專利名稱：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的肽，因此該肽可以用作具有降低血壓作用的健康食品、藥物等的組分。
現(xiàn)有技術(shù)高血壓是與生活方式相關(guān)的疾病的一個典型的例子，高血壓患者的數(shù)量年年增加。已知高血壓誘導(dǎo)各種并發(fā)癥例如腦出血，蛛網(wǎng)膜下出血，腦梗死，心肌梗死，心絞痛，腎硬化等等。因此已經(jīng)對高血壓的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行各種研究。
作為血壓-調(diào)節(jié)系統(tǒng)，與血壓升高相關(guān)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)和與血壓降低相關(guān)的激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)起到重要的作用。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中，肝臟中分泌的血管緊張素原被腎產(chǎn)生的腎素轉(zhuǎn)化成血管緊張素I。血管緊張素I進(jìn)一步被血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)轉(zhuǎn)化成血管緊張素II。血管緊張素II誘導(dǎo)血管平滑肌收縮因而血壓升高。另一方面，降低血壓系統(tǒng)中的激肽釋放酶作用于激肽原，因此產(chǎn)生緩激肽。緩激肽具有引發(fā)血管舒張的作用并降低血壓。然而，ACE具有降解緩激肽的作用。就是說，已知ACE通過上述兩種作用參與到血壓升高中，即產(chǎn)生血管緊張素II，其是一種血管加壓肽，以及鈍化緩激肽，其是一種降低血壓肽。因此可能通過抑制ACE的酶活性從而減少血壓升高。已經(jīng)廣泛使用作為ACE抑制劑的脯氨酸衍生物例如卡托普利和依拉普利治療高血壓。
最近幾年，已經(jīng)報道通過用酶消化食物原料得到的肽具有ACE抑制活性。例如，已經(jīng)報導(dǎo)了大量的這類消化產(chǎn)物，例如，明膠的膠原酶消化產(chǎn)物(日本專利公開SHO 52-148631)，酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物(日本專利公開SHO 58-109425，日本專利公開SHO 59-44323，日本專利公開SHO 60-23086，日本專利公開SHO 60-23087，日本專利公開SHO 61-36226和日本專利公開SHO 61-36227)，γ-玉米醇溶蛋白的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物(日本專利公開SHO 2-32127)，沙丁魚肉的胃蛋白酶消化產(chǎn)物(日本專利公開HEI 3-11097)，干鰹的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物(日本專利公開HEI 4-144696)，芝麻蛋白質(zhì)的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物(日本專利公開HEI 8-231588)，κ-酪蛋白的胃蛋白酶消化產(chǎn)物(日本專利公開8-269088)等。
這些食物來源的ACE抑制肽具有顯著的優(yōu)勢，即它們幾乎沒有安全問題(即，副作用，毒性等)并且像普通的食物一樣可以食用。然而，已經(jīng)報道上述肽產(chǎn)物主要包括具有5個或更多個氨基酸的肽(日本專利公開SHO 52-148631，日本專利公開SHO 58-109425，日本專利公開SHO 59-44323，日本專利公開SHO 60-23086，日本專利公開SHO 61-36226，日本專利公開SHO 61-36227，日本專利公開HE I3-11097，日本專利NO.3135812，日本專利公開HEI 8-269088)。已經(jīng)指出，由長氨基酸鏈構(gòu)成的肽不能取得根據(jù)體外強(qiáng)ACE抑制活性而預(yù)期的降血壓作用水平，很可能因為它們?nèi)菀妆惑w內(nèi)的消化酶消化，因而失去該ACE抑制活性，或者即使它們不被消化，由于它們的大分子結(jié)構(gòu)，它們不容易被吸收。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供ACE抑制三肽，當(dāng)口服使用時，該ACE抑制三肽不容易被消化酶所消化，因而在體內(nèi)較少地傾向于失去它們的ACE抑制活性。
