專利名稱：：羥烷基淀粉與g－csf的偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及羥烷基淀粉與粒細(xì)胞集落刺激因子蛋白質(zhì)(G-CSF)的偶聯(lián)物，其中這些偶聯(lián)物由羥烷基淀粉或羥烷基淀粉的衍生物與蛋白質(zhì)通過共價鍵形成。本發(fā)明還涉及制備這些偶聯(lián)物的方法，以及這些偶聯(lián)物的用途。
背景技術(shù)：
：通常已知當(dāng)這些蛋白質(zhì)與聚合分子偶聯(lián)時，可改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并且對抗這些蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答降低。WO94/28024揭示經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的生理活性蛋白質(zhì)具有低的免疫原性和抗原性，并且在血液循環(huán)中的壽命顯著高于未偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，即清除率降低。G-CSF是一種21kDa的糖蛋白，其利用兩個鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定，并且包含單一O-連接的碳水化合物部分。成熟的G-CSF具有174個氨基酸。動物體中的G-CSF由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成。其主要功能是作為嗜中性粒細(xì)胞及其前體細(xì)胞的生長和分化因子。然而，本領(lǐng)域也已知G-CSF可活化成熟的嗜中性粒細(xì)胞。此外，它還刺激多種其它造血祖細(xì)胞的生長/分化(與其它造血生長因子協(xié)同作用)，并且促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。臨床上，G-CSF用于給藥治療嗜中性粒細(xì)胞水平的缺乏(例如由再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良、AIDS或化療引起的)。WO02/09766特別公開了生物相容性蛋白質(zhì)-聚合物化合物，它是由生物活性蛋白質(zhì)與生物相容性聚合物衍生物偶聯(lián)制成的。所使用的生物相容性聚合物是高度反應(yīng)性分支聚合物，所得的偶聯(lián)物在聚合物衍生物與蛋白質(zhì)之間包含一個長接頭。作為生物相容性聚合物，描述了通式(P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A的聚合物，其中P和Q為聚合殘基，k可為1或0。P和Q提到的有聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、聚三亞甲基二醇(polytrimethyleneglycol)、聚乳酸及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨基甲酸酯、聚磷腈、聚(L-賴氨酸)、聚亞烷基氧化物、聚丙烯酰胺和水溶性聚合物，如葡聚糖或多糖。蛋白質(zhì)中特別提到α-、β-和γ-干擾素、血液因子、細(xì)胞因子，如白介素、G-CSF、GM-CSF。WO02/09766的實(shí)施例中僅公開了僅與干擾素和表皮生長因子和人類生長激素偶聯(lián)的單-、二-和三-聚乙二醇衍生物。WO94/01483公開了由無生物活性聚合物或聚合物衍生物與藥學(xué)上純的合成親水性聚合物通過特定類型的化學(xué)鍵共價結(jié)合形成的生物相容性聚合物偶聯(lián)物。其中公開的天然聚合物及其衍生物有多糖類如透明質(zhì)酸、蛋白聚糖如硫酸軟骨素A、B和C、幾丁質(zhì)、肝素、硫酸肝素、葡聚糖如環(huán)糊精、羥乙基纖維素、纖維素醚和淀粉、脂質(zhì)如甘油三酯和磷脂。提到的合成聚合物有平均分子量約100至約100,000的聚乙烯及其衍生物。提到的與聚合物或聚合物衍生物連接的蛋白質(zhì)有細(xì)胞因子和生長因子，包括干擾素、腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子、生長因子如成骨因子提取物、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子，等等。WO94/01483的所有實(shí)施例中都使用聚乙二醇衍生物作為聚合物。WO96/11953公開了N-末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)化合物及其制備方法。具體來說，其中描述了由水溶性聚合物與G-CSF的N末端偶聯(lián)形成的G-CSF組合物。WO96/11953中也公開了N-末端與水溶性聚合物偶聯(lián)的組合干擾素。雖然WO96/11953中列出許多種水聚合物(例如乙二醇與丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁茂烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/環(huán)氧乙烷共聚物或聚氧乙基化多元醇)，但WO96/11953的實(shí)施例中僅描述了PEG基化的G-CSF或組合IFN組合物。US6,555,660B2公開的多肽偶聯(lián)物包含具有G-CSF活性的多肽，其氨基酸序列與人類G-CSF氨基酸序列的不同之處在于至少一個特異性引入的和/或去除的氨基酸殘基，其中該偶聯(lián)物包含連接非多肽部分的基團(tuán)，并且還包含至少一個附接在多肽該連接基團(tuán)上的非多肽部分。該非多肽部分可為聚合物，如聚乙二醇或寡糖。US6,555,660B2中明確說明PEG是目前最優(yōu)選的聚合物分子，因?yàn)榕c多糖類如葡聚糖相比，其僅具有極少的可以進(jìn)行交聯(lián)的反應(yīng)性基團(tuán)。WO97/30148涉及變應(yīng)原性降低的多肽偶聯(lián)物，其包含與兩個或多個多肽分子偶聯(lián)的聚合載體分子。這些偶聯(lián)物優(yōu)選地是個人護(hù)理用品市場上所使用組合物的一部份。該偶聯(lián)物的制備方法包括活化聚合載體分子，兩個或多個多肽分子與活化的聚合載體分子反應(yīng)，并阻斷偶聯(lián)物上殘留的活性基團(tuán)。WO97/30148中列出多種聚合載體分子，包括如天然或合成均聚物的不同類別的化合物，如多元醇、聚胺、聚羧酸和包含至少兩個不同連接基團(tuán)的雜聚物。其給出的實(shí)例包括星形PEGs、分支PEGs、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚-D，L-氨基酸。其中還公開了葡聚糖，如羧甲基葡聚糖，纖維素，如羥乙基纖維素或羥丙基纖維素，殼聚糖的水解物，淀粉，如羥乙基淀粉或羥丙基淀粉，糖原、瓊脂糖、瓜爾膠、菊糖、支鏈淀粉、黃原膠、角叉菜膠、果膠、藻酸，等等。至于多肽，其中僅明確公開了幾種酶。Baldwin，J.E.等人，Tetrahedron，vol.27(1981)，pp.1723-1726中描述了葡聚糖與羥乙基淀粉的化學(xué)修飾，產(chǎn)生的醛取代的聚合物可與血紅蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生可溶性的與聚合物結(jié)合的血紅蛋白。其顯示可與氧結(jié)合，但心臟灌注實(shí)驗(yàn)清楚地證實(shí)，該與聚合物結(jié)合的血紅蛋白不適宜用作血液代用品。WO99/49897描述了由多糖類如葡聚糖或羥乙基淀粉與血紅蛋白的氨基反應(yīng)形成的血紅蛋白偶聯(lián)物。使用經(jīng)氧化反應(yīng)打開糖環(huán)所產(chǎn)生的醛基作為多糖的官能團(tuán)。公開了硼烷二甲胺作為優(yōu)選使用的還原劑。此外，WO99/49897僅限于血紅蛋白。WO03/074087涉及一種偶聯(lián)蛋白質(zhì)與淀粉衍生的修飾多糖的方法。蛋白質(zhì)與多糖(羥烷基淀粉)之間的結(jié)合作用是共價連接，此共價連接是在羥烷基淀粉分子的末端醛基或該末端醛基經(jīng)化學(xué)修飾后所得的官能團(tuán)與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)之間形成的。公開了氨基、硫基和羧基作為蛋白質(zhì)的反應(yīng)性基團(tuán)，但未提及蛋白質(zhì)的醛基。此外，雖然其中列出不同連接的多種可能性，包括不同官能團(tuán)，理論上合適的不同接頭分子和不同的化學(xué)方法，但是實(shí)施例只給出兩種選擇第一，使用氧化的羥乙基淀粉，采用乙基二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)活化作用，直接與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，或采用未氧化的羥乙基淀粉，直接與蛋白質(zhì)偶聯(lián)形成希夫氏堿(Schiff’sbase)，其接著還原成各自的胺。因此，WO03/074087的實(shí)施例既未公開通過蛋白質(zhì)的硫基或羧基偶聯(lián)的單一偶聯(lián)物，也未描述包含羥乙基淀粉、蛋白質(zhì)和一種或多種接頭分子的偶聯(lián)物。此外，其實(shí)施例中也未使用G-CSF分子。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供現(xiàn)有技術(shù)中未曾描述的羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉，與G-CSF的偶聯(lián)物。本發(fā)明的另一個目的是提供制備這些偶聯(lián)物的方法。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明涉及一種制備包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物的方法，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，且該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，該方法包括由聚合物或其衍生物的至少一個官能團(tuán)A與蛋白質(zhì)的至少一個官能團(tuán)Z反應(yīng)，由此形成共價連接，其中Z選自氨基、硫醇基、醛基和酮基，并且-其中，若Z為醛基或酮基時，A包含與Z形成該連接的氨基，或-其中，若Z為氨基時，A選自反應(yīng)性羧基和醛基、酮基或半縮醛基，--其中，若A為醛基、酮基或半縮醛基時，該方法還包括向聚合物中引入A，形成聚合物衍生物---由聚合物與一種至少雙官能化合物反應(yīng)，其中一個官能團(tuán)可與聚合物反應(yīng)，其中至少另一個官能團(tuán)為醛基、酮基或半縮醛基，或者是經(jīng)進(jìn)一步化學(xué)修飾可產(chǎn)生醛基、酮基或半縮醛基的官能團(tuán)，或---氧化該聚合物，產(chǎn)生至少一個，特別是至少兩個醛基，或--其中，若A為反應(yīng)性羧基時，該方法還包括向聚合物中引入A，形成聚合物衍生物---選擇性氧化聚合物的還原端，并活化所得的羧基，或---聚合物的未氧化還原端與碳酸二酯反應(yīng)，或-其中，若Z為硫醇基時，A包含--馬來酰亞胺基或--鹵乙?；cZ形成所述連接。因此，本發(fā)明也涉及利用上述方法制得的偶聯(lián)物。G-CSF可通過化學(xué)合成法制備，或者可來自任何人類(參見例如，Burgess，A.W.等人1977，Stimulationbyhumanplacentalconditionedmediumofhemopoieticcolonyformationbyhumanmarrowcells.Blood49(1977)，573-583；Shah，R.G.等人1977，Characterizationofcolony-stimulatingactivityproducedbyhumanmonocytesandphytohemagglutinin-stimulatedlymphocytes.Blood50(1977)，811)或另一種哺乳動物來源，并且可由諸如人類胎盤、人類血液或人類尿液等天然來源純化獲得。此外，有許多上皮癌、急性骨髓性白血病細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞系(膀胱癌、髓母細(xì)胞瘤)能夠表達(dá)該因子。此外，G-CSF的表述還包括G-CSF變體，其中一個或多個氨基酸(例如1至25個，優(yōu)選1至10個，更優(yōu)選1至5個，最優(yōu)選1或2個)已被置換為另一種氨基酸，并且顯示G-CSF活性(參見例如Riedhaar-Olson，J.F.等人1996，Identificationofresiduescriticaltotheactivityofhumangranulocytecolony-stimulatingfactor.Biochemistry359034-90411996；美國專利Nos.5,581476；5,214,132；5,362,853；4,904,584)。G-CSF活性的測定法在本領(lǐng)域中有敘述(G-CSF活性的體外測定法參見例如Shirafuji，N.等人1989，Anewbioassayforhumangranulocytecolony-stimulatingfactor(hG-CSF)usingmurinemyeloblasticNFS-60cellsastargetsandestimationofitslevelsinserafromnormalhealthypersonsandpatientswithinfectiousandhematologicaldisorders，Exp.Hematol.1989，17，116-119；G-CSF活性的體內(nèi)測定法參見例如Tanaka，H.等人1991，Pharmacokineticsofrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorconjugatedtopolyethyleneglycolinrats，CancerResearch51，3710-3714，1991)。其它有關(guān)測定G-CSF活性的方法的文獻(xiàn)為美國專利No.6,555,660；Nohynek，G.J.等人，1997，Comparisonofthepotencyofglycosylatedandnonglycosylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorsinneutropenicandnonneutropenicCDrats.CancerChemotherPharmacol(1997)39；259-266。優(yōu)選重組產(chǎn)生G-CSF。其包括由原核或真核宿主表達(dá)通過基因組或cDNA克隆或DNA合成得到的外源性DNA序列。合適的原核宿主包括多種細(xì)菌，如大腸桿菌(E.coli)。合適的真核宿主包括酵母，如釀酒酵母(S.cerevisiae)，和哺乳動物細(xì)胞，如中國倉鼠卵巢細(xì)胞和猴細(xì)胞。本領(lǐng)域已知蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)生方法。通常，其包括用適當(dāng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)。有關(guān)詳細(xì)資料參見例如Souza，L.M.等人1986，Recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorseffectsonnormalandleukemicmyeloidcells.Science198623261-65，1986；Nagata，S.等人1986，MolecularcloningandexpressionofcDNAforhumangranulocytecolony-stimulatingfactors.Nature319415-418，1986；Komatsu，Y.等人1987，Cloningofhumangranulocytecolony-stimulatingfactorscDNAfromhumanmacrophagesanditsexpressioninEscherichiacoli，JpnJCancerRes.198778(11)1179-1181。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，G-CSF具有人類成熟G-CSF的氨基酸序列(參見例如Nagata，S.等人1986，MolecularcloningandexpressionofcDNAforhumangranulocytecolony-stimulatingfactors.Nature319415-418，1986)，且可進(jìn)一步在其氨基末端包含一個甲硫氨酸，形成175個氨基酸的蛋白質(zhì)。此外，G-CSF可包含絲氨酸或蘇氨酸殘基來代替甲硫氨酸。用于本發(fā)明方法和根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物中的G-CSF可包含一個碳水化合物側(cè)鏈，該側(cè)鏈通過在Thr133位置上O-連接的糖基化作用連接到G-CSF，即G-CSF被糖基化(V.Gervais等人，Eur.J.Biochem.1997，247，386-395)。碳水化合物側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)可以是NeuNAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuNAc(α2-6)]GalNAc和(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(NeuNAc＝N-乙酰神經(jīng)氨酸，GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺)。曾有人建議修飾G-CSF和其它多肽，以便與天然多肽相比，再引入至少另一個碳水化合物鏈(美國專利No.5,218,092)。根據(jù)所使用的宿主不同，G-CSF表達(dá)產(chǎn)物可被哺乳動物或其它真核生物碳水化合物糖基化。通常，當(dāng)G-CSF在真核細(xì)胞中產(chǎn)生時，該蛋白質(zhì)在翻譯后糖基化。結(jié)果，碳水化合物側(cè)鏈可在哺乳動物特別是人類、昆蟲或酵母細(xì)胞中的生物合成期間與G-CSF連接。重組人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治療多種類型的白細(xì)胞減少癥。因此，可獲得名稱為非格司亭(filgrastim)(Gran和Neupogen)、來格司亭(lenograstim)(Neutrogin和Granocyte)和那托司亭(nartograstim)(Neu-up)的商品rhG-CSF制劑。Gran和Neupogen為非糖基化，在重組大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生。Neutrogin和Granocyte為糖基化，在重組CHO細(xì)胞中產(chǎn)生，Neu-up為非糖基化，其在完整rhG-CSF的N-末端區(qū)有5個氨基酸置換，在重組大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生?？墒褂萌魏翁腔疓-CSF，如Granocyte，作為糖基化蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法和偶聯(lián)物中，可使用任何非糖基化G-CSF，如Neupogen，作為非糖基化G-CSF。此外，在1-位上，G-CSF可包含一個甲硫氨酸氨基酸殘基、絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基。在本
發(fā)明內(nèi)容中，術(shù)語″羥烷基淀粉″(HAS)意指被至少一個羥基烷基取代的淀粉衍生物。本發(fā)明的一種優(yōu)選羥烷基淀粉具有根據(jù)式(I)的結(jié)構(gòu)其中淀粉分子的還原端呈非氧化型，末端糖單位顯示為縮醛型，根據(jù)如溶劑的不同，該縮醛型可能與醛型平衡。本發(fā)明使用的術(shù)語”羥烷基淀粉”不限于末端碳水化合物部分包含如式(I)中為了簡便起見所示羥基烷基R1、R2和/或R3的化合物，也指其中在末端碳水化合物部分和/或淀粉分子HAS′中其余部份的任何位置的至少一個羥基被羥基烷基R1、R2或R3取代的化合物。羥烷基淀粉也可能包含兩個或多個不同羥基烷基。包含在HAS中的至少一個羥基烷基可包含兩個或多個羥基。根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方案，包含在HAS中的至少一個羥基烷基包含一個羥基。術(shù)語″羥烷基淀粉″也包括其中烷基被單-或多取代的衍生物。本文中，優(yōu)選的是烷基被鹵素，特別是氟取代，或被芳基取代。此外，羥基烷基的羥基可被酯化或醚化。此外，也可使用直鏈或分支的取代或未取代的烯基代替烷基。羥烷基淀粉是淀粉的醚衍生物。除了所述醚衍生物外，本發(fā)明中也可使用其它淀粉衍生物。例如，可用包含酯化羥基的衍生物。這些衍生物可以是，例如含2-12個碳原子的未取代一元或二元羧酸的衍生物或其取代的衍生物。特別有用的是含2-6個碳原子的未取代一元羧酸的衍生物，特別是乙酸的衍生物。本文中，優(yōu)選乙?；矸邸⒍』矸酆捅矸?。此外，優(yōu)選含2-6個碳原子的未取代二元羧酸的衍生物。對于二元羧酸衍生物，適用的是該二元羧酸的第二個羧基也被酯化的衍生物。此外，二元羧酸的單烷基酯衍生物也適用于本發(fā)明。取代的一元或二元羧酸中，取代基優(yōu)選地可與上述取代烷基殘基的取代基相同。淀粉的酯化技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見例如KlemmD.等人，ComprehensiveCelluloseChemistryVol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，NewYork，特別是第4.4章，“纖維素的酯化(EsterificationofCellulose)”(ISBN3-527-29489-9)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，使用根據(jù)式(I)的羥烷基淀粉。式(I)中，明確說明的糖環(huán)和以HAS′表示的殘基共同代表優(yōu)選羥烷基淀粉分子。HAS′中包含的其它糖環(huán)結(jié)構(gòu)可以與明確說明的糖環(huán)相同或不同。根據(jù)式(I)的殘基R1、R2和R3沒有明確限制。根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方案，R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或各烷基中具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基。優(yōu)選氫和具有2至10個碳原子的羥基烷基。更優(yōu)選具有2至6個碳原子的羥基烷基，更優(yōu)選具有2至4個碳原子的羥基烷基，甚至更優(yōu)選具有2至4個碳原子。因此″羥烷基淀粉″優(yōu)選包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉，其中特別優(yōu)選羥乙基淀粉和羥丙基淀粉，最優(yōu)選羥乙基淀粉。烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直鏈或分支的，并且被適當(dāng)取代。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或含1至6個碳原子的直鏈或分支羥基烷基。因此，R1、R2和R3優(yōu)選地可以是羥基己基、羥基戊基、羥基丁基、羥基丙基，如2-羥基丙基、3-羥基丙基、2-羥基異丙基、羥基乙基，如2-羥基乙基，特別優(yōu)選氫和2-羥基乙基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或2-羥基乙基，特別優(yōu)選其中R1、R2和R3中至少一個殘基為2-羥基乙基的實(shí)施方案。羥乙基淀粉(HES)對于本發(fā)明所有實(shí)施方案都是最優(yōu)選的。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物為羥乙基淀粉，并且聚合物衍生物為羥乙基淀粉衍生物。羥乙基淀粉(HES)是天然支鏈淀粉的衍生物，可被體內(nèi)α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支鏈淀粉的取代衍生物，其在玉米淀粉中的含量濃度高達(dá)95重量％。HES具有有利的生物性質(zhì)，在臨床上用作血容量置換劑及用于血液稀釋療法(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/DrugRes.，41，494-498)。支鏈淀粉由葡萄糖單位組成，其中主鏈中含有α-1，4-糖苷鍵，并且在分支位置處可見α-1，6-糖苷鍵。該分子的物理化學(xué)性質(zhì)主要由糖苷鍵的類型決定。由于存在切口(nicked)α-1，4-糖苷鍵，因此產(chǎn)生每一圈約6個葡萄糖單體的螺旋結(jié)構(gòu)。聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)及生化性質(zhì)可通過取代改變。利用堿性羥乙基化作用可引入羥基乙基。通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件可能使未取代的葡萄糖單體中各羥基對羥乙基化作用具有不同反應(yīng)性。基于此事實(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在有限范圍內(nèi)改變?nèi)〈Ｊ?。HES的主要特征在于分子量分布和取代程度。表述取代程度有兩種可能的方式1.取代程度可表示為取代的葡萄糖單體相對于所有葡萄糖部分的比例。2.取代程度可表示為摩爾取代程度，其中表示每個葡萄糖部分的羥基乙基數(shù)。在本
發(fā)明內(nèi)容中，以DS表示的取代程度涉及如上所述的摩爾取代程度。HES溶液呈現(xiàn)為多分散組合物，其中各分子在聚合度、分支位置的數(shù)量和模式及取代模式上彼此不同。因此，HES是不同分子量的化合物的混合物。因此，特定的HES溶液由借助統(tǒng)計方式得到的平均分子量來決定。本文中，Mn計算為根據(jù)分子數(shù)量的算術(shù)平均值?；蛘?，平均重量Mw(或MW)代表取決于HES質(zhì)量的單位。在本
發(fā)明內(nèi)容中，羥乙基淀粉可優(yōu)選具有1至300kD的平均分子量(平均重量)。羥乙基淀粉可進(jìn)一步顯示0.1至0.8的優(yōu)選摩爾取代程度，羥基乙基的C2∶C6取代的優(yōu)選比例范圍為2至20。本發(fā)明中使用的術(shù)語″平均分子量″涉及根據(jù)Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；和Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/DrugRes.，41，494-498確定的重量。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所使用羥乙基淀粉的平均分子量為1至300kD，更優(yōu)選2至200kD，更優(yōu)選4至130kD，更優(yōu)選4至70kD。平均分子量約130kD的HES的一個實(shí)例為來自Fresenius公司的Voluven。Voluven是一種人造膠體，其用于例如在醫(yī)療上進(jìn)行容量置換，供治療和預(yù)防低血容量癥。Voluven的特征為平均分子量為130,000+/-20,000D，摩爾取代程度為0.4，C2∶C6比例約9∶1。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉為平均分子量4至70Kd的羥乙基淀粉。平均分子量的優(yōu)選范圍是例如4至70kD或10至70kD或12至70kD或18至70kD或50至70kD或4至50kD或10至50kD或12至50kD或18至50kD或4至18kD或10至18kD或12至18kD或4至12kD或10至12kD或4至10kD。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所使用羥乙基淀粉的平均分子量范圍在4kD以上及70kD以下，例如約10kD，或在9至10kD或10至11kD或9至11kD的范圍內(nèi)，或約12kD，或在11至12kD或12至13kD或11至13kD的范圍內(nèi)，或約18kD，或在約17至18kD或18至19kD或17至19kD的范圍內(nèi)，或約50kD，或在49至50kD或50至51kD或49至51kD的范圍內(nèi)。關(guān)于取代程度(DS)，DS優(yōu)選為至少0.1，更優(yōu)選至少0.2，更優(yōu)選至少0.4。DS的優(yōu)選范圍是0.1至0.8，更優(yōu)選0.2至0.8，更優(yōu)選0.3至0.8，甚至更優(yōu)選0.4至0.8，再更優(yōu)選0.1至0.7，更優(yōu)選0.2至0.7，更優(yōu)選0.3至0.7，更優(yōu)選0.4至0.7。特別優(yōu)選的DS值為例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，更優(yōu)選0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，甚至更優(yōu)選0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，再更優(yōu)選0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，特別優(yōu)選例如0.4和0.7。羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉的分子量和其取代程度DS的特別優(yōu)選組合是例如10kD和0.4或10kD和0.7或12kD和0.4或12kD和0.7或18kD和0.4或18kD和0.7或50kD和0.4或50kD和0.7。在本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，羥乙基淀粉(所使用以及包含在本文所述偶聯(lián)物中)的分子量為約20kD至約130kD(即約40kD、約50kD、約60kD、約70kD、約80kD、約90kD、約100kD、約110kD、約120kD、約130kD)，優(yōu)選平均分子量為約30kD至約100kD，更優(yōu)選約40至約70kD，取代程度為0.4至0.8，更優(yōu)選0.5至0.8。本文中術(shù)語″約30kD″理解為是指平均分子量在25kD至34kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為26、27、28、29、31、32、33或34kD的淀粉。本文中術(shù)語″約40kD″理解為是指平均分子量在35kD至44kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為36、37、38、39、41、42、43或44kD的淀粉。本文中術(shù)語″約50kD″理解為是指平均分子量在45kD至54kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為46、47、48、49、51、52、53或54kD的淀粉。本文中術(shù)語″約60kD″理解為是指平均分子量在55kD至64kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為56、57、58、59、61、62、63或64kD的淀粉。本文中術(shù)語″約70kD″理解為是指平均分子量在65kD至74kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為66、67、68、69、71、72、73或74kD的淀粉。本文中術(shù)語″約80kD″理解為是指平均分子量在75kD至84kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為76、77、78、79、81、82、83或84kD的淀粉。本文中術(shù)語″約90kD″理解為是指平均分子量在85kD至94kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為86、87、88、89、91、92、93或94kD的淀粉。本文中術(shù)語″約100kD″理解為是指平均分子量在95kD至104kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為96、97、98、99、101、102、103或104kD的淀粉。本文中術(shù)語″約110kD″理解為是指平均分子量在105kD至114kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為106、107、108、109、111、112、113或114kD的淀粉。本文中術(shù)語″約120kD″理解為是指平均分子量在115kD至124kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為116、117、118、119、121、122、123或124kD的淀粉。本文中術(shù)語″約130kD″理解為是指平均分子量在125kD至134kD的范圍內(nèi)，即也包括平均分子量為126、127、128、129、131、132、133或134kD的淀粉。因此上述實(shí)施方案包括平均分子量約30kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此上述實(shí)施方案中也包括平均分子量約40kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約50kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約60kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約70kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約80kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約90kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約100kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約110kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約120kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。因此，上述實(shí)施方案也包括平均分子量約130kD，取代程度為0.4或0.5或0.6或0.7或0.8，優(yōu)選為0.6、0.7或0.8的羥乙基淀粉(和本文所述包含該羥乙基淀粉的偶聯(lián)物以及本文所述使用該羥乙基淀粉的方法)。平均分子量約130kD的HES的實(shí)例是取代程度為0.2至0.8，如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，優(yōu)選0.4至0.7，如0.4、0.5、0.6或0.7的HES。關(guān)于C2∶C6取代比例，該取代比例優(yōu)選為2至20的范圍內(nèi)，更優(yōu)選2至15，甚至更優(yōu)選3至12。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，也可使用平均分子量不同和/或取代程度不同和/或C2∶C6取代比例不同的羥乙基淀粉的混合物。因此，所使用的羥乙基淀粉的混合物可具有不同平均分子量和不同取代程度和不同C2∶C6取代比例，或具有不同平均分子量和不同取代程度和相同或大約相同的C2∶C6取代比例，或具有不同平均分子量和相同或大約相同的取代程度和不同C2∶C6取代比例，或具有相同或大約相同的平均分子量和不同取代程度和不同C2∶C6取代比例，或具有不同平均分子量和相同或大約相同的取代程度和相同或大約相同的C2∶C6取代比例，或具有相同或大約相同的平均分子量和不同取代程度和相同或大約相同的C2∶C6取代比例，或具有相同或大約相同的平均分子量和相同或大約相同的取代程度和不同C2∶C6取代比例，或具有大約相同的平均分子量和大約相同的取代程度和大約相同的C2∶C6取代比例。根據(jù)本發(fā)明的不同偶聯(lián)物和/或不同方法，可使用不同羥烷基淀粉，優(yōu)選不同羥乙基淀粉和/或不同羥烷基淀粉的混合物，優(yōu)選不同羥乙基淀粉的混合物。根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案，蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為醛基或酮基。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為醛基或酮基。雖然蛋白質(zhì)中的醛或酮基的位置一般沒有限制，但根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，醛或酮基位于蛋白質(zhì)的碳水化合物側(cè)鏈。因此，該實(shí)施方案采用糖基化蛋白質(zhì)。可使用任何糖基化G-CSF，如Granocyte作為糖基化蛋白質(zhì)。在本
