專利名稱：使用含內(nèi)過氧化物橋的化合物治療幽門螺桿菌相關(guān)疾病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療與亞鐵依賴的細(xì)菌例如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)有關(guān)的病理癥狀的方法和組合物，其中所述細(xì)菌的存活和致病機(jī)制需要高濃度細(xì)胞內(nèi)亞鐵。本發(fā)明的組合物包括含內(nèi)過氧化物橋的化合物，其特異性抑制亞鐵依賴的細(xì)菌生長(zhǎng)并優(yōu)選促進(jìn)該細(xì)菌的清除。所述組合物通常還包括至少一種用于治療幽門螺桿菌有關(guān)胃腸機(jī)能紊亂的活性劑，例如質(zhì)子泵抑制劑，H2阻斷劑或含鉍化合物。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(H.pylori)是一種革蘭氏陰性、微量需氧的細(xì)菌，其定殖于人胃粘膜較長(zhǎng)時(shí)間段。涉及世界人口的大約一半并且如果不接受治療會(huì)終身保留的所述感染是潰瘍的主要原因和胃腺瘤和淋巴瘤發(fā)展的輔因子。
幽門螺桿菌耐受廣泛范圍的局部pH條件并相對(duì)耐受酸性條件。據(jù)信這種抗性部分是由于其產(chǎn)生脲酶，使得天然存在于胃液的脲裂解由此形成有機(jī)體周圍緩沖性的氨層。
參與鐵代謝的蛋白質(zhì)被建議用來代表幽門螺桿菌的主要毒性決定因素。幽門螺桿菌對(duì)鐵吸收的依賴公開在例如Velayudhan等(Molecular Microbiology，第37卷，274頁(yè)，2000)。從該出版物可以知道，通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FeoB介導(dǎo)亞鐵的吸收是建立幽門螺桿菌體內(nèi)感染的先決條件。與使用正鐵作為主要鐵源的其他細(xì)菌相反，幽門螺桿菌強(qiáng)烈依賴于亞鐵，其被人胃的低pH和低氧濃度所穩(wěn)定。
正是特殊的生長(zhǎng)要求和在胃內(nèi)定殖使得清除幽門螺桿菌如此困難。理想的適于成功治療幽門螺桿菌相關(guān)疾病的抗微生物藥物應(yīng)該在低pH值下穩(wěn)定并應(yīng)能容易地滲透胃粘膜。合乎要求的抗微生物性質(zhì)難以實(shí)現(xiàn)，因而還有待于使用抗微生物藥物實(shí)現(xiàn)對(duì)幽門螺桿菌的滿意的治療。
目前用于幽門螺桿菌感染的抗生素治療通常由兩種抗生素試劑與輔劑組成，所述輔劑通常是質(zhì)子泵抑制劑(PPI)或H2阻斷劑。幽門螺桿菌的抗生素抗性正越來越普遍(Hazell，SL，Eur J Clin Infect Dis(1999)1883-86)。三重治療方案(四環(huán)素，連同甲硝唑(metronidazole)和三鉀二檸檬酸合鉍(TDB)或加上PPI的四重治療方案已經(jīng)被認(rèn)為比單一治療更有效，但是病人的適應(yīng)性和耐藥性進(jìn)一步限制了其實(shí)用性。
美國(guó)專利No.5,196,205(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)WO 89/03219)描述了一種治療幽門螺桿菌感染的方法，其由給藥鉍化合物、屬于青霉素和四環(huán)素類的抗生素，和另一種抗生素例如甲硝唑組成。因而有關(guān)的治療由每天數(shù)次給藥三種藥物而組成。
還有其它的專利和專利申請(qǐng)描述用于清除幽門螺桿菌的單一或多重治療，例如U.S.專利Nos.5,472,695，5,560,912，5,582,837和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 92/11848和WO 96/02237。這些專利專利申請(qǐng)無一克服一天需要給藥三種藥物若干次的缺點(diǎn)。
青蒿素是由中國(guó)科學(xué)家在1972年從青蒿(Artemisia annua L.)分離的抗瘧疾藥物。青蒿素的內(nèi)過氧化物部分和其類似物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是抗瘧疾活性所必需的，而缺乏該基團(tuán)的類似物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)無活性。在有血紅素參與的情況下，內(nèi)過氧化物橋經(jīng)過還原分解以形成自由基和親電的中間體(Meshnick，Int.J.Parasitology，32(2002)1655)。最近提出青蒿素通過抑制特定的P型ATPase而具有抗寄生蟲活性(Eckstein-Ludwig等，Nature，Vol.424，957)。
由于天然青蒿素物質(zhì)的低水溶性，已經(jīng)進(jìn)行嘗試將其轉(zhuǎn)換為各種合成衍生物以提高藥物利用度。已知的具有高水溶性的青蒿素類似物是二氫青蒿素(dihydroartemisinin)，蒿甲醚(artemether)，青蒿琥酯(artesunnate)，蒿乙醚(arteether)，二氫青蒿素丙基碳酸酯和青蒿酸(artelinic acid)。
美國(guó)專利No.4,978,676公開了青蒿素或青蒿素類似物在治療皮膚疾病例如銀屑癬，水皰皮膚病，病毒性疣和痔瘡中的應(yīng)用。美國(guó)專利No.4,978,676公開了青蒿素和青蒿素類似物與一元羧酸，酯或酰胺的組合在治療丘疹鱗屑性皮膚病，包括銀屑癬，濕疹皮膚病，包括脂溢性皮炎和異位性皮炎中的應(yīng)用。美國(guó)專利No.5,219,880公開了青蒿素或青蒿素類似物在治療疣，觸染性軟疣和痔瘡中的應(yīng)用。美國(guó)專利No.5,225,427公開了宣稱顯示出抗瘧疾和抗原蟲活性的二氫青蒿素的特定10-取代的醚衍生物。青蒿素已經(jīng)被證明在20-180μM范圍在體外是癌細(xì)胞毒性的(Sun等，″青蒿酸和青蒿素B的4種衍生物的體外抗腫瘤活性(Antitumor Activities of 4 Derivatives of Artemisic Acid andArtemisinin B in vitro)″，Chung-Kuo-Yao-Li-Hsueh-Pao 13541-543(1992))。美國(guó)專利No.5,578,637公開了當(dāng)在增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的條件下給藥時(shí)，在體外和體內(nèi)均基本增強(qiáng)具有內(nèi)過氧化物部分的化合物例如青蒿素及其類似物的抗癌活性。
WO 04071506公開了使用青蒿素和/或青蒿素衍生物用于治療由致癌病毒引起的腫瘤和用于治療病毒感染以及治療與病毒感染有關(guān)的宮頸疾病(例如，宮頸癌和宮頸非典型增生)的應(yīng)用。該出版物還公開了殺死或抑制被致癌病毒例如BPV，HTLV-1，皰疹病毒(如，EBV或CMV)，SV40樣病毒，肝炎病毒或腺病毒感染的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。
WO 04041176公開了倍半萜烯內(nèi)酯內(nèi)過氧化物在治療丙型肝炎感染，黃熱病，登革熱，牛病毒性腹瀉和經(jīng)典的豬瘟中的應(yīng)用。
Foglio等公開了dihydro-epideoxyarteannuin B和脫氧青蒿素通過降低由乙醇和吲哚美辛制造的潰瘍性損害指標(biāo)而給大鼠提供胃的細(xì)胞保護(hù)。(Planta Med.2002，68 515-518)。