在本發(fā)明中，也想要提供包含一種或幾種上述三肽的可食用(食物/飲料)的組合物，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及降血壓劑。
附圖的簡要描述

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的肽在自發(fā)性低血壓大鼠身上檢測降血壓效果的實驗結(jié)果。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明者們研究由不超過3個氨基酸構(gòu)成的ACE抑制肽，假定食物原料的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物將含有能解決上述問題的肽。結(jié)果，他們成功地在芝麻的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)3種三肽，所述的三肽具有ACE抑制活性并且在動物實驗中顯示了降血壓的作用?；谶@些發(fā)現(xiàn)完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供分別具有Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr，和Leu-Val-Tyr氨基酸序列的三肽，其顯示了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有一種或幾種上述三肽的可食用的組合物，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及降血壓劑。
根據(jù)本發(fā)明的三肽可以由化學(xué)合成產(chǎn)生。然而，在發(fā)明的一種實施方案中，其中該三肽被加入到食品、飲料或口服藥物中從而利用它們的ACE抑制活性，優(yōu)選產(chǎn)生一種可食用組合物，通過嗜熱菌蛋白酶消化來源于芝麻等中的植物蛋白，并進(jìn)一步將其進(jìn)行純化，使所述可食用組合物富集上述3個三肽中的至少一種。
使用富含蛋白質(zhì)的植物組織(優(yōu)選種子)作為植物性蛋白質(zhì)來源，例如谷類例如米，小麥，大麥，燕麥以及玉米，或豆例如菜豆，蠶豆，大豆以及綠豆和芝麻。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的肽通過嗜熱菌蛋白酶進(jìn)行消化而得到時，處理過程根據(jù)原材料的性質(zhì)進(jìn)行變化。優(yōu)選，作為預(yù)處理，例如通過壓榨除去汁液或用溶劑例如醇，丙酮，己烷等提取脂肪，原料首先被脫脂。為了增強(qiáng)嗜熱菌蛋白酶消化原材料的效率，也優(yōu)選原材料被精細(xì)研磨接著攪拌下懸浮于水中。如果是幾乎不溶的蛋白質(zhì)，也可能采用另一種預(yù)處理，例如加入氫氧化鈉或加熱從而均勻溶解或使蛋白質(zhì)懸浮。接著，加入適當(dāng)量的嗜熱菌蛋白酶，優(yōu)選為500至50000PU/g蛋白質(zhì)，在pH為5至9，溫度為10至80℃，在靜止?fàn)顟B(tài)或攪拌下蛋白質(zhì)消化反應(yīng)進(jìn)行0.5至48小時。(“PU”指的是“蛋白酶單位”，1PU被定義為在pH7.2和35℃條件下，使用乳酪蛋白作為底物每分鐘生成等量于1ug酪氨酸的非蛋白福林顏色的增量而所需的酶量。)。為了檢查是否進(jìn)行了充分的反應(yīng)(即，對于得到想要的三肽，該反應(yīng)是充分的)，使用了一種方法，包括“將液體反應(yīng)溶液加入使用ODS柱的高效液相色譜中，通過測量210nm的吸光度來確定洗脫方式”。通過加入例如鹽酸使反應(yīng)終止?？蛇x擇的是，可以通過加熱使嗜熱菌蛋白酶鈍化。也可能通過加入鹽酸和加熱來終止反應(yīng)。將液體反應(yīng)溶液進(jìn)行離心，過濾等并除去沉淀物。將這樣得到的濾液用氫氧化鈉或鹽酸進(jìn)行中和，接著進(jìn)行濃縮。此外，如果需要，將其用活性炭進(jìn)行處理可以除去臭味(例如苦味，酸澀，刺激氣味等)。如此得到的芝麻肽含有各自數(shù)量為0.001重量％至0.1重量％的Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr以及Leu-Val-Tyr。
