專利名稱：炎癥性腸病預(yù)防和/或治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及炎癥性腸病的預(yù)防和/或治療劑，更詳細(xì)而言涉及潰瘍性大腸炎或克隆氏病等炎癥性腸病的預(yù)防和/或治療劑。
背景技術(shù)：
人炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，下面簡稱為“IBD”)是大腸和小腸的粘膜發(fā)生慢性炎癥或潰瘍，呈慢性經(jīng)過的炎癥性疾病，該疾病的病因還不知道(例如，參見非專利文獻(xiàn)1)。上述IBD除包括潰瘍性大腸炎或克隆氏病以外，廣義上還包括腸道型白塞氏病或缺血性腸炎等，上述潰瘍性大腸炎主要侵襲大腸粘膜，是一種形成糜爛或潰瘍的原因不明的彌漫性非特異炎癥，上述克隆氏病是伴隨纖維化或潰瘍、以及非特異性肉芽腫的炎癥性疾病。目前，在日本，上述疾病的患者越來越多，根據(jù)前年厚生勞動(dòng)省難治愈性腸管障礙研究班報(bào)告，潰瘍性大腸炎、克隆氏病已經(jīng)波及共10萬人，特別是在10多歲～20多歲的年輕人中多見，目前無法根治，畢生都要與上述疾病斗爭、是一種痛苦的疑難病。
炎癥的作用機(jī)制和IBD的免疫應(yīng)答還不明確，但目前已經(jīng)明確腫瘤壞死因子(下面稱為“TNF”)α或巨噬細(xì)胞游走阻止因子等各種炎癥介質(zhì)與病變或惡化有關(guān)。(例如，參見非專利文獻(xiàn)2至5)。
目前針對IBD的治療主要是使用5-氨基水楊酸(5-aminosalicylicacid、簡稱為“5-ASA”)、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或免疫控制劑。但是，也存在對上述治療具有耐性的患者。最近，作為新型治療劑，開發(fā)了抗TNF-α單克隆抗體(例如，參見非專利文獻(xiàn)6和7)。上述抗體抑制TNF-α的活性，快速改善克隆氏病患者的腸炎癥狀。但是，常常并發(fā)感染和惡性腫瘤等副作用(例如，參見非專利文獻(xiàn)8和9)。上述副作用使抗TNF-α單克隆抗體的治療難以繼續(xù)。
熱休克蛋白質(zhì)(下面簡稱為“HSP”)是顯示保護(hù)性質(zhì)、控制免疫應(yīng)答的應(yīng)激誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)(例如，參見非專利文獻(xiàn)10)。HSP的主要功能是作為針對異常折疊或變異蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)侶伴蛋白(chaperone)發(fā)揮作用，在應(yīng)激條件下，賦予細(xì)胞細(xì)胞保護(hù)機(jī)能。作為多種HSP的一種，有因分子量約為70kDa而得名的HSP70。其亞科中，有針對作用于胃、肝臟和心臟的應(yīng)激具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)功能的蛋白質(zhì)(例如，參見非專利文獻(xiàn)11至14)。HSP70轉(zhuǎn)基因小鼠對心臟損傷模型顯示抵抗型(例如，參見非專利文獻(xiàn)15和16)。在人的腸道中，潰瘍性大腸炎與大腸粘膜的非特異性大腸炎比較，HSP70的表達(dá)增加(參見非專利文獻(xiàn)17)。但是，對于HSP在IBD的疾病進(jìn)展中的作用還沒有進(jìn)行充分的研究。
但是，香葉基香葉基丙酮(geranyl geranyl acetone)(下面簡稱為“GGA”)是保護(hù)胃免受潰瘍等損傷的非環(huán)式聚異戊烯化合物。已知該化合物不影響胃酸分泌，有效地保護(hù)胃粘膜免受各種應(yīng)激(例如，參見非專利文獻(xiàn)18至20)。另外，GGA不僅合成或分泌胃粘蛋白(參見非專利文獻(xiàn)21)，還增強(qiáng)糖蛋白質(zhì)或表面活性磷脂成分的合成或分泌(參見非專利文獻(xiàn)22)。幾年前，報(bào)導(dǎo)了GGA誘導(dǎo)胃粘膜細(xì)胞中HSP70的表達(dá)(參見非專利文獻(xiàn)23)。而且，GGA經(jīng)口給藥，在體內(nèi)多處局部組織誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)，保護(hù)組織免于破壞和炎癥(參見非專利文獻(xiàn)24至26)。
另外，已經(jīng)提交了記載GGA對炎癥性腸病有效的專利申請(參見專利文獻(xiàn)1)，但只是在權(quán)利要求范圍中記載，在詳細(xì)的說明中完全沒有記載顯示香葉基香葉基丙酮對炎癥性腸病有效的實(shí)驗(yàn)例，所以對炎癥性腸病是否有效還不明確。
為了研究誘導(dǎo)腸內(nèi)炎癥或免疫應(yīng)答的因子，利用了很多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在上述模型中，考慮到模型本身的可靠性和便利性，廣泛利用葡聚糖硫酸鈉(下面簡稱為“DSS”)或2，4，6-三硝基苯磺酸(下面簡稱為“TNBS”)誘導(dǎo)腸炎模型(例如，參見非專利文獻(xiàn)27至29)。
另一方面，作為同樣的胃粘膜保護(hù)劑，已知依卡倍特鈉(ecabetsodium)，雖然已知其用作如本發(fā)明的炎癥性腸病的預(yù)防、治療劑(例如，參見專利文獻(xiàn)2)，但依卡倍特鈉與GGA的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不相似，而且因?yàn)榻?jīng)口給藥難以到達(dá)大腸等下部消化道，所以為了用于炎癥性腸病的治療，如上述專利文獻(xiàn)1中幾個(gè)實(shí)驗(yàn)例所示，至少需要灌腸給藥。在所述灌腸的情況下，由于在炎癥部位周圍直接給藥，因此除給患者帶來很大的負(fù)擔(dān)以外，還存在因藥物不能到達(dá)降大腸或橫大腸的一部分而限定治療范圍的問題。
