專利名稱：用于降低膽固醇和甘油三酯的富含二酰甘油和植物甾醇酯的油的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物在制造營養(yǎng)補(bǔ)充劑和口服藥物制劑中的用途，該組合物含有溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的二酰甘油(DAG)，主要是1，3-二酰甘油，和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇(phytostanol)酯(PSE)的組合，該營養(yǎng)補(bǔ)充劑和口服藥物制劑能夠降低膽固醇和甘油三酯兩者的血清水平，還呈現(xiàn)出LDL-抗氧化特性，并且其適于治療和預(yù)防心血管病(CVD)和冠心病(CHD)。
背景技術(shù)：
本申請從頭至尾提及的所有出版物在此全部引入作為參考，包括其中引用的所有參考文獻(xiàn)。
冠狀動脈病(如動脈粥樣硬化)是西方發(fā)病率和死亡率的主要原因，其發(fā)病機(jī)理涉及動脈壁細(xì)胞、血細(xì)胞和血漿脂蛋白之間的復(fù)雜相互作用[Rose R.(1993)Nature 362801-809；Glass C.K.和Witztum J.L.(2001)Cell 104503-516]。目前，眾所周知的是降低膽固醇的水平就降低了心臟病發(fā)作、中風(fēng)和其它形式的動脈粥樣硬化血管病的風(fēng)險。此外，許多最近的研究表明氧化應(yīng)力在動脈粥樣硬化、癌癥和其它慢性疾病的發(fā)病機(jī)理中是具有主要作用的機(jī)理。在這種情況下，內(nèi)皮下空間中的巨噬細(xì)胞起了關(guān)鍵作用，其通過氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)激活。最近，將由于氧化應(yīng)力引起的內(nèi)皮功能障礙確定為動脈粥樣硬化斑發(fā)展過程中的引發(fā)因素。
早期動脈粥樣硬化的損害是通過源自負(fù)載膽固醇的巨噬細(xì)胞的泡沫細(xì)胞來表征的[Gerrity R.G.(1981)Am.J.Pathol.103181-190；Schaffner T等(1980)Am.J.Pathol.10057-80]。巨噬細(xì)胞膽固醇累積和泡沫細(xì)胞形成是早期動脈粥樣硬化的標(biāo)志，且這些細(xì)胞中的大部分膽固醇源自血漿低密度脂蛋白(LDL)。然而，天然LDL必需經(jīng)受一些改變以便引起大量的巨噬細(xì)胞膽固醇累積[Brown M.S.和Goldstein J.L.(1983)Annu.Rev.Biochem.52223-261；Kaplan M.和Aviram M.(1999)Clin.Chem.Lab.Med.37777-787；Aviram M.(1983)Atherosclerosis 981-9；Steinberg D.等(1989)N.Engl.J.Med.320915-924]。多數(shù)研究的具有可能的病理重要性的改變是LDL氧化[Aviram M.(1996)Europ.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.34599-608；Aviram M.(1995)Isr.J.Med.Sci.3141-249；Chisolm G.M.和Steinberg D.(2000)Free Radic.Biol.Med.281815-1826]。該改變導(dǎo)致巨噬細(xì)胞攝取修飾脂蛋白的提高，接著細(xì)胞膽固醇累積而導(dǎo)致負(fù)載脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞形成[Aviram(1996)id ibid.；Aviram(1995)idibid；Chisolm(2000)id ibid；Aviram M.(1999)Antiox.Redox.Signal 1585-594]。
數(shù)個報道已經(jīng)指出氧化應(yīng)力為引發(fā)動脈粥樣硬化的主要因素[Heinecke，J.W.(2003)Am.J.Cardiol.9112A-16A；Ceconi，C.等(2003)Arch.Biochem.Biophys.420217-221；Dhalla，N.S.等(2000)J.Hypertens.18655-673]。氧化應(yīng)力定義為自由基(FR)超量的結(jié)果，其在和細(xì)胞膜接觸時出現(xiàn)并導(dǎo)致生物分子如脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)和核酸中的氧化損害[Thomas C.E.和Aust，S.D.(1986)Ann.Emerg.Med.15(9)1075-83]?？梢允艿紽R攻擊的分子之一是LDL，形成ox-LDL，其高水平導(dǎo)致動脈粥樣硬化。