由上述方法得到的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物可以用作本發(fā)明的三肽組合物，進(jìn)行或不進(jìn)行使用離子交換樹脂，高孔聚合樹脂等的進(jìn)一步的處理，從而除去高分子量蛋白質(zhì)，從而提供富含本發(fā)明三肽的部分純化產(chǎn)物。這些消化產(chǎn)物和部分純化產(chǎn)物通常在下文中有時被稱作“富含三肽的組合物”。如果需要，在使用前，這樣的組合物可以用活性炭進(jìn)一步進(jìn)行處理以除去臭味(例如苦味，酸澀，刺激氣味等)。
為了得到本發(fā)明的肽的純化制劑，將上述濃縮物進(jìn)行凝膠過濾柱層析，使用離子交換樹脂或高孔聚合樹脂的層析，親和層析等，并將具有ACE抑制活性的本發(fā)明的肽級分合并。接著，可以使用純化肽時經(jīng)常采用的方法將合并的活性級分進(jìn)行純化，例如使用帶反相柱例如ODS柱或C30柱的高效液相色譜法從而提供基本上是純態(tài)的單一形式的肽。使用上述方法不但從芝麻中(例如，胡麻(Sesamum indicum L.))，而且從谷類例如米(例如，稻(Oryza sativa L.))，小麥(例如，普通小麥(Triticum aestivum L.)，T.durum Desf.，圓錐小麥(T.turgidum L.)，T.pyramidale(Delile)Perciv.non Delile exSchult，T.abyssinicum Vavilov，以及T.carthlicum Nevski)，大麥(例如，大麥(Hordeum vulgare L.))，燕麥(例如，燕麥(AVenasativa L.))或玉米(例如，玉蜀黍(Zea mays L.))，或者豆例如菜豆(例如，菜豆(Phaseolus vulgaris L.))，蠶豆(例如，蠶豆(Vicia faba L.))，大豆(例如，大豆(Glycine max(L.)Merrill))或綠豆(例如，Vigna radiate(L.)R.Wilcz)可以得到本發(fā)明的三肽。三肽或富含三肽的組合物的ACE抑制活性可以通過例如將在下文實施例中描述的體外檢測方法和/或體內(nèi)檢測方法進(jìn)行測定。
當(dāng)本發(fā)明的每種肽都通過化學(xué)合成進(jìn)行制備時，可以使用合成肽時通常使用的任何一種固相方法和液相方法完成所述合成。由該合成得到的本發(fā)明的肽可以用經(jīng)常采用的純化方法進(jìn)行純化，例如反相高效液相色譜法，使用離子交換樹脂或高孔聚合樹脂的色譜法，親和色譜法等。
由此得到的三肽和富含三肽的組合物具有很強(qiáng)的抑制ACE的活性，當(dāng)口服后能顯示出很強(qiáng)的ACE抑制效果。因此作為高度有效的ACE抑制劑它們很有用處。而且，它們很容易通過胃腸道吸收，受熱時也比較穩(wěn)定?；谶@些特性，它們可以應(yīng)用到各種形式的食品，飲料和藥物制品。
因此，本發(fā)明提供含有一種或幾種上述三肽并且應(yīng)該具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制效果的可食用的組合物，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑以及包含一種或幾種上述三肽的降血壓劑。