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專利文獻(xiàn)1WO02/098398號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開2002-104962號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型制劑，該制劑不給患者帶來很大負(fù)擔(dān)、并且在整個(gè)腸道的炎癥性腸病的預(yù)防和/或治療中安全有效。
本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特定的非環(huán)狀聚類異戊二烯化合物在腸道中誘導(dǎo)HSP，對于炎癥性腸病的預(yù)防和/或治療是有效的，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的第一種方案提供含有熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物作為有效成分的腸病預(yù)防和/或治療劑。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療劑的優(yōu)選方案是上述熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑是異戊烯酮(prenylketone)類化合物。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療劑的優(yōu)選方案是上述異戊烯酮類化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療劑的優(yōu)選方案是上述腸病是炎癥性腸病。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療劑的優(yōu)選方案是上述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療劑的優(yōu)選方案是上述熱休克蛋白質(zhì)是熱休克蛋白質(zhì)70。
另外，本發(fā)明提供以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作為有效成分的炎癥性腸病的預(yù)防劑和/或治療劑。
本發(fā)明的預(yù)防劑和/或治療劑的炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
另外，本發(fā)明的第二種方案提供包括給予熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物的步驟的腸病預(yù)防和/或治療方法。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療方法的優(yōu)選方案是上述熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑是異戊烯酮類化合物。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療方法的優(yōu)選方案是上述異戊烯酮類化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療方法的優(yōu)選方案是上述腸病是炎癥性腸病。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療方法的優(yōu)選方案是上述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
本發(fā)明的腸病預(yù)防和/或治療方法的優(yōu)選方案是上述熱休克蛋白質(zhì)是熱休克蛋白質(zhì)70。
另外，本發(fā)明提供以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作為有效成分的炎癥性腸病的預(yù)防方法和/或治療方法。
本發(fā)明的預(yù)防方法和/或治療方法所適用的炎癥性腸病是包括克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
而且，本發(fā)明的第三種方案提供熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物在制備腸病預(yù)防和/或治療劑中的用途，上述腸病預(yù)防和/或治療劑含有熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物作為有效成分。
本發(fā)明的上述用途的優(yōu)選方案是上述熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑是異戊烯酮類化合物。
本發(fā)明的上述用途的優(yōu)選方案是上述異戊烯酮類化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本發(fā)明的上述用途的優(yōu)選方案是上述腸病是炎癥性腸病。
本發(fā)明的上述用途的優(yōu)選方案是上述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
本發(fā)明的上述用途的優(yōu)選方案是上述熱休克蛋白質(zhì)是熱休克蛋白質(zhì)70。
另外，本發(fā)明提供熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物在制備炎癥性腸病的預(yù)防劑和/或治療劑中的用途，上述炎癥性腸病的預(yù)防劑和/或治療劑含有式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作為有效成分。