幾乎沒有出版物公開青蒿素或青蒿素類似物作為抗菌劑的應(yīng)用。美國(guó)專利No.6,127,405公開蒿乙醚抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶缺陷的大腸桿菌(E.coli)的生長(zhǎng)，而具有完整DNA旋轉(zhuǎn)酶基因的野生型大腸桿菌對(duì)所述蒿乙醚不敏感。Shoeb等(J.Chemotherapy，2，362-367，1990)公開青蒿素對(duì)厭氧細(xì)菌具有抗微生物活性。這些出版物都沒有公開或提示青蒿素或其類似物可以用作針對(duì)微需氧性細(xì)菌，一般性或特異性針對(duì)其感染需要高亞鐵攝入的細(xì)菌例如幽門螺桿菌的抗細(xì)菌劑。
對(duì)螺桿菌(Helicobacter sp)感染例如幽門螺桿菌(H.pylori)感染開發(fā)有效治療，尤其是對(duì)本領(lǐng)域現(xiàn)有的抗生素抗性的幽門螺桿菌菌株感染開發(fā)有效治療，將滿足長(zhǎng)期以來的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供抑制亞鐵依賴的細(xì)菌生長(zhǎng)或最優(yōu)選基本上清除該菌的新方法，即那些需要高濃度細(xì)胞內(nèi)亞鐵用于其存活和發(fā)病機(jī)制的細(xì)菌。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抑制胃粘膜內(nèi)亞鐵依賴的細(xì)菌生長(zhǎng)和最優(yōu)選基本上清除該細(xì)菌的新方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于胃中與Helicobacter sp感染，優(yōu)選幽門螺桿菌感染有關(guān)的病理疾病的新方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于抑制幽門螺桿菌細(xì)菌生長(zhǎng)的新方法和組合物，該細(xì)菌對(duì)本領(lǐng)域現(xiàn)有的抗生素具有抗性。
本發(fā)明總體涉及用于抑制，最優(yōu)選清除亞鐵依賴的細(xì)菌以及與此相關(guān)的發(fā)病機(jī)制的方法和組合物。本發(fā)明所述組合物包含具有與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)亞鐵反應(yīng)的內(nèi)過氧化物部分的化合物，該化合物有利產(chǎn)生抗細(xì)菌效果。
雖然本發(fā)明的組合物有效抵抗任何亞鐵依賴的細(xì)菌，優(yōu)選的細(xì)菌是定居在胃粘膜中的細(xì)菌，其中細(xì)胞內(nèi)高亞鐵濃度是在胃的酸性條件下建立感染的先決條件。本發(fā)明所述組合物特別有效針對(duì)幽門螺桿菌細(xì)菌，其在人胃粘膜定殖較長(zhǎng)時(shí)間。由幽門螺桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FeoB介導(dǎo)的亞鐵攝入是建立體內(nèi)胃幽門螺桿菌感染的先決條件。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于抑制所述亞鐵依賴的細(xì)菌生長(zhǎng)和用于治療與此相關(guān)的病理的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括給需要治療的對(duì)象給藥生長(zhǎng)抑制量的具有內(nèi)過氧化物部分的化合物，該部分與細(xì)菌中的高濃度亞鐵反應(yīng)。本發(fā)明的方法已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)特別有效的針對(duì)作為亞鐵依賴性細(xì)菌的例子的幽門螺桿菌細(xì)菌，即一種要求細(xì)胞內(nèi)高亞鐵以長(zhǎng)時(shí)間定殖于人胃粘膜的細(xì)菌。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于治療與螺桿菌感染有關(guān)的病理疾病的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括給需要治療的對(duì)象給藥生長(zhǎng)抑制量的具有內(nèi)過氧化物部分的化合物，該部分與細(xì)菌中的高濃度亞鐵反應(yīng)。本發(fā)明的方法特別有效的針對(duì)需要細(xì)胞內(nèi)高亞鐵以長(zhǎng)時(shí)間定殖在人胃粘膜中的幽門螺桿菌細(xì)菌。
幽門螺桿菌是微量需氧的革蘭氏陰性的細(xì)菌，其與許多胃腸病變有關(guān)，例如胃潰瘍，十二指腸潰瘍，胃炎，十二指腸炎，非潰瘍消化不良，胃癌和MALTOMA。因而，本發(fā)明的方法可用于防止和治療與幽門螺桿菌有關(guān)的胃腸疾病或病癥。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于在需要治療的對(duì)象中抑制抗生素抗性的幽門螺桿菌菌株生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明的方法包括對(duì)需要治療的對(duì)象給藥生長(zhǎng)抑制量的具有內(nèi)過氧化物部分的化合物，該部分據(jù)信與細(xì)菌中的高濃度亞鐵反應(yīng)形成毒性的自由基。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的帶有內(nèi)過氧化物的化合物具有倍半萜烯結(jié)構(gòu)，具體是具有內(nèi)過氧化物基團(tuán)的氧化的三環(huán)倍半萜烯結(jié)構(gòu)，并優(yōu)選那些是其倍半萜烯內(nèi)酯或醇，碳酸酯，酯，醚和磺酸酯的化合物。顯而易見，其它帶有內(nèi)過氧化物的化合物對(duì)本發(fā)明也是有用的。其它合適的帶有內(nèi)過氧化物的化合物的例子包括例如多不飽和脂肪酸的羥基、氫過氧基或過氧基衍生物，trioxolanes，螺和二螺1，2，4-trioxolanes，雙環(huán)(3，2，2)內(nèi)過氧化物，三噁烷，3-取代三噁烷，臭氧化物，2，3雙環(huán)(3.3.1)壬烷，1，2，4-三噁烷，1，2，4，5-四噁烷，萜烯和取代萜烯。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的帶有內(nèi)過氧化物的化合物是通式(I)的倍半萜烯化合物，或其藥物可接受的鹽 其中R是-CO-或R是-CR1-其中R1是氫、羥基、烷基、-OR2、-COR2、-COR2、-COOR2、-CO(CH2)n、-COOH或-SOOR2，其中R2是烷基或芳基，以及n為1到6。
此處使用的術(shù)語“烷基”指具有1到6個(gè)碳原子，優(yōu)選1到4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基。本發(fā)明的烷基可以是直鏈或支鏈基團(tuán)，優(yōu)選直鏈基團(tuán)。所述術(shù)語“芳基”優(yōu)選是指苯基和苯甲基，最優(yōu)選苯基。藥物可接受的鹽包括所述堿金屬或堿土金屬鹽，優(yōu)選鈉或鉀鹽，最優(yōu)選鈉鹽。
這樣優(yōu)選的化合物的例子包括青蒿素；二氫青蒿素；二氫青蒿素的碳酸酯，磺酸酯，酯和醚衍生物，尤其是蒿甲醚，蒿乙醚，阿替夫林(arteflene)，青蒿琥酯，青蒿琥酸鹽，二氫青蒿素丙基碳酸酯，雙醚青蒿酸和二羥基二氫青蒿素。
有利的是，具有在亞鐵存在的情況下反應(yīng)的內(nèi)過氧化物基團(tuán)的其他化合物可以成功地用于該公開的方法，盡管在非限制性的優(yōu)選實(shí)施方案中該內(nèi)過氧化物化合物是此處公開的那些化合物。
一個(gè)例子是倍半萜烯化合物，其包括例如，青蒿素，其中通式(I)的R是C＝O，二氫青蒿素(R1是OH)，青蒿酸(R1是OCO(CH2)2CO2H)，和青蒿琥酯，蒿甲醚(R1是OCH3)和蒿乙醚(R1是OC2H5)。