當(dāng)在食品、飲料、藥品等中使用本發(fā)明的一種或幾種三肽時，可以使用充分純化自芝麻蛋白質(zhì)級分的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物的三肽，等等，或者使用化學(xué)合成產(chǎn)品?；蛘?，既然本發(fā)明的三肽具有高度穩(wěn)定性和強(qiáng)的ACE抑制活性，如上所述的部分純化產(chǎn)物或者嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物或其部分純化產(chǎn)物本身都同樣可以用作富含三肽的組合物；在這種情況下，也能獲得足夠的ACE抑制活性，因此為本發(fā)明的優(yōu)選實施例。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的可食用的組合物加入了一種或幾種如上所述的三肽，在單次服用劑量中三肽的含量為從0.001mg到100mg，優(yōu)選為從0.01mg到20mg，更優(yōu)選為從0.1mg到10mg。本發(fā)明的三肽為固體或粉末形式，很容易處理并極易溶于水。并且三肽也能夠很好地被胃腸道吸收。因此，三肽能夠沒有任何限制地在任何階段用任何方法添加到食品中。也就是說，在食品生產(chǎn)的起始、中間或最后階段，可以用食品工業(yè)領(lǐng)域的常用方法將三肽以粉末、溶液、懸浮液等形式添加到食品中。短暫的、間歇的、連續(xù)的或每天服用含三肽的可食用組合物就有可能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，并獲得例如降低血壓的效果。食品和飲料可以是例如固體、半流體或流體的形式。固體食品的例子包括以餅干，薄片，和諸如片劑、膠囊、顆粒和粉末等藥丸形式出現(xiàn)的普通食品和保健食品。半流體食品的例子包括以糊狀、果凍和膠凍形式出現(xiàn)的產(chǎn)品。流體食品的例子包括以果汁、冷飲、茶飲料、滋補(bǔ)飲料等形式出現(xiàn)的普通飲料和保健飲料。這些食物或飲料可以以營養(yǎng)補(bǔ)充飲料或調(diào)味品的形式供應(yīng)，以使我們能夠連續(xù)服用本發(fā)明的三肽，以此降低血壓升高的風(fēng)險。
本發(fā)明藥物組合物含有本發(fā)明的三肽，其數(shù)量與上述可食用組合物相似。本發(fā)明藥物組合物可以暫時給高血壓患者服用從而抑制體內(nèi)的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶，從而達(dá)到降低血壓的作用?？蛇x擇的是，本發(fā)明的藥物組合物可以安全地連續(xù)服用，因為活性成分源自天然材料。作為可以由本發(fā)明藥物組合物治療和/或預(yù)防的疾病的例子，可以提及高血壓。優(yōu)選該藥物組合物為口服制劑例如片劑，膠囊，粉劑，顆粒劑或糖漿的形式。用于非腸道使用的制劑的例子包括靜脈，動脈，皮下，肌內(nèi)或鼻內(nèi)使用的無菌溶液。這樣的溶液可以是干燥固體的形式，在使用前將其溶解。注射制劑可以通過將有效量的三肽溶解在生理鹽水中，在如生產(chǎn)注射制劑通常采用的無菌條件下進(jìn)行處理而進(jìn)行生產(chǎn)。
實施例現(xiàn)在，參照下面的實施例將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
測量ACE抑制活性的方法在本發(fā)明中，根據(jù)下面的方法測量ACE抑制活性(IC50)。
緩沖液0.1M HEPES，0.3M NaCl，0.01％Triton-x(pH8.3)。
酶來自兔肺的ACE(Sigma)。
將其溶解在上述緩沖液中，調(diào)成濃度為1mU/50ul。
底物Bz-Gly-His-Leu.H2O(Peptide Institute Inc.)。
將8.95mg底物溶解在1ml二甲亞砜中并進(jìn)一步用水稀釋5倍(最終的濃度4mM)。
將5ul含有本發(fā)明肽的樣品用移液管移入96孔微板中。加入25ul緩沖液和10ul酶后，將混合物完全攪拌，在37℃孵育5分鐘。加入10ul底物后，該混合物在37℃反應(yīng)30分鐘，接著加入40ul 0.1N NaOH使反應(yīng)停止。加入20ul 1％鄰苯二醛的甲醇溶液并在室溫下放置10分鐘后，加入100ul 0.1N HCl，將得到的混合液在37℃孵育30分鐘。接著通過激發(fā)(355nm)組氨酸殘基中的氨基和鄰苯二醛之間反應(yīng)形成的熒光物質(zhì)并測定波長為460nm的熒光，從而測定ACE水解形成的His-Leu的數(shù)量。根據(jù)下面等式確定本發(fā)明肽的抑制百分?jǐn)?shù)并計算ACE抑制活性(IC50)。