本發(fā)明用途中的炎癥性疾病包括克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的化合物6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮在腸中誘導(dǎo)熱休克蛋白質(zhì)70，對于腸病，更具體而言對于炎癥性腸病的預(yù)防和/或治療是有效的。另外，由于本發(fā)明的化合物可以不通過灌腸給藥，而進(jìn)行口服給藥，所以能在不給患者帶來過度負(fù)擔(dān)的情況下預(yù)防和/或治療腸病。


圖1表示本發(fā)明中GGA經(jīng)口給藥對DSS給藥7天后的臨床效果的結(jié)果。腹瀉和直腸出血的數(shù)據(jù)是通過F檢驗(yàn)分析的。體重?fù)p失的變化數(shù)據(jù)是利用Studentt檢驗(yàn)分析的。所有的值都與DSS和對照藥處理的小鼠進(jìn)行比較。另外，*表示P＜0.05、**表示P＜0.01、***表示P＜0.001，a表示以給藥當(dāng)天為100％時(shí)的比率。
圖2表示香葉基香葉基丙酮(GGA)對飲用水中含有3％葡聚糖硫酸鈉(DSS)給藥7天后的大腸短小化的抑制效果的結(jié)果。左邊的棒圖表示正常的對照小鼠的結(jié)果，中間的棒圖表示給對照藥的小鼠的結(jié)果，右邊的棒圖表示以300mg/kg的GGA處理的小鼠的結(jié)果。給以對照藥的小鼠(n＝10)與GGA處理的小鼠(n＝10)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。同樣的結(jié)果在3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中都得到確認(rèn)。
圖3表示GGA對DSS誘導(dǎo)BALB/c小鼠組織損傷的效果的組織學(xué)討論結(jié)果。將大腸組織沿長軸方向展開，用10％的中性緩沖福爾馬林固定，然后浸漬在石蠟中。從載玻片上薄薄的組織切片中除去石蠟后，用HE將樣品染色。(A)表示只給飲用水的小鼠大腸顯微鏡照片。(B)表示用3％DSS溶液處理7天的小鼠大腸顯微鏡照片。觀測到重癥炎癥性細(xì)胞浸潤和上皮細(xì)胞破壞。(C)表示每隔1日對給予3％DSS溶液的小鼠給予對照藥的小鼠大腸顯微鏡照片。呈現(xiàn)與(B)相同的組織學(xué)外觀。(D)表示每隔1日(共4次)對給予3％DSS溶液的小鼠用300mg/kg的GGA進(jìn)行處理的小鼠大腸顯微鏡照片。GGA抑制粘膜和粘膜下組織內(nèi)的炎癥性細(xì)胞浸潤，并顯示出保護(hù)大腸粘膜上皮細(xì)胞免于破壞的作用。另外，本圖中的倍率為100倍。
圖4表示3％DSS給藥7天后的小鼠的大腸組織學(xué)評(píng)分結(jié)果。在組織損傷的組織學(xué)評(píng)價(jià)中，用顯微鏡評(píng)價(jià)炎癥性病變程度，利用本說明書的實(shí)施例中所述的方法定量。具有小點(diǎn)的棒圖表示給對照藥的小鼠(n＝10)的結(jié)果，黑色棒圖表示GGA處理的小鼠(n＝10)的結(jié)果。GGA處理的小鼠(n＝10)的結(jié)果與給對照藥的小鼠(n＝10)的結(jié)果比較，組織損傷和病變程度都有意義地被抑制。
圖5表示在3％DSS誘導(dǎo)大腸炎的大腸中，HSP25、40、70、90的Western Blot分析結(jié)果。大腸組織勻漿是由GGA給藥前和給藥12小時(shí)后的小鼠的大腸配制的。利用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)印到硝基纖維素上，使用HSP或β-肌動(dòng)蛋白特異性抗體免疫印跡HSP25、40、70、90的表達(dá)。與給對照藥的小鼠比較，GGA處理的小鼠的HSP70表達(dá)顯著增加。同樣的結(jié)果在3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中都得到確認(rèn)。
圖6表示DSS誘導(dǎo)大腸炎的大腸中HSP70的免疫組織化學(xué)的分析結(jié)果。表示用抗HSP70抗體或羊IgG處理的小鼠的大腸照片(50倍)。(A)表示取自用羊IgG處理的正常小鼠的大腸粘膜切片照片。(B)表示取自用抗HSP70抗體處理的正常小鼠的大腸切片照片。(C)表示用抗HSP70抗體處理的媒介物(vehicle)處理小鼠的大腸切片照片。(D)表示取自用DSS和GGA處理的小鼠的大腸切片照片。與未處理組和對照藥給藥組小鼠比較，表面上皮細(xì)胞和浸潤單核細(xì)胞中HSP70的表達(dá)增加。顯微鏡照片表示由實(shí)驗(yàn)得到的具有代表性的切片。所有試料具有同樣的外觀。
圖7表示小鼠經(jīng)3％DSS誘導(dǎo)大腸炎處理7天后，大腸的髓過氧化物酶(MPO)的活性結(jié)果。左邊的棒圖表示正常的對照小鼠的結(jié)果，中間的棒圖表示媒介物處理小鼠的結(jié)果，黑色棒圖表示經(jīng)300mg/kg的GGA處理的小鼠的結(jié)果。GGA的經(jīng)口給藥能抑制因給予DSS而引起的MPO活性提高。對照藥給藥組的小鼠(n＝10)和GGA處理小鼠(n＝10)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖8表示經(jīng)3％DSS處理7天后，大腸的TNF-α和IFN-γ的生成結(jié)果。利用本說明書的實(shí)施例中所述的ELISA分析細(xì)胞因子含量。左邊的棒圖表示正常的對照小鼠的結(jié)果，中間的棒圖表示媒介物處理小鼠的結(jié)果，黑色棒圖表示經(jīng)300mg/kg的GGA處理的小鼠的結(jié)果。經(jīng)GGA處理的小鼠(n＝10)的大腸中的TNF-α和IFN-γ的生成與對照藥給藥組小鼠(n＝10)比較，有意義地減少。
圖9表示GGA對TNBS誘導(dǎo)的重癥大腸炎存活率的影響結(jié)果。GGA對用TNBS(270mg/kg)處理的BALB/c小鼠的存活率的影響在7天后進(jìn)行評(píng)價(jià)。左邊的棒圖表示正常的對照小鼠的結(jié)果，中間的棒圖表示經(jīng)TNBS和媒介物處理的小鼠的結(jié)果，黑色棒圖表示經(jīng)TNBS和300mg/kg的GGA處理的小鼠的結(jié)果。由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果以平均±SE表示。