發(fā)明內(nèi)容中，術(shù)語″碳水化合物側(cè)鏈″是指羥基醛或羥基酮及其化學(xué)修飾(參見RmppChemielexikon，ThierneVerlagStuttgart，Germany，第9版1990，Vol.9，p.2281-2285和其中引用的文獻(xiàn))。此外，其也指天然碳水化合物部分(如半乳糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-乙酰半乳糖胺)等的衍生物。如果使用N-糖基化的G-CSF突變體，其碳水化合物部分可以是甘露糖。在一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，醛基或酮基是碳水化合物側(cè)鏈的半乳糖殘基的一部份。通過除去末端唾液酸，該半乳糖殘基可與包含在聚合物或聚合物衍生物中的官能團(tuán)A反應(yīng)，然后如下文所述進(jìn)行氧化。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，包含官能團(tuán)A的聚合物或聚合物衍生物連接碳水化合物側(cè)鏈的唾液酸殘基，優(yōu)選碳水化合物側(cè)鏈的末端唾液酸殘基。末端碳水化合物部分的氧化可通過化學(xué)或酶方式進(jìn)行。多肽的碳水化合物部分的化學(xué)氧化方法在本領(lǐng)域公知，包括用高碘酸鹽處理(Chamow等人1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。通過化學(xué)氧化，原則上可以氧化位于末端或非末端的任何碳水化合物部分。然而，通過選擇溫和反應(yīng)條件，優(yōu)選地可以氧化碳水化合物側(cè)鏈的末端唾液酸，產(chǎn)生醛基或酮基。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，所述溫和反應(yīng)條件是指蛋白質(zhì)與適當(dāng)高碘酸鹽水溶液的反應(yīng)條件如下優(yōu)選高碘酸鹽濃度范圍在1至50mM，更優(yōu)選1至25mM，特別優(yōu)選1至10mM，如約1mM，優(yōu)選反應(yīng)溫度為0至40℃，特別優(yōu)選0至21℃，如約0℃，優(yōu)選反應(yīng)時間為5分鐘至5小時，更優(yōu)選10分鐘至2小時，特別優(yōu)選10分鐘至1小時，如約1小時。高碘酸鹽∶蛋白質(zhì)的優(yōu)選摩爾比為1∶200至1∶1，更優(yōu)選1∶50至1∶5，如約15∶1。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中在蛋白質(zhì)與聚合物或聚合物衍生物反應(yīng)之前，先由糖基化蛋白質(zhì)與高碘酸鹽溶液反應(yīng)，產(chǎn)生在氧化的碳水化合物側(cè)鏈上具有醛基或酮基的蛋白質(zhì)?；蛘撸妓衔飩?cè)鏈可經(jīng)酶氧化。用于氧化各碳水化合物側(cè)鏈的酶在本領(lǐng)域公知，例如對于半乳糖，其酶為半乳糖氧化酶。如果多肽已在可使唾液酸連接在碳水化合物鏈上的細(xì)胞如哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生，或在基因改造后可使唾液酸連接在碳水化合物鏈上的細(xì)胞中產(chǎn)生，如果需要氧化末端半乳糖部分，則最終必需(部份或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化學(xué)或酶方法在本領(lǐng)域公知(Chaplin和Kennedy(編輯)，1996，CarbohydrateAnalysisapracticalapproach，特別是第5章，Montreuill，Glycoproteins，p.175-177；IRLPressPracticalapproachseries(ISBN0-947946-44-3))。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，醛基或酮基可位于蛋白質(zhì)的N末端，并且可進(jìn)行適當(dāng)氧化反應(yīng)。尤其在包含羥基的氨基酸位于蛋白質(zhì)的N-末端時，如蘇氨酸或絲氨酸，可進(jìn)行該N-末端氨基酸的氧化反應(yīng)，形成所述酮基或醛基。蘇氨酸是人源G-CSF的N-末端氨基酸。另一個N-末端絲氨酸或蘇氨酸可通過分子生物學(xué)方法引入任何顯示G-CSF樣活性的蛋白質(zhì)中。該蛋白質(zhì)或表達(dá)人類氨基酸序列的蛋白質(zhì)可在原核或真核細(xì)胞，如細(xì)菌、哺乳動物、昆蟲或酵母細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生，并且可經(jīng)或不經(jīng)糖基化。可采用任何適合的方法作為合適N-末端氨基酸的化學(xué)氧化法，優(yōu)選用高碘酸鹽氧化。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述溫和反應(yīng)條件是指蛋白質(zhì)與合適的高碘酸鹽水溶液的反應(yīng)條件如下優(yōu)選高碘酸鹽濃度范圍為1至50mM，更優(yōu)選1至25mM，特別優(yōu)選1至10mM，如大約1mM，優(yōu)選反應(yīng)溫度為0至40℃，特別優(yōu)選0至21℃，如大約0℃，優(yōu)選反應(yīng)時間為5分鐘至5小時，更優(yōu)選10分鐘至2小時，特別優(yōu)選10分鐘至1小時，如大約1小時。高碘酸鹽∶蛋白質(zhì)的優(yōu)選摩爾比為1∶200至1∶1，更優(yōu)選1∶50至1∶5，如大約15∶1。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中醛基或酮基位于蛋白質(zhì)的碳水化合物側(cè)鏈和/或蛋白質(zhì)的N-末端基團(tuán)處。因此，在真核細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的寡糖模式已在翻譯后糖基化，與人源蛋白質(zhì)不同。此外，許多糖基化蛋白質(zhì)并沒有所需數(shù)量的末端唾液酸殘基來遮蔽其它碳水化合物部分，如半乳糖殘基。然而，這些其它碳水化合物部分，如半乳糖殘基，如果未被遮蔽，則可能會存在一些缺點(diǎn)，例如，在該蛋白質(zhì)作為藥物的用途中，該蛋白質(zhì)的血漿半衰期可能會縮短?，F(xiàn)已驚人地發(fā)現(xiàn)，通過提供一種由羥烷基淀粉聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉聚合物形成的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，該聚合物通過例如下文所述的肟連接，直接或通過至少一個連接化合物，如一個或兩個連接化合物，與蛋白質(zhì)的碳水化合物側(cè)鏈中碳水化合物部分共價連接，可以克服至少一項(xiàng)上述缺點(diǎn)。因此，認(rèn)為通過將羥烷基淀粉聚合物或其衍生物，優(yōu)選羥乙基淀粉聚合物或其衍生物，與糖基化蛋白質(zhì)的至少一條碳水化合物側(cè)鏈偶聯(lián)，可彌補(bǔ)碳水化合物側(cè)鏈所缺乏的合適末端碳水化合物殘基。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供一種由羥烷基淀粉聚合物或其衍生物，優(yōu)選羥乙基淀粉聚合物或其衍生物，與如上述氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)的偶聯(lián)物，不僅可彌補(bǔ)上述缺點(diǎn)，而且所提供的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物在所需應(yīng)用領(lǐng)域上，具有比天然蛋白質(zhì)更好的特性。因此，本發(fā)明的各偶聯(lián)物對蛋白質(zhì)具有彌補(bǔ)，甚至增效的效果。甚至與人類蛋白質(zhì)相同或本身是人類蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)也可能在天然碳水化合物部分不具有所需數(shù)量的合適遮蔽末端碳水化合物殘基，如唾液酸殘基。此時，所提供由羥烷基淀粉聚合物或其衍生物，優(yōu)選羥乙基淀粉聚合物或其衍生物與如上所述氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)形成的各偶聯(lián)物不僅可克服及彌補(bǔ)人工制備的蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)，而且可改善天然蛋白質(zhì)的特性。關(guān)于羥烷基淀粉優(yōu)選羥乙基淀粉或其衍生物用于與蛋白質(zhì)的氧化的碳水化合物部分中醛基或酮基偶聯(lián)的官能團(tuán)，可提到下文中所揭示的官能團(tuán)A。該一般概念不僅適用于糖基化G-CSF，原則上也適用于所有缺乏末端碳水化合物殘基的糖基化蛋白質(zhì)。其中可提到促紅細(xì)胞生成素(EPO)、干擾素β1a(IFNβ1a)、ATIII、因子VII、因子VIII、因子IX、α-抗胰蛋白酶(A1AT)、htPA或GM-CSF。因此，本發(fā)明也涉及羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉，或其衍生物在彌補(bǔ)蛋白質(zhì)中天然或翻譯后連接的碳水化合物部分所缺乏的末端碳水化合物殘基，優(yōu)選唾液酸殘基上的用途，這是通過將淀粉或其衍生物與具有至少一個酮基或醛基的蛋白質(zhì)中至少一個氧化的碳水化合物部分共價偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)的。因此，本發(fā)明也涉及一種彌補(bǔ)在蛋白質(zhì)中天然或翻譯后連接的碳水化合物部分上所缺乏的末端碳水化合物殘基，優(yōu)選唾液酸殘基的方法，這是通過將羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉或其衍生物與具有至少一個酮基或醛基的蛋白質(zhì)的至少一個氧化的碳水化合物部分共價偶聯(lián)，優(yōu)選通過肟連接共價偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)的。此外，本發(fā)明也涉及一種由羥烷基淀粉，優(yōu)選羥乙基淀粉，或其衍生物，與蛋白質(zhì)的至少一個氧化的碳水化合物部分共價連接所形成的偶聯(lián)物，該蛋白質(zhì)從天然來源中分離或在真核細(xì)胞如哺乳動物、昆蟲或酵母細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生，該碳水化合物部分具有至少一個酮基或醛基，其中該偶聯(lián)物在所需領(lǐng)域的用途中，優(yōu)選作為藥物的用途中，具有與各種未修飾的蛋白質(zhì)相同或更優(yōu)的特性。如果蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為醛基或酮基，聚合物或其衍生物的官能團(tuán)A包含如結(jié)構(gòu)式-NH-的氨基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中可與聚合物中任選氧化的還原端反應(yīng)的官能團(tuán)A包含結(jié)構(gòu)式-NH-的氨基。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，該官能團(tuán)A為具有結(jié)構(gòu)式R′-NH-的基團(tuán)，其中R′是氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基，其中環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可直接連接NH基團(tuán)，或根據(jù)另一實(shí)施方案，可通過氧橋連接NH基團(tuán)。烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可被適當(dāng)取代。優(yōu)選取代基可以是鹵素，如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選的是氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選具有1、2、3、4、5或6個碳原子的基團(tuán)。更優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中R′是氫或甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)A具有結(jié)構(gòu)R′-NH-R″-，其中R″優(yōu)選包含結(jié)構(gòu)單位-NH-和/或結(jié)構(gòu)單位-(C＝G)-，其中G為O或S，和/或結(jié)構(gòu)單位-SO2-。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)R″選自和其中如果G出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S。因此，包含氨基-NH2的優(yōu)選官能團(tuán)A是，例如H2N-其中G為O或S，并且如果出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S，且R′為甲基。包含氨基的特別優(yōu)選的官能團(tuán)A是氨基氧基特別優(yōu)選H2N-O-，及酰肼基其中G優(yōu)選為O。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z是醛基或酮基，官能團(tuán)A是氨基氧基或酰肼基。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，A是氨基氧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z是醛基或酮基，官能團(tuán)A是氨基氧基或酰肼基。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，A是氨基氧基。當(dāng)聚合物或聚合物衍生物的氨基氧基與蛋白質(zhì)的醛基或酮基反應(yīng)時，形成肟連接。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)與聚合物或聚合物衍生物之間的共價連接是蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z(該官能團(tuán)Z為醛基或酮基)與聚合物或聚合物衍生物的官能團(tuán)A(該官能團(tuán)A為氨基氧基)反應(yīng)所形成的肟連接。當(dāng)聚合物或聚合物衍生物的酰肼基與蛋白質(zhì)的醛基或酮基反應(yīng)時，形成腙連接。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)與聚合物或其聚合物衍生物之間的共價連接是蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z(該官能團(tuán)Z為醛基或酮基)與聚合物或聚合物衍生物的官能團(tuán)A(該官能團(tuán)A為酰肼基)反應(yīng)所形成的腙連接。為了向聚合物中引入官能團(tuán)A，只要產(chǎn)生包含官能團(tuán)A的聚合物衍生物，沒有明確限制。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，通過使聚合物與至少雙官能化合物反應(yīng)將官能團(tuán)A引入聚合物中，其中一個官能團(tuán)可與聚合物中至少一個官能團(tuán)反應(yīng)，至少雙官能化合物中至少另一個官能團(tuán)是官能團(tuán)A或者可經(jīng)化學(xué)修飾形成官能團(tuán)A。根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，聚合物與至少雙官能化合物在其任選氧化的還原端反應(yīng)。如果聚合物與其未氧化還原端反應(yīng)時，該聚合物優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)其中式(I)中包括未氧化還原端的醛型。如果聚合物與其氧化的還原端反應(yīng)時，該聚合物優(yōu)選具有如式(IIa)的結(jié)構(gòu)和/或如式(IIb)的結(jié)構(gòu)。聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉的還原端的氧化反應(yīng)可根據(jù)產(chǎn)生具有上述結(jié)構(gòu)(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法組合進(jìn)行。雖然氧化可根據(jù)所有產(chǎn)生羥烷基淀粉的氧化的還原端的合適一種或多種方法進(jìn)行，但優(yōu)選利用如DE19628705A1所述的堿性碘溶液進(jìn)行，該文獻(xiàn)的內(nèi)容(實(shí)施例A，第9欄，第6至24行)在此引入作為參考?？梢允褂每膳c羥烷基淀粉的任選氧化的還原端形成化學(xué)鍵的各官能團(tuán)作為可與聚合物中任選氧化的還原端反應(yīng)的至少雙官能化合物的官能團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，該官能團(tuán)包含化學(xué)結(jié)構(gòu)-NH-。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng))包含結(jié)構(gòu)-NH-。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述至少雙官能化合物的該官能團(tuán)是具有結(jié)構(gòu)R′-NH-的基團(tuán)，其中R′為氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基，其中環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可直接連接NH基團(tuán)，或者根據(jù)另一實(shí)施方案，可通過氧橋連接NH基團(tuán)。該烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可適當(dāng)取代。優(yōu)選的取代基可提及鹵素，如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選的是氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選含1、2、3、4、5或6個碳原子的基團(tuán)。更優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中R′為氫或甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，至少雙官能化合物的官能團(tuán)具有結(jié)構(gòu)R′-NH-R″-，其中R″優(yōu)選包含結(jié)構(gòu)單位-NH-和/或結(jié)構(gòu)單位-(C＝G)-，其中G為O或S，和/或結(jié)構(gòu)單位-SO2-。根據(jù)更優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)R″選自和其中如果G出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng))選自H2N-其中G為O或S，并且如果出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S，R′為甲基。根據(jù)本發(fā)明一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng)，且包含氨基)是氨基氧基特別優(yōu)選H2N-O-，或者是酰肼基其中G優(yōu)選為O。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為醛基或酮基，且該至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng))為氨基氧基或酰肼基，優(yōu)選氨基氧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為醛基或酮基，且該至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng))為氨基氧基或酰肼基，優(yōu)選氨基氧基。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，該至少雙官能化合物與聚合物的未氧化的還原端反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng)的至少雙官能化合物包含官能團(tuán)A。該至少雙官能化合物可先與聚合物反應(yīng)，產(chǎn)生的聚合物衍生物繼續(xù)通過官能團(tuán)A與蛋白質(zhì)反應(yīng)。也可能該至少雙官能化合物首先通過官能團(tuán)A與蛋白質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)衍生物繼續(xù)通過包含在蛋白質(zhì)衍生物中至少雙官能化合物殘基的至少一個官能團(tuán)與聚合物反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，該至少雙官能化合物首先與聚合物反應(yīng)。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，該方法還包括聚合物的未氧化的還原端先與包含可與聚合物的未氧化還原端反應(yīng)的官能團(tuán)與基團(tuán)A的至少雙官能連接化合物反應(yīng)，然后包含A的聚合物衍生物與包含Z的蛋白質(zhì)反應(yīng)?？衫萌魏魏线m的間隔基分隔可與聚合物反應(yīng)的至少雙官能連接化合物的官能團(tuán)與可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的至少雙官能連接化合物的官能團(tuán)A。其中間隔基可為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。通常，烴殘基具有至多60個碳原子，優(yōu)選至多40個，更優(yōu)選至多20個，更優(yōu)選至多10個，更優(yōu)選至多6個，特別優(yōu)選至多4個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個雜原子，優(yōu)選1至8個，更優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至4個，特別優(yōu)選1至2個雜原子。優(yōu)選O作為雜原子。烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)本發(fā)明一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)利用具有4個碳原子的直鏈烴鏈分隔。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)利用具有4個碳原子和至少一個，優(yōu)選一個雜原子，特別優(yōu)選一個氧原子的直鏈烴鏈分隔。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該至少雙官能連接化合物是均雙官能連接化合物。因此，本發(fā)明也涉及一種制備如上所述偶聯(lián)物的方法，其中該至少雙官能連接化合物是均雙官能化合物。因此，對于連接化合物的上述優(yōu)選官能團(tuán)，所述均雙官能連接化合物優(yōu)選包含兩個氨基氧基H2N-O-或兩個氨基氧基R′-O-NH-或兩個酰肼基H2N-NH-(C＝G)-，優(yōu)選氨基氧基H2N-O-和酰肼基H2N-NH-(C＝O)-，特別優(yōu)選氨基氧基H2N-O-。在含有兩個酰肼基H2N-NH-(C＝O)-的所有可能均雙官能化合物中，優(yōu)選酰肼，其中兩個酰肼基利用烴殘基分隔，該烴殘基具有至多60個，優(yōu)選至多40個，更優(yōu)選至多20個，更優(yōu)選至多10個，更優(yōu)選至多6個，特別優(yōu)選至多4個碳原子。更優(yōu)選地，該烴殘基具有1至4個碳原子，如1、2、3或4個碳原子。最優(yōu)選地，該烴殘基具有4個碳原子。因此，優(yōu)選如下式的均雙官能化合物。根據(jù)本發(fā)明一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，雙官能連接化合物是碳酰肼如上所述，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該至少雙官能連接化合物是均雙官能化合物且包含兩個氨基氧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該至少雙官能連接化合物是均雙官能化合物且包含兩個氨基氧基H2N-O-。如上所述，聚合物優(yōu)選地在其反應(yīng)前未氧化的還原端與雙官能連接化合物反應(yīng)。因此，包含兩個氨基氧基H2N-O-的優(yōu)選均雙官能化合物與聚合物反應(yīng)，產(chǎn)生包含肟連接的聚合物衍生物。因此，由于蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z是優(yōu)選與聚合物衍生物的氨基氧基反應(yīng)的醛或酮基，因此本發(fā)明也涉及如上所述的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含聚合物和蛋白質(zhì)，分別利用肟或環(huán)狀縮醛胺連接共價連接連接化合物。在包含兩個氨基氧基H2N-O-的所有可能的均雙官能化合物中，優(yōu)選如下雙官能化合物，其中兩個氨基氧基利用烴殘基分隔，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選1至10個，更優(yōu)選1至6個，特別優(yōu)選1至4個碳原子。更優(yōu)選地，該烴殘基具有1至4個碳原子，如1、2、3或4個碳原子。最優(yōu)選地，該烴殘基具有4個碳原子。甚至更優(yōu)選地，該烴殘基具有至少一個雜原子，更優(yōu)選一個雜原子，最優(yōu)選一個氧原子。特別優(yōu)選如下式的化合物O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羥胺。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或HAS′優(yōu)選為HES′。特別優(yōu)選的羥乙基淀粉是例如平均分子量約10kD且DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD且DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD且DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD且DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD且DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD且DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD且DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD且DS約0.7的羥乙基淀粉。聚合物的未氧化還原端與連接化合物的反應(yīng)優(yōu)選在水性系統(tǒng)中進(jìn)行，特別是在該連接化合物是包含兩個氨基氧基H2N-O-的均雙官能連接化合物時。用于本發(fā)明的術(shù)語″水性系統(tǒng)″是指溶劑或溶劑混合物中的含水量為占所涉及溶劑重量的至少10％重量比，優(yōu)選至少50％重量比，更優(yōu)選至少80％重量比，甚至更優(yōu)選至少90％重量比，或者可達(dá)100％重量比。優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)是水。根據(jù)另一個實(shí)施方案，可以使用至少另一種可溶解HAS，優(yōu)選HES的溶劑。這些溶劑的實(shí)例是例如DMF、二甲基乙酰胺或DMSO。反應(yīng)期間所采用的溫度沒有明確限制，只要反應(yīng)產(chǎn)生所需的聚合物衍生物即可。如果聚合物與包含兩個氨基氧基H2N-O-的均雙官能連接化合物，優(yōu)選O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羥胺反應(yīng)，溫度優(yōu)選為0至45℃，更優(yōu)選4至30℃，特別優(yōu)選15至25℃。聚合物與包含兩個氨基氧基H2N-O-的均雙官能連接化合物，優(yōu)選O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羥胺的反應(yīng)時間可根據(jù)具體需要調(diào)整，通常在1小時至7天的范圍內(nèi)，優(yōu)選1小時至3天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選2小時至48小時。聚合物與包含兩個氨基氧基H2N-O-的均雙官能連接化合物，優(yōu)選O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羥胺的反應(yīng)pH值可根據(jù)具體需要調(diào)整，如反應(yīng)物的化學(xué)性質(zhì)。pH值優(yōu)選為4.5至9.5，更優(yōu)選4.5至6.5。上述反應(yīng)條件的具體實(shí)例是例如反應(yīng)溫度約25℃，及pH約5.5。反應(yīng)混合物的合適pH值可通過添加至少一種合適緩沖液來調(diào)節(jié)。優(yōu)選的緩沖液可提及乙酸鈉緩沖液、磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液。一旦形成包含聚合物和與之連接的雙官能連接化合物的聚合物衍生物，即可采用至少一種合適的方法，從反應(yīng)混合物中分離。必要時，該聚合物衍生物可先沉淀，再采用至少一種合適方法分離。如果先使聚合物衍生物沉淀，則可能例如在合適溫度下，使反應(yīng)混合物與至少一種不同于反應(yīng)混合物中溶劑或溶劑混合物的溶劑或溶劑混合物接觸。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，其中使用水性介質(zhì)，優(yōu)選水作為溶劑，反應(yīng)混合物與2-丙醇在優(yōu)選-20至+50℃，特別優(yōu)選-20至25℃的溫度下接觸。聚合物衍生物的分離可以采用可包括一個或多個步驟的合適方法進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，首先利用合適的方法，如離心或過濾法，從反應(yīng)混合物或反應(yīng)混合物與例如2-丙醇水性混合物的混合物中分離聚合物衍生物。第二步，分離的聚合物衍生物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游?、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或冷凍干燥等后處理。根據(jù)本發(fā)明一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，首先優(yōu)選相對于水透析所分離的聚合物衍生物，然后冷凍干燥，直到反應(yīng)產(chǎn)物的溶劑含量足夠低，符合產(chǎn)物所需要求。冷凍干燥可在20至35℃，優(yōu)選20至30℃的溫度下進(jìn)行。所分離的聚合物衍生物再進(jìn)一步通過官能團(tuán)A與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)，其中Z為醛基或酮基。在A是氨基氧基H2N-O-，可在聚合物衍生物與蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生肟連接的特別優(yōu)選的例子中，反應(yīng)優(yōu)選在水性介質(zhì)中，優(yōu)選在水中，優(yōu)選在0至40℃，更優(yōu)選4至25℃，特別優(yōu)選15至25℃的溫度下進(jìn)行。反應(yīng)介質(zhì)的優(yōu)選pH值為4至10，更優(yōu)選5至9，特別優(yōu)選5至7。反應(yīng)時間優(yōu)選為1至72小時，更優(yōu)選1至48小時，特別優(yōu)選4至24小時。偶聯(lián)物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游?、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或冷凍干燥等后處理。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為氨基。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為氨基。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，與作為官能團(tuán)Z的氨基反應(yīng)的官能團(tuán)A是反應(yīng)性羧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團(tuán)Z為氨基，聚合物或聚合物衍生物的官能團(tuán)A是反應(yīng)性羧基。根據(jù)本發(fā)明第一個優(yōu)選實(shí)施方案，反應(yīng)性羧基通過在還原端選擇性氧化聚合物而引入該聚合物中。因此，要引入反應(yīng)性羧基的聚合物優(yōu)選具有如式(IIa)和/或如式(IIb)的結(jié)構(gòu)。如式(I)的聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉的還原端的氧化可根據(jù)產(chǎn)生上述結(jié)構(gòu)(IIa)和/或(IIb)的各方法或方法組合進(jìn)行。雖然氧化可根據(jù)所有可產(chǎn)生羥烷基淀粉的氧化的還原端的合適一種或多種方法進(jìn)行，但優(yōu)選采用如DE19628705A1所述的堿性碘溶液法進(jìn)行，其內(nèi)容(實(shí)施例A，第9欄，第6至24行)在此引用作為參考?？刹捎盟锌尚械姆椒▽⒎磻?yīng)性羧基引入其還原端已選擇性氧化的聚合物中。氧化的聚合物可以這樣使用或者作為鹽使用，如堿金屬鹽，優(yōu)選鈉鹽和/或鉀鹽。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選方法，其還原端已選擇性氧化的聚合物在氧化的還原端與至少一種醇反應(yīng)，優(yōu)選與至少一種酸性醇反應(yīng)。進(jìn)一步優(yōu)選的是25℃的PKA值為6至12，更優(yōu)選7至11的酸性醇。酸性醇的分子量優(yōu)選為80至500克/摩爾，更優(yōu)選90至300克/摩爾，特別優(yōu)選100至200克/摩爾。合適的酸性醇是所有具有酸性質(zhì)子并且可與氧化的聚合物反應(yīng)形成各反應(yīng)性聚合物酯的H-O-RA醇，其優(yōu)選如下式更優(yōu)選如下式優(yōu)選的醇類是N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。所有醇類均可單獨(dú)使用或者作為兩種或多種的適當(dāng)組合使用。在本