抑制百分?jǐn)?shù)＝{1-(A-a)/(B-b)}x100A當(dāng)加入樣品時熒光測量值。
a當(dāng)加入樣品并加入緩沖液作為酶的替代品時熒光測量值。
B當(dāng)加入蒸餾水替代樣品時熒光測量值。
b當(dāng)加入蒸餾水替代樣品并加入緩沖液替代酶時熒光測量值。
實施例1產(chǎn)生并純化肽將2L水加入100g脫脂芝麻中，并加入NaOH使得到的混合物的pH值調(diào)節(jié)至12.0至12.5。55℃攪拌1小時后，將該混合物過濾得到蛋白質(zhì)提取物。將HCl加入蛋白質(zhì)提取物中使pH值調(diào)節(jié)至4.0。離心后得到芝麻蛋白質(zhì)(折算成干重為19.8g)。
將300ml水加入10g得到的芝麻蛋白質(zhì)中，用NaOH將混合物的pH值調(diào)到7.5。接著向內(nèi)加入10mg嗜熱菌蛋白酶(Nacalai Tesque，7000PU/mg)，輕柔攪拌下該混合物于65℃反應(yīng)6小時。反應(yīng)完成后，將HCl加入反應(yīng)混合物中調(diào)至pH4.0，并加熱至90℃10分鐘使嗜熱菌蛋白酶鈍化。加熱后，通過離心除去這樣形成的沉淀物，通過紙濾器過濾上清液(Toyo，No.2)。將濾液冷凍干燥得到5.9g肽粉末。
將80mg該肽粉末溶解在2ml 10％乙醇溶液中，并進(jìn)行凝膠過濾柱層析。采用的條件如下柱Bio-Gel P-2(15mm ID x 820mm L，Bio-Rad)。
洗脫液10％乙醇。
流速0.15ml/min。
檢測UV210nm。
使用級分收集器以15分鐘間隔收集來自柱的洗脫級分。根據(jù)上述方法測定每種級分的ACE抑制活性。結(jié)果，在上述條件下觀察到主要的ACE抑制活性在級分32至38中。將這些級分進(jìn)行合并并進(jìn)行冷凍干燥。將該步驟重復(fù)3次，因而總共得到37.5mg的肽。
接著，將Bio-Gel P-2凝膠過濾柱層析得到的37.5mg ACE抑制活性肽溶解在2ml純凈水中，并加入使用ODS柱的高效液相色譜中從而分離肽。采用的條件如下柱Develosil ODS-10(20mm ID x 250mm L，Nomura Chemical)。
流動相緩沖液A5％CH3CN，0.1％TFA。
緩沖液B40％CH3CN，0.1％TFA。
梯度0至20分鐘0％緩沖液B20至80分鐘0至100％緩沖液B。
流速10ml/min。
檢測UV210nm。
使用級分收集器以1分鐘間隔收集洗脫級分。每種級分用移液管取5ul移入96孔微板中，并減壓蒸發(fā)至干燥。接著將殘留物溶解在5ul純凈水中得到用于測量ACE抑制活性的樣品。接著根據(jù)上述方法測量每種級分的ACE抑制活性。結(jié)果，級分39，52和54顯示出強(qiáng)的ACE抑制活性。將這3個級分冷凍干燥，因此從每種級分得到少量的肽。
純化級分39中的ACE抑制肽將級分39的冷凍干燥肽溶解在200ul純凈水中，進(jìn)行使用C30柱的高效液相色譜分析，從而分離肽。采用的條件如下柱Develosil C30-UG-5(10mm ID x 250mm L，Nomura Chemical)流動相緩沖液5％CH3CN，0.1％TFA。
流速4ml/min。
檢測UV210nm。
在上述條件下，使用級分收集器以15秒間隔收集洗脫級分。每種級分用移液管取5ul移入96孔微板中，并減壓蒸發(fā)至干燥。接著將殘留物溶解在5ul純凈水中得到用于測量ACE抑制活性的樣品。接著根據(jù)上述方法測量每種級分的ACE抑制活性。結(jié)果，級分44和45顯示出強(qiáng)的ACE抑制活性。將這2個級分分別冷凍干燥，因此從每種級分得到少量的肽。接著將這些級分進(jìn)行氨基酸分析和TOF MS/MS分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)級分44和45的肽為Leu-Ser-Ala。
純化級分52中的ACE抑制肽將級分52的冷凍干燥肽溶解在200ul純凈水中，進(jìn)行使用C30柱的高效液相色譜分析，從而分離肽。采用的條件如下柱Develosil C30-UG-5(10mm ID x 250mm L)流動相緩沖液14％CH3CN，0.1％TFA。
流速4ml/min。
檢測UV210nm。