圖10表示GGA對TNBS誘導(dǎo)大腸炎的體重?fù)p失的預(yù)防結(jié)果。表示GGA對TNBS誘導(dǎo)7天后導(dǎo)致的體重?fù)p失的保護(hù)效果。白色棒圖表示未經(jīng)處理的小鼠(n＝10)的結(jié)果，具有斜線的棒圖表示經(jīng)TNBS和媒介物處理的小鼠(n＝6)的結(jié)果，黑色棒圖表示經(jīng)TNBS和300mg/kg的GGA處理的小鼠(n＝6)的結(jié)果。結(jié)果以平均±SE表示。
圖11是DSS腸炎模型小鼠的對照組的病理組織圖。
圖12是DSS腸炎模型小鼠的GGA給藥組的病理組織圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施方式是為了說明本發(fā)明的示例，并不是將本發(fā)明限定于該實(shí)施方式。本發(fā)明只要不脫離其要旨，可以以各種方式實(shí)施。
本發(fā)明提供對腸病、尤其是炎癥性腸病的治療有效、毒性小的預(yù)防劑和/或治療劑。下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
作為本發(fā)明的有效成分的化合物是以式(I)表示的異戊烯酮類化合物。
本發(fā)明中優(yōu)選使用的化合物的化學(xué)名為6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮(別名香葉基香葉基丙酮，通用名替普瑞酮，下面簡稱為“GGA”)。本發(fā)明使用的GGA在其結(jié)構(gòu)中具有4處雙鍵，一共存在8種幾何異構(gòu)體，但本發(fā)明中沒有特別限定，可以使用任一種異構(gòu)體，也可以為2種或2種以上的混合物。上述化合物中，作為優(yōu)選的化合物可以舉出(5E，9E，3E)-6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮和(5Z，9E，13E)-6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
本發(fā)明使用的GGA是公知的化合物，可以作為試劑、工業(yè)原料購入。作為GGA的合成方法，例如，可以按照特開昭53-145922號(hào)公報(bào)中公開的方法合成。
本發(fā)明中使用的有效成分GGA中可以存在多晶型，沒有特別限定，可以單獨(dú)使用任一種結(jié)晶型，也可以使用結(jié)晶型混合物。而且，本發(fā)明中使用的GGA在生物體內(nèi)分解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
本發(fā)明的預(yù)防劑和/或治療劑可以直接使用GGA，或配合下述通常用作醫(yī)藥品制劑的原料的成分，通過常用方法制成制劑，上述成分包括公知的藥理學(xué)上可接受的載體等，例如，賦形劑(具體可以舉出乳糖、白糖、淀粉、甘露醇等)、粘合劑(具體可以舉出α-淀粉、阿拉伯膠、羧基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等)、潤滑劑(具體包括硬脂酸鎂、滑石等)、崩解劑、著色劑、矯味矯臭劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、pH調(diào)整劑、防腐劑、抗氧化劑等。另外，根據(jù)需要還可以配合血流促進(jìn)劑、殺菌劑、消炎劑、細(xì)胞激活劑、維生素類、氨基酸、保濕劑、角質(zhì)溶解劑等成分。
作為本發(fā)明的預(yù)防劑和/或治療劑的制劑化的劑型，可以舉出片劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、包衣片劑、膠囊劑、糖漿劑、含片劑、吸入劑、栓劑、注射劑、凍干劑、軟膏劑、眼膏劑、滴眼劑、滴鼻劑、滴耳劑、糊劑、洗劑等。
另外，在本發(fā)明中，對GGA的給藥方式?jīng)]有特別限定，優(yōu)選經(jīng)口給藥。GGA可以以商品名為“Selbex”(衛(wèi)材株式會(huì)社制)的產(chǎn)品購入。
本發(fā)明的含有GGA的預(yù)防劑和/或治療劑對哺乳動(dòng)物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、馬、猴等)的腸病的預(yù)防和/或治療是有用的，特別是對人的腸病的治療和/或預(yù)防有用。
本發(fā)明的含有GGA的預(yù)防劑和/或治療劑的給藥量根據(jù)癥狀、年齡、體重等條件適當(dāng)選擇，成人一日20～2000mg，優(yōu)選50～1000mg，進(jìn)一步優(yōu)選100～500mg。
本發(fā)明的GGA化合物治療的疾病是腸病，可以舉出克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病、單純性潰瘍、放射線腸炎和缺血性腸炎等，尤其對克隆氏病或潰瘍性大腸炎有效。
利用下面的實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于此。基于本發(fā)明的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行各種變更、修飾，上述變更、修飾也包括在本發(fā)明中。
實(shí)施例實(shí)施例1(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)小鼠使用8-10周齡、體重22～25g的SPF(specific pathogen free)BALB/c雄性小鼠(Charles River Japan(株))。全部小鼠都給予標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)飼料，使其自由攝食飲水。本發(fā)明遵守赫爾辛基宣言，已經(jīng)得到北海道大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定委員會(huì)的批準(zhǔn)。
