給藥。
12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中在至少一次NOI或蛋白給藥中，將NOI或蛋白包被于粒子上，或者摻入粒子中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)粒子加速設(shè)備將粒子給予至受試者。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中在至少一次NOI或蛋白給藥中，所述NOI或蛋白以以下形式給藥(i)包括制藥上可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑的藥物組合物；或者(ii)包括免疫學(xué)上可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑的疫苗組合物；或者(iii)包括免疫學(xué)上可接受的載體、賦形劑或者稀釋劑的免疫治療組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～13之一的方法，其中所述NOI或蛋白與佐劑或者能夠在受試者細(xì)胞中表達(dá)佐劑的多核苷酸同時(shí)給藥；或者，根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括佐劑或者能夠在受試者細(xì)胞中表達(dá)佐劑的多核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述佐劑為無(wú)毒性形式的大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)或者霍亂弧菌霍亂毒素(CT)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述佐劑為L(zhǎng)T腸毒素的B亞基(LTB)，或者CT霍亂毒素的B亞基(CTB)。
18.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述T細(xì)胞表位來(lái)自病原體或者癌細(xì)胞。
19.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述T細(xì)胞表位來(lái)自HSV、HIV或HPV。
20.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述方法用于預(yù)防或治療受試者中的疾病。
21.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述NOI編碼至少兩種HSV、HIV或HPV抗原。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述NOI編碼一種HIV-1 gag蛋白或者包含它的一個(gè)gag表位的片段，以及第二種HIV抗原或者編碼所述的第二種HIV抗原的一個(gè)表位的片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述第二種抗原選自Nef、RT或者包含Nef或RT的一個(gè)表位的片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述NOI編碼選自以下抗原的組合-Gag(p17，p24)，Nef截短形式-Gag(p17，p24)(密碼子優(yōu)化)，Nef(截短形式)-Gag(p17，p24)，RT，Nef(截短形式)-Gag(p17，p24)，密碼子優(yōu)化的RT，Nef(截短形式)-Gag(p17，p24)，密碼子優(yōu)化的RT，密碼子優(yōu)化的Nef截短形式；和/或失活的密碼子優(yōu)化的RT、截短的Nef以及密碼子優(yōu)化的gag基因的p17/p24部分，任選地與愛(ài)荷華長(zhǎng)度HCMV啟動(dòng)子+外顯子1下游有效連接，以及與兔珠蛋白多腺苷酸化信號(hào)的上游有效連接。
25.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中給予每一種均編碼同一表位的至少兩種不同的NOI，和/或給予包含同一表位的至少兩種不同的蛋白。
26.一種測(cè)試誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的方法的有效性的檢測(cè)方法，其中所述誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的方法包括(i)第一次免疫，包括對(duì)受試者進(jìn)行相隔1到14天的至少兩次給藥，其中每次給藥包括給予編碼T細(xì)胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任選地，(ii)第二次免疫，包括給予受試者至少一次(a)編碼T細(xì)胞表位的NOI，或者(b)包含T細(xì)胞表位的蛋白，其中-第一次免疫的第一次給藥與-第二次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間間隔為21到365天，其中所述檢測(cè)方法包括在哺乳動(dòng)物受試者中施行所述的誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的方法，然后檢測(cè)受試者中對(duì)所述表位具有特異性的活化或者記憶T細(xì)胞的水平。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的檢測(cè)方法，包括檢測(cè)(i)第一次免疫的給藥是否都落在第一次免疫的第一次給藥和活化T細(xì)胞水平下降至基礎(chǔ)水平之間的時(shí)間段內(nèi)，和/或(ii)第二次免疫的第一次給藥是否發(fā)生于活化T細(xì)胞水平下降至基礎(chǔ)水平之后。
28.一種進(jìn)行前述任一權(quán)利要求的方法或檢測(cè)方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括(i)前述任一權(quán)利要求中限定的NOI，或者根據(jù)權(quán)利要求14的組合物；以及(ii)根據(jù)前述任一權(quán)利要求中限定的方法或檢測(cè)方法進(jìn)行NOI或組合物給藥的說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在哺乳動(dòng)物宿主受試者中誘發(fā)針對(duì)T細(xì)胞表位的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括(i)第一次免疫，包括對(duì)受試者進(jìn)行相隔1到14天的至少兩次給藥，其中每次給藥包括給予編碼T細(xì)胞表位的所研究核酸(NOI)，并且任選地，(ii)第二次免疫，包括給予受試者至少一次(a)編碼T細(xì)胞表位的NOI，或者(b)包含T細(xì)胞表位的蛋白，其中第一次免疫的第一次給藥與第二次免疫的第一次給藥之間的時(shí)間間隔為21到365天。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1889963SQ200480036459
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者R·P·布勞恩, 董立春 申請(qǐng)人:寶德杰克特疫苗有限公司