在上述條件下，使用級分收集器以15秒間隔收集洗脫級分。每種級分用移液管取5ul移入96孔微板中，并減壓蒸發(fā)至干燥。接著將殘留物溶解在5ul純凈水中得到用于測量ACE抑制活性的樣品。接著根據(jù)上述方法測量每種級分的ACE抑制活性。結(jié)果，級分89和90以及級分96和97顯示出強(qiáng)的ACE抑制活性。將這4個級分分別冷凍干燥，因此從每種級分中得到少量的肽。接著將這些級分進(jìn)行氨基酸分析和TOF MS/MS分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)級分89和90的肽為Ile-Val-Tyr，而級分96和97的肽為Val-Ile-Tyr。
純化級分54中的ACE抑制肽將級分54的冷凍干燥肽溶解在200ul純凈水中，進(jìn)行使用C30柱的高效液相色譜分析，從而分離肽。采用的條件如下柱Develosil C30-UG-5(10mm ID x 250mm L，Nomura Chemical)流動相緩沖液17％CH3CN，0.1％TFA。
流速4ml/min。
檢測UV210nm。
在上述條件下，使用級分收集器以15秒間隔收集洗脫級分。每種級分用移液管取5ul移入96孔微板中，并減壓蒸發(fā)至干燥。接著將殘留物溶解在5ul純凈水中得到用于測量ACE抑制活性的樣品。接著根據(jù)上述方法測量每種級分的ACE抑制活性。結(jié)果，級分69至73顯示出強(qiáng)的ACE抑制活性。將這5個級分分別冷凍干燥，因此從每種級分中得到少量的肽。接著將它們中的級分69，70，72和73進(jìn)行氨基酸分析和TOF MS/MS分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)每種級分中的肽為Leu-Val-Tyr。
實施例2通過化學(xué)合成產(chǎn)生肽使用Applied Biosystems制造的自動肽合成器(ABI430型)，從C-末端開始，采用BOC法根據(jù)該程序連續(xù)延伸肽鏈從而合成想要的保護(hù)的肽樹脂。
完成樹脂上的肽構(gòu)造之后，將保護(hù)的肽樹脂進(jìn)行干燥。這樣得到的受保護(hù)的肽被去掉保護(hù)，將其用無水氟化氫(HF/對甲酚8∶2v/v，60分鐘)進(jìn)行處理，從樹脂載體上除去肽。將這樣得到的粗肽用90％的乙酸進(jìn)行提取并冷凍干燥得到粉末狀固體。將這樣得到的粗肽進(jìn)一步用使用ODS柱的高效液相色譜進(jìn)行純化，因此得到想要的肽。
柱YMC-Pack ODS-2(30mm ID x 250mm L，YMC)流動相緩沖液A5％CH3CN，0.1％TFA。
緩沖液B40％CH3CN，0.1％TFA。
梯度0至10分鐘0％緩沖液B10至90分鐘0至100％緩沖液B。
流速20ml/min。
檢測UV220nm。
這樣純化的肽的純度用使用ODS柱的高效液相色譜進(jìn)行檢測。
柱Zorbax 300SB-C18(4.6mm ID x 250mm L，AgilentTechnologies)。
流動相緩沖液A1％CH3CN，0.1％TFA。
緩沖液B60％CH3CN，0.1％TFA。
梯度0至25分鐘0至100％緩沖液B。
流速1ml/min。
檢測UV220nm。
合成Leu-Ser-Ala使用Boc-Ala(BrZ)樹脂(0.5mmol)作為起始氨基酸樹脂載體，使用2mM的氨基酸衍生物Boc-Ser和Boc-Leu延伸肽鏈。接著通過上面實施例2中描述的純化方法得到純化的Leu-Ser-Ala。通過上述實施例2中描述的方法測定純化產(chǎn)品的純度為99.0％。
合成Val-Ile-Tyr使用Boc-Tyr(BrZ)樹脂(0.5mmol)作為起始氨基酸樹脂載體，使用2mM的氨基酸衍生物Boc-Ile和Boc-Val延伸肽鏈。接著通過上面實施例2中描述的純化方法得到純化的Val-Ile-Tyr。通過上述實施例2中描述的方法測定純化產(chǎn)品的純度為98.8％。
合成Leu-Val-Tyr使用Boc-Tyr(BrZ)樹脂(0.5mmol)作為起始氨基酸樹脂載體，使用2mM的氨基酸衍生物Boc-Val和Boc-Leu延伸肽鏈。接著通過上面實施例2中描述的純化方法得到純化的Leu-Val-Tyr。通過上述實施例2中描述的方法測定純化產(chǎn)品的純度為99.2％。