發(fā)明內(nèi)容中，也可能使用例如通過添加碳酸的二酯而釋放各醇的化合物。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原端被選擇性氧化的聚合物通過氧化的聚合物與酸性醇，優(yōu)選與N-羥基琥珀酰亞胺和/或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)而活化。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，其還原端被選擇性氧化的聚合物在氧化的還原端與至少一種碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-RC反應(yīng)，其中RB與RC可相同或不同。優(yōu)選地，該方法產(chǎn)生如下式的反應(yīng)性聚合物其中HAS′優(yōu)選為HES′。合適的碳酸二酯化合物可使用其醇成分獨(dú)立地是下列成分的化合物N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中在還原端被選擇性氧化的聚合物通過氧化的聚合物與N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯反應(yīng)而活化。酸性醇與氧化的聚合物或氧化的聚合物的鹽反應(yīng)，酸性醇∶聚合物的摩爾比優(yōu)選為5∶1至50∶1，更優(yōu)選8∶1至20∶1，反應(yīng)溫度優(yōu)選為2至40℃，更優(yōu)選10至30℃，特別優(yōu)選15至25℃。反應(yīng)時間優(yōu)選為1至10小時，更優(yōu)選2至5小時，更優(yōu)選2至4小時，特別是2至3小時。碳酸二酯化合物與氧化的聚合物或氧化的聚合物的鹽反應(yīng)，二酯化合物∶聚合物的摩爾比優(yōu)選為1∶1至3∶1，更優(yōu)選1∶1至1.5∶1。反應(yīng)時間優(yōu)選為0.1至12小時，更優(yōu)選0.2至6小時，更優(yōu)選0.5至2小時，特別是0.75至1.25小時。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，氧化的聚合物與酸性醇和/或碳酸二酯的反應(yīng)在至少一種非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行，特別優(yōu)選在水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。優(yōu)選反應(yīng)溫度為2至40℃，更優(yōu)選10至30℃。氧化的聚合物與至少一種酸性醇的反應(yīng)中還使用至少一種活化劑。合適的活化劑特別是羰基二咪唑、碳二亞胺如二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，特別優(yōu)選二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原端已氧化的聚合物與酸性醇在另一種活化劑的存在下反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)性聚合物酯。根據(jù)本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，氧化的聚合物與碳酸二酯和/或酸性醇的反應(yīng)在低堿活性下進(jìn)行，該活性可通過添加反應(yīng)混合物至水中來決定，其中水與反應(yīng)混合物的體積比為10∶1。添加之前，基本上不包含緩沖液的水在25℃下的pH值為7。添加反應(yīng)混合物后測定pH值，獲得反應(yīng)混合物的堿活性數(shù)值優(yōu)選為不超過9.0，更優(yōu)選不超過8.0，特別優(yōu)選不超過7.5。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，氧化的聚合物與N-羥基琥珀酰亞胺在無水DMA中，在沒有水的存在下，使用EDC反應(yīng)，選擇性產(chǎn)生如下式的聚合物N-羥基琥珀酰亞胺酯其中HAS′更優(yōu)選為HES′。令人驚訝的是，該反應(yīng)不產(chǎn)生因EDC與HES的OH基團(tuán)反應(yīng)而產(chǎn)生的副產(chǎn)物，并且意外地抑制了EDC與氧化聚合物所形成的O-酰基異脲形成各N-?；宓闹嘏欧磻?yīng)。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，氧化的聚合物與N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯在無水DMF中，在沒有活化劑的存在下反應(yīng)，選擇性產(chǎn)生如下式的聚合物N-羥基琥珀酰亞胺酯其中HAS′更優(yōu)選為HES′。上述反應(yīng)性聚合物最好進(jìn)一步與蛋白質(zhì)的至少一個氨基反應(yīng)，產(chǎn)生酰胺鍵。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，反應(yīng)性聚合物與蛋白質(zhì)的一個氨基反應(yīng)。因此，本發(fā)明涉及優(yōu)選具有如下式的結(jié)構(gòu)的偶聯(lián)物其中酰胺鍵的N原子來源于蛋白質(zhì)的氨基，其中HAS′更優(yōu)選為HES′，羥乙基淀粉優(yōu)選為平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。反應(yīng)性聚合物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)可通過組合制備反應(yīng)性聚合物的反應(yīng)混合物與蛋白質(zhì)的水溶液進(jìn)行，即不分離反應(yīng)性聚合物，其中包含至少10％重量比，更優(yōu)選至少30％，再更優(yōu)選至少50％重量比的反應(yīng)性聚合物。優(yōu)選的蛋白質(zhì)水溶液包含0.05至10％，更優(yōu)選0.5至5％，特別優(yōu)選0.5至2％重量比的蛋白質(zhì)，優(yōu)選pH為5.0至9.0，更優(yōu)選6.0至9.0，特別優(yōu)選7.5至8.5。根據(jù)本發(fā)明，也可能使用至少一種合適的沉淀劑，如無水乙醇、異丙醇和/或丙酮，通過至少一個，優(yōu)選多重沉淀法純化反應(yīng)性聚合物，產(chǎn)生包含至少10％，更優(yōu)選至少30％，再更優(yōu)選至少50％重量比反應(yīng)性聚合物的固體。純化的反應(yīng)性聚合物可加至蛋白質(zhì)的水溶液中。也可能添加純化的反應(yīng)性聚合物溶液至蛋白質(zhì)的水溶液中。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，反應(yīng)性聚合物與蛋白質(zhì)產(chǎn)生酰胺鍵的反應(yīng)在2至40℃，更優(yōu)選5至35℃，特別是10至30℃的溫度下進(jìn)行，pH優(yōu)選為7.0至9.0，優(yōu)選7.5至9.0，特別優(yōu)選7.5至8.5，反應(yīng)時間優(yōu)選為0.1至12小時，更優(yōu)選0.5至5小時，更優(yōu)選0.5至3小時，再更優(yōu)選0.5至72小時，特別優(yōu)選0.5至1小時，反應(yīng)性聚合物酯∶蛋白質(zhì)的摩爾比優(yōu)選為1∶1至70∶1，更優(yōu)選5∶1至50∶1，特別優(yōu)選10∶1至50∶1。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，還原端選擇性氧化的聚合物在其氧化的還原端與唑化物(azolide)如羰基二咪唑或羰基二苯并咪唑反應(yīng)，產(chǎn)生具有反應(yīng)性羧基的聚合物。在羰基二咪唑的情況下，產(chǎn)生如下式的反應(yīng)性聚合物衍生物其中HAS′優(yōu)選為HES′。聚合物與唑化物反應(yīng)產(chǎn)生的咪唑化物(imidazolide)可優(yōu)先與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，產(chǎn)生酰胺鍵。如果蛋白質(zhì)存在羥基時，也可與羥基反應(yīng)產(chǎn)生酯鍵，或者與蛋白質(zhì)的硫基反應(yīng)產(chǎn)生硫酯鍵，或者如果蛋白質(zhì)存在羧基時，也可能與羧基反應(yīng)產(chǎn)生-(C＝O)-O-(C＝O)-連接。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，具有由聚合物的選擇性氧化的還原端與上述化合物之一，優(yōu)選與至少一種酸性醇類和/或至少一種碳酸二酯化合物反應(yīng)產(chǎn)生的反應(yīng)性羧基A的聚合物，可通過至少一種連接化合物連接到蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z。如果使用連接化合物，該化合物為至少雙官能化合物，其具有至少一個可與聚合物衍生物的官能團(tuán)A反應(yīng)的官能團(tuán)F1，以及至少一個可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的官能團(tuán)F2或經(jīng)化學(xué)修飾可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的官能團(tuán)F2。該化學(xué)修飾可以是例如官能團(tuán)F2與另一種連接化合物的官能團(tuán)F3反應(yīng)，或氧化或還原合適的官能團(tuán)F2。如果使用至少一種連接化合物，該反應(yīng)不限于蛋白質(zhì)的氨基，而是根據(jù)一種或多種連接化合物的官能團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，其可用于與蛋白質(zhì)的各合適的官能團(tuán)如羧基、反應(yīng)性羧基、醛基、酮基、硫基、氨基或羥基形成連接。如果使用兩種連接化合物，所使用的第一種連接化合物具有至少一個可與聚合物的反應(yīng)性羧基A反應(yīng)的官能團(tuán)F1，如氨基、硫基、羥基或羧基。此外，該第一種連接化合物具有至少另一個可與第二連接化合物的至少一個官能團(tuán)F3反應(yīng)的官能團(tuán)F2。官能團(tuán)F2尤其可提到下列官能團(tuán)-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇；-1，2-氨基醇類；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根(triflate)；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)-基團(tuán)其中F3是可與上述基團(tuán)之一形成化學(xué)鍵的基團(tuán)，其優(yōu)選選自上述基團(tuán)。此外，第二連接化合物具有至少一個可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的官能團(tuán)，它是例如氨基、硫基、羧基、反應(yīng)性羧基、醛基、酮基或羥基。如果使用一種連接化合物共價連接聚合物與蛋白質(zhì)，則該聚合物可與連接化合物反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與蛋白質(zhì)反應(yīng)，或蛋白質(zhì)可與連接化合物反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與聚合物反應(yīng)。如果使用兩種連接化合物L(fēng)1與L2，可由聚合物與L1反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與L2反應(yīng)，并由所得聚合物衍生物與蛋白質(zhì)反應(yīng)，或由蛋白質(zhì)與L2反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與L1反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與聚合物反應(yīng)。也可由聚合物與L1反應(yīng)，由蛋白質(zhì)與L2反應(yīng)，再由聚合物衍生物與蛋白質(zhì)衍生物反應(yīng)。此外，也可由L1與L2反應(yīng)，所得化合物再與聚合物反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與蛋白質(zhì)反應(yīng)。此外，也可由L1與L2反應(yīng)，所得化合物再與蛋白質(zhì)反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與聚合物反應(yīng)。根據(jù)關(guān)于向聚合物中引入反應(yīng)性羧基的本發(fā)明第二個優(yōu)選實(shí)施方案，通過使聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)，將反應(yīng)性羧基引入還原端未氧化的聚合物中。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中A是反應(yīng)性羧基，并且其中通過聚合物的至少一個羥基與至少一種碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-RC(其中RB與RC可相同或不同)反應(yīng)，將A引入還原端未氧化的聚合物中。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，還原端未氧化的聚合物中至少一個羥基與唑化物如羰基二咪唑、羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反應(yīng)，產(chǎn)生具有反應(yīng)性羧基的聚合物。適用的碳酸二酯化合物可使用其醇成分分別獨(dú)立為下列成分的化合物N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選對稱性碳酸二酯化合物，因此RB與RC相同。碳酸二酯的醇成分優(yōu)選選自N-羥基琥珀酰亞胺、磺酸化N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑和硝基-及鹵素-取代的苯酚類。其中優(yōu)選硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚，特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯。因此，本發(fā)明也涉及一種羥烷基淀粉衍生物及其制備方法，優(yōu)選羥乙基淀粉衍生物，其中該淀粉的至少一個羥基，優(yōu)選至少兩個羥基已與碳酸二酯化合物反應(yīng)，產(chǎn)生各反應(yīng)性酯。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，還原端未氧化的聚合物與至少一種碳酸二酯化合物的反應(yīng)在2至40℃，更優(yōu)選10至30℃，特別是15至25℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選反應(yīng)時間為0.5至5小時，更優(yōu)選1至3小時，特別優(yōu)選2至3小時。碳酸二酯和/或唑化物，優(yōu)選碳酸二酯化合物∶聚合物的摩爾比取決于聚合物的取代程度，即與碳酸二酯化合物反應(yīng)的羥基數(shù)與未反應(yīng)的聚合物中羥基數(shù)的相對比例。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，碳酸二酯化合物∶無水葡萄糖單位的摩爾比為1∶2至1∶1000，更優(yōu)選1∶3至1∶100，特別優(yōu)選1∶10至1∶50，所產(chǎn)生的取代程度為0.5至0.001，優(yōu)選0.33至0.01，特別優(yōu)選0.1至0.02。取代程度通過紫外光譜法測定。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，還原端未氧化的聚合物與碳酸二酯的反應(yīng)在至少一種非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行，特別優(yōu)選在水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原端未氧化的聚合物中至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)產(chǎn)生反應(yīng)性酯基團(tuán)A的反應(yīng)在無水非質(zhì)子極性溶劑中進(jìn)行，該溶劑優(yōu)選為二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。包含至少一個反應(yīng)性酯基，優(yōu)選至少兩個反應(yīng)性酯基的反應(yīng)性聚合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生至少一個酰胺鍵，優(yōu)選至少兩個酰胺鍵的反應(yīng)可通過組合制備反應(yīng)性聚合物的反應(yīng)混合物與蛋白質(zhì)的水溶液進(jìn)行，即不分離反應(yīng)性聚合物，其中包含至少5％重量比，更優(yōu)選至少10，再更優(yōu)選至少15％重量比的反應(yīng)性聚合物。蛋白質(zhì)的優(yōu)選水溶液包含0.05至10％，更優(yōu)選0.5至5％，特別優(yōu)選0.5至2％重量比的蛋白質(zhì)，優(yōu)選pH為7.0至9，更優(yōu)選7.5至9，特別優(yōu)選7.5至8.5。根據(jù)本發(fā)明，也可能使用至少一種合適的沉淀劑，如無水乙醇、異丙醇和/或丙酮，通過至少一個，優(yōu)選多重沉淀純化反應(yīng)性聚合物，產(chǎn)生包含至少20％，更優(yōu)選至少50％，再更優(yōu)選至少80％重量比反應(yīng)性聚合物的固體。純化的反應(yīng)性聚合物可加至蛋白質(zhì)的水溶液中。也可能添加純化的反應(yīng)性聚合物溶液至蛋白質(zhì)的水溶液中。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，反應(yīng)性聚合物與蛋白質(zhì)產(chǎn)生至少一個，優(yōu)選至少二個酰胺鍵的反應(yīng)在2至40℃，更優(yōu)選5至35℃，特別優(yōu)選10至30℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選pH為7.0至9.0，優(yōu)選7.5至9.0，特別優(yōu)選7.5至8.5，優(yōu)選反應(yīng)時間為0.5至5小時，更優(yōu)選0.5至3小時，特別優(yōu)選0.5至1小時，反應(yīng)性聚合物酯∶蛋白質(zhì)的摩爾比優(yōu)選為1∶1至70∶1，更優(yōu)選5∶1至50∶1，特別優(yōu)選10∶1至50∶1。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，得到寡-或多蛋白質(zhì)-取代的聚合物，其中的蛋白質(zhì)分子通過酰胺鍵與聚合物連接。本
發(fā)明內(nèi)容中所采用的蛋白質(zhì)分子的取代程度(PDS)是指連接蛋白質(zhì)的葡萄糖部分相對于HAS，優(yōu)選HES中所含所有葡萄糖部分的比例。PDS范圍為0.001至1，優(yōu)選0.005至0.5，更優(yōu)選0.005至0.2。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，具有由聚合物的至少一個羥基與上述化合物之一，優(yōu)選至少一種碳酸二酯反應(yīng)產(chǎn)生的反應(yīng)性羧基A的聚合物，可通過至少一種連接化合物連接到蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z。如果使用連接化合物，該化合物是至少雙官能化合物，其具有至少一個可與聚合物衍生物的官能團(tuán)A反應(yīng)的官能團(tuán)F1，以及至少一個可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的官能團(tuán)F2或經(jīng)化學(xué)修飾可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的官能團(tuán)F2。該化學(xué)修飾可以是例如由官能團(tuán)F2與另一種連接化合物的官能團(tuán)F3反應(yīng)，或氧化或還原合適的官能團(tuán)F2。如果使用至少一種連接化合物，該反應(yīng)不限于蛋白質(zhì)的氨基，而是根據(jù)一種或多種連接化合物的官能團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，其可用于與蛋白質(zhì)的各合適官能團(tuán)如羧基、反應(yīng)性羧基、醛基、酮基、硫基、氨基或羥基形成連接。如果使用兩種連接化合物，所使用的第一種連接化合物具有至少一個可與聚合物的反應(yīng)性羧基A反應(yīng)的官能團(tuán)F1，如氨基、硫基、羥基或羧基。此外，該第一種連接化合物具有至少另一個可與第二連接化合物的至少一個官能團(tuán)F3反應(yīng)的官能團(tuán)F2。官能團(tuán)F2尤其可提到下列官能團(tuán)-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇；-1，2-氨基醇類；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)-基團(tuán)其中F3是可與上述基團(tuán)之一形成化學(xué)鍵的基團(tuán)，其優(yōu)選選自上述基團(tuán)。此外，第二連接化合物具有至少一個可與蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z反應(yīng)的官能團(tuán)，它是例如氨基、硫基、羧基、反應(yīng)性羧基、醛基、酮基或羥基。如果使用一種連接化合物共價連接聚合物與蛋白質(zhì)，則該聚合物可與連接化合物反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與蛋白質(zhì)反應(yīng)，或者蛋白質(zhì)可與連接化合物反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與聚合物反應(yīng)。如果使用兩種連接化合物L(fēng)1與L2，可由聚合物與L1反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與L2反應(yīng)，并由所得聚合物衍生物與蛋白質(zhì)反應(yīng)，或由蛋白質(zhì)與L2反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與L1反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與聚合物反應(yīng)。也可由聚合物與L1反應(yīng)，由蛋白質(zhì)與L2反應(yīng)，再由聚合物衍生物與蛋白質(zhì)衍生物反應(yīng)。此外，也可由L1與L2反應(yīng)，所得化合物再與聚合物反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與蛋白質(zhì)反應(yīng)。此外，也可由L1與L2反應(yīng)，所得化合物再與蛋白質(zhì)反應(yīng)，所得蛋白質(zhì)衍生物再與聚合物反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z是氨基，聚合物或其衍生物的官能團(tuán)A是醛基、酮基或半縮醛基。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)Z與官能團(tuán)A通過還原性胺化反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的還原性胺化反應(yīng)，其中聚合物或聚合物衍生物通過至少一個醛基或酮基或半縮醛基與蛋白質(zhì)的至少一個氨基共價連接，該反應(yīng)優(yōu)選在0至40℃，更優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選4至21℃的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選反應(yīng)時間為0.5至72小時，更優(yōu)選2至48小時，特別優(yōu)選4至7小時。優(yōu)選水性介質(zhì)作為反應(yīng)溶劑。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在4至21℃的溫度下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在水性介質(zhì)中進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在4至21℃的溫度下在水性介質(zhì)中進(jìn)行。用于本發(fā)明中的術(shù)語″水性介質(zhì)″是指一種溶劑或溶劑混合物，其中水含量占所涉及溶劑重量的至少10％重量比，更優(yōu)選至少20％重量比，更優(yōu)選至少30％重量比，更優(yōu)選至少40％重量比，更優(yōu)選至少50％重量比，更優(yōu)選至少60％重量比，更優(yōu)選至少70％重量比，更優(yōu)選至少80％重量比，甚至更優(yōu)選至少90％重量比或者可達(dá)100％重量比。優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)是水。反應(yīng)介質(zhì)的pH值一般為4至9或4至8或4至7.3。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，該還原性胺化的反應(yīng)pH低于7.3，更優(yōu)選小于或等于7，最優(yōu)選低于7，即在酸性范圍內(nèi)。因此，優(yōu)選范圍為3至低于7，更優(yōu)選3.5至6.5，再更優(yōu)選4至6，再更優(yōu)選4.5至5.5，特別優(yōu)選約5.0，即4.6或4.7或4.8或4.9或5.0或5.1或5.2或5.3或5.4。優(yōu)選范圍特別是3至6.9或3至6.5或3至6或3至5.5或3至5或3至4.5或3至4或3至3.5或3.5至6.9或3.5至6.5或3.5至6或3.5至5.5或3.5至5或3.5至4.5或3.5至4或4至6.9或4至6.5或4至6或4至5.5或4至5或4至4.5或4.5至6.9或4.5至6.5或4.5至6或4.5至5.5或4.5至5或5至6.9或5至6.5或5至6或5至5.5或5.5至6.9或5.5至6.5或5.5至6或6至6.9或6至6.5或6.5至6.9。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在pH7或以下，更優(yōu)選在pH6或以下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在4至21℃的溫度下，在pH7或以下，優(yōu)選6或以下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在pH7或以下，優(yōu)選6或以下的水性介質(zhì)中進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在4至21℃的溫度下，在pH7或以下，優(yōu)選6或以下的水性介質(zhì)中進(jìn)行。反應(yīng)所使用的聚合物衍生物∶蛋白質(zhì)的摩爾比優(yōu)選為200∶1至5∶1，更優(yōu)選100∶1至10∶1，特別優(yōu)選75∶1至20∶1。已驚人地發(fā)現(xiàn)，尤其在上述優(yōu)選pH范圍內(nèi)，特別在pH低于7且大于或等于4下，可由聚合物衍生物主要與位于蛋白質(zhì)N末端的氨基反應(yīng)。用于本發(fā)明中的術(shù)語″主要″涉及一個實(shí)施方案，其中至少80％，優(yōu)選至少85％的N-末端氨基可用于進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。也可能由至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的N-末端氨基反應(yīng)。雖然無法完全排除除了N-末端氨基以外的氨基進(jìn)行偶聯(lián)的可能性，但是認(rèn)為通過根據(jù)本發(fā)明在pH低于7，優(yōu)選低于6下的還原性胺化反應(yīng)所進(jìn)行的偶聯(lián)基本上選擇性地在N-末端氨基上進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)包含N-末端氨基和至少另一個氨基，該偶聯(lián)物包含的聚合物主要偶聯(lián)在N-末端氨基上。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種主要在蛋白質(zhì)的N-末端氨基上連接經(jīng)醛或酮基或半縮醛官能化的羥烷基淀粉或經(jīng)醛或酮基或半縮醛官能化的羥烷基淀粉衍生物的方法，該方法包括該羥烷基淀粉或其衍生物在pH7或以下，優(yōu)選pH6或以下進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)，該還原性胺化反應(yīng)優(yōu)選在水性介質(zhì)中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選經(jīng)醛官能化的羥烷基淀粉或經(jīng)醛官能化的羥烷基淀粉衍生物。根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種將醛或酮基或半縮醛官能化的羥烷基淀粉或醛或酮基或半縮醛官能化的羥烷基淀粉衍生物選擇性地連接到蛋白質(zhì)的N-末端氨基上的方法，該方法包括該羥烷基淀粉或其衍生物在pH7或以下，優(yōu)選pH6或以下進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)，該還原性胺化反應(yīng)優(yōu)選在水性介質(zhì)中進(jìn)行，所使用的羥乙基淀粉優(yōu)選為平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。聚合物衍生物與蛋白質(zhì)在醛基或酮基或半縮醛基與氨基之間的反應(yīng)是產(chǎn)生希夫氏堿的還原性胺化。該反應(yīng)后，該堿可用至少一種還原劑還原，在聚合物衍生物與蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生穩(wěn)定的連接。也可能在至少一種還原劑的存在下進(jìn)行該反應(yīng)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，該還原性胺化反應(yīng)在至少一種還原劑的存在下進(jìn)行。優(yōu)選的還原劑是硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、有機(jī)硼烷絡(luò)合物，如4-(二甲基胺)吡啶硼烷絡(luò)合物、N-乙基二異丙基胺硼烷絡(luò)合物、N-乙基嗎啉硼烷絡(luò)合物、N-甲基嗎啉硼烷絡(luò)合物、N-苯基嗎啉硼烷絡(luò)合物、二甲基吡啶硼烷絡(luò)合物、三乙胺硼烷絡(luò)合物或三甲胺硼烷絡(luò)合物。特別優(yōu)選氰基硼氫化鈉。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在NaCNBH3的存在下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在pH7或以下，優(yōu)選6或以下的水性介質(zhì)中，在還原劑，優(yōu)選NaCNBH3的存在下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原性胺化在4至21℃的溫度下，在pH7或以下，優(yōu)選6或以下的水性介質(zhì)中，在還原劑，優(yōu)選NaCNBH3的存在下進(jìn)行。反應(yīng)所使用的聚合物衍生物∶蛋白質(zhì)的摩爾比優(yōu)選為200∶1至10∶1，更優(yōu)選100∶1至10∶1，特別優(yōu)選75∶1至20∶1。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，該方法包括在還原劑的存在下，包含醛基的聚合物或聚合物衍生物在水性介質(zhì)中與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，該還原劑優(yōu)選為NaCNBH3。根據(jù)本發(fā)明第一個優(yōu)選實(shí)施方案，該聚合物包含至少兩個通過開環(huán)氧化反應(yīng)引入聚合物中的醛基，該聚合物優(yōu)選包含至少一個如下式的結(jié)構(gòu)根據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案，可以使用能夠氧化聚合物的至少一個糖環(huán)形成具有至少一個，優(yōu)選至少兩個醛基的開放糖環(huán)的氧化劑或氧化劑組合。該反應(yīng)用如下反應(yīng)圖說明，該圖示出聚合物的糖環(huán)經(jīng)氧化產(chǎn)生具有兩個醛基的開放環(huán)合適的氧化劑特別是高碘酸鹽，如堿金屬高碘酸鹽或其兩種或多種的混合物，優(yōu)選高碘酸鈉和高碘酸鉀。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中使用高碘酸鹽對該聚合物進(jìn)行開環(huán)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生具有至少一個，優(yōu)選至少兩個醛基的聚合物衍生物。在該氧化反應(yīng)中，可以使用具有氧化或未氧化型還原端的聚合物，優(yōu)選未氧化型。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中使用具有未氧化型還原端的聚合物。該反應(yīng)溫度的優(yōu)選范圍為0至40℃，更優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選0至5℃。反應(yīng)時間的優(yōu)選范圍為1分鐘至5小時，特別優(yōu)選10分鐘至4小時。根據(jù)所需的氧化程度，即根據(jù)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的醛基數(shù)量，可適當(dāng)選擇高碘酸鹽∶聚合物的摩爾比。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中開環(huán)氧化反應(yīng)在0至5℃的溫度下進(jìn)行。聚合物與高碘酸鹽的氧化反應(yīng)優(yōu)選在水性介質(zhì)中進(jìn)行，最優(yōu)選在水中進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中開環(huán)氧化反應(yīng)在水性介質(zhì)中進(jìn)行。反應(yīng)混合物的合適pH值可通過添加至少一種合適的緩沖液來調(diào)節(jié)。優(yōu)選的緩沖液可提到乙酸鈉緩沖液、磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液。進(jìn)行所述開環(huán)氧化反應(yīng)的羥乙基淀粉優(yōu)選為平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。所得聚合物衍生物可采用至少一種合適的方法從反應(yīng)混合物中純化。需要時，聚合物衍生物可先沉淀，之后再采用至少一種合適的方法分離。如果先使聚合物衍生物沉淀，則可例如將反應(yīng)混合物與至少一種不同于反應(yīng)混合物中溶劑或溶劑混合物的溶劑或溶劑混合物在合適的溫度下接觸。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，其中使用水性介質(zhì)，優(yōu)選水，作為溶劑，反應(yīng)混合物與2-丙醇或丙酮與乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1混合物(v/v)(表示等體積的所述化合物)，在優(yōu)選-20至+50℃，特別優(yōu)選-20至25℃的溫度下接觸。聚合物衍生物可采用合適的方法分離，該方法可包括一個或多個步驟。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，先采用合適的方法，如離心或過濾，從反應(yīng)混合物或反應(yīng)混合物與例如2-丙醇水性混合物的混合物中分離聚合物衍生物。第二步驟中，所分離的聚合物衍生物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游觥PLC、MPLC、凝膠過濾和/或凍干等后處理。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，所分離的聚合物衍生物先透析，優(yōu)選用水進(jìn)行透析，然后凍干，直到反應(yīng)產(chǎn)物的溶劑含量足夠低，符合產(chǎn)物所需的要求。凍干可在20至35℃，優(yōu)選20至30℃的溫度下進(jìn)行。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，氧化反應(yīng)產(chǎn)生的氧化聚合物采用至少一種合適的方法純化，如超濾和/或透析，以便例如除去不需要的低分子量鹽類和聚合物成分，從而也提供控制氧化聚合物的分子量范圍的方法。氧化的聚合物可直接用于與蛋白質(zhì)反應(yīng)或在第一步中適當(dāng)回收，例如利用凍干法回收，然后再溶于水中，用于在第二步中與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。關(guān)于蛋白質(zhì)的至少一個氨基與聚合物的至少一個醛基通過還原性胺化進(jìn)行的偶聯(lián)，可參見上述有關(guān)還原性胺化反應(yīng)的具體反應(yīng)參數(shù)如pH或溫度的詳細(xì)描述。根據(jù)第二個優(yōu)選實(shí)施方案，聚合物與至少雙官能化合物反應(yīng)，該至少雙官能化合物包含至少一個可與聚合物反應(yīng)的官能團(tuán)M和至少一個可與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)且為醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)Q。氧化的聚合物可直接用于與蛋白質(zhì)反應(yīng)或在第一步中適當(dāng)回收，例如利用凍干法回收，然后再溶于水中，用于在第二步中與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。關(guān)于蛋白質(zhì)的至少一個氨基與聚合物的至少一個醛基通過還原性胺化進(jìn)行的偶聯(lián)，可參見上述有關(guān)還原性胺化反應(yīng)的具體反應(yīng)參數(shù)如pH或溫度的詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，還原性胺化優(yōu)選在0至5℃，如大約4℃的溫度下，在約pH4.5至5.5，如大約5.0下進(jìn)行，反應(yīng)時間約20至30小時，如大約24小時。根據(jù)第二個優(yōu)選實(shí)施方案，聚合物與至少雙官能化合物反應(yīng)，該至少雙官能化合物包含至少一個可與聚合物反應(yīng)的官能團(tuán)M及至少一個可與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)且為醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)Q。優(yōu)選使用的化合物中除了醛基或酮基或半縮醛基外，還包含至少一個羧基或至少一個反應(yīng)性羧基，優(yōu)選一個羧基或一個反應(yīng)性羧基。該醛基或酮基或半縮醛基與該羧基或反應(yīng)性羧基可被任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。通常，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個，優(yōu)選1至8個，特別優(yōu)選1至4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，該烴殘基是具有5至7個，優(yōu)選6個碳原子的芳基殘基。該烴殘基最優(yōu)選地是苯殘基。根據(jù)該優(yōu)選實(shí)施方案，羧基和醛基可位于苯環(huán)1，4-位、1，3-位或1，2-位，優(yōu)選1，4-位。作為反應(yīng)性羧基，可提到反應(yīng)性酯、異硫氰酸酯或異氰酸酯。優(yōu)選的反應(yīng)性酯衍生自N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。所有醇類均可單獨(dú)使用或兩種或多種組合使用。特別優(yōu)選的反應(yīng)性酯是五氟苯基酯與N-羥基琥珀酰亞胺酯。因此，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物與甲酰基苯甲酸反應(yīng)。根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物與甲?；郊姿嵛宸交シ磻?yīng)。根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物與甲酰基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)。根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物與4-(4-甲?；?3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反應(yīng)。