(統(tǒng)計(jì)分析)只要沒有特別說明，后述的全部數(shù)據(jù)都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用F檢驗(yàn)和Student t檢驗(yàn)(StatView，SAS Institute，Cray，NC)，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(GGA的配制和經(jīng)口給藥)將GGA(商品名“Selbex”、衛(wèi)材株式會(huì)社制)由5％阿拉伯膠溶液和0.0008％生育酚混合后進(jìn)行使用。通過1ml注射器上帶有的金屬管，以300mg/kg/次的給藥量，將以體積表示為5ml/kg/次的GGA經(jīng)口給予小鼠。對照組小鼠給以含有相同量的生育酚的阿拉伯膠(以下稱為對照藥)。各組小鼠在DSS給藥前2小時(shí)和第一次DSS給藥后，連續(xù)7天，每隔一天給予GGA或?qū)φ账幰淮?共4次)。在DSS大腸炎的臨床評(píng)價(jià)中，劑量依賴性實(shí)驗(yàn)是通過GGA的不同給藥量(50、100、300、500mg/kg)進(jìn)行評(píng)價(jià)的。為利用Western Blot法分析GGA對HSP70的誘導(dǎo)效果，將小鼠以300mg/kg GGA單次經(jīng)口給藥進(jìn)行處理。收集GGA或?qū)φ账幗o藥前后的各小鼠大腸組織的樣品。
(葡聚糖硫酸鈉DSS大腸炎的誘導(dǎo)和評(píng)價(jià))通過使小鼠在7天內(nèi)自由攝入3.0％DSS(分子量40,000；ICNBiochemicals Inc制，美國加利福尼亞州)的水溶液，誘導(dǎo)腸炎。從給藥開始，每天觀察小鼠的體重、直腸出血和腹瀉。稱量各小鼠的體重。在實(shí)驗(yàn)的各階段，為進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，測定細(xì)胞因子、HSP和髓過氧化物酶(下面稱為“MPO”)的活性，以各種時(shí)間間隔采集大腸組織。將大腸保存在-80℃直至使用前。大腸炎的嚴(yán)重程度通過在DSS給藥開始7天后的大腸長度和組織學(xué)檢查進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖1表示在本發(fā)明的實(shí)施例中，對照藥給藥組和GGA處理組的小鼠在DSS誘導(dǎo)大腸炎時(shí)腹瀉和直腸出血的頻率。由圖1可知，與對照藥給藥組比較，300mg/kg/次和500mg/kg/次的GGA處理組中腹瀉和直腸出血的頻率有意義地減少。另外，在對照藥給藥組中，以DSS給藥前的體重作為100％，DSS給藥7天后，小鼠體重減少至86.3±2.4％，而在GGA處理組中，與處理組比較，體重的變化有意義地降低(300mg/kg/次的組為93.8±4.1％，500mg/kg/次的組為94.7±5.0％)。在GGA劑量依賴性效果的臨床評(píng)價(jià)中，發(fā)現(xiàn)GGA300mg/kg/次的給藥量就能充分抑制疾病發(fā)作。
已知大腸的短小化與組織的變化存在緊密關(guān)系，通常將大腸的長度用作炎癥程度的形態(tài)學(xué)參數(shù)。為了評(píng)價(jià)大腸的長度，在規(guī)定的時(shí)間處死各組小鼠。圖2表示DSS給藥7天后大腸的長度。圖2表示GGA處理組的大腸長度(6.8±0.3cm)有意義地長于對照藥處理組的大腸長度(5.1±0.1cm)。
(DSS大腸炎的組織學(xué)分析)將大腸組織沿長軸方向切開并展開，用10％中性福爾馬林緩沖液固定，浸漬在石蠟中。在載玻片上除去上述組織部分的石蠟后，用蘇木精曙紅(以下稱為“HE”)染色。作為組織損傷的組織學(xué)評(píng)價(jià)，利用顯微鏡觀察炎癥性病變區(qū)域，對Cooper等的方法(Benjamin IJ，McMIllan DR.Stress(heat shock)proteins molecular chaperones.Circ Res.199827；83117-32.)進(jìn)行若干修改，由二位病理學(xué)專家進(jìn)行定量。將大腸損傷分為6個(gè)階段。即，0粘膜正常，1炎癥細(xì)胞浸潤，2半數(shù)或半數(shù)以下的腺窩發(fā)生短小化，3半數(shù)以上腺窩發(fā)生短小化，4腺窩消失，5上皮細(xì)胞脫落(潰瘍形成或侵蝕)。此外，還評(píng)價(jià)炎癥病變的范圍。將大腸整體的病變范圍分為6個(gè)階段。即，00％，11～20％，221～40％，341～61％，461～80％，581～100％。
圖3表示本發(fā)明的DSS大腸炎的組織學(xué)分析結(jié)果。DSS處理的BALB/c小鼠的大腸組織學(xué)是利用HE染色，為評(píng)價(jià)GGA對組織損傷的效果而進(jìn)行研究的。大腸浸潤細(xì)胞的數(shù)目在DSS處理前最小(參見圖3A)，DSS處理7天后，浸潤細(xì)胞的數(shù)目增加，同時(shí)腺窩消失，上皮細(xì)胞壞死增加(參見圖3B)。在GGA處理組，組織損傷得到有意義地改善，與對照藥處理組比較，浸潤炎癥細(xì)胞的數(shù)目減少(參見圖3C及D)。在GGA處理的小鼠中，包括組織損傷和病變范圍的病理組織學(xué)評(píng)分結(jié)果與未處理組或?qū)φ账幪幚斫M小鼠相比，有意義地降低(參見圖4)。另外，圖4表示本發(fā)明的3％DSS給藥7天后的小鼠大腸組織學(xué)評(píng)分結(jié)果。