作為本發(fā)明代表性的內(nèi)過氧化物化合物的青蒿素分子，是含有可以被鐵催化形成毒性自由基的內(nèi)過氧化物橋的倍半萜烯內(nèi)酯。本發(fā)明利用青蒿素的這個(gè)性質(zhì)并將其靶向到幽門螺桿菌細(xì)菌。這種選擇性作用是因?yàn)橛捎拈T螺桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FeoB介導(dǎo)的亞鐵攝入是建立幽門螺桿菌體內(nèi)感染的先決條件。本發(fā)明的倍半萜烯化合物具有內(nèi)過氧化物橋結(jié)構(gòu)。當(dāng)暴露于未結(jié)合的亞鐵時(shí)，過氧化物以Fenton型反應(yīng)產(chǎn)生毒性自由基。因此，細(xì)菌內(nèi)部亞鐵濃度的增加可以導(dǎo)致在存在倍半萜烯化合物的情況下細(xì)胞內(nèi)形成自由基以及細(xì)胞死亡。此外青蒿素還可通過例如Eckstein Ludwig等人建議的不同機(jī)制具有抗細(xì)菌亞鐵依賴的活性(Nature，Vol.424，957)。
除含有內(nèi)過氧化物的化合物之外，本發(fā)明的組合物還可以包含一種或者多種用于治療幽門螺桿菌有關(guān)的胃腸病變的活性劑以進(jìn)一步增強(qiáng)臨床功效。這樣的試劑例如胃酸分泌的抑制劑，質(zhì)子泵抑制劑(不可逆或可逆的質(zhì)子泵抑制劑)，H2阻斷劑，鉍鹽，抗生素試劑，治療與黏膜中幽門螺桿菌感染有關(guān)的炎癥的抗炎劑，細(xì)胞保護(hù)劑例如硫糖(sucralfete)，前列腺素類似物例如迷索前列醇，或鐵以提高細(xì)胞內(nèi)鐵濃度。
本發(fā)明所述組合物特別有效用于清除胃中的幽門螺桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，青蒿素或其活性衍生物以設(shè)計(jì)成能在口服之后在胃中局部作用的組合物的形式配制。因?yàn)榍噍锼鼗蚱浠钚缘难苌锊蝗苡谖敢旱乃嵝詶l件，有必要保留其在胃中的溶解度以使得活性物質(zhì)在局部作用。
因此，組合物還可以包含保持帶有內(nèi)過氧化物的化合物在胃液中溶解性的試劑。這使得帶有內(nèi)過氧化物的化合物在胃中局部地針對(duì)細(xì)菌作用。這樣的試劑優(yōu)選是堿性試劑或抗酸劑，當(dāng)其溶解在胃液中能夠提高胃液的pH，使得該pH下至少顯著比例的帶有內(nèi)過氧化物的化合物保持可溶于胃液中。
根據(jù)不同的實(shí)施方案，組合物還可以包含一種或者多種提高胃粘膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)帶有內(nèi)過氧化物的化合物的利用度的試劑。這樣的試劑例如溶粘劑，其降低胃粘膜粘性，從而促進(jìn)帶有內(nèi)過氧化物的化合物抵達(dá)細(xì)菌以及在胃中局部而不是通過體循環(huán)作用的能力。
為了促進(jìn)青蒿素或其活性衍生物在胃中的局部作用，推薦延長(zhǎng)其胃潴留時(shí)間。.因此在另一個(gè)實(shí)施方案，所述組合物還可以包含一種或者多種胃潴留劑。這些胃潴留劑使得活性化合物能在胃中局部作用足以消除細(xì)菌的較長(zhǎng)時(shí)間。
這樣的胃潴留劑可以是例如一種或者多種聚合物，其在胃中通過吸收來自胃液的水而膨脹，從而增加顆粒的尺寸以促進(jìn)胃中的胃潴留?；钚猿煞滞ㄟ^擴(kuò)散作用或顆粒在胃中被緩慢侵蝕后而從顆粒緩慢釋放。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明組合物的配制使得帶有內(nèi)過氧化物的化合物在小腸被系統(tǒng)吸收。為了促進(jìn)帶有內(nèi)過氧化物的化合物在小腸的吸收，組合物可以包含媒介物例如適于液體制劑的植物油，以提高在小腸內(nèi)的吸收。
本發(fā)明所述組合物可以通過靜脈內(nèi)，胃腸外，或口服的方法給藥。盡管本發(fā)明中任何合適的給藥途徑都是可接受的，優(yōu)選口服給藥該組合物。所述活性化合物通常與藥物可接受的載體結(jié)合以形成藥物組合物。所述藥物可接受的載體可以包含生理可接受的化合物，其例如起穩(wěn)定組合物或提高試劑的吸收的作用。
組合物還可以包含一種或者多種促進(jìn)帶有內(nèi)過氧化物的化合物在水性環(huán)境中的溶解性和穩(wěn)定性的試劑。這樣的試劑例如環(huán)糊精類似物，其與青蒿素或其衍生物形成復(fù)合物，從而改善復(fù)合物的水溶性和內(nèi)過氧化物橋在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于抑制亞鐵依賴的細(xì)菌菌株生長(zhǎng)的藥物組合物。在此實(shí)施例中，所述組合物優(yōu)選包含藥物有效量的通式(I)的化合物 其中R是-CO-或R是-CR1-其中R1是氫、羥基、烷基、-OR2、-COR2、-COR2、-COOR2、-CO(CH2)n、-COOH或-SOOR2，其中R2是烷基或芳基，n是1到6，和用于治療幽門螺桿菌有關(guān)的胃腸病變的一種或者多種活性劑例如抗生素試劑，胃酸分泌抑制劑，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，可逆的質(zhì)子泵抑制劑，H2阻斷劑，含鉍化合物，細(xì)胞保護(hù)劑，前列腺素類似物例如迷索前列醇或抗炎劑。最優(yōu)選藥物組合物被設(shè)計(jì)成最有效針對(duì)螺桿菌，例如幽門螺桿菌的菌株。
藥物組合物如果單獨(dú)給藥通常優(yōu)選包含足以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)量的各活性組分，即含內(nèi)過氧化物的化合物和用于治療幽門螺桿菌有關(guān)的胃腸病變的活性劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含內(nèi)過氧化物的化合物與用于治療幽門螺桿菌有關(guān)的胃腸病變的活性劑的比率從大約50∶1到大約1∶100，更優(yōu)選10∶1到1∶50。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含內(nèi)過氧化物的化合物是青蒿素或青蒿琥酯，而用于治療幽門螺桿菌有關(guān)的胃腸病變的活性劑是PPI。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含含內(nèi)過氧化物的化合物，優(yōu)選倍半萜烯，更優(yōu)選青蒿素或其活性衍生物和PPI的新型口服制劑。有利的是，所述口服組合物還可以包含抗生素。這樣的口服劑型可以包含一種或兩種立即釋放形式的藥物或緩釋形式例如胃潴留形式的藥物。
口服劑型可以是片劑、膠囊、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散性粉劑或顆粒、乳劑、多顆粒制劑、糖漿、酏劑等等。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述口服組合物在單個(gè)口服劑型中包含青蒿素或其活性衍生物和PPI，所述口服劑型優(yōu)選雙層片劑或硬膠囊。所述組合的口服組合物可以還包含抗生素。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述口服組合物在單獨(dú)的口服劑型例如片劑或膠囊中包含青蒿素或其活性衍生物，PPI和可能的抗生素。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方案，PPI可以通過腸衣或非腸衣的形式給藥。
這些和另外的實(shí)施方案從下述的詳細(xì)說明和實(shí)施例將變得顯而易見。
附圖簡(jiǎn)述.