實驗和臨床研究兩者中增加的證據(jù)表明氧化應(yīng)力在兩種類型的糖尿病的致病機(jī)理中起主要作用。超量產(chǎn)生活性氧物質(zhì)的可能來源是廣泛的且包括酶解途徑、葡萄糖的自體氧化和線粒體。這些自由基的異常高水平和同時的抗氧化防御機(jī)制的衰弱導(dǎo)致提高的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、細(xì)胞器和酶的損害以及CVD的發(fā)展。因此，許多研究者認(rèn)為糖尿病中氧化應(yīng)力的預(yù)防是對抗糖尿病血管病發(fā)展的主要防御。此外，一些最近的研究指向氧化應(yīng)力、山梨糖途徑的激活、高級糖化終產(chǎn)物(AGE)和AGE前體為導(dǎo)致這些患者CVD而不是高血糖癥的基礎(chǔ)性異常[Duckworth W.C.(2001)Curr.Atheroscler.Rep.3383-91；Yorek M.A.(2003)Free Radic.Res.37471-80；Maritim A.C.(2003)J.Biochem.Mol.Toxicol.1724-38]。
對氧磷酶(PON1)是作為HDL的組分運(yùn)送進(jìn)血漿中的糖蛋白。已經(jīng)在體外顯示了PON1抑制LDL的氧化修飾。因此，HDL中PON1的存在可以占據(jù)這些脂蛋白抗氧化特性的比例[Mackness，M.I.等(1991)FEBS Lett.286152-154]。
動脈粥樣硬化的LDL氧化假設(shè)引起了對以下的廣泛研究抗氧化劑對抗LDL氧化的作用作為動脈粥樣硬化可能的預(yù)防性治療。盡管觀察到用各種合成藥劑治療后對氧化的LDL提高的抗性，還是作出努力來鑒別給予了對抗LDL氧化的抗氧化防御的天然食品。
橄欖油已經(jīng)顯示出能抑制LDL氧化，且該效果與其高油酸含量以及一些酚類(羥基甲苯，oleoropein)和植物甾醇如谷甾醇相關(guān)[Aviram M.和Kasem E.(1998)Ann.Nutr.Metabol.3775-84；VisioliF.等(1995)Atherosclerosis 11725-32]。
除了LDL氧化，對于冠心病(CHD)-冠狀動脈中動脈粥樣硬化的結(jié)果-已知的風(fēng)險因素包括高血清LDL膽固醇濃度。血清總膽固醇和LDL膽固醇濃度、與CHD的風(fēng)險或CHD死亡率之間存在正向線性相關(guān)[Jousilahtu等(1998)Circulation 971084-1094]。
高濃度血清甘油三酯也是引起CHD的原因[Austin，M.A.(1989)Am.J.Epidemiol.129249-259]，但是證據(jù)不是很清楚。和健康人中的甘油三酯相比較，二酰甘油(DAG)已經(jīng)顯示出能降低餐后血清甘油三酯的升高[Taguchi等(2000)J.Am.Coll.Nutr.19789-796]。在餐后六小時時和那些攝食44gTG油的相比較，攝食44gDAG油后的血清甘油三酯(TG)濃度顯著低。即使是使用低脂肪劑量(10和20g)，該差異也是可再現(xiàn)的[Robert A.Moreau等(2002)Progress in LipidResearch 41457-500]。
植物甾醇和CHD術(shù)語“植物甾醇”涵蓋植物固醇和植物甾烷醇。植物固醇是天然形成物質(zhì)，作為植物油的微量組分存在于膳食中。植物固醇在植物中具有和膽固醇在哺乳動物中相似的作用，例如，形成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。在人類營養(yǎng)中，植物固醇和植物甾烷醇在降低總血漿膽固醇水平和LDL-膽固醇中都是有效的。
食用植物固醇和植物甾烷醇通過抑制膳食的吸收和小腸內(nèi)生性產(chǎn)生的膽固醇而降低了血液膽固醇水平。植物固醇/甾烷醇是吸收非常差的組分。該抑制與植物固醇和甾烷醇與膽固醇相似的物理化學(xué)特性相關(guān)。
已經(jīng)在涉及超過2,400名患者的大量臨床試驗中研究了植物固醇降低血液膽固醇的效果，使用每天25g高的劑量，持續(xù)時間為3天。在全部數(shù)十個植物固醇的輔助臨床效果測試中或普通臨床使用中沒有觀察到副作用。此外，藥物谷甾醇(主要是β-谷甾醇)作為處方藥已經(jīng)超過20年了并具有卓越的安全記錄。
此外，植物固醇和植物甾烷醇已經(jīng)接受了嚴(yán)格的毒性評價。對于吸收、分布、代謝和分泌的研究顯示了植物固醇的小腸吸收是差的(1-10％)。
已經(jīng)進(jìn)行了一系列人的研究，使用涂抹醬中的植物油植物固醇酯，攝入高達(dá)8.6g植物固醇/天，進(jìn)行4周。評價了臨床化學(xué)、血液學(xué)、消化道菌叢的細(xì)菌特征圖和普通物理狀態(tài)。在所有研究中，沒有檢測到副作用。
在美國，一組獨(dú)立的專家推斷符合合適的食品級規(guī)格和通過常規(guī)食品制造慣例生產(chǎn)(21C.F.R.§182.1(b))的植物油固醇酯，對于用作植物油涂覆醬中的配料是安全的，使用量不超過植物固醇酯中的20％。這是專家小組和本領(lǐng)域有資格的專家共同的意見，認(rèn)為植物油固醇酯是使用安全的，即植物油固醇酯得到了GRAS標(biāo)準(zhǔn)(公認(rèn)安全無害)的準(zhǔn)予?；贕RAS認(rèn)識，美國食品與藥物管理局(FDA)已經(jīng)明確可以使用含有高達(dá)20％植物固醇酯的涂覆醬和另一含有植物甾烷醇酯的涂覆醬。在不同的歐洲國家以及亞洲和澳洲也給出了相似的批準(zhǔn)。