與包含M(其中M優(yōu)選的是羧基或反應(yīng)性羧基)和Q(其中Q是醛基或酮基或半縮醛基)的化合物反應(yīng)的羥乙基淀粉最優(yōu)選的是平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。也可能是平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。特別優(yōu)選地使用具有氧化型還原端的羥烷基淀粉，甚至更優(yōu)選羥乙基淀粉。所產(chǎn)生的具有醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物然后與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。關(guān)于蛋白質(zhì)的至少一個氨基與聚合物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基通過還原性胺化進(jìn)行的偶聯(lián)，可參見上述有關(guān)還原性胺化反應(yīng)的具體反應(yīng)參數(shù)如pH或溫度的詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，與蛋白質(zhì)的氨基的反應(yīng)優(yōu)選在0至40℃，更優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選4至21℃的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選反應(yīng)時間范圍為30分鐘至72小時，更優(yōu)選2至48小時，特別優(yōu)選4小時至17小時。反應(yīng)溶劑優(yōu)選水性介質(zhì)。反應(yīng)介質(zhì)的pH值優(yōu)選為4至9，更優(yōu)選4至8，特別優(yōu)選4.5至5.5。根據(jù)第三個優(yōu)選實(shí)施方案，聚合物中任選氧化的還原端與包含氨基M與官能團(tuán)Q的至少雙官能化合物反應(yīng)，其中該氨基M與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng)，而官能團(tuán)Q則經(jīng)化學(xué)修飾，產(chǎn)生醛官能化的聚合物衍生物，該衍生物再與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。對于官能團(tuán)Q，特別可提到下列官能團(tuán)-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇類；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-1，2-氨基醇類；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)-基團(tuán)根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，術(shù)語″官能團(tuán)Q″是指一種包含化學(xué)結(jié)構(gòu)-NH-的官能團(tuán)Q。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)M是具有結(jié)構(gòu)R′-NH-的基團(tuán)，其中R′是氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基，其中環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可直接連接到NH基團(tuán)，或者根據(jù)另一個實(shí)施方案，可以通過氧橋連接到NH基團(tuán)。烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可以適當(dāng)取代。優(yōu)選的取代基可提到鹵素，如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選的是氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選含1、2、3、4、5或6個碳原子的基團(tuán)。更優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，官能團(tuán)M具有結(jié)構(gòu)R′-NH-R″-，其中R″優(yōu)選包含結(jié)構(gòu)單位-NH-和/或結(jié)構(gòu)單位-(C＝G)-，其中G為O或S，和/或結(jié)構(gòu)單位-SO2-。官能團(tuán)R″的具體實(shí)例是和其中如果G出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團(tuán)M選自H2N-其中G為O或S，并且如果出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S，且R′是甲基。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)M是氨基-NH2。術(shù)語″氨基Q″是指一種包含化學(xué)結(jié)構(gòu)-NH-的官能團(tuán)Q。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)Q是具有結(jié)構(gòu)R′-NH-的基團(tuán)，其中R′是氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基，其中環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可直接連接到NH基團(tuán)，或者根據(jù)另一個實(shí)施方案，可利用氧橋連接到NH基團(tuán)。烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可適當(dāng)取代。優(yōu)選的取代基可提到鹵素，如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選的是氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選含1、2、3、4、5或6個碳原子的基團(tuán)。更優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，官能團(tuán)Q具有結(jié)構(gòu)R′-NH-R″-，其中R″優(yōu)選包含結(jié)構(gòu)單位-NH-和/或結(jié)構(gòu)單位-(C＝G)-，其中G為O或S，和/或結(jié)構(gòu)單位-SO2-。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)R″選自和其中如果G出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團(tuán)Q選自H2N-其中G為O或S，如果出現(xiàn)兩次，則分別獨(dú)立地是O或S，且R′為甲基。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)Q是氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，M和Q二者均包含氨基-NH-。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，M和Q二者均為氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，包含M和Q的化合物是均雙官能化合物，更優(yōu)選的是最優(yōu)選包含氨基-NH2，或者根據(jù)其它實(shí)施方案，包含羥基氨基-O-NH2或如下基團(tuán)作為官能團(tuán)M和Q的均雙官能化合物G優(yōu)選為O。這些包含M和Q的化合物的具體實(shí)例是或或與包含M(M優(yōu)選為氨基-NH-，更優(yōu)選為氨基-NH2，再更優(yōu)選M和Q均包含氨基-NH-，特別優(yōu)選M和Q均包含氨基-NH2)的化合物反應(yīng)的羥乙基淀粉優(yōu)選平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。也可能是平均分子量分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。如果M和Q二者都是氨基-NH2，M和Q可利用任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，通常，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基團(tuán)通常包含1至20個，優(yōu)選1至8個，特別優(yōu)選1至4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，烴殘基為1至20個，優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選為2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子的烷基鏈。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反應(yīng)，產(chǎn)生聚合物衍生物。包含M和Q的至少雙官能化合物與聚合物的反應(yīng)優(yōu)選在0至100℃，更優(yōu)選4至80℃，特別優(yōu)選20至80℃的溫度下進(jìn)行；優(yōu)選反應(yīng)時間范圍為4小時至7天，更優(yōu)選10小時至5天，特別優(yōu)選17至4小時。至少雙官能化合物∶聚合物的優(yōu)選摩爾比為10至200，特別是50至100。至少雙官能化合物與聚合物反應(yīng)的溶劑，優(yōu)選至少一種非質(zhì)子溶劑，特別優(yōu)選水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。也可使用水性介質(zhì)作為至少雙官能化合物與聚合物反應(yīng)的溶劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，包含聚合物和至少雙官能化合物的聚合物衍生物在游離官能團(tuán)Q處化學(xué)修飾，產(chǎn)生包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物。根據(jù)該實(shí)施方案，優(yōu)選使聚合物衍生物與包含可與官能團(tuán)Q反應(yīng)的官能團(tuán)和醛基或酮基或半縮醛基的至少一種至少雙官能化合物反應(yīng)。各種具有醛基或酮基或半縮醛基和至少一個可與聚合物衍生物的官能團(tuán)Q形成連接的官能團(tuán)的化合物適于作為至少雙官能化合物。該至少一個官能團(tuán)選自與Q相同的官能團(tuán)集合，并且選擇為可與Q反應(yīng)。在Q為氨基-NH2的優(yōu)選例子中，優(yōu)選使用除了醛基或酮基或半縮醛基外，還包含至少一個羧基或至少一個反應(yīng)性羧基，優(yōu)選一個羧基或一個反應(yīng)性羧基的化合物。該醛基或酮基或半縮醛基與該羧基或反應(yīng)性羧基可利用任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。通常，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個，優(yōu)選1至8個，特別優(yōu)選1至4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，該烴殘基是具有5至7個，優(yōu)選6個碳原子的芳基殘基。該烴殘基最優(yōu)選的是苯殘基。根據(jù)該優(yōu)選實(shí)施方案，羧基和醛基可位于苯環(huán)1，4-位、1，3-位或1，2-位，優(yōu)選1，4-位。作為反應(yīng)性羧基可提到反應(yīng)性酯、異硫氰酸酯或異氰酸酯。優(yōu)選的反應(yīng)性酯衍生自N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。所有醇類均可單獨(dú)使用或兩種或多種適當(dāng)組合使用。特別優(yōu)選五氟苯基酯和N-羥基琥珀酰亞胺酯作為反應(yīng)性酯。因此，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q為氨基-NH2)進(jìn)一步與甲?；郊姿岱磻?yīng)。根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q為氨基)進(jìn)一步與甲?；郊姿嵛宸交シ磻?yīng)。根據(jù)另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q為氨基)進(jìn)一步與甲酰基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)。根據(jù)另一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含Q的聚合物衍生物(Q為氨基)進(jìn)一步與4-(4-甲?；?3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸反應(yīng)。對于包含氨基的聚合物衍生物與例如甲?；郊姿岬姆磻?yīng)溶劑，優(yōu)選至少一種非質(zhì)子溶劑，特別優(yōu)選水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。該反應(yīng)優(yōu)選在0至40℃，更優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選15至25℃的溫度下進(jìn)行，反應(yīng)時間優(yōu)選為0.5至24小時，特別優(yōu)選1至17小時。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，該反應(yīng)在活化劑的存在下進(jìn)行。合適的活化劑特別是碳二亞胺類，如二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，特別優(yōu)選二異丙基碳二亞胺(DIC)。所得聚合物衍生物可以采用至少一種合適的方法從反應(yīng)混合物中純化。必要時，該聚合物衍生物可先沉淀，然后再采用至少一種合適的方法分離。如果先使聚合物衍生物沉淀，則可能例如將反應(yīng)混合物與至少一種不同于反應(yīng)混合物中溶劑或溶劑混合物的溶劑或溶劑混合物在合適的溫度下接觸。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，其中使用水性介質(zhì)，優(yōu)選水作為溶劑，反應(yīng)混合物與2-丙醇或丙酮與乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1混合物(v/v)(表示等體積的所述化合物)，在優(yōu)選-20至+50℃，特別優(yōu)選-20至25℃的溫度下接觸。聚合物衍生物的分離可以采用可包括一個或多個步驟的適當(dāng)方法進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，先利用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ珉x心或過濾，從反應(yīng)混合物或反應(yīng)混合物與例如2-丙醇水性混合物的混合物中分離聚合物衍生物。第二步驟中，分離的聚合物衍生物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游?、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或凍干等后處理。根據(jù)本發(fā)明甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，先透析所分離的聚合物衍生物，優(yōu)選相對于水透析，然后凍干，直到反應(yīng)產(chǎn)物的溶劑含量足夠低，符合產(chǎn)物所需的要求。凍干可在20至35℃，優(yōu)選20至30℃的溫度下進(jìn)行。所得含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物繼續(xù)與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。關(guān)于蛋白質(zhì)的至少一個氨基與聚合物的至少一個醛基或酮基或半縮醛基通過還原性胺化進(jìn)行的偶聯(lián)，可參見上述有關(guān)還原性胺化反應(yīng)的具體反應(yīng)參數(shù)如pH或溫度的詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，還原性胺化在0至10℃，如大約1至8℃或2至6℃，如大約4℃的溫度下，在pH4.5至5.5，如大約5.0下進(jìn)行。反應(yīng)時間約10至20小時，如12至19小時或14至18小時，如大約17小時或大約20至30小時，如大約24小時。因此，根據(jù)上述優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)聚合物通過其氧化的還原端反應(yīng)時，本發(fā)明也涉及如下式的偶聯(lián)物根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，該聚合物是羥乙基淀粉，即HAS′是HES′，且n＝2、3或4，最優(yōu)選4，如上所述。因此，當(dāng)聚合物通過其氧化的還原端反應(yīng)時，本發(fā)明也涉及如下式的偶聯(lián)物根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)聚合物通過其氧化的還原端反應(yīng)時，本發(fā)明也涉及如下式的偶聯(lián)物其中n＝2、3或4，R4獨(dú)立地是氫或甲氧基，并且當(dāng)R4為氫時，m＝0，當(dāng)R4為甲氧基時，m＝1，HAS優(yōu)選為HES′。在上述各式中，與蛋白質(zhì)連接的氮來源于蛋白質(zhì)的氨基，聚合物衍生物則通過醛基連接。根據(jù)上述實(shí)施方案，官能團(tuán)M和Q包含氨基-NH2，其中M也可能是氨基-NH2，并且Q包含β-羥基氨基-CH(OH)-CH2-NH2，優(yōu)選β-羥基氨基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中包含兩個氨基M和Q的化合物中的氨基Q是β-羥基氨基-CH(OH)-CH2-NH2。在這種情況下，M和Q可利用任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。通常，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選1至6個，特別優(yōu)選1至2個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個，優(yōu)選為1至8個，特別優(yōu)選1至4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，該烴殘基是具有1至20個，優(yōu)選1至10個，更優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至4個碳原子，特別優(yōu)選1至2個碳原子的烷基鏈。更優(yōu)選地，M和Q通過亞甲基分隔。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中該聚合物與1，3-二氨基-2-羥基丙烷反應(yīng)。如果聚合物通過其氧化的還原端反應(yīng)，則產(chǎn)生如下式的聚合物衍生物其中特別優(yōu)選HAS′＝HES′。包含M和Q的至少雙官能化合物，特別優(yōu)選1，3-二氨基-2-羥基丙烷，與聚合物的反應(yīng)優(yōu)選在40至120℃，更優(yōu)選40至90℃，特別優(yōu)選60至80℃的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選反應(yīng)時間范圍為17至168小時，更優(yōu)選17至96小時，特別優(yōu)選48至96小時。至少雙官能化合物∶聚合物的優(yōu)選摩爾比范圍為200∶1至10∶1，特別是50∶1至100∶1。對于該至少雙官能化合物與聚合物的反應(yīng)溶劑，優(yōu)選至少一種非質(zhì)子溶劑，優(yōu)選水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。聚合物衍生物的β-羥基氨基Q通?？膳c至少雙官能化合物反應(yīng)，后者包含至少一個可與Q反應(yīng)的官能團(tuán)，并且還包含至少一個是醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)或可經(jīng)修飾產(chǎn)生醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，該β-羥基氨基經(jīng)化學(xué)氧化直接進(jìn)行化學(xué)修飾，產(chǎn)生醛基。該氧化反應(yīng)可使用所有可將β-羥基氨基轉(zhuǎn)化成醛基的合適氧化劑進(jìn)行。優(yōu)選的氧化劑是高碘酸鹽，如堿金屬高碘酸鹽。特別優(yōu)選高碘酸鈉，優(yōu)選用其水溶液。該溶液的優(yōu)選碘酸根濃度為1至50mM，更優(yōu)選1至25mM，特別優(yōu)選1至10mM。該氧化反應(yīng)在0至40℃，優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選4至20℃的溫度下進(jìn)行。所得聚合物衍生物可采用至少一種合適的方法從反應(yīng)混合物中純化。需要時，聚合物衍生物可先沉淀，然后再采用至少一種合適的方法分離。如果先使聚合物衍生物沉淀，則可以例如將反應(yīng)混合物與至少一種不同于反應(yīng)混合物中溶劑或溶劑混合物的溶劑或溶劑混合物在合適的溫度下接觸。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，其中使用水性介質(zhì)，優(yōu)選水，作為溶劑，反應(yīng)混合物與2-丙醇或丙酮與乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1混合物(v/v)(表示等體積的所述化合物)，優(yōu)選在-20至+50℃，特別優(yōu)選-20至25℃的溫度下接觸。聚合物衍生物的分離可采用可包括一個或多個步驟的適當(dāng)方法進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，先采用合適的方法，如離心或過濾，從反應(yīng)混合物或反應(yīng)混合物與例如2-丙醇水性混合物的混合物中分離聚合物衍生物。第二步驟中，所分離的聚合物衍生物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游?、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或凍干等后處理。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，所分離的聚合物衍生物先透析，優(yōu)選相對于水透析，然后凍干，直到反應(yīng)產(chǎn)物的溶劑含量足夠低，符合產(chǎn)物所需的要求。凍干可在20至35℃，優(yōu)選20至30℃的溫度下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中β-羥基氨基Q的氧化用高碘酸鹽進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，其中當(dāng)使用的聚合物具有氧化的還原端時，優(yōu)選使用高碘酸鹽氧化具有β-羥基氨基的聚合物衍生物，特別優(yōu)選并且特別是HAS′＝HES′，產(chǎn)生具有醛基的聚合物衍生物，特別優(yōu)選并且特別是HAS′＝HES′。所產(chǎn)生的具有醛基A的聚合物衍生物繼續(xù)與蛋白質(zhì)反應(yīng)。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，該方法包括具有β-羥基氨基的聚合物衍生物，當(dāng)所使用的聚合物具有氧化的還原端時，特別優(yōu)選如下式并且特別是HAS′＝HES′，與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)。所產(chǎn)生的具有醛基的聚合物衍生物繼續(xù)與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。有關(guān)蛋白質(zhì)的至少一個氨基與聚合物的至少一個醛基利用還原性胺化進(jìn)行的偶聯(lián)，可參見上文的詳細(xì)內(nèi)容。因此，根據(jù)上述優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明也涉及一種如下式的偶聯(lián)物特別是HAS′＝HES′，當(dāng)所使用的聚合物具有氧化的還原端時。在上式中，與蛋白質(zhì)連接的氮來源于蛋白質(zhì)的氨基，聚合物衍生物則通過醛基連接。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，聚合物先與合適的化合物反應(yīng)，產(chǎn)生包含至少一個反應(yīng)性羧基的第一聚合物衍生物。該第一聚合物衍生物再與另一種至少雙官能化合物反應(yīng)，其中該另一種化合物的至少一個官能團(tuán)與聚合物衍生物的至少一個反應(yīng)性羧基反應(yīng)，并且該另一種化合物的至少另一個官能團(tuán)是醛基或酮基或半縮醛基，或者是可經(jīng)化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)，其中所產(chǎn)生的包含該醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物如上所述，通過還原性胺化，與蛋白質(zhì)的至少一個氨基反應(yīng)。也可能改變各化合物的相互反應(yīng)順序。根據(jù)該另一個實(shí)施方案的第一種替代方案，包含至少一個反應(yīng)性羧基的聚合物的制備方法包括在聚合物的還原端選擇性氧化該聚合物，然后使已成為內(nèi)酯和/或羧酸或羧酸的合適鹽，如堿金屬鹽，優(yōu)選鈉鹽和/或鉀鹽，且HAS′優(yōu)選為HES′的氧化聚合物，與合適的化合物反應(yīng)，產(chǎn)生包含至少一個反應(yīng)性羧基的聚合物。聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉的氧化可根據(jù)產(chǎn)生具有上述結(jié)構(gòu)(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法組合進(jìn)行。雖然氧化反應(yīng)可根據(jù)所有產(chǎn)生羥烷基淀粉的氧化還原端的合適的一種或多種方法進(jìn)行，但優(yōu)選采用例如DE19628705A1所述的堿性碘溶液進(jìn)行，該文獻(xiàn)的內(nèi)容(實(shí)施例A，第9欄，第6至24行)在此引用作為參考。向還原端已選擇性氧化的聚合物中引入反應(yīng)性羧基可以采用所有可能的方法和所有合適的化合物進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明一個具體方法，還原端已選擇性氧化的聚合物在其氧化的還原端與至少一種醇反應(yīng)，優(yōu)選與至少一種酸性醇，如25℃下的pKA值為6至12或7至11的酸性醇反應(yīng)。該酸性醇的分子量范圍可以是80至500克/摩爾，如90至300克/摩爾或100至200克/摩爾。合適的酸性醇是所有具有酸性質(zhì)子且可與氧化的聚合物反應(yīng)形成各反應(yīng)性聚合物酯的醇H-O-RA，優(yōu)選如下式更優(yōu)選如下式優(yōu)選的醇是N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選的是N-羥基琥珀酰亞胺類，特別優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。所有醇均可單獨(dú)使用或其兩種或多種適當(dāng)組合使用。在本
發(fā)明內(nèi)容中，也可能使用例如通過添加碳酸的二酯而釋放醇的化合物。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中在還原端選擇性氧化的聚合物通過該氧化的聚合物與酸性醇，優(yōu)選與N-羥基琥珀酰亞胺和/或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)而活化。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，還原端選擇性氧化的聚合物在其氧化的還原端與至少一種碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-RC反應(yīng)，其中RB與RC可相同或不同。優(yōu)選地，該方法產(chǎn)生如下式的反應(yīng)性聚合物其中HAS′優(yōu)選為HES′。合適的碳酸二酯化合物可使用其醇成分分別獨(dú)立為下列基團(tuán)的化合物N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法，其中還原端選擇性氧化的聚合物通過該氧化的聚合物與N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯反應(yīng)而活化。酸性醇與氧化的聚合物或氧化的聚合物的鹽反應(yīng)的摩爾比是酸性醇∶聚合物優(yōu)選為5∶1至50∶1，更優(yōu)選8∶1至20∶1，優(yōu)選反應(yīng)溫度為2至40℃，更優(yōu)選10至30℃，特別優(yōu)選15至25℃。優(yōu)選反應(yīng)時間為1至10小時，更優(yōu)選2至5小時，更優(yōu)選2至4小時，特別是2至3小時。碳酸二酯化合物與氧化的聚合物或氧化的聚合物的鹽反應(yīng)的摩爾比一般是二酯化合物∶聚合物為1∶1至3∶1，如1∶1至1.5∶1。反應(yīng)時間一般是0.1至12小時，如0.2至6小時，或0.5至2小時或0.75至1.25小時。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，氧化的聚合物與酸性醇和/或碳酸二酯的反應(yīng)在至少一種非質(zhì)子溶劑中，如水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑特別是二甲基亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。優(yōu)選反應(yīng)溫度為2至40℃，更優(yōu)選10至30℃。氧化的聚合物與至少一種酸性醇的反應(yīng)中使用至少另一種活化劑。合適的活化劑特別是羰基二咪唑、碳二亞胺，如二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，特別優(yōu)選二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原端已氧化的聚合物與酸性醇，在另一種活化劑的存在下反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)性聚合物酯。根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案，氧化的聚合物與碳酸二酯和/或酸性醇的反應(yīng)在低堿活性下進(jìn)行，該活性可通過以10∶1的水∶反應(yīng)混合物體積比將反應(yīng)混合物添加至水中來確定。添加之前，基本上不包含緩沖液的水在25℃下的pH值為7。添加反應(yīng)混合物后測定pH值，反應(yīng)混合物的堿活性值優(yōu)選不超過9.0，更優(yōu)選不超過8.0，特別優(yōu)選不超過7.5。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，氧化的聚合物與N-羥基琥珀酰亞胺在無水DMA中，在沒有水的存在下，使用EDC進(jìn)行反應(yīng)，選擇性產(chǎn)生如下式的聚合物N-羥基琥珀酰亞胺酯HAS′更優(yōu)選為HES′。令人驚訝的是，該反應(yīng)不產(chǎn)生因EDC與HES的OH基團(tuán)反應(yīng)而產(chǎn)生的副產(chǎn)物，并且意外地抑制了EDC與氧化聚合物所形成的O-酰基異脲形成各N-?；宓闹嘏欧磻?yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，氧化的聚合物與N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯在無水DMF中，在沒有水及活化劑的存在下反應(yīng)，選擇性產(chǎn)生如下式的N-羥基琥珀酰亞胺酯其中HAS′更優(yōu)選為HES′。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，還原端選擇性氧化的聚合物在氧化的還原端處與唑化物如羰基二咪唑或羰基二苯并咪唑反應(yīng)，產(chǎn)生具有反應(yīng)性羧基的聚合物。如果使用羰基二咪唑，得到如下式的反應(yīng)性咪唑化物聚合物衍生物其中HAS′優(yōu)選為HES′。根據(jù)本發(fā)明該另一個實(shí)施方案的第二替代方案，關(guān)于向聚合物中引入至少一個反應(yīng)性羧基，通過聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)，向還原端未氧化的聚合物中引入該反應(yīng)性羧基。因此，本發(fā)明也涉及一種方法和偶聯(lián)物，其中通過聚合物的至少一個羥基與至少一種碳酸二酯RB-O-(C＝O)-O-RC(其中RB與RC可相同或不同)反應(yīng)，向還原端未氧化的聚合物中引入反應(yīng)性羧基。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，還原端未氧化的聚合物在至少一個羥基上與唑化物如羰基二咪唑、羰基-二-(1，2，4-三唑)或羰基二苯并咪唑反應(yīng)，產(chǎn)生具有反應(yīng)性羧基的聚合物。合適的碳酸二酯化合物可以使用其醇成分獨(dú)立地是下列基團(tuán)的化合物N-羥基琥珀酰亞胺類，如N-羥基琥珀酰亞胺或磺基-N-羥基琥珀酰亞胺，適當(dāng)取代的苯酚類，如對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰′-二硝基苯酚、三氯苯酚，如2，4，6-三氯苯酚或2，4，5-三氯苯酚、三氟苯酚，如2，4，6-三氟苯酚或2，4，5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如羥基苯并三唑。特別優(yōu)選對稱性碳酸二酯化合物，因此RB與RC相同。碳酸二酯的醇成分優(yōu)選選自N-羥基琥珀酰亞胺、磺酸化N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑和硝基-及鹵素-取代的苯酚類。其中優(yōu)選硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。特別優(yōu)選的是N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯和磺基-N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，特別優(yōu)選N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯。因此，本發(fā)明也涉及一種羥烷基淀粉衍生物，優(yōu)選羥乙基淀粉衍生物，其中該淀粉的至少一個羥基，優(yōu)選至少兩個羥基已與碳酸二酯化合物反應(yīng)，產(chǎn)生各反應(yīng)性酯。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，還原端未氧化的聚合物與至少一種碳酸二酯化合物的反應(yīng)在2至40℃，更優(yōu)選10至30℃，特別是15至25℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選反應(yīng)時間為0.5至5小時，更優(yōu)選1至3小時，特別優(yōu)選2至3小時。碳酸二酯化合物∶聚合物的摩爾比取決于聚合物的取代程度，即與碳酸二酯化合物反應(yīng)的羥基數(shù)與未反應(yīng)的聚合物中羥基數(shù)的相對比例。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，碳酸二酯化合物∶無水葡萄糖單位的摩爾比為1∶2至1∶1000，更優(yōu)選1∶3至1∶100，特別優(yōu)選1∶10至1∶50，所產(chǎn)生的取代程度為0.5至0.001，優(yōu)選為0.33至0.01，特別優(yōu)選0.1至0.02。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，還原端未氧化的聚合物與碳酸二酯的反應(yīng)在至少一種非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行，特別優(yōu)選在水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中還原端未氧化的聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)產(chǎn)生反應(yīng)性羧基的反應(yīng)在無水非質(zhì)子性極性溶劑中進(jìn)行，該溶劑優(yōu)選為二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。包含至少一個反應(yīng)性羧基的反應(yīng)性聚合物衍生物，優(yōu)選如上述由聚合物與酸性醇、碳酸酯和/或唑化物反應(yīng)產(chǎn)生的，進(jìn)一步與另一種至少雙官能化合物反應(yīng)，其中該另一種化合物的至少一個官能團(tuán)F1與聚合物衍生物的至少一個反應(yīng)性羧基反應(yīng)。該另一種化合物的至少一個官能團(tuán)F1沒有明確限制，只要可與聚合物的至少一個反應(yīng)性羧基反應(yīng)即可。優(yōu)選的官能團(tuán)F1是例如氨基或羥基或硫基或羧基。