圖1顯示青蒿素對(duì)大腸桿菌(E.coli)(E.c)，痤瘡桿菌(P.acnes)(P.a)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)(L.a)和幽門螺桿菌(H.pylori)(Hp)的最小抑制濃度值，顯示青蒿素針對(duì)幽門螺桿菌的特異性。
圖2顯示甲基紅霉素和甲硝唑抗性株幽門螺桿菌對(duì)青蒿素敏感。
圖3顯示青蒿素和奧美拉唑?qū)η宄拈T螺桿菌的協(xié)同效應(yīng)。
圖4顯示青蒿素和其活性衍生物對(duì)于幽門螺桿菌的最小抑制濃度值。
圖5表明青蒿琥酯對(duì)幽門螺桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物的長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致不可逆的細(xì)菌清除。
圖6表明青蒿琥酯即使在低pH條件下長(zhǎng)時(shí)間溫育之后仍保留其抗螺桿菌活性。
圖7表明與安慰劑比較，青蒿琥酯有效地減少用青蒿琥酯治療的幽門螺桿菌感染小鼠中的菌落形成單位的數(shù)量。
發(fā)明詳述本發(fā)明總體涉及抑制需要細(xì)胞內(nèi)高亞鐵用于其存活的細(xì)菌的生長(zhǎng)和發(fā)病機(jī)制的方法和組合物，所述細(xì)菌即亞鐵依賴的細(xì)菌，例如，螺桿菌種，例如幽門螺桿菌。.在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法和組合物被設(shè)計(jì)成基本上清除所述亞鐵依賴的細(xì)菌。所述術(shù)語“基本上清除”優(yōu)選表示至少50％，更優(yōu)選75％，和最優(yōu)選至少95％的亞鐵依賴的細(xì)菌被殺死。
本發(fā)明所述組合物包含具有內(nèi)過氧化物部分的化合物，該部分被認(rèn)為與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)亞鐵反應(yīng)從而產(chǎn)生抗細(xì)菌效果。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含含有內(nèi)過氧化物的倍半萜烯化合物，比如，青蒿素或其活性衍生物。這些組合是有效和選擇性地抑制胃中幽門螺桿菌的生長(zhǎng)同時(shí)維持腸內(nèi)正常菌群完好。此外，本發(fā)明的組合物對(duì)抑制或更優(yōu)選基本清除對(duì)常規(guī)的抗生素抗性的幽門螺桿菌菌株是有用的。
青蒿素為用于本發(fā)明的優(yōu)選的倍半萜烯化合物，已經(jīng)顯示通過基于氧和碳的自由基機(jī)制起作用。其結(jié)構(gòu)包括內(nèi)過氧化物橋。當(dāng)暴露于未結(jié)合的亞鐵時(shí)，過氧化物以Fenton型反應(yīng)產(chǎn)生自由基?？赡茉谇噍锼卮嬖诘那闆r下，細(xì)菌內(nèi)部高亞鐵濃度導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基形成和細(xì)胞死亡。亞鐵催化由過氧化氫產(chǎn)生毒性羥基自由基，這通過細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝作用由超氧陰離子的自發(fā)組合產(chǎn)生。羥基自由基是高度有害的，破壞細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸。自由基在脂質(zhì)中誘導(dǎo)形成不飽和鍵，降低膜流動(dòng)性和引起細(xì)胞裂解。它們還與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)，引起交聯(lián)和失活。羥基自由基還可以從DNA和RNA吸取氫原子，引起磷酸二酯主鏈的突變或開裂。
此外青蒿素還可通過例如Eckstein Ludwig等人建議的不同的機(jī)制(Nature，Vol.424，957)具有抗細(xì)菌亞鐵依賴的活性。Eckstein Ludwig等提出青蒿素通過抑制特定的P型ATPase而具有抗寄生蟲活性。青蒿素的抗寄生蟲活性要求存在亞鐵，因?yàn)轵翔F會(huì)消除抗寄生蟲活性。
本發(fā)明的組合物對(duì)清除胃中幽門螺桿菌特別有用。本發(fā)明的組合物還可以包含作為任選成分的已經(jīng)用于治療幽門螺桿菌相關(guān)的胃腸病變的一種或者多種試劑，以增加臨床功效。連同青蒿素或青蒿素衍生物給藥的優(yōu)選的試劑是質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，H2阻斷劑，鉍鹽，或有效針對(duì)幽門螺桿菌的抗生素。所述口服組合物可以還包含鐵以提高細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，以便增加含有內(nèi)過氧化物的分子抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的有效性。
許多的質(zhì)子泵抑制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，例如US專利6,093,738描述了新的有效作為質(zhì)子泵抑制劑的噻二唑化合物。歐洲專利Nos.322133和404322公開了喹唑啉衍生物，歐洲專利No.259174描述了喹啉衍生物，WO 91/13337和US 5,750,531公開了嘧啶衍生物，作為質(zhì)子泵抑制劑。合適的質(zhì)子泵抑制劑還公開在例如EP-A1-174726，EP-A1-166287，GB 2163747和WO90/06925，WO91/19711，WO91/19712，WO94/27988和WO95/01977。通常，在酸小管內(nèi)活化和抑制H+/K+腺苷三磷酸酶(ATPase)質(zhì)子泵活性的任何質(zhì)子泵抑制劑可以與本發(fā)明含內(nèi)過氧化物的化合物組合使用。特別優(yōu)選的PPI包含但是不限于奧美拉唑，埃索美拉唑，雷貝拉唑，蘭索拉唑，泰妥拉唑和潘托拉唑和其衍生物或類似物。
所述口服組合物還可以包含用于治療與螺桿菌(如，幽門螺桿菌)感染有關(guān)的潰瘍的抗生素。這樣的抗生素包括，例如，阿莫西林，甲基紅霉素或其它大環(huán)內(nèi)酯，甲硝唑和有關(guān)抗生素，四環(huán)素，喹諾酮，利福布丁或呋喃唑酮。
用于本發(fā)明的PPI能夠以中性形式或鹽的形式(例如堿性鹽)使用，例如Mg+2，CA+2，NA+，K+或Li+鹽，優(yōu)選Mg+2鹽。此外在適用的情況下，該化合物能夠以外消旋的形式或其對(duì)映體形式，或外消旋物或單一對(duì)映體的鹽的形式使用。
用于本發(fā)明方法的活性化合物可以通過靜脈內(nèi)，胃腸外，或口服途徑給藥。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物被口服給藥。這樣的口服劑型可以包含立即釋放或緩釋形式的活性化合物。
組合物還可以包含一種或者多種提高胃粘膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)帶有內(nèi)過氧化物的化合物的利用度的試劑，從而實(shí)現(xiàn)帶有內(nèi)過氧化物的化合物針對(duì)細(xì)菌的局部活性。這樣的試劑例如溶粘劑，其降低胃粘膜粘性，從而促進(jìn)帶有內(nèi)過氧化物的化合物抵達(dá)細(xì)菌的能力。這樣的溶粘劑例如還原劑例如N-乙酰半胱氨酸，二硫蘇糖醇，檸檬酸或甘露糖醇。
另外，組合物還可以包含保持帶有內(nèi)過氧化物的化合物在胃液中溶解性的試劑。這使得帶有內(nèi)過氧化物的化合物在胃中局部地針對(duì)細(xì)菌作用。這樣的試劑優(yōu)選是堿性試劑或抗酸劑，當(dāng)其溶解在胃液中能夠提高胃液的pH，使得該pH下至少顯著比例的帶有內(nèi)過氧化物的化合物保持可溶于胃液中。