膳食在促進(jìn)或預(yù)防心臟病中的用途是重要研究的主題。然而，使用可以降低LDL-膽固醇和甘油三酯水平并抑制LDL-氧化的天然形成物質(zhì)對于使用合成藥物是具有優(yōu)勢的。
最近的研究教導(dǎo)了近幾年伴隨著對功能食品日益增長的興趣，植物甾醇用于降低血清膽固醇水平的用途已經(jīng)成為重要的要素[Stark，A.H.等(2002)Nutrition Reviews 60(6)170-176]。這尤其歸因于植物甾醇和脂肪酸的酯化作用(甾烷醇酯)，提供了商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)含有植物甾醇的食品，如人造黃油。如甾烷醇酯，植物甾醇酯(甾醇酯)已經(jīng)在臨床研究中顯示出一貫地降低血清LDL-膽固醇(LDL-C)水平(減少高達(dá)約10％或更多)，沒有觀察到HDL-膽固醇(HDL-C)值的改變。評論建議適當(dāng)配制的游離植物甾醇和甾烷醇在降低人LDL-C水平中可以與甾烷醇酯以及甾醇酯一樣有效。
WO01/32035教導(dǎo)了基于橄欖油的產(chǎn)品，基于特別高級的橄欖油(如初榨橄欖油)，含有植物甾烷醇酯和/或植物固醇酯。
US專利5,843,99公開了從玉米纖維可榨取的油，含有阿魏酸酯(和阿魏酸酯化的植物甾醇酯)，尤其是谷甾烷醇酯，其已經(jīng)顯示出具有降低膽固醇的活性。該專利提及玉米纖維油(含有約73％脂肪(甘油三酯)、8％固醇(脂肪?；?酯、4％游離固醇、6％二酰甘油和6％阿魏酸酯(固醇酯))用作降低膽固醇水平的補(bǔ)充食品的添加劑。
美國專利6,326,050公開了包括油或脂肪，溶解于或分散于油或脂肪中的二酰甘油、游離植物甾醇和維生素E的組合物。該組合物在降低高膽固醇血癥個體的血液膽固醇中起了作用。上述提及的出版物沒有一個描述同時降低了膽固醇和甘油三酯的血清水平。
橄欖油，和其它提及的植物油(如玉米纖維油、餐桌用烹調(diào)油、大豆油、菜籽油、米糠油和棕櫚油)相反，尤其是包括55至85％的單不飽和脂肪酸(MUFA)，特別是油酸，其是使該油具有高營養(yǎng)價值的原因。使用橄欖油比使用其它植物油存在一些截然不同的優(yōu)勢。富含橄欖油的膳食已經(jīng)顯示出在降低總膽固醇和LDL-膽固醇中比不含有高含量MUFA的常規(guī)膳食治療更有效[Brown M.S和Goldstein J.L.(1983)Ann.Rev.Biochem.52223-261]。
此外，橄欖油是地中海型膳食的整體配料，且累積數(shù)據(jù)表明其具有健康的益處，包括降低冠心病的風(fēng)險因素，預(yù)防數(shù)種癌癥以及緩和免疫和炎癥反應(yīng)[Brown和Goldstein(1983)id ibid]。
本申請人的未決的以色列專利申請No.147942描述了物質(zhì)的組合物，包括分散于油和/或脂肪中的二酰甘油，主要是1，3-二酰甘油(DAG)，和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯(PSE)。
在研究營養(yǎng)補(bǔ)充劑和/或藥物的組合效果中，發(fā)明者目前發(fā)現(xiàn)了IL147942所述的混合物，即油和/或脂肪中的二酰甘油，主要是1，3-DAG，和PSE的組合，具有協(xié)同效果并降低了血液中LDL-膽固醇和甘油三酯兩者的水平。該組合物進(jìn)一步呈現(xiàn)了提高血清和巨噬細(xì)胞的抗氧化特性，尤其是LDL抗氧化特性，導(dǎo)致CHD和動脈血管疾病風(fēng)險的降低。這些新的治療用途是本發(fā)明的主要目的。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是通過給藥所述的組合物來降低哺乳動物血液中膽固醇和甘油三酯的水平，并隨后降低CHD風(fēng)險，將分開在油中的所述兩個配料(DAG和PSE)各自所獲得的降低膽固醇和甘油三酯的水平合并并和該組合物相比較，發(fā)現(xiàn)該組合物能較大程度地降低血液膽固醇水平。在現(xiàn)有技術(shù)中沒有描述過或證明過這樣的協(xié)同效果。如上所述，美國專利6,326,050涉及二酰甘油和游離植物固醇的組合。盡管在該專利中評述了當(dāng)二酰甘油的量超過80％wt時，可以預(yù)期對脂質(zhì)代謝的協(xié)同效果，但該專利中沒有證明或討論這樣的效果。
根據(jù)本發(fā)明在這方面可以強(qiáng)調(diào)，甚至當(dāng)使用僅含有20wt％DAG和11wt％植物甾醇酯的組合物時，可以同時觀察到降低了膽固醇和甘油三酯兩者的血清水平的效果和提高的抗氧化特性。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是將所述組合物用作膳食/營養(yǎng)補(bǔ)充劑(食品添加劑)或在藥物制劑形式中的用途。