該另一種至少雙官能化合物包含至少另一個為醛基的官能團(tuán)F2或可經(jīng)化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基的官能團(tuán)F2。該化學(xué)修飾可以是，例如，官能團(tuán)F2與另一種連接化合物的官能團(tuán)F3反應(yīng)，或氧化或還原合適的官能團(tuán)F2。如果F2與另一種化合物的官能團(tuán)F3反應(yīng)，官能團(tuán)F2特別可選自-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇；-1，2-氨基醇類；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)；-基團(tuán)其中F3是可與上述基團(tuán)之一形成化學(xué)鍵的基團(tuán)，其優(yōu)選選自上述基團(tuán)。此外，第二連接化合物優(yōu)選具有至少一個可與蛋白質(zhì)的氨基通過還原性胺化反應(yīng)的醛基或酮基或半縮醛基。官能團(tuán)F1與該至少雙官能連接化合物中與聚合物反應(yīng)的醛基或酮基或半縮醛基，和/或該至少雙官能連接化合物中與聚合物反應(yīng)的官能團(tuán)F1和F2，和/或該另一種至少雙官能連接化合物中的官能團(tuán)F3與醛基或酮基或半縮醛基，可分別利用任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。通常，該烴殘基具有至多60個，優(yōu)選至多40個，更優(yōu)選至多20個，更優(yōu)選至多10個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個，優(yōu)選1至8個，更優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至4個，特別優(yōu)選1至2個雜原子。優(yōu)選O作為雜原子。烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。具有官能團(tuán)F1和F2的化合物的實(shí)例有例如具有2至20個碳原子的任選取代的二氨基烷，特別優(yōu)選1，2-二氨基乙烷、1，3-二氨基丙烷和1，4-二氨基丁烷。具有官能團(tuán)F3和醛基或酮基或半縮醛基的優(yōu)選化合物實(shí)例是例如甲?；郊姿?、4-甲酰基苯甲酸五氟苯基酯、4-甲酰基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯和4-(4-甲?；?3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。因此，本發(fā)明也涉及一種制備偶聯(lián)物的方法，該方法包括聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉，在其任選氧化的還原端與選自下組的化合物反應(yīng)酸性醇、碳酸二酯和唑化物，產(chǎn)生包含至少一個反應(yīng)性羧基的聚合物衍生物，該聚合物衍生物與至少一種至少雙官能化合物反應(yīng)，產(chǎn)生包含醛基或酮基或半縮醛基或可經(jīng)化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)的聚合物衍生物，任選地化學(xué)修飾該官能團(tuán)，產(chǎn)生包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物，再由該包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。因此，本發(fā)明也涉及一種偶聯(lián)物，其包含與蛋白質(zhì)互相共價連接的聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉，該偶聯(lián)物可通過制備偶聯(lián)物的方法獲得，該方法包括聚合物在任選氧化的還原端與選自下組的化合物反應(yīng)酸性醇、碳酸二酯和唑化物，產(chǎn)生包含至少一個反應(yīng)性羧基的聚合物衍生物，該聚合物衍生物與至少一種至少雙官能化合物反應(yīng)，產(chǎn)生包含醛基或酮基或半縮醛基或可經(jīng)化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基或酮基或半縮醛基的官能團(tuán)的聚合物衍生物，任選地化學(xué)修飾該官能團(tuán)，產(chǎn)生包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物，再由該包含醛基或酮基或半縮醛基的聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行還原性胺化反應(yīng)。具有官能團(tuán)F1和已氧化成醛基的官能團(tuán)F2的化合物的一個具體實(shí)例是例如具有氨基作為F1以及具有β-羥基氨基作為F2的化合物。特別優(yōu)選的實(shí)例是1，3-二氨基-2-羥基丙烷。該氧化反應(yīng)可以使用所有可將β-羥基氨基轉(zhuǎn)化成醛基的合適氧化劑進(jìn)行。優(yōu)選的氧化劑是高碘酸鹽，如堿金屬高碘酸鹽。特別優(yōu)選高碘酸鈉，優(yōu)選使用其水溶液。該溶液的優(yōu)選碘酸根濃度為1至50mM，更優(yōu)選1至25mM，特別優(yōu)選1至10mM。該氧化反應(yīng)在0至40℃，優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選4至20℃的溫度下進(jìn)行。所產(chǎn)生的聚合物衍生物可采用至少一種合適的方法從反應(yīng)混合物中純化。需要時，聚合物衍生物可先沉淀，然后再采用至少一種合適的方法分離。如果先使聚合物衍生物沉淀，則可例如將反應(yīng)混合物與至少一種不同于反應(yīng)混合物中溶劑或溶劑混合物的溶劑或溶劑混合物在合適的溫度下接觸。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，其中使用水性介質(zhì)，優(yōu)選水，作為溶劑，反應(yīng)混合物與2-丙醇或丙酮與乙醇的混合物，優(yōu)選1∶1混合物(v/v)(表示等體積的所述化合物)，在優(yōu)選-20至+50℃，特別優(yōu)選-20至25℃的溫度下接觸。聚合物衍生物的分離可以采用可包括一個或多個步驟的合適的方法進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，先采用合適的方法，如離心或過濾，從反應(yīng)混合物或反應(yīng)混合物與例如2-丙醇水性混合物的混合物中分離聚合物衍生物。第二步中，所分離的聚合物衍生物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游?、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或凍干等后處理。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，所分離的聚合物衍生物先透析，優(yōu)選相對于水透析，然后凍干，直到反應(yīng)產(chǎn)物的溶劑含量足夠低，符合產(chǎn)物所需的要求。凍干可在20至35℃，優(yōu)選20至30℃的溫度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，與聚合物或聚合物衍生物的官能團(tuán)A反應(yīng)的蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為硫醇基。該硫醇基可本身存在于蛋白質(zhì)中。此外，也可能根據(jù)合適的方法向蛋白質(zhì)中引入硫醇基。其中可提到化學(xué)方法。如果蛋白質(zhì)中存在二硫鍵時，可還原-S-S-結(jié)構(gòu)，得到硫醇基。也可以將多肽中的氨基轉(zhuǎn)化為SH基，其實(shí)現(xiàn)方法是多肽通過氨基與具有至少兩個不同官能團(tuán)的化合物反應(yīng)，其中一個官能團(tuán)可與氨基反應(yīng)，另一個則是SH基或SH基的前體，例如N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼狨セ騈-琥珀酰亞胺基-3-(吡啶二硫)丙酸酯。也可能利用蛋白質(zhì)的突變引入SH基，例如向蛋白質(zhì)中引入另一個半胱氨酸，交換一個氨基酸為半胱氨酸，或者例如從蛋白質(zhì)中除去一個半胱氨酸，以使蛋白質(zhì)中另一個半胱氨酸無法形成二硫鍵。最優(yōu)選地，聚合物連接到蛋白質(zhì)的游離半胱氨酸，特別優(yōu)選Cys17或Cys18，其中Cys17例如存在于Granocyte中，Cys18例如存在于Neupogen中。根據(jù)第一個實(shí)施方案，蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z為硫醇基，聚合物的官能團(tuán)A為鹵素乙?；⑶移渲蠥的引入方法包括聚合物在任選氧化的還原端與具有至少兩個官能團(tuán)且各包含氨基的至少雙官能化合物反應(yīng)，產(chǎn)生具有至少一個包含氨基的官能團(tuán)的聚合物衍生物，該聚合物衍生物再與單鹵素取代的乙酸和/或反應(yīng)性單鹵素取代的乙酸衍生物反應(yīng)。對于具有至少兩個官能團(tuán)且各包含氨基的至少雙官能化合物，可以是所有可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng)產(chǎn)生聚合物衍生物的化合物，該聚合物衍生物包含可與單鹵素取代的乙酸和/或反應(yīng)性單鹵素取代的乙酸衍生物反應(yīng)的氨基。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，該至少雙官能化合物的一個官能團(tuán)(該官能團(tuán)與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng))選自H2N-其中G為O或S，如果出現(xiàn)兩次，其分別獨(dú)立為O或S，R′為甲基。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，該至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)與任選氧化的還原端反應(yīng))是氨基-NH2。根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，該官能團(tuán)，最優(yōu)選氨基，與聚合物的氧化的還原端反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，該至少雙官能化合物的官能團(tuán)(該官能團(tuán)與單鹵素取代的乙酸和/或反應(yīng)性單鹵素取代的乙酸衍生物反應(yīng))是氨基-NH2。該至少雙官能化合物的官能團(tuán)，優(yōu)選均為氨基-NH2(該官能團(tuán)與聚合物的任選氧化的還原端，優(yōu)選氧化的還原端，和單鹵素取代的乙酸和/或反應(yīng)性單鹵素取代的乙酸衍生物反應(yīng))，可利用任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。合適的取代基特別是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、鹵素、羰基、?；?、羧基、羧基酯、羥基、硫基、烷氧基和/或烷硫基。通常，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個，優(yōu)選1至8個，特別優(yōu)選1至4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，該烴殘基是具有1至20個，優(yōu)選2至10個，特別優(yōu)選2至8個碳原子的烷基鏈。因此，優(yōu)選的至少雙官能化合物是雙官能團(tuán)氨基化合物，特別優(yōu)選1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷。根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，該至少雙官能化合物是二氨基聚乙二醇，優(yōu)選如下式的二氨基聚乙二醇H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2其中m是整數(shù)，m優(yōu)選為1、2、3或4。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物與1，8-二氨基辛烷、1，7-二氨基庚烷、1，6-二氨基己烷、1，5-二氨基戊烷、1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-二氨基乙烷在其氧化的還原端反應(yīng)，產(chǎn)生如下式的聚合物衍生物其中n＝2、3、4、5、6、7或8，該聚合物特別優(yōu)選的是HES。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物與H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2在其氧化的還原端反應(yīng)，其中m是1、2、3或4，產(chǎn)生如下式的聚合物衍生物其中m＝1、2、3或4，且聚合物特別優(yōu)選的是HES。聚合物，優(yōu)選羥乙基淀粉的還原端的氧化可根據(jù)可產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)(IIa)和/或(IIb)的化合物的各方法或方法組合進(jìn)行。雖然氧化可根據(jù)所有可產(chǎn)生羥烷基淀粉的氧化的還原端的一種或多種適當(dāng)方法進(jìn)行，但優(yōu)選利用堿性碘溶液進(jìn)行，例如DE19628705A1所述，其內(nèi)容(實(shí)施例A，第9欄，第6至24行)在此引用作為參考。聚合物與至少雙官能化合物反應(yīng)產(chǎn)生的聚合物衍生物再與單鹵素取代的乙酸和/或反應(yīng)性單鹵素取代的乙酸衍生物反應(yīng)。作為單鹵素取代的乙酸或反應(yīng)性酸，優(yōu)選Cl-取代的、Br-取代的及I-取代的乙酸，特別優(yōu)選乙酰氯。如果使用鹵素取代的酸本身，優(yōu)選使酸與聚合物衍生物在活化劑的存在下反應(yīng)。合適的活化劑特別是碳二亞胺類，如二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，特別優(yōu)選二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物，優(yōu)選HES，與二氨基化合物，優(yōu)選含2至8個碳原子的二氨基烷或H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(其中m＝1、2、3或4)反應(yīng)，所得聚合物衍生物再與Br取代和I取代的乙酸在活化劑，優(yōu)選EDC的存在下反應(yīng)。因此，本發(fā)明也涉及一種如下式的聚合物衍生物其中X＝Cl、Br或I，n＝2、3、4、5、6、7或8，該聚合物特別優(yōu)選的是HES，或如下式的聚合物衍生物其中X＝Cl、Br或I，m＝1、2、3或4，該聚合物特別優(yōu)選的是HES。聚合物衍生物與鹵素取代的乙酸的反應(yīng)優(yōu)選在水性系統(tǒng)中，優(yōu)選在水中，在優(yōu)選3.5至5.5，更優(yōu)選4.0至5.0，特別優(yōu)選4.5至5.0的pH下，在優(yōu)選4至30℃，更優(yōu)選15至25℃，特別優(yōu)選20至25℃的反應(yīng)溫度下進(jìn)行，優(yōu)選反應(yīng)時間為1至8小時，更優(yōu)選2至6小時，特別優(yōu)選3至5小時。包含包括聚合物的聚合物衍生物、至少雙官能化合物和鹵素取代乙酸的反應(yīng)混合物可用于與蛋白質(zhì)本身反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，優(yōu)選采用超濾，然后沉淀，任選洗滌和真空干燥，從反應(yīng)混合物中分離聚合物衍生物。聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)優(yōu)選在水性系統(tǒng)中進(jìn)行。聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)優(yōu)選在pH6.5至8.5，更優(yōu)選7.0至8.5，特別優(yōu)選7.5至8.5下；在優(yōu)選4至30℃，更優(yōu)選15至25℃，特別優(yōu)選20至25℃的反應(yīng)溫度下進(jìn)行；反應(yīng)時間優(yōu)選為0.5至8小時，更優(yōu)選1至6小時，特別優(yōu)選2至5小時。聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的硫醇基的反應(yīng)在聚合物衍生物與蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生硫醚鍵。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物，優(yōu)選HES，與二氨基化合物，優(yōu)選含2至8個碳原子的二氨基烷或H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(其中m＝1、2、3或4)反應(yīng)，所產(chǎn)生的聚合物衍生物再與Br取代和I取代的乙酸在活化劑的存在下，優(yōu)選在EDC的存在下反應(yīng)，所產(chǎn)生的聚合物衍生物再與蛋白質(zhì)的硫醇基反應(yīng)，產(chǎn)生在蛋白質(zhì)與聚合物衍生物之間包含硫醚鍵的偶聯(lián)物。因此，本發(fā)明也涉及一種如下式的偶聯(lián)物其中n＝2、3、4、5、6、7或8，該聚合物特別優(yōu)選的是HES，或如下式的偶聯(lián)物其中m＝1、2、3或4，該聚合物特別優(yōu)選的是HES。該羥乙基淀粉優(yōu)選為平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。根據(jù)第二個實(shí)施方案，蛋白質(zhì)的官能團(tuán)Z是硫醇基，聚合物的官能團(tuán)A包含馬來酰亞胺基。根據(jù)該實(shí)施方案，有數(shù)種可能性可產(chǎn)生偶聯(lián)物。通常，聚合物在其任選氧化的還原端與至少一種至少雙官能化合物反應(yīng)，其中該至少雙官能化合物包含一個可與該聚合物中任選氧化的還原端反應(yīng)的官能團(tuán)，和至少一個包含馬來酰亞胺基或經(jīng)化學(xué)修飾以產(chǎn)生包含馬來酰亞胺基的聚合物衍生物的官能團(tuán)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，該官能團(tuán)經(jīng)化學(xué)修飾，以產(chǎn)生包含馬來酰亞胺基的聚合物衍生物。因此，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其通過包含馬來酰亞胺基的聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的硫醇基反應(yīng)產(chǎn)生，該方法包括聚合物在其任選氧化的還原端與包含可與該任選氧化的還原端反應(yīng)的官能團(tuán)U的至少雙官能化合物反應(yīng)，該至少雙官能化合物還包含可經(jīng)化學(xué)修飾以產(chǎn)生馬來酰亞胺基的官能團(tuán)W，該方法還包括化學(xué)修飾官能團(tuán)W，產(chǎn)生馬來酰亞胺基。官能團(tuán)U可以是可與聚合物的任選氧化的還原端反應(yīng)的各官能團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)U包含化學(xué)結(jié)構(gòu)-NH-。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團(tuán)U包含結(jié)構(gòu)-NH-。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)U是具有結(jié)構(gòu)R′-NH-的基團(tuán)，其中R′是氫或烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基，其中環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可直接連接到NH基團(tuán)，或者根據(jù)另一個實(shí)施方案，可通過氧橋連接到NH基團(tuán)。該烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、芳基環(huán)烷基、烷芳基或環(huán)烷基芳基殘基可被適當(dāng)取代。優(yōu)選的取代基可以是鹵素，如F、Cl或Br。特別優(yōu)選的殘基R′是氫、烷基和烷氧基，甚至更優(yōu)選的是氫和未取代的烷基和烷氧基。在烷基和烷氧基中，優(yōu)選含1、2、3、4、5或6個碳原子的基團(tuán)。更優(yōu)選甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。特別優(yōu)選甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別優(yōu)選甲基或甲氧基。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中R′是氫或甲基或甲氧基。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案，官能團(tuán)U具有結(jié)構(gòu)R′-NH-R″-，其中R″優(yōu)選包含結(jié)構(gòu)單位-NH-和/或結(jié)構(gòu)單位-(C＝G)-，其中G為O或S，和/或結(jié)構(gòu)單位-SO2-。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，官能團(tuán)R″選自和其中如果G出現(xiàn)兩次，其分別獨(dú)立為O或S。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中官能團(tuán)U選自H2N-其中G為O或S，如果出現(xiàn)兩次，其分別獨(dú)立為O或S，R′是甲基。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，U包含氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案，通過包含W的聚合物衍生物與另一種包含可與W反應(yīng)的官能團(tuán)并且還包含馬來酰亞胺基的至少雙官能化合物反應(yīng)，化學(xué)修飾該至少雙官能化合物的官能團(tuán)W。作為官能團(tuán)W和該另一種至少雙官能化合物中可與W反應(yīng)的官能團(tuán)，可特別提到下列官能團(tuán)-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇；-1，2-氨基醇類；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)-基團(tuán)其中W和該另一種至少雙官能化合物的官能團(tuán)分別是可與上述一種基團(tuán)形成化學(xué)鍵的基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明再更優(yōu)選的實(shí)施方案，W包含氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，W和另一個官能團(tuán)均是來自上列基團(tuán)列表的基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案，這些官能團(tuán)之一是硫基。在這個特別的例子中，該另一個官能團(tuán)優(yōu)選選自其中Hal是Cl、Br或I，優(yōu)選Br或I。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，這些官能團(tuán)之一選自反應(yīng)性酯，如羥胺的酯，其具有亞胺結(jié)構(gòu)如N-羥基琥珀酰亞胺，或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N是雜芳基化合物的一部份，或者例如具有取代芳基殘基，如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物，或任選轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性酯的羧基。在該特別的例子中，該另一個官能團(tuán)包含化學(xué)結(jié)構(gòu)-NH-。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，W包含結(jié)構(gòu)-NH-，該另一種至少雙官能化合物包含反應(yīng)性酯和馬來酰亞胺基。關(guān)于包含結(jié)構(gòu)-NH-的官能團(tuán)W，可參見上述官能團(tuán)，其中W可與U相同或不同。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，U與W相同。更優(yōu)選地，U和W均包含氨基。特別優(yōu)選地，U和W均為氨基-NH2。根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案，聚合物可與包含U和W的至少雙官能化合物在其未氧化的還原端在水性介質(zhì)中反應(yīng)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，其中U和W均為氨基，該反應(yīng)采用具有氧化型還原端的聚合物，在至少一種非質(zhì)子溶劑中，特別優(yōu)選在水含量不超過0.5％重量比，優(yōu)選不超過0.1％重量比的無水非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。合適的溶劑特別是二甲亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)和其中兩種或多種的混合物。特別在U和W均為氨基-NH2時，U和W可利用任何合適的間隔基分隔。其中間隔基可以是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基。合適的取代基是烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、鹵素、羰基、?；Ⅳ然?、羧基酯、羥基、硫基、烷氧基和/或烷硫基。通常，該烴殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子。如果存在雜原子，該分隔基通常包含1至20個，優(yōu)選1至8個，特別優(yōu)選1至4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如5至7個碳原子的任選分支的烷基鏈或芳基或環(huán)烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可以是直鏈和/或環(huán)狀烷基。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，該烴殘基是具有1至20個，優(yōu)選2至10個，更優(yōu)選2至6個，特別優(yōu)選2至4個碳原子的烷基鏈。因此，本發(fā)明也涉及一種如上所述的方法和偶聯(lián)物，其中聚合物在其氧化的還原端與1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基丙烷或1，2-二氨基乙烷反應(yīng)，產(chǎn)生如下式的聚合物衍生物其中n＝2、3或4，該聚合物優(yōu)選為HES。根據(jù)上述優(yōu)選實(shí)施方案，包含氨基的聚合物衍生物再與包含反應(yīng)性酯基和馬來酰亞胺基的至少雙官能化合物反應(yīng)。該反應(yīng)性酯基和馬來酰亞胺基可利用合適的間隔基分隔。關(guān)于該間隔基，可參見官能團(tuán)U與W之間的間隔基。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，反應(yīng)性酯基與馬來酰亞胺基之間利用具有1至10個，優(yōu)選1至8個，更優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至2個，特別優(yōu)選1個碳原子的烴鏈分隔。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該反應(yīng)性酯是琥珀酰亞胺酯，根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，該包含馬來酰亞胺基和反應(yīng)性酯基的至少雙官能化合物是N-(α-馬來酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯。因此，本發(fā)明也涉及一種如下式的聚合物衍生物其中n＝2、3或4，聚合物優(yōu)選為HES。包含馬來酰亞胺基的聚合物衍生物進(jìn)一步與蛋白質(zhì)的硫醇基反應(yīng)，產(chǎn)生包含通過硫醚基與蛋白質(zhì)連接的聚合物衍生物的偶聯(lián)物。因此，本發(fā)明也涉及包含蛋白質(zhì)和聚合物的如下式的偶聯(lián)物其中n＝2、3或4，優(yōu)選4，該聚合物優(yōu)選為HES，其中式中的S原子來源于蛋白質(zhì)的Cys17或Cys18。該羥乙基淀粉優(yōu)選為平均分子量約10kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約10kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約12kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約18kD，DS約0.7的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.4的羥乙基淀粉，或平均分子量約50kD，DS約0.7的羥乙基淀粉。包含馬來酰亞胺基的聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的硫醇基的反應(yīng)優(yōu)選在緩沖的水性系統(tǒng)中進(jìn)行，優(yōu)選pH為5.5至8.5，更優(yōu)選6至8，特別優(yōu)選6.5至7.5，優(yōu)選反應(yīng)溫度為0至40℃，更優(yōu)選0至25℃，特別優(yōu)選4至21℃，優(yōu)選反應(yīng)時間為0.5至24小時，更優(yōu)選1至20小時，特別優(yōu)選2至17小時。該反應(yīng)混合物的合適pH值可通過添加至少一種合適的緩沖液來調(diào)節(jié)。優(yōu)選的緩沖液可提到乙酸鈉緩沖液、磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，其含有優(yōu)選濃度為0至8M，更優(yōu)選2至8M，特別優(yōu)選4至8M的尿素，并且/或者包含優(yōu)選濃度為0至1％(w/v)，更優(yōu)選0.4至1％(w/v)，特別優(yōu)選0.8至1％(w/v)的SDS。偶聯(lián)物可進(jìn)一步處理，如透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析、反向?qū)游?、HPLC、MPLC、凝膠過濾和/或凍干等后處理。因此，本發(fā)明也涉及一種可通過上述方法制得的偶聯(lián)物。因此，本發(fā)明也涉及一種可通過上述方法制得的偶聯(lián)物，其中A是反應(yīng)性羧基，其中通過聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)，向還原端未氧化的聚合物中引入A，并且其中該偶聯(lián)物包含一個聚合物分子和至少一個，特別是1至10個通過酰胺鍵連接到聚合物上的蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2和R3分別獨(dú)立地是氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O，且其中L是任選適當(dāng)取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，其任選包含至少一個雜原子，優(yōu)選具有2至60個碳原子的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基殘基。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為N＝C雙鍵中肟連接一部份的碳水化合物部分的碳原子。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中-L-是-(CH2)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，優(yōu)選2、3、4、5、6，更優(yōu)選2、3、4，特別優(yōu)選4。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2和R3分別獨(dú)立地是氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為N＝C雙鍵中肟連接一部份的碳水化合物部分的碳原子。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物是羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2和R3分別獨(dú)立地是氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中L為任選適當(dāng)取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，其任選包含至少一個雜原子，優(yōu)選具有2至60個碳原子的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基殘基。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為N＝C雙鍵中肟連接一部份的碳水化合物部分的碳原子。上述兩種結(jié)構(gòu)說明了這樣一種結(jié)構(gòu)其中交聯(lián)化合物通過肟連接連接到HAS的還原端，且其中HES的末端糖單位呈開放型，以及一種具有各環(huán)狀縮醛胺型的結(jié)構(gòu)，其中交聯(lián)化合物通過氧氨基連接到HES的還原端，且其中HES的末端糖單位呈環(huán)狀型。這兩種結(jié)構(gòu)均可同時以互相平衡的狀態(tài)存在。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中-L-是-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-其中Ra、Rb、Rc、Rd分別獨(dú)立地是氫、烷基、芳基，優(yōu)選氫，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O，并且其中m為1、2、3或4，其中m個CRaRb基團(tuán)中的殘基Ra與Rb可相同或不同；n為0至20，優(yōu)選0至10，更優(yōu)選1、2、3、4、5，最優(yōu)選1或2；o為0至20，優(yōu)選0至10，更優(yōu)選1、2、3、4、5，最優(yōu)選1或2，其中o個CRcRd基團(tuán)中的殘基Rc與Rd可相同或不同。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中Ra、Rb、Rc、Rd為氫，m＝2，n＝1，o＝2。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為酰胺鍵一部份的氨基的氮原子。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中連接-O-(C＝O)-通過羧基或反應(yīng)性羧基與HAS分子的羥基反應(yīng)形成。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為酰胺鍵一部份的氨基的氮原子。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中L是任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，其任選含有至少一個雜原子，具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選1至10個，更優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至2個碳原子，特別優(yōu)選1個碳原子，L特別是CH2。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為氨甲基連接一部份的氨基的氮原子。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中L1和L2分別獨(dú)立為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，其任選包含至少一個雜原子，其包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基和/或雜芳烷基部分，該殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選1至10個碳原子，且其中D為一連接，優(yōu)選為連接L1的適當(dāng)官能團(tuán)F2和連接L2的適當(dāng)官能團(tuán)F3所形成的共價鍵。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為氨甲基連接一部份的氨基的氮原子。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中L1為-(CH2)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，優(yōu)選2、3、4、5、6，更優(yōu)選2、3、4，特別優(yōu)選4。