用于本發(fā)明的堿性試劑包含例如碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，氧化鎂，氫氧化鎂或碳酸鎂，乳酸鎂，葡糖酸鎂(magnesium glucomate)，氫氧化鋁，鋁、鈣、鈉或鉀的碳酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽，碳酸氫鈉，磷酸氫二鈉，甘氨酸鋁和緩沖液的混合物，氫氧化鈣，乳酸鈣，碳酸鈣，碳酸氫鈣，及其他鈣鹽。值得注意的是碳酸氫鈉容易溶解在水中，而碳酸鈣是水不溶的，僅僅緩慢的可溶于酸性環(huán)境。因此，當(dāng)需要堿性試劑在胃中持續(xù)溶解時(shí)碳酸鈣是有用的。
用于本發(fā)明的抗酸劑的例子包含一種或者多種以下物質(zhì)礬土，碳酸鈣，和碳酸氫鈉；礬土和氧化鎂；礬土，氧化鎂，碳酸鈣，和二甲基硅油(simethicone)；礬土，氧化鎂，和碳酸鎂；礬土，氧化鎂，碳酸鎂，和二甲基硅油；礬土，氧化鎂，和二甲基硅油；礬土，藻酸鎂，和碳酸鎂；礬土和碳酸鎂；礬土，碳酸鎂，和二甲基硅油；礬土，碳酸鎂，和碳酸氫鈉；礬土和三硅酸鎂；礬土，三硅酸鎂，和碳酸氫鈉；礬土和二甲基硅油；礬土和碳酸氫鈉；堿式碳酸鋁；堿式碳酸鋁，和二甲基硅油；氫氧化鋁；碳酸鈣；碳酸鈣和氧化鎂；碳酸鈣，氧化鎂，和二甲基硅油；碳酸鈣和二甲基硅油；碳酸鈣和碳酸鎂；氫氧化鎂鋁；氫氧化鎂鋁(magaldrate)和二甲基硅油；碳酸鎂和碳酸氫鈉；氫氧化鎂；氧化鎂。
為了促進(jìn)帶有內(nèi)過氧化物的化合物在胃中的局部作用，推薦延長(zhǎng)其胃潴留時(shí)間。因此在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物還可以包含一種或者多種胃潴留劑。這些胃潴留劑使得活性物質(zhì)能在胃中局部作用較長(zhǎng)時(shí)間足以消除細(xì)菌。
這樣的胃潴留劑可以是例如一種或者多種聚合物，其在胃中通過吸收來自胃液的水而膨脹，從而增加顆粒的尺寸以促進(jìn)胃中的胃潴留。活性成分通過擴(kuò)散作用或顆粒在胃中被緩慢侵蝕后而從顆粒緩慢釋放。
適于用作胃潴留劑的聚合物具有吸收來自胃液的水后膨脹并隨時(shí)間逐漸被侵蝕的性質(zhì)。液體與劑型表面的相互作用產(chǎn)生的聚合物在胃中的侵蝕性質(zhì)主要由聚合物分子量和藥物/聚合物比率決定。為了保證在數(shù)小時(shí)內(nèi)逐漸侵蝕，聚合物的分子量范圍最好從大約105到大約107克/摩爾。此外，活性化合物/聚合物比率最好在大約2∶3到大約9∶1范圍之內(nèi)，優(yōu)選大約3∶2到9∶1，和最優(yōu)選大約4∶1到9∶1。
活性化合物優(yōu)選均相分散在聚合物中，其中聚合物在胃液中的逐漸侵蝕容許活性化合物的延長(zhǎng)釋放。用作胃潴留劑的優(yōu)選的聚合物是例如合成聚合物，例如聚(環(huán)氧乙烷)，聚乙酸乙烯酯鄰苯二甲酸酯，紫膠，其取代的衍生物和上述任意的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案，基于纖維素的聚合物可以被用于胃潴留。這樣的聚合物例如羥丙基甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯，醋酸纖維素偏苯三酸酯，醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯，羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯或制藥工業(yè)中已經(jīng)用于控釋的口服施藥系統(tǒng)的任何其它的基于纖維素的聚合物。能夠在水中膨脹的其它的聚合物可被用于本發(fā)明。這樣的聚合物的例子是聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(電解質(zhì)復(fù)合物)，與可水解的鍵交聯(lián)的聚(醋酸乙烯酯)，水膨脹的N-乙烯基內(nèi)酰胺多糖，天然膠，瓊脂，瓊脂糖，海藻酸鈉，角叉菜膠，墨角藻聚糖，帚叉藻聚糖，昆布多糖，沙菜屬，石芝屬，阿拉伯樹膠，印度膠，魔芋膠，西黃蓍樹膠，刺槐豆膠，arbinoglactan，果膠，支鏈淀粉，明膠，親水膠體比如羧甲基纖維素膠，或與多元醇比如丙二醇交聯(lián)的藻酸鹽膠等等。能夠在水中膨脹的其它的聚合物包括親水性水凝膠，已知如Carbopol，酸性羧基聚合物，Cyanamer，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸，聚環(huán)氧乙烷，淀粉接枝共聚物，丙烯酸聚合物，酯交聯(lián)聚葡聚糖等等。
其它的延遲胃排空方法可以用于延長(zhǎng)活性化合物在胃中的局部作用。這些方法包括使用將胃的活動(dòng)模式改變?yōu)檫^飽狀態(tài)的不易消化的聚合物或脂肪酸鹽，從而降低胃排空速度和允許藥物釋放延長(zhǎng)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間(公開在例如Singh和Kim，J.of Controlled Release 63(2000)235-259)。
口服劑型可以是片劑、膠囊、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散性粉劑或顆粒、乳劑、多顆粒制劑、糖漿、酏劑等等。
合適的藥物可接受的載體包括但是不限于水，鹽溶液，醇，阿拉伯樹膠，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，凝膠(gelate)，糖類比如乳糖，直鏈淀粉或淀粉，硬脂酸鎂滑石，硅酸，粘稠石蠟，芳香油，脂肪酸單甘油酯和二甘油酯，季戊四醇脂肪酸酯，羥甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等等。所述藥物制劑可以被滅菌，和如果需要的話與助劑例如潤(rùn)滑劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，濕潤(rùn)劑，乳化劑，用于影響緩沖液的滲透壓力的鹽，著色劑，調(diào)味劑和/或芳香物等等混合。需要時(shí)它們還可以與其它的活性劑例如抗生素組合。對(duì)于口服，特別合適的是片劑，糖丸，液體，滴劑，栓劑，或膠囊，小膠囊和膠帽(gelcap)。
口服用組合物可以根據(jù)任何本領(lǐng)域已知的方法制備，這樣的組合物可以包含一種或者多種選自適于制造片劑的惰性、無毒藥物賦形劑的試劑。這樣的賦形劑包括，例如惰性稀釋劑比如乳糖；造粒和崩解劑比如玉米淀粉；粘合劑比如淀粉；和潤(rùn)滑劑比如硬脂酸鎂。所述片劑可以是未涂布的或它們可以通過已知的技術(shù)涂布使之美觀或旨在延遲所述所述活性成分的釋放。用于口服的制劑此外可以硬明膠膠囊形式呈現(xiàn)，其中活性成分與惰性稀釋劑混合。
與本發(fā)明有關(guān)，通?？梢允褂镁哂性趤嗚F存在的情況下反應(yīng)形成毒性自由基的內(nèi)過氧化物基團(tuán)的化合物。優(yōu)選的內(nèi)過氧化物化合物在上文中陳述，盡管從本說明書可以顯見其它未特別提到的內(nèi)過氧化物化合物也將可用于抑制亞鐵依賴的細(xì)菌的方法。
幽門螺桿菌是微量需氧的革蘭氏陰性的細(xì)菌，其與許多胃腸病變有關(guān)，例如胃潰瘍，十二指腸潰瘍，胃炎，十二指腸炎，非潰瘍消化不良，和胃癌。因此，本發(fā)明的活性化合物可以被用來防止和治療與幽門螺桿菌有關(guān)的任何病理。
因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)的情況，胃潰瘍被認(rèn)為是由幽門螺桿菌細(xì)菌感染的結(jié)果，本發(fā)明的組合物可以被用來防止和治療與胃酸分泌和幽門螺桿菌感染有關(guān)的臨床病訴有關(guān)的任何胃腸疾病，例如在非類固醇抗炎藥物(NSAID)治療(包括小劑量阿司匹林)病人中，在患有非潰瘍消化不良的病人中，在需要長(zhǎng)期PPI治療的患有有癥狀胃食管回流疾病(GERD)的病人中，在患有急性上消化道出血的病人中，和在應(yīng)激性潰瘍的病癥中。此外，本發(fā)明的組合物可以被用來治療，例如Zollinger-Ellison綜合癥(ZES)，Werner氏綜合癥，和系統(tǒng)肥大細(xì)胞增多癥等病癥。