隨著以下的描述本發(fā)明的這些和其它目的將變得清楚。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括食用組合物的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或預(yù)防由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力所產(chǎn)生的有害影響，該食用組合物包括溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的DAG，主要是1，3-DAG，和PSE的組合。當(dāng)該組合溶解于或分散于所述食用油和/或食用脂肪中時，在此也稱為MultOil。
所述組合物中包括的油可以是任何天然油，如橄欖油、大豆油、向日葵油、紅花油、低芥酸菜子油、芝麻油、棕櫚油、鱷梨油或魚油。優(yōu)選油是橄欖油、低芥酸菜子油或魚油。
所述組合物中包括的脂肪可以是任何合適的脂肪，如乳脂、可可脂、無水乳脂或豬脂。
所述組合物中DAG的脂肪酸殘基可以對應(yīng)于所用油的脂肪酸殘基。實例基團(tuán)是油酸殘基、棕櫚酸殘基、棕櫚油酸殘基、硬脂酸殘基、亞油酸殘基、亞麻酸殘基、二十二碳六烯酸殘基、二十碳五烯酸殘基和花生酸殘基。
所述組合物中的植物甾醇酯可以是任何脂肪酸酯，例如但不限制于豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、5-燕麥甾醇的油酸酯和棕櫚酸酯及其異構(gòu)體和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑中，所述組合物可以還包括營養(yǎng)組合物的常規(guī)配料。
優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑所包括的組合物中，二酰甘油與植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯之間的摩爾比是約1∶5至約5∶1。
所述組合物中二酰甘油的含量優(yōu)選至少為1wt％，且植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的含量優(yōu)選至少為1wt％。
特定實施方案中，本發(fā)明涉及所述膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物中二酰甘油的含量為1至99wt％，優(yōu)選7至48wt％，且所述組合物中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的含量為1至99wt％，優(yōu)選5至50wt％。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)民涉及所述膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物包括溶解于或分散于橄欖油中的15wt％DAG，主要是1，3-二酰甘油，和25wt％總PSE。實例組合物中，植物甾醇酯包括約0.4wt％菜籽甾醇酯，3.1wt％菜油甾醇酯，2.0wt％豆甾醇酯，5.3wt％β-谷甾醇酯，0.2wt％燕麥甾醇酯，且DAG含有以下的脂肪酸殘基油酸殘基(65wt％)，棕櫚酸殘基(15wt％)，亞油酸殘基(10wt％)和10wt％包括棕櫚油酸殘基、硬脂酸殘基、亞麻酸殘基和花生酸殘基的脂肪酸殘基。特定實施方案中，所述組合物包括溶解于或分散于橄欖油中的15wt％DAG，主要是1，3-二酰甘油，和25wt％總植物甾醇酯(PSE)。
如在此所涉及的，術(shù)語膳食營養(yǎng)物也涉及食用品或食品。
第二方面，本發(fā)明涉及口服藥物組合物，其用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或預(yù)防由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響，該口服藥物組合物包括溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的DAG，主要是1，3-二酰甘油，和PSE的組合，且任選還包括藥物學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、賦形劑和/或載體。
本發(fā)明的藥物組合物中，所述組合中二酰甘油與植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯之間的摩爾比優(yōu)選約1∶5至約5∶1。
本發(fā)明的藥物組合物中，所述組合中二酰甘油的量至少為1wt％。
此外，本發(fā)明的藥物組合物中，所述組合中的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的量優(yōu)選至少為1wt％。