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中L2包含任選適當(dāng)取代的芳基部分，優(yōu)選包含6個碳原子的芳基部分，L2特別優(yōu)選C6H4，或其中L2為-(CH2)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，優(yōu)選2、3、4、5、6，更優(yōu)選2、3、4。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中選自-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-1，2-氨基醇類；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，如羥胺的酯，其具有如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部份，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或是NH或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根；--C≡C-H；--(C＝NH2Cl)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)-基團(tuán)且其中F3是可與F2形成化學(xué)鍵的官能團(tuán)，優(yōu)選選自上述基團(tuán)中，F(xiàn)2優(yōu)選包含部分-NH-，更優(yōu)選包含氨基，F(xiàn)3優(yōu)選包含部分-(C＝G)-，更優(yōu)選-(C＝O)-，更優(yōu)選部分-(C＝G)-G-，再更優(yōu)選-(C＝O)-G-，特別優(yōu)選-(C＝O)-O，D特別優(yōu)選為酰胺鍵。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中部分-CH2-N2-的碳原子來源于通過開環(huán)氧化反應(yīng)引入聚合物中的醛基，其中HAS″是指不含開環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的并與蛋白質(zhì)中氨基反應(yīng)的醛基的羥烷基淀粉分子，其中氮原子來源于蛋白質(zhì)的氨基。上式中使用的縮寫″蛋白質(zhì)’″是指用于反應(yīng)的G-CSF分子，它不含作為酰胺鍵一部份的氨基的氮原子。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中L為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，其任選包含至少一個雜原子，其包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基和/或雜芳烷基部分，該殘基具有2至60個，優(yōu)選2至40個，更優(yōu)選2至20個，更優(yōu)選2至10個碳原子，且其中硫原子來源于蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基或二硫化物基團(tuán)。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中-L-為-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-其中Ra、Rb、Rc、Rd分別獨(dú)立為氫、烷基、芳基，優(yōu)選氫，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選為O，且其中m為1、2、3或4，最優(yōu)選2，其中m個基團(tuán)CRaRb中的殘基Ra與Rb可相同或不同；n為1至20，優(yōu)選1至10，最優(yōu)選1、2、3或4；o為1至20，優(yōu)選1至10，更優(yōu)選1、2、3、4、5，更優(yōu)選1或2，最優(yōu)選1，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc與Rd可相同或不同；或其中n為0；且o為2至20，優(yōu)選2至10，更優(yōu)選2、3、4、5、6、7或8，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc與Rd可相同或不同。本發(fā)明也涉及一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，該蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中L為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，其任選包含至少一個雜原子，其包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基和/或雜芳烷基部分，該殘基具有2至60個，優(yōu)選2至40個，更優(yōu)選2至20個，更優(yōu)選2至10個碳原子，且其中硫原子來源于蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基或二硫化物基團(tuán)。本發(fā)明也涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，其中-L-為-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-其中Ra、Rb、Rc、Rd分別獨(dú)立為氫、烷基、芳基，優(yōu)選氫，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選為O，且其中m為1、2、3或4，最優(yōu)選2，其中m個基團(tuán)CRaRb中的殘基Ra與Rb可相同或不同；n為1至20，優(yōu)選1至10，最優(yōu)選1、2、3或4；o為1至20，優(yōu)選1至10，更優(yōu)選1、2、3、4、5，更優(yōu)選1或2，最優(yōu)選1，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc與Rd可相同或不同；或其中n為0；且o為2至20，優(yōu)選2至10，更優(yōu)選2、3、4、5、6、7或8，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc與Rd可相同或不同。本發(fā)明也涉及如上所述的任何偶聯(lián)物，其中羥烷基淀粉為羥乙基淀粉。本發(fā)明也涉及如上所述的任何偶聯(lián)物，其中羥乙基淀粉的分子量為2至200kD，優(yōu)選4至130kD，更優(yōu)選4至70kD。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的偶聯(lián)物，或可通過上述方法制得的偶聯(lián)物，其用于治療人體或動物體的方法。此外，本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，其包含治療有效量的如上所述的偶聯(lián)物或可通過上述方法制得的偶聯(lián)物。本發(fā)明中所使用的術(shù)語″治療有效量″意指其用量可針對特定病癥和給藥方案提供治療效果。優(yōu)選通過給藥途徑給藥。具體的途徑根據(jù)所治療的病癥選擇。優(yōu)選采用包含合適載體如聚山梨酸酯、合適稀釋劑如水和/或合適佐劑如山梨糖醇作為制劑的一部份進(jìn)行給藥。所需劑量取決于所治療病癥的嚴(yán)重性、患者的個別反應(yīng)、所采用的給藥方法等等。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物還包含至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑和/或載體，特別優(yōu)選用于G-CSF治療。藥物組合物優(yōu)選用于治療特征在于造血或免疫功能下降的病變或其相關(guān)疾病。因此，本發(fā)明也涉及如上所述包含上述偶聯(lián)物或可通過上述方法制得的偶聯(lián)物的藥物組合物在制備用于治療特征在于造血或免疫功能下降的疾病的藥物中的用途。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，特征在于造血或免疫功能下降特征的疾病是化療、放射療法、感染性疾病、重度慢性中性粒細(xì)胞減少癥或白血病所造成的。因此，本發(fā)明也涉及如上所述包含上述偶聯(lián)物或可通過上述方法制得的偶聯(lián)物的藥物組合物在制備用于治療特征在于造血或免疫功能下降的疾病的藥物中的用途，其中該疾病是化療、放射療法、感染性疾病、重度慢性中性粒細(xì)胞減少癥或白血病所造成的。采用本發(fā)明的藥物組合物治療的個體優(yōu)選經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下途徑給藥。為此，藥物組合物可作為無菌溶液形式給藥。本發(fā)明進(jìn)一步利用下列附圖、表格和實(shí)施例說明，但并非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。圖1a圖1a顯示根據(jù)實(shí)施例2.1(a)制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物Neupogen的SDSpage分析。使用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BG-CSF(Neupogen)按照實(shí)施例2.1(a)所述與HES偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道CG-CSF初始物。圖1b圖1b顯示根據(jù)實(shí)施例2.1(a)制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物Granocyte的SDSpage分析。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BG-CSF(Granocyte)根據(jù)實(shí)施例2.1(a)所述與HES偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道CG-CSF初始物。圖2圖2顯示根據(jù)實(shí)施例2.1(b)制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BG-CSF與HES10/0.4在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道CG-CSF與HES10/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道DG-CSF與HES50/0.4在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道EG-CSF與HES50/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道FG-CSF初始物。圖3圖3顯示根據(jù)實(shí)施例2.2制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道BG-CSF與氧化的HES10/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道CG-CSF與氧化的HES50/0.4在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道DG-CSF與氧化的HES50/0.7在0.1MNaOAc緩沖液pH5.0中偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道EG-CSF初始物。圖4圖4顯示根據(jù)實(shí)施例2.3制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，該G-CSF為Neupogen或Granocyte。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(i-N)。泳道C根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(ii-N)。泳道D根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(iii-N)。泳道E根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(iv-N)。泳道F根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(i-G)。泳道G根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(ii-G)。泳道H根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(iii-G)。泳道I根據(jù)實(shí)施例2.3的粗產(chǎn)物(iv-G)。泳道JNeupogen。圖5圖5顯示根據(jù)實(shí)施例2.4制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實(shí)施例2.4的粗產(chǎn)物(vi)。泳道C根據(jù)實(shí)施例2.4的粗產(chǎn)物(v)。泳道DG-CSF初始物。泳道E蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道F根據(jù)實(shí)施例2.4的粗產(chǎn)物(ix)。泳道G根據(jù)實(shí)施例2.4的粗產(chǎn)物(viii)。泳道H根據(jù)實(shí)施例2.4的粗產(chǎn)物(vii)。泳道IG-CSF初始物。圖6圖6顯示根據(jù)實(shí)施例2.5制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用10％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實(shí)施例2.5的粗產(chǎn)物。泳道CG-CSF初始物。圖7圖7顯示根據(jù)實(shí)施例3制備的HES-G-CSF偶聯(lián)物的SDSpage分析，該G-CSF為Neupogen或Granocyte。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物SeeBluePlus2(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。分子量標(biāo)記物由上至下為188kD、98kD、62kD、49kD、38kD、28kD、17kD、14kD、6kD、3kD。泳道B根據(jù)實(shí)施例3的粗產(chǎn)物(x)。泳道C根據(jù)實(shí)施例3的粗產(chǎn)物(xi)。泳道D根據(jù)實(shí)施例3的粗產(chǎn)物(xii)。泳道E根據(jù)實(shí)施例3的粗產(chǎn)物(xiii)。泳道F根據(jù)實(shí)施例3的粗產(chǎn)物(xiv)。泳道G根據(jù)實(shí)施例3的粗產(chǎn)物(xv)。圖8圖8顯示實(shí)施例6的體外結(jié)果。圖中，x軸表示濃度，以pg/ml為單位，y軸表示細(xì)胞數(shù)/100,000。該圖中，下列縮寫是指G-CSF/A32根據(jù)實(shí)施例2.5制備的G-CSF偶聯(lián)物G-CSF/A33用于實(shí)施例2.5的偶聯(lián)物的G-CSF初始物G-CSF/A57未修飾的NeulastaG-CSF/A58未修飾的NeupogenG-CSF/A60根據(jù)實(shí)施例4.2制備的G-CSF偶聯(lián)物圖9圖9顯示根據(jù)實(shí)施例4.1的粗偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的HPGPC層析圖。HPGPC分析中采用下列參數(shù)柱Superose12HR10/30300×10mmI.D.(Pharmacia)洗脫液27.38mMNa2HPO4；12.62mMNaH2PO4；0.2MNaCl；0,005％NaN3的1升去礦物質(zhì)水溶液流量0.24毫升/小時檢測器1MALLS檢測器檢測器2UV(280nm)檢測器3RI(折射率檢測器)A代表檢測器1的結(jié)果，B代表檢測器2的結(jié)果。圖10圖10顯示根據(jù)實(shí)施例4.1的偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的HPGPC層析圖，其中反應(yīng)副產(chǎn)物如未反應(yīng)的氧代-HES和游離N-羥基琥珀酰亞胺的混合物以及溶劑含量均采用10Kd超濾膜通過低溫離心下調(diào)。HPGPC分析采用下列參數(shù)柱Superose12HR10/30300×10mmI.D.(Pharmacia)洗脫液27.38mMNa2HPO4；12.62mMNaH2PO4；0.2MNaCl；0.005％NaN3的1升去礦物質(zhì)水溶液流量0.24毫升/小時檢測器1MALLS檢測器檢測器2UV(280nm)檢測器3RI(折射率檢測器)A代表檢測器1的結(jié)果，B代表檢測器2的結(jié)果。圖11HPGPC分析采用下列參數(shù)柱Superose12HR10/30300×10mmI.D.(Pharmacia)洗脫液27.38mMNa2HPO4；12.62mMNaH2PO4；0.2MNaCl；0.005％NaN3的1升去礦物質(zhì)水溶液流量0.24毫升/小時檢測器1MALLS檢測器檢測器2UV(280nm)檢測器3RI(折射率檢測器)A代表檢測器1的結(jié)果，B代表檢測器2的結(jié)果。圖12HPGPC分析采用下列參數(shù)柱Superose12HR10/30300×10mmI.D.(Pharmacia)洗脫液27.38mMNa2HPO4；12.62mMNaH2PO4；0.2MNaCl；0.005％NaN3的1升去礦物質(zhì)水溶液流量0.24毫升/小時檢測器1MALLS檢測器檢測器2UV(280nm)檢測器3RI(折射率檢測器)A代表檢測器1的結(jié)果，B代表檢測器2的結(jié)果。圖13圖13顯示HES-修飾的G-CSF(A32)在DEAE-SepharoseCL-6B上層析后的流過液(flow-through)和洗出液的SDS-PAGE分析。取1.5％指定級分經(jīng)超濾脫鹽，在SpeedVac中干燥，加至12.5％聚丙烯酰胺凝膠上。圖14圖14顯示G-CSF初始物的MALDI/TOF圖譜(樣品A33)。圖15圖15顯示HES-修飾的G-CSF的MALDI/TOF圖譜(樣品A32)。圖16圖16顯示HES-修飾的G-CSF的MALDI/TOF圖譜(樣品A60)。圖17圖17顯示實(shí)施例7.2(b)的反應(yīng)混合物的凝膠電泳。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。凝膠使用Roti-Blue(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根據(jù)制造商的說明染色。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物Roti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)，分子量標(biāo)記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。泳道BhG-CSF與實(shí)施例7.1(d)制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道ChG-CSF與實(shí)施例7.1(b)制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道DhG-CSF與實(shí)施例7.1(j)制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道E反應(yīng)對照HES50/07。圖18圖18顯示實(shí)施例7.2(d)的反應(yīng)混合物的凝膠電泳。采用XCellSureLockMiniCell(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)和ConsortE143電源(CONSORTnv，Tumhout，B)進(jìn)行凝膠電泳。根據(jù)制造商的說明，使用12％Bis-Tris凝膠和還原條件下的MOPSSDS電泳緩沖液(均來自InvitrogenGmbH，Karlsruhe，D)。凝膠使用Roti-Blue(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)根據(jù)制造商的說明染色。泳道A蛋白質(zhì)標(biāo)記物Roti-MarkSTANDARD(CarlRothGmbH+Co.KG，Karlsruhe，D)，分子量標(biāo)記物由上至下為200KD、119KD、66KD、43KD、29KD、20KD、14.3KD。泳道B如實(shí)施例7.2(c)所述進(jìn)行緩沖液交換后的hG-CSF。泳道ChG-CSF與如實(shí)施例7.1(f)所述制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。泳道DhG-CSF與如實(shí)施例7.1(h)所述制備的HES衍生物偶聯(lián)后的粗產(chǎn)物。圖19圖19顯示根據(jù)實(shí)施例7.3的偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的HPGPC層析圖(MALLS檢測器上圖；UV檢測器下圖)。HPGPC分析采用下列參數(shù)柱Superose12HR10/30300×10mmI.D.(Pharmacia)洗脫液27.38mMNa2HPO4；12.62mMNaH2PO4；0.2MNaCl；0.005％NaN3的1升去礦物質(zhì)水溶液流量0.24毫升/小時檢測器1MALLS檢測器檢測器2UV(280nm)檢測器3RI(折射率檢測器)圖20圖20顯示實(shí)施例7.4的有絲分裂原性測定結(jié)果。Y軸代表NFS-60-細(xì)胞數(shù)/毫升，X-軸代表濃度，以pg/ml為單位。圖21圖21顯示實(shí)施例7.5的體內(nèi)測定結(jié)果。實(shí)施例實(shí)施例1醛官能化的羥乙基淀粉的合成實(shí)施例1.1(a)通過高碘酸鹽氧化法選擇性氧化羥乙基淀粉的還原端并在0℃下孵育的合成取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1)，溶于5ml20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中，冷卻至0℃。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同緩沖液中，冷卻至0℃?；旌线@兩份溶液，在0℃下孵育10分鐘后，添加0.73ml甘油，反應(yīng)混合物在21℃下孵育10分鐘。反應(yīng)混合物相對于水透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5Kd，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實(shí)施例1.1(b)通過高碘酸鹽氧化法選擇性氧化羥乙基淀粉的還原端并在21℃下孵育的合成取100mg氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1)，溶于5ml20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同緩沖液中。混合這兩份溶液，在21℃下孵育10分鐘后，添加0.73ml甘油，反應(yīng)混合物在21℃下孵育10分鐘。反應(yīng)混合物相對于水透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實(shí)施例1.2(a)采用高碘酸鹽氧化羥乙基淀粉的未氧化還原端并在0℃下孵育，合成醛官能化的羥乙基淀粉取100mgHES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)溶于5ml20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中，冷卻至0℃。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同緩沖液中，冷卻至0℃。混合這兩份溶液，在0℃下孵育10分鐘后，添加0.73ml甘油，反應(yīng)混合物在21℃下孵育10分鐘。反應(yīng)混合物相對于水透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實(shí)施例1.2(b)采用高碘酸鹽氧化羥乙基淀粉的未氧化還原端并在21℃下孵育，合成醛官能化的羥乙基淀粉取100mgHES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備)溶于5ml20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中。取21.4mg高碘酸鈉(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于5ml相同緩沖液中?；旌线@兩份溶液，在21℃下孵育10分鐘后，添加0.73ml甘油，反應(yīng)混合物在21℃下孵育10分鐘。反應(yīng)混合物相對于水透析24小時(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)并凍干。實(shí)施例1.3由氨基官能化的羥乙基淀粉和甲?；郊姿岷铣扇┕倌芑牧u乙基淀粉氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15ml無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.1ml(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10ml無水二甲亞砜溶液中，在40℃下攪拌19小時。添加反應(yīng)混合物至80ml乙醇和80ml丙酮的混合物中。離心分離產(chǎn)生的沉淀，用20ml乙醇和20ml丙酮的混合物洗滌，再溶于80ml水中。該溶液相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。得到67％(3.4g)氨基-HES10/0.4。取150mg4-甲?；郊姿岷?30mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺中(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加204μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃下孵育30分鐘后，添加1g氨基-HES10/0.4。在22℃下振蕩19小時后，添加反應(yīng)混合物至84mL冰冷的丙酮和乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于50ml水中，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，凍干。實(shí)施例1.4由羥乙基淀粉和甲?；郊姿岷铣扇┕倌芑牧u乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。取83mg4-甲?；郊姿岷?80mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF，肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加78μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃下孵育30分鐘后，添加0.5g氧代-HES10/0.7。在22℃下振蕩19小時后，添加反應(yīng)混合物至37.5mL冰冷的丙酮與乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于2.5ml水與2.5mlDMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述離心收集反應(yīng)產(chǎn)物，再溶于10ml水，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，并凍干。實(shí)施例1.5由羥乙基淀粉和甲?；郊姿岷铣扇┕倌芑牧u乙基淀粉HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備。取50mg4-甲?；郊姿岷?08mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于3mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加47μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃下孵育30分鐘后，添加0.3gHES10/0.7。在22℃下振蕩19小時后，添加反應(yīng)混合物至23mL冰冷的丙酮與乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于1.5ml水與1.5mlDMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述離心收集反應(yīng)產(chǎn)物，再溶于10ml水，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，并凍干。實(shí)施例1.6由氨基官能化的羥乙基淀粉和甲酰基苯甲酸五氟苯基酯合成醛官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。取6.0g(0.6mmol)氧代-HES10/0.7溶于20ml無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮?dú)庀轮鸬渭又?ml(60mmol)1，4-二氨基丁烷的11ml無水二甲亞砜溶液中，在40℃下攪拌19小時。添加反應(yīng)混合物至80ml乙醇與80ml丙酮的混合物中。離心分離產(chǎn)生的沉淀，用20ml乙醇與20ml丙酮的混合物洗滌，再溶于80ml水中，該溶液相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。得到52％(3.15g)氨基-HES10/0.7。4-甲?；郊姿嵛宸交ト鏙.S.Lindsey等人，Tetrahedron50(1994)pp.8941-68，特別是p.8956中所述合成。取50mg氨基-HES10/0.7溶于0.5mlN，N-二甲基甲酰胺中(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加15.3mg4-甲?；郊姿嵛宸交ァＴ?2℃下振蕩22小時后，添加反應(yīng)混合物至3.5ml冰冷的2-丙醇中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，用4ml冰冷的2-丙醇洗滌，再溶于50ml水中，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，并凍干。實(shí)施例1.7由羥乙基淀粉和甲?；郊姿嵛宸交ズ铣扇┕倌芑牧u乙基淀粉氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。4-甲?；郊姿嵛宸交ト鏙.S.Lindsey等人，Tetrahedron50(1994)pp.8941-68，特別是p.8956所述合成。取200mg氧代-HES10/0.7溶于2mlN，N-二甲基甲酰胺中(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加61.2mg4-甲?；郊姿嵛宸交ァＴ?2℃下振蕩22小時后，添加反應(yīng)混合物至15ml冰冷的丙酮與乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于1.4ml水與0.7mlDMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述離心收集反應(yīng)產(chǎn)物，再溶于10ml水，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，并凍干。實(shí)施例1.8由氨基官能化的羥乙基淀粉和4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸合成醛官能化的羥乙基淀粉氧代-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。取5.1g(0.51mmol)氧代-HES10/0.4溶于15ml無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，在氮?dú)庀轮鸬渭又?.1ml(51mmol)1，4-二氨基丁烷的10ml無水二甲亞砜溶液中，在40℃下攪拌19小時。添加反應(yīng)混合物至80ml乙醇與80ml丙酮的混合物中。離心分離產(chǎn)生的沉淀，用20ml乙醇與20ml丙酮的混合物洗滌，再溶于80ml水中。該溶液相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。得到67％(3.4g)氨基-HES10/0.4。取80.5mg4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸(Calbiochem-Novabiochem，Laufelfingen，CH)和61mg1-羥基-1H-苯并三唑(Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于3mlN，N-二甲基甲酰胺中(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加45.4μlN，N′-二異丙基碳二亞胺。在21℃下孵育30分鐘后，添加0.3g氨基-HES10/0.4。在22℃下振蕩22小時后，添加反應(yīng)混合物至23ml冰冷的丙酮與乙醇的1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于2ml水與1mlDMF的混合物中，再如上所述沉淀一次。如上所述離心收集反應(yīng)產(chǎn)物，再溶于10ml水，相對于水透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，并凍干。實(shí)施例2通過還原性胺化合成G-CSF偶聯(lián)物實(shí)施例2.1(a)通過還原性胺化，使用含未氧化的還原端的羥乙基淀粉在pH＝7.4下合成G-CSF-偶聯(lián)物(對比實(shí)施例)在實(shí)施例2.1中，試圖采用WO03/074087(實(shí)施例12，p.22-23)的合成法制備HES-G-CSF偶聯(lián)物。向3.33μlG-CSF(Neupogen，來自Amgen，Munchen，D或Granocyte，來自AventisPharmaAG，Zurich，CH，分別為3mg/ml)的0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.4水溶液中添加3.33μlHES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SuprarnolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，79mg/ml)的相同緩沖液的溶液。向該混合物中添加3.33μl60mM氰基硼氫化鈉的相同緩沖液的溶液，所得混合物在22℃下孵育4小時。然后，再添加3.33μl新鮮制備的60mM氰基硼氫化鈉溶液。在30小時孵育期間，共添加5份3.33μl新鮮制備的60mM氰基硼氫化鈉溶液。通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。未觀察到反應(yīng)。實(shí)施例2.1(b)通過還原性胺化，使用含未氧化的還原端的羥乙基淀粉在pH＝5.0至9.2下合成G-CSF-偶聯(lián)物(對比實(shí)施例)向3.33μLG-CSF(G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D，3mg/mL)的指定緩沖液水溶液中添加3.33μlHES(300mg/ml)的相同緩沖液溶液?；旌衔锢鋮s至4℃，在4℃下添加3.33μL60mM氰基硼氫化鈉的相同緩沖液溶液，所得混合物在4℃下孵育20小時。使用下列HES制劑和緩沖液a)緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0-HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Pvodheim，D)b)緩沖液0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)c)緩沖液0.1M硼酸鈉緩沖液pH8.3-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)d)緩沖液0.2M硼酸鉀緩沖液pH9.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)通過凝膠電泳分析各反應(yīng)混合物。偶聯(lián)反應(yīng)未觀察到或幾乎可以忽略(未顯示反應(yīng)b)至d)的凝膠掃瞄結(jié)果)。實(shí)施例2.2通過還原性胺化，使用含氧化的還原端的羥乙基淀粉，在pH5.0至9.2下合成G-CSF-偶聯(lián)物(對比實(shí)施例)向3.33μLG-CSF(G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D，3mg/mL)的指定緩沖液水溶液中添加3.33μl氧代-HES(300mg/ml)的相同緩沖液溶液?；旌衔锢鋮s至4℃，在4℃下添加3.33μL60mM氰基硼氫化鈉的相同緩沖液溶液，所得混合物在4℃下孵育17小時。