本發(fā)明的內(nèi)過氧化物化合物組合物通常包含一定量的足以抑制亞鐵依賴的細(xì)菌生長(zhǎng)的內(nèi)過氧化物化合物，和藥物可接受的載體。組合物通常以將足夠量的內(nèi)過氧化物化合物定位在胃中以促進(jìn)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)長(zhǎng)和最優(yōu)選基本消除細(xì)菌的量給藥到人或其它動(dòng)物對(duì)象。通常任何藥物可接受的載體可以被用于這個(gè)目的，只要載體不顯著干擾本發(fā)明的倍半萜烯化合物穩(wěn)定性或生物利用度。
本發(fā)明的組合物可以以任何有效的藥物可接受的形式給藥到溫血?jiǎng)游?，包括人及其他?dòng)物對(duì)象，如，口服，栓劑，胃腸外，或可灌注劑型，或以任何其它的方式有效遞送試劑到靶組織。給藥途徑優(yōu)選被設(shè)計(jì)成能最優(yōu)化試劑遞送和定位到靶組織。
設(shè)計(jì)用于注射的組合物可以包含藥物可接受的無菌的含水或不含水溶液，懸浮液或乳狀液。合適的非水載體，稀釋劑，溶劑或媒介物的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。這樣的組合物還可以包含佐劑例如防腐劑，濕潤(rùn)劑，乳化劑，和分配劑。它們可以通過例如截留細(xì)菌的過濾器過濾或向組合物摻入殺菌劑而滅菌。它們還可以在給藥前制造成能夠被溶解或懸浮在無菌水，鹽水，或其它可注射介質(zhì)中的無菌固體組合物形式。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊，片劑，丸劑，栓劑，粉末，和顆粒。在固體劑型中，所述組合物可以與至少一種惰性稀釋劑混合，例如蔗糖，乳糖，或淀粉，并可以另外包含潤(rùn)滑劑，緩沖劑，腸溶衣，及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他組分。
實(shí)施本發(fā)明時(shí)，含有內(nèi)過氧化物的化合物在待施用的制劑中的濃度通常在最大的耐受劑量范圍內(nèi)，但是濃度不是關(guān)鍵的并可以廣泛地改變。然而對(duì)于青蒿素及其類似物，使用含有化合物的制劑將獲得最好的結(jié)果，化合物的水平從每公斤體重每天大約0.1到大約100mg，優(yōu)選每公斤體重每天從大約1到大約90mg，并最優(yōu)選每公斤體重每天從大約1到大約75mg。當(dāng)然主治醫(yī)師使用的精確量將取決于化合物，給藥途徑，和病人的身體狀況及其他因素而改變。每日劑量可以作為單劑量給藥或可以分成多劑量給藥。實(shí)際給藥用于治療的化合物的量是治療有效量，此處使用的術(shù)語表示產(chǎn)生基本的臨床改善需要的量或足以抑制對(duì)象中細(xì)菌生長(zhǎng)的量。最適量將根據(jù)給藥方法而變化，并通常與以相同或類似的形式給藥的常規(guī)藥劑的量一致。例如口服，通?？梢砸砸惶煲淮蔚饺瓮瓿?。
含有內(nèi)過氧化物化合物和其它抗生素或質(zhì)子泵抑制劑的組合物可以按類似方式給藥。優(yōu)選的抗生素例如阿莫西林，甲基紅霉素或其它的大環(huán)內(nèi)酯，甲硝唑和有關(guān)抗生素，四環(huán)素，喹諾酮，利福布丁或呋喃唑酮。優(yōu)選的質(zhì)子泵抑制劑例如奧美拉唑，雷貝拉唑，蘭索拉唑，潘托拉唑和其衍生物或類似物。
含有內(nèi)過氧化物的物質(zhì)以口服和非腸道給藥，單獨(dú)給藥或與藥物可利用的媒介物組合給藥。在口服給藥情況下，合適的藥物媒介物包括用來制備片劑，粉末，膠囊等等的惰性稀釋劑或增量劑。如果需要，這些藥物組合物可以包含附加成分比如調(diào)味劑，粘合劑，矯正劑等等。例如，使用包含不同的矯正劑例如檸檬酸鈉連同各種可溶性物質(zhì)例如淀粉，藻酸鹽和特定復(fù)合硅酸鹽和粘合劑例如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，明膠和阿拉伯樹膠的片劑。此外，潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂，十二烷基硫酸鈉和滑石通常適于制備片劑。相似性質(zhì)的固體組合物也用作填充劑以填充軟膠囊和硬明膠膠囊。因此，優(yōu)選的材料包括乳糖和高分子量的聚乙二醇。
為了更充分地說明本發(fā)明的特定實(shí)施方案，顯示以下實(shí)施例。然而它們不應(yīng)當(dāng)以任何方式被理解為對(duì)本發(fā)明廣泛的范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)此處公開的原理的許多變化和修改，而不偏離本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例下列實(shí)施例不是打算用來限制本發(fā)明的范圍，而是僅僅說明與本發(fā)明有關(guān)的代表性的可能方面。
實(shí)施例1青蒿素顯示強(qiáng)的和特異性的針對(duì)幽門螺桿菌的抗菌活性為了測(cè)試青蒿素對(duì)幽門螺桿菌生長(zhǎng)的效果，新鮮制備的細(xì)菌被暴露于不同濃度的青蒿素。細(xì)菌生長(zhǎng)一段固定的培養(yǎng)時(shí)間，使用分光光度計(jì)監(jiān)控它們的生長(zhǎng)水平。比較處理的細(xì)菌與未處理的細(xì)菌的生長(zhǎng)。如表1所示，青蒿素對(duì)幽門螺桿菌的最小抑制濃度(MIC)是2.5μM，表示該化合物的高抗細(xì)菌性質(zhì)。
為了進(jìn)一步測(cè)定青蒿素的抗菌效果，在不同濃度青蒿素存在下維持的幽門螺桿菌被接種在固體培養(yǎng)基上，并監(jiān)測(cè)單菌落的數(shù)目。如表1所示，在濃度等于或高于125-250μM的青蒿素處理的細(xì)菌不能形成菌落形成單位。這個(gè)結(jié)果表示125-250μM青蒿素可被認(rèn)為是最小殺菌濃度(MBC)。因而，青蒿素對(duì)幽門螺桿菌是高度活性的。這個(gè)結(jié)果也許可以解釋為存在于幽門螺桿菌中的細(xì)胞內(nèi)亞鐵的高度累積。
為了測(cè)定青蒿素的效果是否特異地針對(duì)幽門螺桿菌，測(cè)試青蒿素抑制大腸桿菌和痤瘡桿菌生長(zhǎng)的能力。與微需氧性細(xì)菌幽門螺桿菌相比，E.coli是好氧性的大腸細(xì)菌，而痤瘡桿菌是厭氧真皮細(xì)菌。這些細(xì)菌暴露于不同濃度的青蒿素，測(cè)定MIC和MBC值。大腸桿菌和痤瘡桿菌抵抗毫摩爾濃度的青蒿素，顯示青蒿素的抑制效果可能限于幽門螺桿菌(表1和圖1)。
檢測(cè)青蒿素對(duì)屬于腸內(nèi)正常菌群的一部分的嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)的效果。嗜酸乳桿菌在不同濃度青蒿素下生長(zhǎng)并測(cè)定青蒿素的效果。如表1和圖1所示，青蒿素在任何低于5mg/ml的使用濃度不影響嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)。這些結(jié)果指出青蒿素的利用不干擾腸內(nèi)的正常菌群。
表1
*-MIC是最小抑制濃度。