特定實施方案中，本發(fā)明藥物組合物所包括的組合，包括1至99wt％量的二酰甘油，優(yōu)選7至48wt％，且所述組合中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的量為1至99wt％，優(yōu)選5至50wt％。
另一特定實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物基本上由溶解于或分散于橄欖油中的15wt％DAG，主要是1，3-二酰甘油，和25wt％總PSE組成。該組合物呈現(xiàn)了降低血液膽固醇和甘油三酯水平的效果。實例組合物中，植物甾醇酯包括0.4wt％菜籽甾醇酯，3.1wt％菜油甾醇酯，2.0wt％豆甾醇酯，5.3wt％β-谷甾醇酯和0.2wt％燕麥甾醇酯。DAG含有油酸殘基(65wt％)，棕櫚酸殘基(15wt％)，亞油酸殘基(10wt％)和10wt％其它的脂肪酸殘基，其主要是棕櫚油酸殘基、硬脂酸殘基、亞麻酸殘基和花生酸殘基。
本發(fā)明的組合物尤其適于治療和/或預(yù)防心血管病癥及其相關(guān)的疾病如冠心病、動脈粥樣硬化和由其他疾病如糖尿病尤其是II型糖尿病誘發(fā)的或顯現(xiàn)的心血管病癥，以及與脂質(zhì)相關(guān)的氧化應(yīng)力或脂蛋白和巨噬細(xì)胞動脈粥樣硬化形成相關(guān)的任何病癥。
再一方面，本發(fā)明涉及溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的DAG，主要是1，3-二酰甘油，和PSE，且任選還包括藥物學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、賦形劑和/或載體的組合在制備口服藥物組合物中的用途，該口服藥物組合物用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或預(yù)防由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。
附圖簡述

圖1A-B橄欖油、橄欖油+植物甾醇和橄欖油MultOil(oliveMultOil)對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞過氧化物含量的影響。
圖1A通過細(xì)胞平均熒光(由DCF發(fā)射)強(qiáng)度測定的巨噬細(xì)胞過氧化物含量。
圖1B通過熒光陽性細(xì)胞的百分比測定的巨噬細(xì)胞過氧化物含量。
縮寫PT，植物甾醇；cont.，對照；OL.O.，橄欖油，M.F.I，平均熒光強(qiáng)度；Perc.Pos.Ce.，陽性細(xì)胞的百分比。
圖2橄欖油、橄欖油+植物甾醇和橄欖油MultOil對巨噬細(xì)胞過氧化物陰離子釋放的影響。
通過細(xì)胞色素C的過氧化物歧化酶可抑制還原而測定的巨噬細(xì)胞過氧化物陰離子釋放。
縮寫PT，植物甾醇；cont.，對照；OL.O.，橄欖油；S.O.rel.，過氧化物釋放；prot.，蛋白質(zhì)。
圖3食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對血清甘油三酯特征的影響。
縮寫Triglyc.，甘油三酯；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油。
圖4食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對血清總膽固醇特征圖的影響。
縮寫Chol.，膽固醇；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油。
圖5食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對血清氧化應(yīng)力的影響。
縮寫Ser.lip.Per.，血清脂質(zhì)過氧化物；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油。
圖6食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對血清PON1活性的影響。
縮寫Ser.PON1 act.，血清PON1活性；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油。
圖7食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對腹膜巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL的影響。
縮寫prot.，蛋白質(zhì)；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油；deg.，降解；ass.，結(jié)合。
圖8食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對氧化狀態(tài)的影響。
縮寫Rel.Fluor.U，相對熒光單位；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油。