使用下列HES制劑和緩沖液a)緩沖液0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0-氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)-氧代-HES50/0.4(MW＝50kD，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)-氧代-HES50/0.7(MW＝50kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)b)緩沖液0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)c)緩沖液0.1M硼酸鈉緩沖液pH8.3-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)d)緩沖液0.2M硼酸鉀緩沖液pH9.2-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)采用凝膠電泳分析各反應(yīng)混合物。偶聯(lián)反應(yīng)未觀察到或幾乎可以忽略(未顯示反應(yīng)b)至d)的凝膠掃瞄結(jié)果)。HES10/0.4(MW＝10kD，DS＝0.4)的氧化由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D進(jìn)行；根據(jù)DE19628705A1。實(shí)施例2.3通過還原性胺化，使用經(jīng)高碘酸鹽氧化合成的醛官能化的羥乙基淀粉合成G-CSF-偶聯(lián)物向3.33μlG-CSF(Granocyte，來自AventisPharmaAG，Zurich，CH和Neupogen，來自Amgen，Munchen，D，分別3mg/mL)的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0水溶液中添加3.33μl醛基-HES(79mg/mL)的相同緩沖液溶液。向混合物中添加3.33μL60mM氰基硼氫化鈉的相同緩沖液溶液，混合物在21℃下孵育25小時。通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。使用下列醛官能化的HES偶聯(lián)物(i-N)使用Neupogen根據(jù)上述實(shí)施例1.1(a)制備；(ii-N)使用Neupogen根據(jù)上述實(shí)施例1.1(b)制備；(iii-N)使用Neupogen根據(jù)上述實(shí)施例1.2(a)制備；(iv-N)使用Neupogen根據(jù)上述實(shí)施例1.2(b)制備；(i-G)使用Granocyte根據(jù)上述實(shí)施例1.1(a)制備；(ii-G)使用Granocyte根據(jù)上述實(shí)施例1.1(b)制備；(iii-G)使用Granocyte根據(jù)上述實(shí)施例1.2(a)制備；(iv-G)使用Granocyte根據(jù)上述實(shí)施例1.2(b)制備。實(shí)施例2.4通過還原性胺化，使用由羥乙基淀粉與甲酰基羧酸偶聯(lián)合成的醛官能化的羥乙基淀粉合成G-CSF-偶聯(lián)物向3.33μlG-CSF(G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D，3mg/ml)的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0水溶液中添加3.33μl醛基-HES(118.5mg/mL)的相同緩沖液溶液，冷卻至4℃。在4℃下，向混合物中添加3.33μl60mM氰基硼氫化鈉的相同緩沖液溶液，混合物在4℃下孵育17小時。通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。使用下列醛官能化的HES偶聯(lián)物(v)根據(jù)上述實(shí)施例1.4制備；(vi)根據(jù)上述實(shí)施例1.5制備；(vii)根據(jù)上述實(shí)施例1.6制備；(viii)根據(jù)上述實(shí)施例1.7制備；(ix)根據(jù)上述實(shí)施例1.8制備。實(shí)施例2.5通過還原性胺化，使用由羥乙基淀粉與甲?；人崤悸?lián)成的醛官能化的羥乙基淀粉合成G-CSF-偶聯(lián)物向2.5mlG-CSF(G-CSF來自StrathmannBiotecAG，Hamburg，D，2.27mg/ml)的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.0水溶液中添加136mg如上述實(shí)施例1.3所述制備的醛基-HES10/0.4，溶液冷卻至0℃。向混合物中添加2.5ml冰冷的40mM氰基硼氫化鈉的相同緩沖液溶液，混合物在4℃下孵育17小時。通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。實(shí)施例3通過SH烷化合成G-CSF偶聯(lián)物氧代-HES10/0.7(MW＝10kD，DS＝0.7)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。取6.0g(0.6mmol)氧代-HES10/0.7溶于20ml無水二甲亞砜(DMSO，F(xiàn)luka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，在氮?dú)庀轮鸬渭又?ml(60mmol)1，4-二氨基丁烷的11ml無水二甲亞砜溶液中，在40℃下攪拌19小時。添加反應(yīng)混合物至含80ml乙醇與80ml丙酮的混合物中。離心分離所得沉淀，以含20ml乙醇與20ml丙酮的混合物洗滌，再溶于80ml水中。溶液相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。得到52％(3.15g)氨基-HES10/0.7。取132μg氨基-HES10/0.7溶于100μl磷酸鈉緩沖液(0.1M，0.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)中，添加10μl17.5mg/mlN-α(馬來酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯(AMAS)的無水DMSO溶液(均來自Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)，該澄清溶液在25℃下孵育80分鐘，然后在40℃下孵育20分鐘。使用VIVASPIN0.5ml濃縮器，5KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，在13,000rpm下離心過濾除去過量AMAS，以450μl磷酸鹽緩沖液洗滌2次30分鐘，以450μl緩沖液B洗滌一次。向殘留溶液中添加10μgG-CSF(Neupogen，來自Amgen，Munchen，D和Granocyte來自AventisPharmaAG，Zurich，CH，分別3μg/μl，溶于磷酸鹽緩沖液中)，混合物在25℃下孵育16小時。真空濃縮后，通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物。選用下列方法(x)G-CSF(Granocyte)采用磷酸鈉緩沖液(0.1M，0.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)作為緩沖液B。(xi)G-CSF(Neupogen)采用磷酸鈉緩沖液(0.1M，0.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)作為緩沖液B。(xii)G-CSF(Granocyte)采用磷酸鈉緩沖液(0.1M，0.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)與8M尿素，1％SDS，pH7.4的1∶1(v/v)混合物作為緩沖液B。(xiii)G-CSF(Neupogen)采用磷酸鈉緩沖液(0.1M，0.15MNaCl，50mMEDTA，pH7.2)與8M尿素，1％SDS，pH7.4的1∶1(v/v)混合物作為緩沖液B。(xiv)G-CSF(Granocyte)采用8M尿素，1％SDS，pH7.4作為緩沖液B。(xv)G-CSF(Neupogen)采用8M尿素，1％SDS，pH7.4作為緩沖液B。實(shí)施例4通過具有反應(yīng)性酯基的羥乙基淀粉與G-CSF反應(yīng)合成G-CSF偶聯(lián)物實(shí)施例4.1氧代-HES10/0.4(MW＝10,559D，DS-0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。氧代-HES的氧化度為95％。取66mg氧代-HES10/0.4溶于0.5ml無水DMF中。向該溶液中添加3.4mgN，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，混合物在室溫下攪拌2小時。所得溶液的反應(yīng)性HES濃度為13％重量比。取濃度約0.5mgG-CSF/ml的G-CSF的溶液(StrathmannBiotecAG，Hamburg，D)，采用冷卻離心機(jī)，在阻斷值10kD下進(jìn)行超速離心，濃縮至10mg/ml的濃度。向0.5ml該濃縮G-CSF溶液中添加180μl碳酸氫鈉溶液。然后，分3份(每次100μl)滴加反應(yīng)性HES溶液至蛋白質(zhì)溶液中，直到約30分鐘后反應(yīng)結(jié)束為止。因此，反應(yīng)性HES∶G-CSF的總摩爾比為20∶1。然后，使用0.1NHCl調(diào)節(jié)混合物的pH至4.0。HPGPC分析(高效凝膠滲透層析)得到約70％的產(chǎn)率。該結(jié)果示于圖9?；旌衔锟稍趐H4.0下和4℃下貯存4天，根據(jù)HPGPC分析，仍保持穩(wěn)定，即沒有變化?？梢圆捎?0Kd超濾膜，在冷卻離心機(jī)中，沒有困難地降低混合物中反應(yīng)副產(chǎn)物，如未反應(yīng)的氧代-HES和游離N-羥基琥珀酰亞胺及溶劑的含量。該降低含量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖10。實(shí)施例4.2氧代-HES10/0.4(MW＝10,559D，DS＝0.4)由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1。氧代-HES的氧化度為95％。取400mg氧代-HES10/0.4溶于1ml無水DMF中。向該溶液中添加21mgN，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，混合物在室溫下攪拌2小時。所得溶液的反應(yīng)性HES濃度為40％重量比。取濃度約0.5mgG-CSF/ml的G-CSF的溶液(StrathmannBiotecAG，Hamburg，D)，采用冷卻離心機(jī)，在阻斷值10kD下進(jìn)行超速離心，濃縮至10mg/ml的濃度。向0.5ml該濃縮G-CSF溶液中添加180μl碳酸氫鈉溶液。然后，分3份(每次100μl)滴加反應(yīng)性HES溶液至蛋白質(zhì)溶液中，直到約30分鐘后反應(yīng)結(jié)束為止。因此，反應(yīng)性HES∶G-CSF的總摩爾比約為50∶1。然后，使用0.1NHCl調(diào)節(jié)混合物的pH至4.0。HPGPC分析(高效凝膠滲透層析)得到大于95％的產(chǎn)率。沒有檢測到未反應(yīng)的G-CSF。該結(jié)果示于圖11?；旌衔锟刹捎贸瑸V技術(shù)，沒有困難地純化。該結(jié)果示于圖12。實(shí)施例55.1.純化獲得基本上具有與商品Neupogen(Amgen)相同特性的純化G-CSF，取其中一份保留不修飾，作為對照。5.2HES與G-CSF的偶聯(lián)物合成基本上如實(shí)施例4.2所述，但是其中改用氧代-HES50/0.7(樣品編號A60)，或如實(shí)施例2.5所述(樣品編號A32)合成偶聯(lián)物，并用于進(jìn)一步的緩沖液交換和純化。5.3G-CSF與HES-修飾的G-CSF樣品在純化前使用陰離子交換層析進(jìn)行的緩沖液交換取HES-修飾的G-CSF樣品或未修飾的G-CSF(作為對照)(0.5-5mg蛋白質(zhì))使用Vivaspin6濃縮器單元(10.000MWCOPES，Vivascience，目錄編號VS0602)進(jìn)行緩沖液交換。樣品濃縮至0.5-0.7ml，用10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2稀釋至5ml。各樣品進(jìn)行該濃縮/緩沖液交換循環(huán)共3次。5.4G-CSF與其HES-修飾型在DEAE-Sepharose柱上進(jìn)行的陰離子交換層析純化HES-修飾后的G-CSF樣品及用于對照的未修飾的G-CSF樣品，在室溫下采用AKTAexplorer10系統(tǒng)通過離子交換層析進(jìn)行分析。取HES化之前或之后的等份G-CSF，通過超濾相對于所述緩沖液A(10mM磷酸鈉，pH7.2)透析，或使用約13倍體積的緩沖液A稀釋。柱中含有2mlDEAE-Sepharose(DEAE-SepharoseCL-6B，Pharmacia目錄編號17-0710-01)，經(jīng)添加5.0倍柱體積(CV)的6.5M胍/HCl、5.0CV緩沖液A、5.0CV緩沖液C(1.5MNaCl，含于10mM磷酸鈉溶液，pH7.2)，然后10CV緩沖液A進(jìn)行再生。然后以0.6ml/min的流速注射樣品(0.8-4.5ml，含于10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2)。然后用10ml(使用2ml樣品環(huán)管時)或20ml(使用5ml樣品環(huán)管時)緩沖液A洗滌樣品環(huán)管，根據(jù)添加的樣品，柱再用0-22CV的緩沖液A洗滌(流速＝0.8ml/min)。采用5CV的線性梯度0-100％緩沖液B和2.5CV等濃度100％緩沖液B，以0.6ml/min的流速進(jìn)行洗脫。柱子用5CV緩沖液A再平衡，如上所述采用1ml/min的流速再生。需要時，樣品采用Vivaspin濃縮器濃縮并如上所述進(jìn)行緩沖液交換。樣品在使用0.2μm過濾單位(Corning，目錄編號431215)進(jìn)行無菌過濾之前或之后貯存在0-8℃的10mM乙酸鈉緩沖液pH4.0中。制備下列樣品用于體外生物分析和進(jìn)一步分析。蛋白質(zhì)濃度如下文第6.1節(jié)所述測定I.0401-15/A33，0.44mg/ml，體積＝500μlG-CSF(大腸桿菌(E.coli))II.0402-03/A60，0.35mg/ml，體積＝600μlH-G-CSF(G-CSFHES修飾，10/0.4)III.0401-13/A32，0.28mg/ml，體積＝900μlG-CSF(大腸桿菌)HES修飾，10/0.4IV.0401-28/A58，0.60mg/ml，體積＝350μlNeupogenV.0401-28/A57，0.50mg/ml，體積＝400μlNeulasta5.5.G-CSF樣品的進(jìn)一步分析取樣品等份分析其蛋白質(zhì)含量及進(jìn)行修飾。5.5(a)通過RP-HPLC進(jìn)行G-CSF蛋白質(zhì)定量樣品的G-CSF蛋白質(zhì)含量采用未修飾的蛋白質(zhì)制劑(濃度0.453mg/ml)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量。采用DionexHPLC系統(tǒng)，其包括泵P680AHPG、脫氣單元DegasysDG1210、自動取樣器和注射器ASI-100、樣品環(huán)管250μL、柱恒溫器TCC100和UV/Vis-檢測器UVD170U，其中裝有軟件Chromeleon層析管理系統(tǒng)。使用預(yù)置柱CC8/4Nucleosil120-5C4，Macherey-Nagel，目錄編號No.721889和分離柱40C-4NucleosilMPN，5μm，125×4mmRP-柱(Macherey-Nagel，訂購編號720045.40)。溶劑A為H2O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶劑B為90％乙腈的水溶液，其中含0.06％(v/v)三氟乙酸，流速1ml/min。在214、221、260和280nm波長下進(jìn)行UV檢測。將約10-20μg樣品注射至RP-HPLC柱中。采用下列梯度0-5分鐘0-10％B-17分鐘10-45％B-35分鐘45-80％B-36分鐘80-100％B-38分鐘100％B-39分鐘10％B-45分鐘10％B采用標(biāo)準(zhǔn)G-CSF制劑的洗脫位置所得波峰面積，與約29分鐘處在280nm波長下所得波峰的參考標(biāo)準(zhǔn)比較。5.5(b)G-CSF蛋白質(zhì)的還原+羧酰氨甲基化取G-CSF蛋白質(zhì)樣品等份，如文獻(xiàn)所述進(jìn)行還原和羧酰氨甲基化(GuillerminaForno，MarielaBollatiFogolin，MarcosOggero，RicardoKratje，MarinaEtcheverrigaray，HaraldS.Conradt，ManfredNimtz(2004)N-andO-linkedcarbohydratesandglycosylationsiteoccupancyinrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorsecretedbyaChinesehamsterovarycellline；EuropeanJ.Biochem，273(5)，907-919)。羧酰氨甲基化反應(yīng)產(chǎn)生修飾的半胱氨酸殘基。羧酰氨甲基化的蛋白質(zhì)在含1M尿素，pH7.8的25mMNH4HCO3中以0.2∶10的酶/底物比進(jìn)行內(nèi)切蛋白酶Glu-C消化18-24小時。5.5(c)通過RP-HPLC分離內(nèi)切-Glu-C肽內(nèi)切Endo-Glu-C消化產(chǎn)生的肽在DionexHPLC系統(tǒng)上分離，該系統(tǒng)包括泵P680AHPG、脫氣單元DegasysDG1210、自動取樣器和注射器ASI-100、樣品環(huán)管250μL、柱恒溫器TCC100和UV/Vis-檢測器UVD170U，其中裝有軟件Chromeleon層析管理系統(tǒng)。使用預(yù)置柱CC8/4Nucleosil120-5C4，Macherey-Nagel，目錄編號No.721889和分離柱40C-4NucleosilMPN，5μm，125×4mmRP-柱(Macherey-Nagel，訂購編號720045.40)。溶劑A為H2O加0.06％(v/v)三氟乙酸，溶劑B為90％乙腈的水溶液，含0.06％(v/v)三氟乙酸，流速1ml/min。采用下列梯度0-5分鐘10％B-17分鐘45％B-65分鐘100％B-67分鐘100％B-69分鐘10％B-75分鐘10％B在214、221、260和280nm波長下進(jìn)行UV檢測。分離內(nèi)切-Glu-C消化產(chǎn)生的肽(未示出數(shù)據(jù))。5.5(d)通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法分析蛋白質(zhì)水解的肽采用質(zhì)譜法檢測所制備的不同樣品中G-CSF的完整N-末端。還原且羧酰氨甲基化的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)內(nèi)切蛋白酶Glu-C消化產(chǎn)生的樣品(3-5μg)直接用于MS-分析(不包括步驟6.3的RP-HPLC)，采用含C18反向物質(zhì)的ZipTip吸管尖端，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行純化。用0.1％(v/v)甲酸洗滌后，以10μl0.1％(v/v)甲酸的60％(v/v)乙腈溶液進(jìn)行肽的洗脫。蛋白質(zhì)水解(內(nèi)切-Glu-C)的肽片段用BrukerULTRAFLEX飛行時間(TOF/TOF)儀器以線性正離子模式進(jìn)行分析，采用22.4mg3，5-二甲氧基-4-羥基-肉桂酸在400μL乙腈和600μl0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液中的溶液作為基質(zhì)；并采用含19mgα-氰基-4-羥基肉桂酸在相同溶劑混合物中的溶液作為基質(zhì)，使用反射器(reflectron)加強(qiáng)解析度，測定(糖基)-肽。取1μL濃度約1-10pmol-μl-1的樣品溶液與等量各基質(zhì)混合。將混合物點(diǎn)樣在不銹鋼目標(biāo)上，在室溫下干燥后進(jìn)行分析。在質(zhì)量范圍900-5000道爾頓下記錄質(zhì)譜。下表顯示預(yù)期質(zhì)量與各G-CSF肽的相關(guān)性。表由XM02產(chǎn)生的內(nèi)切-Glu-C肽的理論(單同位素)質(zhì)量半胱氨酸殘基被羧酰氨甲基化；以脂肪標(biāo)記的肽在未修飾的G-CSF的MALDI/TOF圖譜上檢測。包括蛋白質(zhì)位點(diǎn)1-20的N-末端內(nèi)切-Glu-C肽(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE；m/z2189.1)，在如上所述使用內(nèi)切蛋白酶Glu-C蛋白水解處理G-CSF后，在樣品的MALDI/TOF-MS圖譜上檢測。5.6.結(jié)果5.6(a)G-CSF和HES修飾的變體的純化A32、A60和未修飾的G-CSF采用DEAE-SepharoseCL-6B柱如A4所述進(jìn)行純化。對于未修飾的樣品0401-15/A33，流過液在280nm處未檢測到顯著吸收，以40-50％緩沖液B(0.16-0.20MNaCl)，體積6ml洗脫的蛋白質(zhì)在280nm處的特定波峰面積為660mAU×ml×mg-1。樣品0401-14/A32(來源于0401-15/A33；使用醛基HES10/0.4進(jìn)行HES化)在濃度20-80％(0.08-0.32MNaCl)緩沖液B的大梯度范圍和12ml體積下進(jìn)行洗脫。在280nm處，在流過液中檢測到約90％的總波峰面積，其中包含約50％的總蛋白質(zhì)，通過如上述圖13所示的SDS-PAGE分析進(jìn)行檢測，其分子量顯然稍高于洗脫出的蛋白質(zhì)。樣品0402-03/A60(用HES10/0.4HES化，按照實(shí)施例4.2的完整程序)在類似濃度的20-80％緩沖液B下洗脫出，體積為10.5ml。此時，在280nm處，在流過液中檢測到約35％的總波峰面積，然而，通過SDS-PAGE分析，該級分未檢測到未結(jié)合的蛋白質(zhì)。與樣品0401-15/A33的特定波峰面積相比，樣品0402-03/A60的洗出液中蛋白質(zhì)含量比加至柱中的指定蛋白質(zhì)量高45％。蛋白質(zhì)的回收率根據(jù)洗脫級分的波峰面積(A280nm)與未修飾的G-CSF蛋白質(zhì)相比較來計算。表1280nm檢測的波峰面積的比較**蛋白質(zhì)的RP-HPLC定量證實(shí)了這些結(jié)果5.6(b)通過內(nèi)切蛋白酶Glu-C處理后的肽圖譜和MALDI/TOFMS的蛋白質(zhì)分析通過MALDI/TOF-MS清楚地檢測羧酰氨甲基化的未修飾G-CSF(圖14)和市售產(chǎn)品Neupogen(未顯示數(shù)據(jù))二者經(jīng)內(nèi)切蛋白酶Glu-C消化產(chǎn)生的N-末端肽(MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE，m/z2189.1；半胱氨酸被羧酰氨甲基化)。該信號在通過還原性胺化進(jìn)行HES-修飾的樣品(圖15)和Neulasta(未顯示數(shù)據(jù))中不存在，表示該肽被修飾。對于HES-修飾的G-CSF，其中通過活化酯化學(xué)法進(jìn)行修飾，以相對于未修飾的初始物A32的相對信號強(qiáng)度來檢測N-末端肽(圖16)，表示該衍生物的HES修飾已在不同氨基酸側(cè)鏈上實(shí)現(xiàn)。HES修飾的G-CSF(樣品A33和市售產(chǎn)品Neulasta)的N-末端測序顯示其N-末端已封閉，提示該蛋白質(zhì)衍生物的N-末端甲硫氨酸殘基被HES衍生物修飾。由于在樣品A60中未檢測到相當(dāng)于包含氨基酸殘基位點(diǎn)35-47的肽(KLCATYKLCHPEE；兩個半胱氨酸殘基均被羧酰氨甲基化，m/z1648.78)的信號，因此其結(jié)論是其中一個或兩個賴氨酸殘基(位點(diǎn)35和41)可能被HES修飾。參考文獻(xiàn)GuillerminaForno，MarielaBollatiFogolin，MarcosOggero，RicardoKratje，MarinaEtcheverrigaray，HaraldS.Conradt，ManfredNimtz(2004)N-andO-linkedcarbohydratesandglycosylationsiteoccupancyinrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorsecretedbyaChinesehamsterovarycellline；EuropeanJ.Biochem，271(5)，907-919Nimtz，M.，Grabenhorst，E.，Conradt，H.S.，Sanz，L.&Calvete，J.J.(1999)StructuralcharacterizationoftheoligosaccharidechainsofnativeandcrystallizedboarseminalplasmaspermadhesinPSP-IandPSP-IIglycoforms.Eur.J.Biochem.265，703-718.Nimtz，M.，Martin，W.，Wray，V.，Kloppel，K.-D.，Agustin，J.&Conradt，H.S.(1993)StructuresofsialylatedoligosaccharidesofhumanerythropoietinexpressedinrecombinantBHK-21cell.EurJ.Biochem，213，39-56Nimtz，M.，NollG.Paques，E.&Conradt，H.S.(1990)CarbohydrateStructuresofhumantissueplasminogenactivatorvariantexpressedinrecombinantChinesehamsterovarycells.FEBSLett.271，14-18.Schrter，S.，Derr，P.，Conradt，U.S.，Nimtz，M.，Hale，G.&Kirchhoff，C.(1999)Male-specificmodificationofhumanCD52.J.Biol.Chem.274，29862-29873E.GrabenhorstandH.S.Conradt(1999)TheCytoplasmic，TransmembraneandtheStemRegionsofGlycosyltransferasesspecifytheirinvivofunctionalsublocalizationandstabilityintheGolgi.J.Biol.Chem.，274，36107-36116E.Grabenhorst，A.Hoffmann，M.Nimtz，G.Zett1meiβlandH.S.Conradt(1995)ConstructionofstableBHK-21cellcoexpressinghumansecretoryglycoproteinsandhumanGalβ1-4GlcNAc-R□2，6-sialyltransferase□2，6-linkedNeuAcispreferablyattachedtotheGalβ1-4GlcNAcβ1-2ManB1-3-branchofbiantennaryoligosaccharidesfromsecretedrecombinant-traceprotein.Eur.J.Biochem.，232718-725實(shí)施例6在實(shí)施例2.5和4.2中制得的并且按照實(shí)施例5純化的G-CSF-偶聯(lián)物的體外結(jié)果G-CSF變體對小鼠NFS-60細(xì)胞的有絲分裂原性已知G-CSF對嗜中性粒細(xì)胞系的造血細(xì)胞的增殖、分化和活化具有特定影響。采用小鼠NFS-60細(xì)胞(N.Shirafuji等人，Exp.Hematol.1989，17，116-119)測試G-CSF變體的促有絲分裂能力。細(xì)胞在含有5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述培養(yǎng))條件培養(yǎng)基作為外源性IL-3來源的含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(GibcoINVITROGENGmbH，Karlsruhe)中生長，離心收集，洗滌，在24-孔板中分成每孔100,000個細(xì)胞。使細(xì)胞在不含WEHI-3B條件培養(yǎng)基的RPMI培養(yǎng)基中37℃適應(yīng)1小時，然后添加用相同培養(yǎng)基稀釋的G-CSF生長因子樣品。在37℃下，使NFS-60細(xì)胞接觸純化的G-CSF變體3天，然后電子計數(shù)細(xì)胞(CasyTT細(xì)胞計數(shù)器，ScharfeSystem，Reutlingen，D)。結(jié)果示于圖12。由圖12可見，與未添加生長因子的培養(yǎng)基相比，不同G-CSF變體(0.5-50pg/ml)可在3天后刺激細(xì)胞數(shù)增加。未修飾的對照蛋白質(zhì)G-CSF/A33和G-CSF/A58對細(xì)胞的刺激程度非常類似(ED50＝5-10pg/ml)，而G-CSF偶聯(lián)物G-CSF/A60G-CSF/A32和G-CSF/A57比未修飾型只顯示活性稍微降低(ED50＝10-25pg/ml)(參見圖8)。實(shí)施例7G-CSF-偶聯(lián)物的合成實(shí)施例7.1.醛基-HES衍生物的合成實(shí)施例7.1(a)氨基HES10/0.4的合成取5.12g氧代-HES10/0.4(MW＝10000D，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，根據(jù)DE19628705A1)在80℃真空下加熱過夜，在氮?dú)庀氯苡?5mL無水二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，添加5.13mL1，4-二氨基丁烷。在40℃下攪拌17小時后，添加反應(yīng)混合物至150mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，以40mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗滌，離心收集。粗產(chǎn)物溶于80mL水中，相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為67％。實(shí)施例7.1(b)醛基HES10/0.4的合成取105mg4-甲?；郊姿岷?35mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于7mLN，N-二甲基甲酰胺中(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加135μLN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分鐘后，添加0.7g氨基HES10/0.4(如1.1所述合成)。在22℃下振蕩18小時后，添加反應(yīng)混合物至42mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于5mLDMF中，如上所述使用42mL乙醇/丙酮沉淀。離心后，所收集的沉淀溶于水中，相對于水透析1天SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為95％。實(shí)施例7.1(c)氨基HES10/0.7的合成取6.02g氧代-HES10/0.7(MW＝10000D，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，根據(jù)DE19628705)在氮?dú)庀氯苡?2mL無水二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，添加6.03mL1，4-二氨基丁烷。在40下攪拌17小時后，添加反應(yīng)混合物至150mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，以40mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗滌，離心收集。粗產(chǎn)物溶于80mL水中，相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為52％。實(shí)施例7.1(d)醛基HES10/0.7的合成取150mg4-甲酰基苯甲酸和230mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)，添加204μLN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分鐘后，添加1g氨基HES10/0.7(如1.3所述合成)。在22℃下振蕩19小時后，添加反應(yīng)混合物至84mL冰冷2-丙醇中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于50mL水中，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為83％。實(shí)施例7.1(e)氨基HES30/0.4的合成取5g氧代-HES30/0.4(MW＝30000D，DS＝0.4，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，采用根據(jù)DE19628705A1的成分摩爾比)在80℃真空下加熱過夜，然后在氮?dú)庀氯苡?8mL無水二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，添加1.67mL1，4-二氨基丁烷。在40℃下攪拌17小時后，添加反應(yīng)混合物至175mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物。粗產(chǎn)物溶于40mL水中，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。未測定分離產(chǎn)物的產(chǎn)率。實(shí)施例7.1(f)醛基HES30/0.4的合成取130mg4-甲?；郊姿岷?53mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于36mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)中，添加110μLN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分鐘后，添加2.61g氨基HES30/0.4(如1.5所述合成)。在22℃下振蕩22.5小時后，添加反應(yīng)混合物至160mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，以丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗滌。離心后，沉淀溶于30mL水中，相對于水透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為81％。實(shí)施例7.1(g)氨基HES30/0.7的合成取5g氧代-HES30/0.7(MW＝30000D，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，采用根據(jù)DE19628705A1的成分摩爾比)在80℃真空下加熱過夜，然后在氮?dú)庀氯苡?8mL無水二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，添加1.67mL1，4-二氨基丁烷。在40℃下攪拌17小時后，添加反應(yīng)混合物至175mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物。粗產(chǎn)物溶于40mL水中，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。未測定分離產(chǎn)物的產(chǎn)率。實(shí)施例7.1(h)醛基HES30/0.7的合成取122mg4-甲?；郊姿岷?44mg1-羥基-H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于34mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)中，添加103μLN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分鐘后，添加2.46g氨基HES30/0.7(如1.7所述合成)。在22℃下振蕩22.5小時后，添加反應(yīng)混合物至160mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，以丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗滌。離心后，沉淀溶于30mL水中，相對于水透析1天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為87％。實(shí)施例7.1(i)氨基HES50/0.7的合成取6.09g氧代-HES50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D，采用根據(jù)DE19628705A1的成分摩爾比)在80℃真空下加熱過夜，然后在氮?dú)庀氯苡?2mL無水二甲亞砜(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)中，添加1.22mL1，4-二氨基丁烷。在40℃下攪拌17小時后，添加反應(yīng)混合物至150mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物。以丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物洗滌，離心收集。粗產(chǎn)物溶于80mL水中，相對于水透析4天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為82％。