(Western Blot分析)使用Polytron均化器(Kinematica，Lucerne Switzerland)粉碎組織。將等量的組織勻漿溶解在含有2-巰基乙醇(1％)、SDS(2％)、丙三醇(20％)和溴酚藍(lán)(0.04％)的20μl 50mM(pH6.8)Tris-HCl中，將樣品在100℃加熱5分鐘。接下來，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離上述樣品，然后，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜上。用PBS溶液中的1％無脂肪干燥乳固定上述膜，使用抗HSP25、40、70、90抗體(Stressgen，Victoria，BC Canada)和β-肌動(dòng)蛋白(Sigma，St Loius，MO)進(jìn)行探測，然后使其與結(jié)合有辣根過氧化酶(以下稱為“HRP”)的羊抗兔IgG抗體反應(yīng)。為了用于基于制造商操作指示的檢出系統(tǒng)，對殘留的復(fù)合體進(jìn)行處理。使用Micro BCA蛋白質(zhì)檢查試劑盒定量細(xì)胞組織勻漿的蛋白質(zhì)濃度。
(免疫組織化學(xué))HSP70免疫組織化學(xué)的分析是基于制造商操作指示，使用VectastainABC試劑盒進(jìn)行的。將石蠟浸漬的大腸組織切成4μ厚的薄片。將上述薄片在3％H2O2中，于4℃進(jìn)行10分鐘前處理，接下來，在室溫下，用10％的正常羊血清處理30分鐘，然后在4℃用抗HSP70抗體(以1∶200進(jìn)行稀釋，Stressgen，Victoria，BC Canada)培養(yǎng)1夜。利用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)將HSP70陽性染色，使其可視化。
圖5是在3％DSS處理的大腸炎模型小鼠的大腸中，HSP25、40、70、90的Western Blot分析結(jié)果。使用HSP25、40、70、90對應(yīng)的抗體，利用Western Blot分析研究HSP的表達(dá)。HSP70在GGA添加(300mg/kg)前檢出較弱，但在GGA處理12小時(shí)后其表達(dá)水平增大。另一方面，HSP25、40和90的表達(dá)，經(jīng)GGA處理沒有變化(參見圖5)。
圖6表示本發(fā)明的DSS誘導(dǎo)大腸炎的大腸中HSP70的免疫組織化學(xué)的分析結(jié)果。為了確認(rèn)患有DSS誘導(dǎo)大腸炎的小鼠的大腸中HSP70的表達(dá)部位，利用大腸組織中HSP70的特異性抗體進(jìn)行HSP70的免疫組織學(xué)評(píng)價(jià)。HSP70的免疫反應(yīng)性在上皮細(xì)胞和正常小鼠的腺窩處是弱陽性(參見圖6B)。在DSS誘導(dǎo)和對照藥處理小鼠的大腸中HSP70陽性的染色細(xì)胞幾乎不存在。更有趣的是，GGA處理的小鼠大腸組織的染色比對照藥處理小鼠的染色強(qiáng)很多(參見圖6D)。上述現(xiàn)象支持了GGA在大腸誘導(dǎo)內(nèi)因性HSP的假說。
(大腸中髓過氧化物酶活性的測定)組織MPO活性是根據(jù)將Krawisz等的方法(Krawisz JE，Sharon P，Stenson WF.Quantitative assay for acute intestinal inflammation based onmyeloperoxidase activity.Assessment of inflammation in rat and hamstermodels.Gastroenterology 1984；871344-50.)進(jìn)行若干修改后的方法測定的。即，使用Polytron型均化器，將各試料分別置于冰浴中，在緩沖液(pH6.0、50mM磷酸鉀緩沖液中的、0.5％十六烷基三甲基溴化銨)中粉碎組織試料(約300mg)，共進(jìn)行3次，每次30秒。在4℃以20，000xg的條件將上述樣品離心分離20分鐘，收集上清液。將100μl上述樣品加入到2.9ml含有0.167mg/ml的鄰聯(lián)二茴香胺鹽酸鹽和0.0005％過氧化氫的50mM磷酸緩沖液(pH6.0)中，在25℃使用分光器進(jìn)行測定。為了校正，使用Bradford測試試劑盒(Bio-rad laboratories，Hercules，CA)確定上清液的蛋白質(zhì)濃度，并使用來源于人白細(xì)胞(Sigma，St.Loius，MO)的精制MPO將其值標(biāo)準(zhǔn)化。
作為炎癥的其他參數(shù)，有大腸組織中髓過氧化物酶(MPO)的活性水平。MPO是主要由多核白細(xì)胞產(chǎn)生的酶，是與組織的粒細(xì)胞相關(guān)的酶。圖7表示本發(fā)明中3％DSS誘導(dǎo)大腸炎處理7天后的小鼠大腸的MPO活性結(jié)果。在DSS給藥的媒介物處理小鼠中，MPO活性水平顯著增大(參見圖7)。與媒介物處理組的MPO活性水平(2.8±0.3units/g)比較，GGA處理小鼠的MPO活性水平有意義地降低(1.4±0.4units/g、P＜0.03)。上述結(jié)果證實(shí)了GGA阻礙粒細(xì)胞浸潤。
(針對細(xì)胞因子的酶免疫測定法)利用TNF-α特異性ELISA試劑盒(GT，Minneapolis，MN)測定大腸組織中的TNF-α。將溶解在50ml的磷酸緩沖生理鹽水(PBS)中的抗小鼠TNF-αIgG單克隆抗體加到96孔板的各孔中，于室溫放置30分鐘。將上述板用蒸餾水沖洗3次后，在全部孔中加入用于固定的含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS，于室溫放置20分鐘。除去固定溶液后，向各孔添加2次血漿或組織樣品，于室溫培養(yǎng)1小時(shí)。使用添加了肝素的注射器利用心臟穿刺采集血漿。為制備大腸組織樣品，用Polytron均化器(Kinematica，Lucerne Switzerland)粉碎含有蛋白酶抑制劑(根據(jù)制造商操作指示調(diào)制，每20mg組織使用1μl蛋白酶抑制劑)的混合物的PBS中的組織，然后以12，000xg的條件離心分離10分鐘，檢測上清液。為了得到標(biāo)準(zhǔn)曲線利用小鼠重組TNF-α蛋白質(zhì)。用含有0.05％Tween-20(沖洗緩沖液)的PBS沖洗3次孔板以后，向各孔中加入50μl結(jié)合有生物素的抗TNF-α抗體。于室溫培養(yǎng)1小時(shí)后，再次用沖洗緩沖液將孔板沖洗3次。接下來，向各孔中加入結(jié)合有抗生物素蛋白的羊抗兔IgG抗體，將上述孔板于室溫培養(yǎng)15分鐘。用沖洗緩沖液沖洗3次后，向各孔中加入50μl基質(zhì)溶液。上述10μl基質(zhì)溶液中含有8μg鄰苯二胺和4μl 30％H2O2的檸檬酸磷酸緩沖液(pH5.0)。于室溫培養(yǎng)20分鐘后，用25μl的4N硫酸停止反應(yīng)。使用ELISA孔板讀數(shù)器(Bio-rad，Model 3550，Hercules，CA，USA)在492nm下測定吸光度。