圖9食用MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)和MultOil-f(魚油MultOil)對巨噬細(xì)胞中PMA誘導(dǎo)的過氧化物陰離子釋放的影響。
縮寫S.O.rel，過氫化物釋放；prot.，蛋白質(zhì)；Plac.，安慰劑；Can.，低芥酸菜子油。
發(fā)明詳述說明書中沿用以下縮寫低芥酸菜子油MultOi(Canola MultOil)(MultOil-c)其中基料是低芥酸菜子油的MultOil。
CHD冠心病CVD心血管病DAG二酰甘油，主要是1，3-二酰甘油DHA二十二碳六烯酸魚油MultOil(Fish MultOil)(MultOil-f)其中基料是魚油的MultOil。
HBSSHanks′平衡鹽溶液HDL高密度脂蛋白LDL低密度脂蛋白MPM小鼠腹膜巨噬細(xì)胞MultOil油和/或脂肪基料中二酰甘油，主要是1，3-二酰甘油，和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的組合。
橄欖油MultOil(Olive MultOil)(MultOil-o)其中基料是橄欖油的MultOil。
Ox-LDL氧化的LDL
PBS磷酸鹽緩沖鹽水PSE植物甾醇酯或植物甾烷醇酯本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)使用動物模型系統(tǒng)apoE0小鼠，其中在幼年產(chǎn)生了嚴(yán)重的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化斑來評價新食用組合物的抗動脈粥樣硬化特性，在此新食用組合物指的是MultOil-o、MultOil-c和MultOil-f，與安慰劑和/或低芥酸菜子油相比較。
如上所述，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)油和/或脂肪中的DAG，主要是1，3-DAG，和PSE的組合(也稱為MultOil)通過降低血液中LDL-膽固醇和甘油三酯的水平而提供了增強(qiáng)的效果。該組合以及含有該組合的組合物，進(jìn)一步呈現(xiàn)了增強(qiáng)的血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的抗氧化特性，以及抑制了泡沫細(xì)胞的形成和/或防止了由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響，其導(dǎo)致CHD和動脈相關(guān)疾病如糖尿病風(fēng)險的降低。
根據(jù)所述組合所用的油基料，如果是橄欖油、低芥酸菜子油或是海產(chǎn)來源的，本發(fā)明的組合在整個說明書中各自稱為MultOil-o(橄欖油MultOil)、MultOil-c(低芥酸菜子油MultOil)或MultOil-f(魚油MultOil)。
因此本發(fā)明主要涉及含有二酰甘油和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的組合作為藥劑的新用途，該藥劑能夠降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。
如實施例和附圖中所證明的，和安慰劑治療相比較，在動物模型系統(tǒng)中各種MultOil能夠充分地降低血液中甘油三酯和膽固醇兩者的水平。
本發(fā)明所用的組合基本上由分散于食用油和/或食用脂肪中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯和二酰甘油，主要是1，3-二酰甘油組成。更特別地，該組合包括溶解于或分散于所述油和/或脂肪中的至少1wt％二酰甘油和至少1wt％植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。
油和/或脂肪中含有的二酰甘油含量為1wt％至約99wt％，優(yōu)選約7wt％至約48wt％，最優(yōu)選約10wt％至約22wt％。
油中含有的植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯含量為1wt％至約99wt％，優(yōu)選約5wt％至約50wt％，最優(yōu)選約20wt％至約35wt％。
二酰甘油基本上由主要含有不飽和脂肪酸殘基的1，3-二酰甘油組成。二酰甘油的結(jié)構(gòu)取決于用于溶解或分散植物甾醇酯的特定油和/或脂肪。例如，當(dāng)使用橄欖油時，二酰甘油主要由1，3-二酰甘油組成。一般而言，DAG的脂肪酸部分包括油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸和花生酸脂肪酸(DAG為1，2-二油?；视汀?，3-二油?；视汀?，2-油酰基棕櫚酰甘油和1，3-油酰基棕櫚酰甘油)。
植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯可以是任何植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。這樣的酯的實例是豆甾醇油酸酯、豆甾醇棕櫚酸酯、谷甾醇油酸酯、谷甾醇棕櫚酸酯、β-谷甾醇油酸酯和β-谷甾醇棕櫚酸酯。