**-MBC是最低殺細(xì)菌濃度。
實(shí)施例2甲基紅霉素和甲硝唑抗性株的幽門螺桿菌對(duì)青蒿素敏感對(duì)感染上幽門螺桿菌的病人治療不成功常常與甲基紅霉素和甲硝唑抗性相關(guān)。為了評(píng)估使用青蒿素針對(duì)具有抗生素抗性的幽門螺桿菌分離物的能力，測(cè)試青蒿素對(duì)顯示甲基紅霉素和甲硝唑抗性的細(xì)菌菌株的效果。顯示對(duì)甲基紅霉素(CLR)和甲硝唑抗性的幽門螺桿菌在存在1mM CLR或2.5-10μM青蒿素的情況下生長(zhǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)物在微好氧條件下培養(yǎng)。在3天之后使用分光光度計(jì)測(cè)試甲基紅霉素或青蒿素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的效果。如圖2所示，測(cè)試的抗性株對(duì)青蒿素具有顯著的敏感性。這一發(fā)現(xiàn)指出青蒿素可被認(rèn)為是治療感染上幽門螺桿菌抗性株的病人的優(yōu)良的候選物。
實(shí)施例3青蒿素和奧美拉唑協(xié)同抑制幽門螺桿菌的生長(zhǎng)為了探究青蒿素和PPI之間可能的協(xié)同作用，研究在青蒿素、奧美拉唑或兩者存在的情況下細(xì)菌的生長(zhǎng)。幽門螺桿菌細(xì)菌在存在3-24μg/ml奧美拉唑或0.5-4μg/ml青蒿素的情況下生長(zhǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)物在微好氧條件下培養(yǎng)。在3天之后使用分光光度計(jì)測(cè)試青蒿素和奧美拉唑?qū)?xì)菌生長(zhǎng)的組合效果。如圖3所示，為了獲得細(xì)菌生長(zhǎng)的急劇降低，連同0.5μg/ml青蒿素給藥3μg/ml奧美拉唑是足夠的。這些結(jié)果表示以藥物單獨(dú)給藥無效的濃度組合給藥奧美拉唑和青蒿素對(duì)幽門螺桿菌生長(zhǎng)具有協(xié)同的抑制效果。
實(shí)施例4青蒿素衍生物抑制幽門螺桿菌的生長(zhǎng)為了測(cè)試青蒿素衍生物對(duì)幽門螺桿菌生長(zhǎng)的效果，新鮮制備的細(xì)菌被暴露于不同濃度的青蒿素衍生物。細(xì)菌生長(zhǎng)一段固定的培養(yǎng)時(shí)間，使用分光光度計(jì)監(jiān)控它們的生長(zhǎng)水平。比較處理的細(xì)菌與未處理的細(xì)菌的生長(zhǎng)。如圖4所示，青蒿素衍生物對(duì)幽門螺桿菌的最小抑制濃度(MIC)如下青蒿素和二氫青蒿素＝1.25-2.5μM，蒿甲醚＝0.3-0.6μM，蒿乙醚＝0.15-0.3μM。因此，所有測(cè)試的青蒿素衍生物具有抗幽門螺桿菌活性。
實(shí)施例5幽門螺桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物長(zhǎng)時(shí)間曝露于青蒿琥酯導(dǎo)致不可逆的細(xì)菌清除青蒿琥酯(0.625或6.25mM)在不同的時(shí)點(diǎn)(0.5、1、2、4、6和18小時(shí))被添加到細(xì)菌培養(yǎng)物(0.2O.D.600)。然后通過沉淀細(xì)菌和用PBS洗滌從培養(yǎng)物中洗掉青蒿琥酯，其后細(xì)菌被重懸在新鮮的無青蒿琥酯的培養(yǎng)基中。細(xì)菌被維持在無青蒿琥酯的培養(yǎng)基另外36小時(shí)，通過分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)。圖5顯示的結(jié)果表明幽門螺桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物長(zhǎng)時(shí)間曝露到青蒿琥酯導(dǎo)致不可逆細(xì)菌清除。
實(shí)施例6青蒿琥酯在低pH條件下長(zhǎng)時(shí)間溫育之后保存它的抗螺桿菌活性青蒿琥酯(1mg/ml)在人工胃液(SGF，pH 1.2)或在細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基(BBM，天然pH)在37℃C中預(yù)溫育不同的時(shí)間段(1，2，4，6和24小時(shí))。在預(yù)保溫之后，細(xì)菌培養(yǎng)物(0.01O.D)被暴露到包含預(yù)保溫的青蒿琥酯的培養(yǎng)基36小時(shí)。通過分光光度計(jì)測(cè)定青蒿琥酯對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的效果。圖6顯示的結(jié)果指出青蒿琥酯的活性在酸性條件下預(yù)保溫24小時(shí)后仍保留。
實(shí)施例7對(duì)比安慰劑治療的幽門螺桿菌感染的小鼠，在青蒿琥酯治療的幽門螺桿菌感染的小鼠中青蒿琥酯有效地降低菌落形成單位數(shù)目在幽門螺桿菌感染的小鼠中測(cè)試青蒿琥酯針對(duì)幽門螺桿菌體內(nèi)感染的效果。通過接種(×3/天)109個(gè)幽門螺桿菌菌株SS1的懸浮液而感染小鼠。感染兩個(gè)星期后，口服給藥50mg/kg青蒿琥酯3次/天持續(xù)8天對(duì)小鼠進(jìn)行治療。通過計(jì)算來源于治療第4和8天的勻漿化的胃的菌落形成單位的數(shù)目測(cè)定細(xì)菌感染的水平。如圖7所示，對(duì)比安慰劑治療的小鼠，青蒿琥酯有效地降低青蒿琥酯治療的小鼠中菌落形成單位的數(shù)目，表示青蒿琥酯能在體內(nèi)清除幽門螺桿菌。
實(shí)施例8包含微錠(mini-tabs)中的青蒿琥酯，腸衣奧美拉唑珠和碳酸鈣的硬明膠膠囊硬明膠膠囊被配制成包含混合顆粒群體的單一劑型。各膠囊包含下面的成分40mg奧美拉唑作為腸衣珠250mg青蒿琥酯顆粒550mg碳酸鈣(CaCO3)羥丙基甲基纖維素(HPMC)K100MPolyox WSR N60青蒿琥酯結(jié)合HPMC，Polyox和CaCO3被?；嚎s成微錠。微錠具有在接觸胃中的胃液后快速膨脹的能力，從而青蒿琥酯得以在胃粘膜內(nèi)部胃潴留和具有局部活性。青蒿琥酯和CaCO3釋放入胃中通過膨脹的微錠的聚合物基質(zhì)的侵蝕速率而控制。青蒿琥酯微錠和腸衣奧美拉唑珠一起被包裝成大小0的硬膠囊，每一膠囊含量相當(dāng)于40mg奧美拉唑，250毫克青蒿琥酯和550mg碳酸鈣。
實(shí)施例9包含腸衣奧美拉唑和青蒿琥酯珠的多顆粒膠囊本實(shí)施例說明涉及制造多顆粒硬明膠膠囊的步驟。膠囊被配制為包含粒子混合群體的單一劑型青蒿琥酯珠和腸衣奧美拉唑珠。各膠囊包含下面的成分40mg奧美拉唑腸衣珠250mg青蒿琥酯顆粒實(shí)施例10包含青蒿琥酯粉末和奧美拉唑粉末的腸衣片劑壓縮片劑配制為包含下列成分的單一劑型40mg奧美拉唑粉末250mg青蒿琥酯粉末通過混合和壓縮250mg青蒿琥酯粉末和40毫克奧美拉唑粉末制備壓縮片劑。最終片劑涂布有腸衣，使得可以在腸內(nèi)系統(tǒng)吸收活性成分。在另一個(gè)實(shí)施例中，活性成分被壓縮成雙層片劑，其中第一層包含250毫克青蒿琥酯，第二層費(fèi)包括40毫克奧美拉唑粉末。然后最終的片劑被涂布腸衣。
該壓縮片劑可以包括一個(gè)或多個(gè)下列賦形劑乳糖，甘露糖醇，玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，微晶纖維素，金合歡膠，明膠，膠體二氧化硅，交聯(lián)羥甲纖維素鈉(croscarmellose Na)，滑石，硬脂酸鎂，硬脂酸，及其他賦形劑，著色劑，稀釋劑，緩沖劑，濕潤(rùn)劑，防腐劑，調(diào)味劑，和藥物相容的載體。
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權(quán)利要求
1.一種在含有亞鐵依賴的細(xì)菌的對(duì)象中抑制該細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)需要治療的對(duì)象給藥含內(nèi)過氧化物的化合物，該化合物的量足以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中包含內(nèi)過氧化物的化合物選自倍半萜烯內(nèi)酯和醇，碳酸酯，酯，醚磺酸酯和其藥物可接受的鹽，trioxolanes，雙環(huán)內(nèi)過氧化物，三噁烷，四噁烷，萜烯和取代的萜烯。