同樣，組織中的小鼠IFN-γ也使用IFN-γ特異性ELISA試劑盒進(jìn)行測定。
為從GGA處理抑制大腸中細(xì)胞因子生成的觀點(diǎn)說明作用部位，使用ELISA測定大腸組織中TNF-α和IFN-γ的生成。圖8表示3％DSS處理7天后的大腸中TNF-α和IFN-γ的生成結(jié)果。在大腸組織中，TNF-α和IFN-γ的含量，在DSS處理7天后增加(分別為7.9±1.0和9.7±1.2pg/mg蛋白)。另一方面，GGA處理小鼠的上述細(xì)胞因子的生成與媒介物處理小鼠相比有意義地減少(分別為4.2±0.8和4.1±0.8pg/mg蛋白)。上述結(jié)果暗示GGA抑制大腸中促炎(proinflammatory)細(xì)胞因子的生成。
(2，4，6-三硝基苯磺酸TNBS大腸炎的誘導(dǎo)和評(píng)價(jià))使上述BALB/c小鼠誘導(dǎo)TNBS大腸炎。即，禁食一夜后腹腔注射苯巴比妥(70mg/kg)，麻醉小鼠。為評(píng)價(jià)TNBS大腸炎的存活率，利用具有聚乙烯插管(intramedic PE-20；Beckton Dicknson社制；加利福尼亞州圣荷西)的1ml注射器對腸管內(nèi)腔(距離肛門外緣約3cm)注射50％乙醇溶液中的100μl TNBS(250mg/kg)。為測定體重與第一天相比的變化，以50％的乙醇中的給藥量為100mg/kg的TNBS處理小鼠。
為評(píng)價(jià)不同大腸炎模型中GGA的效果，研究了GGA對TNBS誘導(dǎo)大腸炎的存活率和體重?fù)p失的效果。在該模型中，由于270mg/kg的TNBS給藥量誘導(dǎo)重癥炎癥，因此很多小鼠在TNBS給藥7天后死亡。
圖9表示本發(fā)明的GGA對TNBS誘導(dǎo)的重癥大腸炎的存活率的影響結(jié)果。對照藥處理和TNBS處理小鼠的存活率減少至23.3±8.8％(參見圖9)。而通過GGA經(jīng)口給藥，TNBS誘導(dǎo)大腸炎的存活率有意義地增加至56.7±3.3％。
圖10表示GGA對TNBS誘導(dǎo)大腸炎的體重?fù)p失的預(yù)防效果的結(jié)果。與存活率相同，與對照藥處理小鼠比較(22.1±3.3％)，GGA處理小鼠的體重?fù)p失最小(-5.6±1.2％)(參見圖10)。
實(shí)施例2(DSS模型中大腸炎的出現(xiàn))使8周齡的小鼠(Balb/c小鼠，Charles River，靜岡)(n＝10)在7日內(nèi)自由飲用3％葡聚糖硫酸鈉(以下稱為“DSS”)水溶液，出現(xiàn)腸炎。小鼠在DSS水溶液給藥第5～6天，出現(xiàn)腹瀉、便血、體重減少。在DSS給藥前和DSS給藥3天后，使用探測裝置將GGA(衛(wèi)材株式會(huì)社制)100mg/kg混合在生理鹽水中給藥。
(GGA給藥對大腸炎模型的炎癥抑制效果)DSS給藥開始7天后取小鼠腸管，肉眼評(píng)價(jià)組織學(xué)現(xiàn)象。非給藥組和給藥組的病理組織圖分別如圖11和圖12所示。其結(jié)果是圖11的對照組中發(fā)生組織損傷，另一方面，在GGA給藥組中幾乎未見組織損傷。而且，針對發(fā)明人制定的6階段評(píng)分，對炎癥導(dǎo)致的組織損傷程度、炎癥范圍分別進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分基準(zhǔn)如下所示。
炎癥導(dǎo)致的組織損傷程度0無炎癥1炎癥細(xì)胞輕度浸潤2腺窩輕度短小化3腺窩高度短小化4腺窩消失5上皮細(xì)胞脫落炎癥的范圍0無11～20％221～40％341～60％461～80％581～100％。
GGA給藥組和非給藥組的評(píng)分比較，其結(jié)果如表1所示。由表1可知，給予GGA能抑制組織損壞的程度，而且縮小炎癥的范圍。另外，同樣地比較腹瀉的發(fā)病率、便血的發(fā)病率、體重減少率、腸管長度。其結(jié)果如表2所示。由表2可知，GGA給藥能抑制DSS腸炎引起的腹瀉或便血的發(fā)病，并且也具有抑制體重減少或腸管收縮的效果。
由此可知，GGA對作為炎癥性腸病模型的DSS腸炎是非常有效的。
表1、GGA給藥對DSS腸炎的抑制效果的組織學(xué)評(píng)分

表2、GGA給藥對DSS腸炎的抑制效果

以上結(jié)果證實(shí)了GGA經(jīng)口給藥抑制DSS誘導(dǎo)的腹瀉和直腸出血、以及體重?fù)p失等臨床疾病癥狀。而且，GGA經(jīng)口給藥，在大腸中誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)，抑制MPO的活性水平和促炎細(xì)胞因子的生成。另外，在與DSS腸炎模型不同的TNBS誘導(dǎo)大腸炎中，GGA的效果也得到確認(rèn)。已知對于小鼠，急性TNBS誘導(dǎo)大腸炎比DSS誘導(dǎo)腸炎嚴(yán)重。TNBS的高劑量給藥處理的小鼠的存活率可以通過GGA的經(jīng)口給藥得到改善，體重?fù)p失也由于GGA而被有意義地抑制。由上述結(jié)果可知GGA通過HSP70的高表達(dá)顯示抗炎癥作用，在人IBD的治療中有效。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，通過GGA給藥，在大腸中誘導(dǎo)熱休克蛋白質(zhì)，對腸病，特別是炎癥性腸病的預(yù)防和/或治療有效，因此本發(fā)明提供含有GGA作為有效成分的腸病的預(yù)防和/或治療劑。
權(quán)利要求