油中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯與二酰甘油的摩爾比為約5∶1至約1∶5，優(yōu)選約2∶1。
本發(fā)明組合物中包括的油可以是任何食用油，包括但不限制于橄欖油、大豆油、向日葵油、紅花油、低芥酸菜子油、芝麻油、棕櫚油、鱷梨油或魚油。優(yōu)選，油至少是橄欖油、低芥酸菜子油或魚油中的一種。本發(fā)明組合物中含有的脂肪可以是任何合適的脂肪，如乳脂、無水乳脂、可可脂以及動物脂肪如豬脂或魚油濃縮物。
可以通過任何常規(guī)的酶解或非酶解方法來獲得二酰甘油。優(yōu)選，通過存在于油和/或脂肪中的植物甾醇和甘油三酯之間的酯交換來獲得?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)的酶解或非酶解方法來獲得植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯。優(yōu)選，通過存在于食用油和/或食用脂肪中的植物甾醇和/或植物甾烷醇與甘油三酯之間的酯交換來獲得。本發(fā)明所用的來獲得組合的方法詳細(xì)描述于所述的IL147942中，在此全部引入作為參考。如IL147942中所述的，還可以通過用油和/或脂肪來混合(或摻合)所需量的二酰甘油和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯來制得本發(fā)明的組合物。
如以下實施例所示的，獲得了測試組合物防止和/或降低血清ox-LDL以及巨噬細(xì)胞氧化的顯著效果。因此，除了具有降低血液LDL-膽固醇和甘油三酯水平的效果，所述組合以及含有該組合的組合物呈現(xiàn)了血清LDL和巨噬細(xì)胞抗氧化特性。實施例進(jìn)一步顯示了橄欖油、低芥酸菜子油和/或魚油MultOil制劑呈現(xiàn)出顯著的抗氧化特性，抑制泡沫細(xì)胞的形成，和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。
特別地，圖5、7、8和9呈現(xiàn)了結(jié)果來證明不同的MultOil制劑是怎樣降低以下的氧化應(yīng)力參數(shù)的血清氧化應(yīng)力、腹膜巨噬細(xì)胞的ox-LDL攝取、巨噬細(xì)胞氧化狀態(tài)以及巨噬細(xì)胞中PMA誘導(dǎo)的過氧化物陰離子釋放。
本發(fā)明者已經(jīng)測量了血清中的PON1活性。PON1是HDL-相關(guān)的酯酶，可以消除ox-LDL。令人感興趣的，圖6的結(jié)果顯示了低芥酸菜子油降低了PON1的活性，而本發(fā)明的MultOil組合能夠維持PON1較高的活性，提出本發(fā)明可以保護(hù)動脈粥樣硬化前(proatherosclerotic)環(huán)境中的PON1活性。
MultOil組合本身可以用作食用品。或者，可以作為食用品和補(bǔ)充劑的配料，其可以進(jìn)一步地任意含有食品工業(yè)中所用的常規(guī)添加劑，如防腐劑、色素、調(diào)味劑、香料、抗氧化劑和硬化劑、維生素、鈣、其他礦物質(zhì)微量元素、益生元、異黃酮、熱量劑等等。
此外，本發(fā)明的食品補(bǔ)充劑可以用于任一種功能食品、功能飲料或膳食補(bǔ)充劑的制造中?？梢栽谄渲圃爝^程中通過混合、添加和摻入將所述食品補(bǔ)充劑引入所述食品、飲料和膳食補(bǔ)充劑中。
或者，組合可以作為活性成分包括于藥物組合物中，該藥物組合物用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。藥物組合物可以含有藥物學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、賦形劑和載體。
藥物組合物的制備是本領(lǐng)域公知的，參見，例如，US專利5,736,519，5,733,877，5,554,378，5,439,688，5,418,219，5,354,900，5,298,246，5,164,372，4,900,549，4,755,383，4,639,435，4,457,917和4,064,236。本發(fā)明所用的組合可以優(yōu)選和賦形劑、載體和/或稀釋劑，以及任意的防腐劑等等混合，藥物學(xué)上可接受的賦形劑如本領(lǐng)域公知的，參見例如上述美國專利。賦形劑的實例包括葡萄糖、甘露醇、肌醇、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉、玉米淀粉、微晶纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等。任選，可以加入增稠劑，如天然膠體、纖維素衍生物、丙烯酸聚合物或乙烯聚合物等等。
優(yōu)選以液體、固體或半固體來提供藥物組合物。優(yōu)選以水懸浮液、油懸浮液或微膠囊組合物來提供液體制劑。優(yōu)選以含水凝膠或油性凝膠或膏劑來提供半固體組合物。