實施例3測量肽的ACE抑制活性根據(jù)上述方法測量實施例2中得到的3種肽的ACE抑制活性并確定IC50值。表1顯示該結(jié)果。作為對照，也測量實施例1中得到的芝麻肽粉末的ACE抑制活性并確定其IC50值。
表1
實施例4肽對自發(fā)產(chǎn)生高血壓的大鼠的降血壓作用使17至22周的SHR大鼠整夜禁食。接著以1mg/kg的劑量口服實施例2中得到的3種肽中的每一種。對于對照組，口服相同量的水作為對照。測量之前，以及服用后24小時測量心臟收縮壓的改變(BP-98A，SOFTRON)。圖1顯示該結(jié)果。
實施例5使用實施例2的合成產(chǎn)品，由下列成分產(chǎn)生谷類茶飲料。
組成烘烤的大麥 60g熱水 2000ml實施例2的肽Leu-Ser-Ala 19mgVal-Ile-Tyr 18mgLeu-Val-Tyr 18mg產(chǎn)生方法將熱水加入烘烤的大麥中并加熱至90℃5分鐘。冷卻至40℃后，將混合物進(jìn)行過濾。接著將水加入該提取物中將體積調(diào)至2000ml。接著加入上述肽并攪拌溶解得到谷類茶飲料。
實施例6從蛋白酶處理的植物種子中分離并定量Leu-Val-Tyr分別稱量25g的米和燕麥谷粒，接著將其磨碎得到粉末。向每種粉末中加入50ml己烷，通過過濾紙(Whattman，No.1)除去該溶劑。相同的己烷處理總共重復(fù)4次。除去過濾紙上的殘留物中的己烷從而分別得到18.8g脫脂米粉末和15.9g脫脂燕麥粉末。
每種脫脂粉末稱量10g，將其懸浮在200ml 0.01N NaOH中，于55℃攪拌1小時。冷卻至室溫后，將懸浮液用濾紙(Whattman，No.1)進(jìn)行過濾。加入0.1N HCl將濾液調(diào)至pH4.0。通過離心收集這樣形成的沉淀物，冷凍干燥分別得到0.38g和0.57g米和燕麥的粗蛋白粉末。
稱量0.2g得到的粉末，將其懸浮在10ml 0.1mM CaCl2中。將該懸浮液調(diào)至pH為7.5，向內(nèi)加入0.2mg嗜熱菌蛋白酶(7,000PU/mg，Nacalai Tesque)，于65℃輕柔攪拌6小時從而實現(xiàn)酶反應(yīng)。反應(yīng)期后，用1N HCl將pH調(diào)到4.0，90℃加熱該混合物10分鐘從而鈍化嗜熱菌蛋白酶。3,000rpm離心30分鐘除去加熱形成的沉淀物。將上清液冷凍干燥從而得到來自米的28.6mg肽粉末以及來自燕麥的87.8mg肽粉末。
如下從上面得到的米和燕麥肽粉末中分離和定量Leu-Val-Tyr，該Leu-Val-Tyr是本發(fā)明的一種肽。
i)在PD-10柱上的預(yù)處理從每種米和燕麥的肽粉末中稱出20mg，溶解在0.1N乙酸中達(dá)到5mg/ml，通過微濾器(Millex-HV，孔徑為0.45um，濾器直徑為13mm，Millipore Corporation)進(jìn)行過濾以除去不溶成分。將濾液中的2.5ml部分加入用0.1N乙酸平衡的PD-10柱中(脫鹽柱，AmershamBiosciences)。該柱進(jìn)一步用3.5ml體積的0.1N乙酸沖洗。接著收集另外用3.0ml體積的0.1N乙酸洗脫的級分，蒸發(fā)干燥，溶解在0.5ml水中，接著進(jìn)行冷凍干燥。
ii)使用TSK-GEL G2000SWXL的凝膠過濾HPLC將PD-10柱預(yù)處理制備的樣品溶解在250ul 45％CH3CN，0.1％TFA中，以進(jìn)行2,000rpm離心5分鐘。將濾液通過微濾器(Millex-HV，孔徑為0.45um，濾器直徑為13mm，Millipore Corporation)進(jìn)行過濾以除去不溶成分。
將50ul濾液加樣到45％CH3CN，0.1％TFA平衡的TSK-GELG2000SWXL(7.8 x 300mm，Tosoh Corporation)，用45％CH3CN，0.1％TFA進(jìn)行HPLC(流速為0.7ml/min，檢測波長為280nm)。收集保留時間之前和之后30秒之間的1分鐘的洗出液，蒸發(fā)干燥，溶解在0.5ml水中并冷凍干燥。Leu-Val-Tyr的保留時間通過在相同條件下分別將合成的Leu-Val-Tyr進(jìn)行HPLC而預(yù)先確定。