1.一種腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其含有熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其中所述熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑是異戊烯酮類化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其中所述異戊烯酮類化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
4.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其中所述腸病是炎癥性腸病。
5.如權(quán)利要求4所述的腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其中所述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
6.如權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其中所述熱休克蛋白質(zhì)是熱休克蛋白質(zhì)70。
7.一種炎癥性腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作為有效成分。
8.如權(quán)利要求7所述的炎癥性腸病預(yù)防劑和/或治療劑，其中所述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
9.一種腸病的預(yù)防方法和/或治療方法，其包括給予熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的腸病的預(yù)防方法和/或治療方法，其中所述熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑是異戊烯酮類化合物。
11.如權(quán)利要求10所述的腸病的預(yù)防方法和/或治療方法，其中所述異戊烯酮類化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
12.如權(quán)利要求9～11任一項(xiàng)所述的腸病的預(yù)防方法和/或治療方法，其中所述腸病是炎癥性腸病。
13.如權(quán)利要求12所述的預(yù)防方法和/或治療方法，其中所述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
14.如權(quán)利要求9～13任一項(xiàng)所述的腸病的預(yù)防方法和/或治療方法，其中所述熱休克蛋白質(zhì)是熱休克蛋白質(zhì)70。
15.一種炎癥性腸病的預(yù)防方法和/或治療方法，其以式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作為有效成分。
16.如權(quán)利要求15所述的預(yù)防方法和/或治療方法，其中所述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
17.熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物在制備含有熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物作為有效成分的腸病預(yù)防劑和/或治療劑中的用途。
18.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑是異戊烯酮類化合物。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述異戊烯酮類化合物是式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮。
20.如權(quán)利要求17～19任一項(xiàng)所述的用途，其中所述腸病是炎癥性腸病。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其中所述炎癥性疾病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
22.如權(quán)利要求17～21任一項(xiàng)所述的用途，其中所述熱休克蛋白質(zhì)是熱休克蛋白質(zhì)70。
23.熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物在制備含有式(I)所示的6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九碳四烯-2-酮作為有效成分的炎癥性腸病的預(yù)防劑和/或治療劑中的用途。
24.如權(quán)利要求23所述的用途，其中所述炎癥性腸病是選自克隆氏病、潰瘍性大腸炎、腸道型白塞氏病和缺血性腸炎的疾病。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供對腸病，特別是炎癥性腸病有效的制劑。上述目的是通過含有熱休克蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑或其鹽或上述化合物的水合物作為有效成分的腸病的預(yù)防劑和/或治療劑而實(shí)現(xiàn)的。具體而言，本發(fā)明提供含有作為異戊烯酮類化合物的6，10，14，18－四甲基－5，9，13，17－十九碳四烯－2－酮作為有效成分的腸病的預(yù)防劑和/或治療劑。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1791394SQ20048001357
公開日2006年6月21日 申請日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日
發(fā)明者淺香正博, 西平順, 大川原辰也, 武田宏司 申請人:衛(wèi)材株式會(huì)社, 淺香正博