實(shí)施例7.1(i)醛基HES50/0.7的合成取125mg4-甲酰基苯甲酸和174mg1-羥基-1H-苯并三唑(均來自Aldrich，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)溶于38mLN，N-二甲基甲酰胺(肽合成級，Biosolve，Valkenswaard，NL)中，添加155μLN，N′-二異丙基碳二亞胺(Fluka，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，D)。在21℃下孵育30分鐘后，添加3.8g氨基HES50/0.7(如1.9所述合成)。在22℃下振蕩19小時后，添加反應(yīng)混合物至160mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物中。在4℃下離心收集沉淀產(chǎn)物，再溶于20mLN，N-二甲基甲酰胺中，如上所述以80mL丙酮與乙醇的冰冷1∶1(v/v)混合物沉淀。離心后，沉淀溶于50mL水中，相對于水透析2天(SnakeSkin透析管，阻斷值3.5kD，PerbioSciencesDeutschlandGmbH，Bonn，D)，然后凍干。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率為77％。實(shí)施例7.2通過還原性胺化合成HES-G-CSF偶聯(lián)物實(shí)施例7.2(a)緩沖液交換A取33mL0.454mg/mLhG-CSF(XM02，BioGeneriXAG，Mannheim，D)的10mM乙酸鈉溶液、50mg/mL山梨糖醇和0.004％Tween80，pH4.0，在0℃下，使用Vivaspin15R濃縮器(VS15RH11，5KDMWCO，VivascienceAG，Hannover，D)通過滲濾濃縮至4mL，再使用0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0稀釋至15mL。重復(fù)該滲濾2次。該最后滲濾步驟的最終濃度為3mg/mL。實(shí)施例7.2(b)hG-CSF與實(shí)施例7.1(b)、7.1(d)和7.1(i)的醛基HES衍生物的反應(yīng)經(jīng)過緩沖液交換成0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(如以上7.2(a)所述)之后，向1.67mLhG-CSF溶液中添加1.67mLHES-衍生物和1.67mL60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，該溶液在4℃下孵育15.5小時。所有溶液均冷卻至0℃后才混合。采用下列最終HES濃度39.4mg/mL根據(jù)實(shí)施例7.1(b)和7.1(d)制備的HES衍生物。197mg/mL根據(jù)實(shí)施例7.1(j)制備的HES衍生物。197mg/mLHES50/0.7(MW＝50000D，DS＝0.7，SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D)作為反應(yīng)對照。通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物(參見圖17)。實(shí)施例7.2(c)緩沖液交換B取20mL0.454mg/mLhG-CSF(XM02，BioGeneriXAG，Mannheim，D)的10mM乙酸鈉溶液、50mg/mL山梨糖醇和0.004％Tween80，pH4.0，在15℃下，使用Vivaspin15R濃縮器(VS15RH11，5KDMWCO，VivascienceAG，Hannover，D)通過滲濾濃縮至4mL，再使用0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0稀釋至15mL。重復(fù)該滲濾2次。該最后滲濾步驟中的最終濃度為1.5mg/mL。實(shí)施例7.2(d)hG-CSF與實(shí)施例7.1(f)和7.1(h)的醛基HES衍生物的反應(yīng)經(jīng)過緩沖液交換成0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.0(如以上7.2(c)所述)之后，向3.3mLhG-CSF溶液中添加3.3mL789mgHES-衍生物和3.3mL60mM氰基硼氫化鈉在相同緩沖液中的溶液，該溶液在4℃下孵育30小時。所有溶液均冷卻至0℃后才混合。17小時后取樣用作反應(yīng)對照。通過凝膠電泳分析反應(yīng)混合物(參見圖18)。實(shí)施例7.3通過N，N′-琥珀酰亞胺基碳酸酯偶聯(lián)合成HES-GCFS偶聯(lián)物實(shí)施例7.3(a)通過具有反應(yīng)性酯基的羥乙基淀粉與G-CSF的反應(yīng)合成G-CSF偶聯(lián)物取400mg氧代-HES10/0.7(由SupramolParenteralColloidsGmbH，Rosbach-Rodheim，D制備；根據(jù)DE19628705A1，氧代-HES的氧化度為95％)溶于1ml無水DMF中。向該溶液中添加21mgN，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，在室溫下攪拌該混合物2小時。所得溶液的反應(yīng)性HES濃度為40％重量比。取濃度約0.5mgG-CSF/ml的G-CSF溶液(StrathmannBiotecAG，Hamburg，D)用冷卻離心機(jī)以阻斷值100kD超速離心濃縮至濃度為10mg/ml。向0.5ml該濃縮G-CSF溶液中添加180μl碳酸氫鈉溶液。然后分3份(每次各100μl)滴加反應(yīng)性HES溶液至蛋白質(zhì)溶液中，直到約30分鐘后反應(yīng)已結(jié)束為止。因此反應(yīng)性HES∶G-CSF的總摩爾比為約50∶1。然后使用0.1NHCl調(diào)節(jié)混合物pH至4.0。HPGPC分析(高效凝膠滲透層析)得到的產(chǎn)率超過95％。沒有檢測到未反應(yīng)的G-CSF。此結(jié)果示于圖19。實(shí)施例7.4體外測定G-CSF變體對小鼠NFS-60細(xì)胞的有絲分裂原性已知G-CSF對嗜中性粒細(xì)胞系的造血細(xì)胞的增殖、分化和活化作用具有特定影響。采用小鼠NFS-60細(xì)胞(N.Shirafuji等人，Exp.Hematol.1989，17，116-119)測試G-CSF變體的促有絲分裂能力。細(xì)胞在含5-10％WEHI-3B(DSMZ，Braunschweig，D；如DSMZ所述培養(yǎng))條件培養(yǎng)基作為外源性IL-3來源的含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(GibcoINVITROGENGmbH，Karlsruhe，D)中生長，離心收集，洗滌，在24-孔板中分成每孔100,000個細(xì)胞。使細(xì)胞在不含WEHI-3B條件培養(yǎng)基的RPMI培養(yǎng)基中37℃適應(yīng)1小時，然后添加用相同培養(yǎng)基稀釋的G-CSF生長因子樣品。在37℃下，使NFS-60細(xì)胞接觸純化的G-CSF變體3天(根據(jù)實(shí)施例5.3、5.4進(jìn)行純化，根據(jù)實(shí)施例5.5(a)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量)Neupogen、Neulasta均來自Amgen，″HES-GCFS10/0.4偶聯(lián)物″按照實(shí)施例7.2(b)制備，″HES-GCFS10/0.7偶聯(lián)物″按照實(shí)施例7.2(b)制備，″HES-GCFS30/0.4偶聯(lián)物″按照實(shí)施例7.2(d)制備，″HES-GCFS30/0.7偶聯(lián)物″按照實(shí)施例7.2(d)制備，″HES-GCFS50/0.7偶聯(lián)物″按照實(shí)施例7.2(b)制備，″HES-GCFS10/0.7偶聯(lián)物(Supramol)″按照實(shí)施例7.3(a)制備，″偽孵育″(＝反應(yīng)對照，197mg/mlHES50/0.7，MW50000D，DS7，SupramolParenteralColloidsGmbH，RosbachRodheim，Germany)，然后電子計數(shù)細(xì)胞(CasyTT細(xì)胞計數(shù)器，ScharfeSystem，Reutlingen，D)。其結(jié)果示于表2和圖20。在所有情況下，表2和圖20所示蛋白質(zhì)含量僅代表偶聯(lián)物的G-CSF含量，并且以GlycoThera所測定的濃度為基礎(chǔ)。由圖20可見，與未添加生長因子的培養(yǎng)基相比，不同G-CSF變體(2.5-250pg/ml)可在3天后刺激細(xì)胞數(shù)增加。所有變體均在250pg/ml的濃度下達(dá)到相同的最高刺激水平。表2由G-CSF變體誘導(dǎo)的小鼠NFS-60細(xì)胞的增殖實(shí)施例7.5hG-CSF偶聯(lián)物在大鼠中的體內(nèi)生物效應(yīng)大鼠抵達(dá)時[雄性CRLCD大鼠(7周大)，CharlesRiverDeutschlandGmbH，SanghoferWeg7，D-97633Sulzfeld]隨機(jī)分成每組5只。適應(yīng)7天后，淘汰狀態(tài)較差的大鼠，換成備用動物。大鼠抵達(dá)時的體重為181-203g。每組隨機(jī)選出的5只大鼠經(jīng)靜脈內(nèi)施用下列未偶聯(lián)或偶聯(lián)的G-CSF樣品(根據(jù)實(shí)施例5.3、5.4純化，根據(jù)實(shí)施例5.5(a)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量)，每公斤體重施用100μg蛋白質(zhì)(注射速度15秒/劑量，載體5mlPBS/公斤體重)Neupogen、Neulasta均來自Amgen，″HES-GCFS10/0.4偶聯(lián)物″(10/0.4)根據(jù)實(shí)施例7.2(b)制備，″HES-GCFS10/0.7偶聯(lián)物″(10/0.7)根據(jù)實(shí)施例7.2(b)制備，″HES-GCFS30/0.4偶聯(lián)物″(30/0.4)根據(jù)實(shí)施例7.2(d)制備，″HES-GCFS30/0.7偶聯(lián)物″(30/0.7)根據(jù)實(shí)施例7.2(d)制備，″HES-GCFS50/0.7偶聯(lián)物″(50/0.7)根據(jù)實(shí)施例7.2(b)制備，″HES-GCFS10/0.7偶聯(lián)物(Supramol)″(S10-0.7)根據(jù)實(shí)施例7.3(a)制備，″偽孵育″(＝反應(yīng)對照，197mg/mlHES50/0.7，MW50000D，DS7，SupramolParenteralColloidsGmbH，RosbachRodheim，Germany)，和載體對照在輕乙醚麻醉下，所有動物從眼球后靜脈叢抽出約200μLEDTA全血的血樣。在試驗(yàn)前5天，在早晨對已禁食一夜的所有動物采血一次。試驗(yàn)第1至8天，每天采血2次，其間間隔12小時。第一天的第一份血樣在施用G-CSF/GCSF-偶聯(lián)物之前采集。白細(xì)胞(WBC)計數(shù)用BayerADVIATM120(德國Fernwald)進(jìn)行。其結(jié)果示于圖21。權(quán)利要求1.一種制備包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物的方法，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)且蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，該方法包括聚合物或其衍生物的至少一個官能團(tuán)A與蛋白質(zhì)的至少一個官能團(tuán)Z反應(yīng)，由此形成共價連接，其中Z選自氨基、硫醇基、醛基和酮基，且-其中，如果Z為醛基或酮基，A包含與Z形成該連接的氨基，或-其中，如果Z為氨基，A選自反應(yīng)性羧基和醛基、酮基或半縮醛基，--其中，如果A為醛基、酮基或半縮醛基，該方法還包括向聚合物中引入A，以產(chǎn)生聚合物衍生物---由聚合物與至少雙官能化合物反應(yīng)，其中一個官能團(tuán)可與聚合物反應(yīng)，并且至少另一個官能團(tuán)為醛基、酮基或半縮醛基，或者是進(jìn)一步化學(xué)修飾可產(chǎn)生醛基、酮基或半縮醛基的官能團(tuán)，或---氧化該聚合物，形成至少一個，特別至少兩個醛基，或--其中，如果A為反應(yīng)性羧基，該方法還包括向聚合物中引入A，產(chǎn)生聚合物衍生物---選擇性氧化聚合物的還原端，并活化所產(chǎn)生的羧基，或---由聚合物的未氧化的還原端與碳酸二酯反應(yīng)，或-其中，如果Z為硫醇基，A包含--馬來酰亞胺基或--鹵乙酰基與Z形成所述連接。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述羥烷基淀粉為羥乙基淀粉。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述羥乙基淀粉的分子量為2至200kD，優(yōu)選4至130kD，更優(yōu)選4至70kD。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中Z為醛基或酮基。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述醛基或酮基位于蛋白質(zhì)的碳水化合物側(cè)鏈和/或蛋白質(zhì)的N-末端基團(tuán)。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其還包括氧化蛋白質(zhì)的碳水化合物側(cè)鏈和/或氧化蛋白質(zhì)的N-末端基團(tuán)，產(chǎn)生醛基或酮基。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述氧化反應(yīng)是采用酶法或用高碘酸鹽進(jìn)行的，需要時，其分別可在除去末端唾液酸之后進(jìn)行。8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)的方法，其還包括在包含基團(tuán)A的聚合物衍生物與包含基團(tuán)Z的蛋白質(zhì)反應(yīng)之前，先由聚合物的未氧化的還原端與包含可與聚合物的未氧化還原端反應(yīng)的官能團(tuán)和基團(tuán)A的至少雙官能連接化合物反應(yīng)。9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)的方法，其中A為氨基氧基或酰肼基。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述至少雙官能連接化合物為均雙官能化合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述均雙官能化合物包含兩個氨基氧基。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述均雙官能化合物為O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羥胺。13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物與所述至少雙官能連接化合物的反應(yīng)在水性介質(zhì)中進(jìn)行。14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物與所述至少雙官能連接化合物的反應(yīng)產(chǎn)生肟連接和/或氧氨基連接。15.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中Z為氨基。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其還包括選擇性氧化聚合物的還原端，并由氧化的聚合物與N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯在其氧化的還原端上反應(yīng)，產(chǎn)生包含反應(yīng)性羧基A的聚合物衍生物。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其還包括由還原端未氧化的聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)性羧基A。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述碳酸二酯為對稱性二酯。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中酯的醇成分選自N-羥基琥珀酰亞胺、磺酸化N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑和硝基或鹵素取代的苯酚。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述鹵素取代的苯酚選自硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)的方法，其中還原端未氧化的聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)產(chǎn)生反應(yīng)性酯基A的反應(yīng)在無水非質(zhì)子極性溶劑中進(jìn)行。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述溶劑為二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。23.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中A為醛基、酮基或半縮醛基，該方法還包括由聚合物與至少雙官能化合物的官能團(tuán)M反應(yīng)，產(chǎn)生聚合物衍生物，該至少雙官能化合物還包含至少另一個為醛基，酮基或半縮醛基A的官能團(tuán)Q。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中M包含氨基。25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中A為醛基、酮基或半縮醛基，該方法還包括由聚合物與至少雙官能化合物的官能團(tuán)M反應(yīng)，產(chǎn)生聚合物衍生物，該至少雙官能化合物還包含至少一個不是醛基、酮基或半縮醛基的其它官能團(tuán)Q，該方法還包括由官能團(tuán)Q與至少一種合適的化合物反應(yīng)，產(chǎn)生包含醛基、酮基或半縮醛基A的聚合物衍生物。26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中M和Q包含氨基。27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中所述至少一種合適的化合物包含羧基和醛基、酮基或半縮醛基。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述至少一種合適的化合物為甲?；郊姿峄?-(4-甲?；?3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。29.根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中M包含氨基，且Q包含β-羥基氨基。30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述聚合物在其氧化的還原端與至少雙官能化合物的官能團(tuán)M反應(yīng)。31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其還包括氧化β-羥基氨基，產(chǎn)生醛基。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述氧化反應(yīng)使用高碘酸鹽進(jìn)行。33.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述聚合物使用高碘酸鹽進(jìn)行開環(huán)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生具有至少一個，特別至少兩個醛基A的聚合物衍生物。34.根據(jù)權(quán)利要求23至33中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物或聚合物衍生物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)為還原性胺化。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中還原性胺化在NaCNBH3的存在下進(jìn)行。36.根據(jù)權(quán)利要求34或35的方法，其中還原性胺化在pH7或以下進(jìn)行。37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中該pH為6或以下。38.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任一項(xiàng)的方法，其中還原性胺化在0至25℃的溫度下進(jìn)行。39.根據(jù)權(quán)利要求34至38中任一項(xiàng)的方法，其中還原性胺化在水性介質(zhì)中進(jìn)行。40.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中Z為硫醇基。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中A包含鹵素乙酰基，該方法還包括由聚合物的任選氧化的還原端與具有至少兩個各包含氨基的官能團(tuán)的至少雙官能化合物反應(yīng)，產(chǎn)生具有至少一個包含氨基的官能團(tuán)的聚合物衍生物，該方法還包括由聚合物衍生物與單鹵素取代的乙酸和/或反應(yīng)性單鹵素取代的乙酸衍生物反應(yīng)。42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述鹵素為Br或I。43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的方法，其中所述至少雙官能化合物為具有2至10個碳原子的二氨基烷。44.根據(jù)權(quán)利要求41或42的方法，其中所述至少雙官能化合物為具有1至5個亞烷基單位的二氨基聚乙二醇。45.根據(jù)權(quán)利要求41至44中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物與所述至少雙官能化合物在其氧化的還原端反應(yīng)。46.根據(jù)權(quán)利要求41至45中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含鹵素乙?；木酆衔镅苌锱c蛋白質(zhì)在包含二甲基甲酰胺與水的混合物的溶劑存在下反應(yīng)。47.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中A包含馬來酰亞胺基，該方法還包括聚合物在其任選氧化的還原端與包含可與該任選氧化的還原端反應(yīng)的官能團(tuán)U的至少雙官能化合物反應(yīng)，該至少雙官能化合物還包含可經(jīng)化學(xué)修飾產(chǎn)生馬來酰亞胺基的官能團(tuán)W，該方法還包括化學(xué)修飾官能團(tuán)W，產(chǎn)生馬來酰亞胺基。48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中U包含氨基。49.根據(jù)權(quán)利要求47或48的方法，其中W包含氨基。50.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項(xiàng)的方法，其中包含W的聚合物衍生物與包含可與W反應(yīng)的官能團(tuán)并且還包含馬來酰亞胺基的至少雙官能化合物反應(yīng)。51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述至少雙官能化合物為N-(α-馬來酰亞胺基乙酰氧基)琥珀酰亞胺酯。52.一種根據(jù)權(quán)利要求1至51中任一項(xiàng)的方法制得的偶聯(lián)物。53.根據(jù)權(quán)利要求52的偶聯(lián)物，其中A為反應(yīng)性羧基，且其中通過聚合物的至少一個羥基與碳酸二酯反應(yīng)向還原端未氧化的聚合物中引入A，并且其中包含一個聚合物分子和通過酰胺鍵與該聚合物連接的至少一個，特別是1至10個蛋白質(zhì)分子。54.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O，并且其中L為任選適當(dāng)取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，任選包含至少一個雜原子，優(yōu)選具有2至60個碳原子的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基殘基。55.根據(jù)權(quán)利要求54的偶聯(lián)物，其中-L-為-(CH2)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，優(yōu)選2、3、4、5、6，更優(yōu)選2、3、4，特別優(yōu)選4。56.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O。57.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2與R3分別獨(dú)立為氫或具有1至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，且其中L為任選適當(dāng)取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，任選包含至少一個雜原子，優(yōu)選具有2至60個碳原子的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基殘基。58.根據(jù)權(quán)利要求57的偶聯(lián)物，其中-L-為-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-其中Ra、Rb、Rc、Rd分別獨(dú)立為氫、烷基、芳基，優(yōu)選氫，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O，并且其中m為1、2、3或4，其中n個基團(tuán)(CRaRb)中的殘基Ra和Rb可相同或不同；n為0至20，優(yōu)選0至10，更優(yōu)選1、2、3、4或5，最優(yōu)選1或2；o為0至20，優(yōu)選0至10，更優(yōu)選1、2、3、4或5，最優(yōu)選1或2，其中o個基團(tuán)(CRcRd)中的殘基Rc和Rd可相同或不同。59.根據(jù)權(quán)利要求57或58的偶聯(lián)物，其中Ra、Rb、Rc、Rd為氫，m＝2；n＝1；且o＝2。60.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基。61.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，并且其中連接-O-(C＝O)-由羧基或反應(yīng)性羧基與HAS分子的羥基反應(yīng)形成，其中HAS″是指不含所述羥基的HAS分子。62.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)和/或其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，并且其中L為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，任選包含至少一個雜原子，具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選1至10個，更優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至2個碳原子，尤其優(yōu)選1個碳原子，L特別為CH2。63.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，并且其中L1和L2分別獨(dú)立為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，任選包含至少一個雜原子，包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基和/或雜芳烷基部分，所述殘基具有1至60個，優(yōu)選1至40個，更優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選1至10個碳原子，并且其中D為一個連接，優(yōu)選由連接L1的合適官能團(tuán)F2與連接L2的合適官能團(tuán)F3所形成的共價連接。64.根據(jù)權(quán)利要求63的偶聯(lián)物，其中L1為-(CH2)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，優(yōu)選2、3、4、5、6，更優(yōu)選2、3、4，特別優(yōu)選為4。65.根據(jù)權(quán)利要求63或64的偶聯(lián)物，其中L2包含任選適當(dāng)取代的芳基部分，優(yōu)選包含6個碳原子的芳基部分，L2特別優(yōu)選為C6H4。66.根據(jù)權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中F2選自-C-C-雙鍵或C-C-三鍵或芳香族C-C-鍵；-硫醇基或羥基；-烷基磺酸酰肼、芳基磺酸酰肼；-1，2-二元醇；-1，2-氨基-硫醇類；-疊氮化物；-1，2-氨基醇類；-氨基-NH2或包含結(jié)構(gòu)單位-NH-的氨基的衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；-羥基氨基-O-NH2，或包含結(jié)構(gòu)單位-O-NH-的羥基氨基的衍生物，如羥基烷基氨基、羥基芳基氨基、羥基芳烷基氨基或羥基烷芳基氨基；-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，其各包含結(jié)構(gòu)單位-NH-O-；-具有羰基-Q-C(＝G)-M的殘基，其中G為O或S，M為例如---OH或-SH；--烷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基；--烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基；--烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；--活化的酯，例如羥胺的酯，其具諸如N-羥基琥珀酰亞胺的亞胺結(jié)構(gòu)或具有結(jié)構(gòu)單位O-N，其中N為雜芳基化合物的一部分，或其中G＝O且Q不存在，如具有取代芳基殘基如五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基的芳氧基化合物；其中Q不存在或?yàn)镹H或雜原子，如S或O；--NH-NH2或-NH-NH-；--NO2；-腈基；-羰基，如醛基或酮基；-羧基；--N＝C＝O基團(tuán)或-N＝C＝S基團(tuán)；-乙烯基鹵化物基團(tuán)，如乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團(tuán)或三氟甲磺酸根；--C≡C-H；--(C＝NH2C1)-O烷基--(C＝O)-CH2-Hal基團(tuán)，其中Hal為Cl、Br或I；--CH＝CH-SO2-；-包含結(jié)構(gòu)-S-S-的二硫化物基團(tuán)；-基團(tuán)-基團(tuán)其中F3為可與F2形成化學(xué)鍵的官能團(tuán)，優(yōu)選選自上述基團(tuán)，F(xiàn)2優(yōu)選包含-NH-部分，更優(yōu)選包含氨基，F(xiàn)3優(yōu)選包含-(C＝G)-部分，更優(yōu)選-(C＝O)-，更優(yōu)選-(C＝G)-G-部分，更優(yōu)選-(C＝O)-G-，特別優(yōu)選-(C＝O)-O，D特別優(yōu)選為酰胺鍵。67.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中-CH2-N2-部分中的碳原子來源于通過開環(huán)氧化反應(yīng)引入聚合物中的醛基，其中氮原子來源于蛋白質(zhì)的氨基。68.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，并且其中L為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，任選包含至少一個雜原子，包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基和/或雜芳烷基部分，該殘基具有2至60個，優(yōu)選2至40個，更優(yōu)選2至20個，更優(yōu)選2至10個碳原子，并且其中硫原子來源于蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基或二硫化物基團(tuán)。69.根據(jù)權(quán)利要求68的偶聯(lián)物，其中-L-為-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-其中Ra、Rb、Rc、Rd分別獨(dú)立為氫、烷基、芳基，優(yōu)選氫，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O，并且其中m為1、2、3或4，最優(yōu)選2，其中m個基團(tuán)(CRaRb)中的殘基Ra和Rb可相同或不同；n為1至20，優(yōu)選1至10，最優(yōu)選1、2、3或4；o為1至20，優(yōu)選1至10，更優(yōu)選1、2、3、4、5，更優(yōu)選1或2，最優(yōu)選1，其中o個(CRcRd)基團(tuán)中的殘基Rc和Rd可相同或不同；或者，其中n為0；且o為2至20，優(yōu)選2至10，更優(yōu)選2、3、4、5、6、7或8，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc和Rd可相同或不同。70.一種包含蛋白質(zhì)和聚合物或其衍生物的偶聯(lián)物，其中該聚合物為羥烷基淀粉(HAS)，蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的結(jié)構(gòu)其中R1、R2和R3分別獨(dú)立為氫或具有2至10個碳原子的羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，優(yōu)選氫或羥基烷基，更優(yōu)選氫或羥基乙基，并且其中L為任選取代的直鏈、分支和/或環(huán)狀烴殘基，任選包含至少一個雜原子，包含烷基、芳基、芳烷基雜烷基和/或雜芳烷基部分，該殘基具有2至60個，優(yōu)選2至40個，更優(yōu)選2至20個，更優(yōu)選2至10個碳原子，并且其中硫原子來源于蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基或二硫化物基團(tuán)。71.根據(jù)權(quán)利要求70的偶聯(lián)物，其中-L-為-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-其中Ra、Rb、Rc、Rd分別獨(dú)立為氫、烷基、芳基，優(yōu)選氫，其中G選自O(shè)和S，優(yōu)選O，且其中m為1、2、3或4，最優(yōu)選2，其中m個基團(tuán)CRaRb中的殘基Ra和Rb可相同或不同；n為1至20，優(yōu)選1至10，最優(yōu)選1、2、3或4；o為1至20，優(yōu)選1至10，更優(yōu)選1、2、3、4、5，更優(yōu)選1或2，最優(yōu)選1，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc和Rd可相同或不同；或者其中n為0；o為2至20，優(yōu)選2至10，更優(yōu)選2、3、4、5、6、7或8，其中o個基團(tuán)CRcRd中的殘基Rc和Rd可相同或不同。72.根據(jù)權(quán)利要求54至71中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述羥烷基淀粉為羥乙基淀粉。73.根據(jù)權(quán)利要求72的偶聯(lián)物，其中所述羥乙基淀粉的分子量為2至200kD，優(yōu)選4至130kD，更優(yōu)選4至70kD。74.根據(jù)權(quán)利要求52至73中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其用于治療人體或動物體的方法。75.一種藥物組合物，其包含治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求52至73中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物。76.根據(jù)權(quán)利要求75的藥物組合物，其還包含至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。77.根據(jù)權(quán)利要求52至73中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物在制備用于治療特征在于造血或免疫功能降低的疾病的藥物中的用途。78.根據(jù)權(quán)利要求77的用途，其中所述疾病是由化療、放射療法、感染性疾病、重度慢性中性粒細(xì)胞減少癥或白血病引起的。全文摘要本發(fā)明涉及羥烷基淀粉與粒細(xì)胞集落刺激因子蛋白質(zhì)(G－CSF)的偶聯(lián)物，其中該偶聯(lián)物由羥烷基淀粉或羥烷基淀粉的衍生物與蛋白質(zhì)通過共價鍵形成。本發(fā)明還涉及制備這種偶聯(lián)物的方法，以及這種偶聯(lián)物的用途。文檔編號A61K47/48GK1832762SQ200480022650公開日2006年9月13日申請日期2004年8月6日優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日發(fā)明者沃爾弗拉姆·艾希納,赫爾穆特·克內(nèi)勒,卡塔琳娜·盧特貝克,諾貝特·燦德爾,羅納德·弗蘭克,克勞斯·佐默邁爾,哈拉爾德·S·康拉特,?？ǖ隆じ窭净羲固厣暾埲?弗雷澤紐斯卡比德國有限公司