3.權(quán)利要求2的方法，其中包含內(nèi)過氧化物的化合物如通式(I)所示 其中R是-CO或R是-CR1-，其中R1是氫，羥基，烷基，-OR2，-COR2，-COR2，-COOR2，-CO(CH2)n，-COOH，或-SOOR2，其中R2是烷基或芳基，而n是1到6。
4.權(quán)利要求3的方法，其中含內(nèi)過氧化物的化合物是選自以下的倍半萜烯青蒿素，二氫青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚，阿替夫林，青蒿琥酯，二羥基二氫青蒿素，青蒿酸，和二氫青蒿素丙基碳酸酯。
5.權(quán)利要求1的方法，還包括向?qū)ο蠼o藥治療有效量的至少一種選自以下的活性劑抗生素試劑，胃酸分泌抑制劑，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，可逆的質(zhì)子泵抑制劑，H2阻斷劑，含鉍化合物，細(xì)胞保護(hù)劑，前列腺素類似物，和鐵。
6.權(quán)利要求5的方法，其中PPI選自雷貝拉唑，奧美拉唑，埃索美拉唑，蘭索拉唑，潘托拉唑，來明拉唑，泰妥拉唑和其單一對(duì)映體，其堿性鹽和其混合物。
7.權(quán)利要求5的方法，其中抗生素試劑選自阿莫西林，大環(huán)內(nèi)酯，甲硝唑，四環(huán)素，喹諾酮，利福布丁和呋喃唑酮。
8.權(quán)利要求1的方法，其中亞鐵依賴的細(xì)菌是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)。
9.一種治療或防止需要治療的對(duì)象的螺桿菌相關(guān)疾病的方法，其包括向?qū)ο蠼o藥含內(nèi)過氧化物的化合物，化合物的量足以治療或防止該疾病。
10.權(quán)利要求9的方法，其中含內(nèi)過氧化物的化合物選自倍半萜烯內(nèi)酯和醇，碳酸酯，酯，醚磺酸酯和其藥物可接受的鹽，trioxolanes，雙環(huán)內(nèi)過氧化物，三噁烷，四噁烷，萜烯和取代的萜烯。
11.權(quán)利要求10的方法，其中包含內(nèi)過氧化物的化合物如通式(I)所示 其中R是-CO或R是-CR1-，其中R1是氫，羥基，烷基，-OR2，-COR2，-COR2，-COOR2，-CO(CH2)n，-COOH，或-SOOR2，其中R2是烷基或芳基，而n是1到6。
12.權(quán)利要求11的方法，其中含內(nèi)過氧化物的化合物是選自以下的倍半萜烯青蒿素，二氫青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚，阿替夫林，青蒿琥酯，二羥基二氫青蒿素，青蒿酸，和二氫青蒿素丙基碳酸酯。
13.權(quán)利要求9的方法，還包括給對(duì)象給藥治療有效量的至少一種選自以下的活性劑抗生素試劑，胃酸分泌抑制劑，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，可逆的質(zhì)子泵抑制劑，H2阻斷劑，含鉍化合物，粘膜吸附劑，前列腺素類似物，和鐵。
14.權(quán)利要求13的方法，其中PPI選自雷貝拉唑，奧美拉唑，埃索美拉唑，蘭索拉唑，潘托拉唑，來明拉唑，泰妥拉唑和其單一對(duì)映體，其堿性鹽和其混合物。
15.權(quán)利要求13的方法，其中抗生素試劑選自阿莫西林，大環(huán)內(nèi)酯，甲硝唑，四環(huán)素，喹諾酮，利福布丁和呋喃唑酮。
16.權(quán)利要求9的方法，其中螺桿菌相關(guān)疾病是螺桿菌相關(guān)的胃腸機(jī)能紊亂。
17.權(quán)利要求16的方法，其中螺桿菌相關(guān)的胃腸機(jī)能紊亂選自胃潰瘍，十二指腸潰瘍，胃炎，十二指腸炎，非潰瘍消化不良，MALTOMA，胃的腸組織轉(zhuǎn)化和胃癌。
18.權(quán)利要求16的方法，其中與胃腸機(jī)能紊亂相關(guān)的螺桿菌是幽門螺桿菌。
19.權(quán)利要求18的方法，其中與胃腸機(jī)能紊亂相關(guān)的幽門螺桿菌是對(duì)<}0{>甲基紅霉素或甲硝唑抗性的幽門螺桿菌菌株。
20.權(quán)利要求9的方法，其中含內(nèi)過氧化物的化合物通過靜脈內(nèi)、腸胃外或口服方式給藥。
21.權(quán)利要求18的方法，其中含內(nèi)過氧化物的化合物基本清除細(xì)菌。
22.一種治療或防止螺桿菌相關(guān)胃腸機(jī)能紊亂的藥物組合物，包含藥物有效量的通式(I)的化合物， 其中R是-CO或R是-CR1-，其中R1是氫，羥基，烷基，-OR2，-COR2，-COR2，-COOR2，-CO(CH2)n，-COOH，或-SOOR2，其中R2是烷基或芳基，而n是1到6，和一種或多種用于治療螺桿菌相關(guān)胃腸機(jī)能紊亂的活性劑，選自抗生素試劑，胃酸分泌抑制劑，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，可逆的質(zhì)子泵抑制劑，H2阻斷劑，含鉍化合物，粘膜吸附劑，前列腺素類似物，和抗炎劑。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中螺桿菌相關(guān)胃腸機(jī)能紊亂是幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)相關(guān)的胃腸機(jī)能紊亂。
24.權(quán)利要求22的組合物，還包含以下至少一種鐵，一種或多種溶粘劑，一種或多種胃潴留劑，環(huán)糊精和一種或多種堿性試劑。
25.權(quán)利要求22的組合物，其中口服組合物采取片劑、膠囊、溶液、粉末、懸浮液、分散系或乳劑的形式。
26.權(quán)利要求22的組合物，其中所述化合物是選自以下的倍半萜烯青蒿素，二氫青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚，阿替夫林，青蒿琥酯，二羥基二氫青蒿素，青蒿酸，和二氫青蒿素丙基碳酸酯。
27.權(quán)利要求22的組合物，其中PPI選自雷貝拉唑，奧美拉唑，埃索美拉唑，蘭索拉唑，潘托拉唑，來明拉唑，泰妥拉唑和其單一對(duì)映體，其堿性鹽和其混合物。
28.權(quán)利要求22的組合物，其中抗生素試劑選自阿莫西林，大環(huán)內(nèi)酯，甲硝唑，四環(huán)素，喹諾酮，利福布丁和呋喃唑酮。
29.權(quán)利要求22的組合物，其中通式(I)的化合物是青蒿素或青蒿琥酯，而PPI是奧美拉唑。
30.權(quán)利要求22的組合物，其中治療螺桿菌相關(guān)胃腸機(jī)能紊亂的通式(I)的化合物和活性劑的比例從大約50∶1到大約1∶100。
31.權(quán)利要求22的組合物，其中螺桿菌相關(guān)胃腸機(jī)能紊亂疾病選自胃潰瘍，十二指腸潰瘍，胃炎，十二指腸炎，非潰瘍消化不良，MALTOMA，胃的腸組織轉(zhuǎn)化和胃癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療與亞鐵依賴的細(xì)菌有關(guān)的病理疾病的方法和組合物，所述細(xì)菌例如，幽門螺桿菌，其中細(xì)胞內(nèi)的高亞鐵濃度是它們生存和致病所需要的。本發(fā)明的組合物包含含有內(nèi)過氧化物橋的化合物，其特異性抑制亞鐵依賴的細(xì)菌的生長(zhǎng)，并優(yōu)選促進(jìn)清除該細(xì)菌。該組合物，通常還包括至少一種治療螺桿菌有關(guān)胃腸機(jī)能紊亂的活性劑，例如質(zhì)子泵抑制劑，H2阻斷劑或含鉍化合物。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1882328SQ200480034004
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者邁克爾·馬拉希, 葉連娜·克呂弗 申請(qǐng)人:維克塔有限公司