iii)Develosil C30-UG-5的反相HPLC(定量Leu-Val-Tyr)通過Develosil C30-UG-5柱的反相HPLC(3 x 150mm，NomuraChemical Co.，Ltd)對進(jìn)行凝膠過濾的活性肽級分中的Leu-Val-Tyr進(jìn)行定量分析。將來自TSK-GEL G2000SWXL的凝膠過濾HPLC的級分溶解在250ul 5％CH3CN，0.1％TFA中，2,000rpm離心5分鐘，將上清液通過微濾器(Millex-HV，孔徑為0.45um，濾器直徑13mm，MilliporeCorporation)進(jìn)行過濾以除去不溶成分。將50ul濾液上樣到用5％CH3CN，0.1％TFA平衡的Develosil C30-UG-5柱上，在下列條件下完成層析洗脫溶劑0-5分鐘5％CH3CN，0.1％TFA5-10分鐘5-14％CH3CN，0.1％TFA10-35分鐘14％CH3CN，0.1％TFA流速0.4ml檢測波長280nm收集Develosil C30-UG-5柱色譜中米和燕麥中的每種肽的峰，其保留時間與真實的肽Leu-Val-Tyr的保留時間相對應(yīng)。將級分進(jìn)行TOFMS分析以及TOF MS/MS分析從而證實該級分為Leu-Val-Tyr。
在相同條件下如上所述將不同量的真實的Leu-Val-Tyr上樣到相同的Develosil C30-UG-5柱，繪制峰面積對上樣量，從而制備校準(zhǔn)曲線。
校準(zhǔn)曲線Y＝249197X-2150.6(R2＝0.9991)Y峰面積，XLeu-Val-Tyr的數(shù)量(ug)米和燕麥的Develosil C30-UG-5柱色譜的Leu-Val-Tyr級分的峰面積應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線。結(jié)果，來自米和燕麥的1mg肽中的Leu-Val-Tyr的數(shù)量分別被確定為0.71ug和1.05ug。
權(quán)利要求
1.一種三肽，具有選自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的三肽，其通過用嗜熱菌蛋白酶消化來源于選自米，小麥，大麥，燕麥，玉米，菜豆，蠶豆，大豆，綠豆和芝麻的一種或幾種原料的蛋白質(zhì)而得到。
3.一種可食用組合物，含有添加的一種或幾種三肽，該三肽具有選自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
4.一種血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑，含有作為活性成分的一種或幾種三肽，該三肽具有選自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
5.一種降血壓劑，含有作為活性成分的一種或幾種三肽，該三肽具有選自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的可食用組合物，其在單次攝入劑量中包含0.001mg至100mg的所述添加的三肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑，其在用于口服的單次劑量中包含0.001mg至100mg的所述三肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的降血壓劑，其在用于口服的單次劑量中包含0.001mg至100mg的所述三肽。
全文摘要
想要提供ACE抑制三肽，當(dāng)口服后其不容易被消化酶所消化，因此在體內(nèi)較少地傾向于失去它們的ACE抑制活性。更具體的是，在芝麻的嗜熱菌蛋白酶消化產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)了具有ACE抑制活性并且在動物實驗中顯示降血壓作用的三種三肽。這些三肽分別具有氨基酸序列Leu－Ser－Ala，Val－Ile－Tyr和Leu－Val－Tyr，并顯示具有血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制活性。
文檔編號A61K38/06GK1780639SQ200480011269
公開日2006年5月31日 申請日期2004年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月18日
發(fā)明者小倉亨一, 飯野妙子, 淺見純生 申請人:三得利株式會社