含有本發(fā)明組合的片劑、硬片劑、膠囊，和特別地，軟明膠膠囊是優(yōu)選的，作為膳食補(bǔ)充劑和作為藥物劑型。實質(zhì)上，適用于口服的任何藥物劑型可以用來傳送本發(fā)明的組合。
本發(fā)明的MultOil組合的劑量取決于待治療的病癥、患者的年齡、性別和體重，且由參與的內(nèi)科醫(yī)師或營養(yǎng)學(xué)家來決定。對于成人的優(yōu)選劑量為約4至約6g MultOil每天，優(yōu)選5g，其包括約1300mgPSE和800mg DAG。
本發(fā)明還涉及治療和/或預(yù)防與高膽固醇和甘油三醇血液水平、血清氧化應(yīng)力、巨噬細(xì)胞的ox-LDL攝取、巨噬細(xì)胞氧化狀態(tài)、泡沫細(xì)胞形成和脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力任一相關(guān)病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的食品補(bǔ)充劑或其組合物口服給藥于需要的患者。因此，該方法對于心血管病癥、冠心病、動脈粥樣硬化以及由其他疾病如糖尿病尤其是II型糖尿病誘發(fā)的和顯現(xiàn)的心血管病癥的治療也是有效的。
或者，通過食用根據(jù)本發(fā)明的食品來治療這樣的病癥。
最后，本發(fā)明提供了用于提高健康的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明的膳食營養(yǎng)物或其藥物組合物給藥于需要的患者。
本發(fā)明通過權(quán)利要求來限定，其可閱讀到的內(nèi)容包括于本說明書公開的范圍內(nèi)。
所公開的和所述的，可以理解本發(fā)明不受限制于在此所公開的特定實施例、工序和材料，因為這樣的工序和材料可以稍微改變。還可以理解在此所用的術(shù)語僅僅是為了描述特定實施方案的目的，并不是用來限制，因為本發(fā)明的范圍只通過所附權(quán)利要求及其等效的來限定。
必須注意的是，本說明書和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“這個”包括復(fù)數(shù)對象，除非文中另外明確指出。
貫穿本說明書以及隨后的權(quán)利要求，除非文中另外需要，詞語“包括”以及變化“包含”和“含有”將理解為包含所述整體或整體的步驟或組合和步驟，但是不排除任何其他整體或整體的步驟或組合或步驟。
以下的實施例是本發(fā)明者在實施本發(fā)明各個方面中所用技術(shù)的代表?？梢哉J(rèn)識到這些技術(shù)是實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的實例，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員，根據(jù)本發(fā)明的公開，將認(rèn)識到可以作出各種改變而不脫離本發(fā)明所確定的范圍。
實施例材料-橄欖油商業(yè)初榨橄欖油，由Meshek Eger(YokeneamHaMoshava，Israel)制造。
-低芥酸菜子油商業(yè)低芥酸菜子油，由Shemen Taasiot(Haifa，Israel)。
-魚油商業(yè)魚油，由Pronova(Lysaker，Norway)制造。
表1本發(fā)明所用油的組成
所有材料避光，有氣味的產(chǎn)品放置于不高于25℃的溫度。
方法自由基清除能力通過DPPH試驗分析橄欖油、橄欖油+植物甾醇和橄欖油MultOil的自由基清除能力。DPPH(1，1-二苯基-2-苦基-偕腙肼)是產(chǎn)生自由基的底物，廣泛用于監(jiān)控各種抗氧化劑的自由基清除能力(化合物提供電子的能力)[Belinky，P.A.等(1998)Free Radic.Biol.Med.241419-29]。由于其不成對的電子DPPH基團(tuán)具有深紫色，且接著通過517nm處吸收值的損耗可以分光光度測定自由基清除，因為產(chǎn)生了淺黃色非自由基形式。將15μl每個樣品的儲液和1mL乙醇中0.1mmol的DPPH/L混合，并連續(xù)監(jiān)控517nm處光密度的改變。
小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的分離在腹膜內(nèi)注射鹽水中(3Ml)的巰基乙酸鹽(24g/L)4天后，從E0小鼠(15-25g)的腹膜流體中收集小鼠腹膜巨噬細(xì)胞(MPM)。將細(xì)胞(10-20×106/小鼠)用PBS洗滌3次并以106/mL重懸浮于含有5％胎牛血清(在56℃熱滅活30分鐘)、100U盤尼西林/mL、100μg鏈霉素/mL和2mM谷氨酰胺的DMEM中。將細(xì)胞懸浮液接種于培養(yǎng)皿中，并在濕潤的培養(yǎng)器(5％CO2，95％空氣)中孵育2小時。用DMEM將培養(yǎng)皿洗滌一次來除去非粘著細(xì)胞，并將單細(xì)胞層在相同條件下孵育18小時。從每個組的6只小鼠中分離小鼠腹膜巨噬細(xì)胞，每個試驗重復(fù)兩次或三次組合并分析。
巨噬細(xì)胞過氧化物釋放以過氧化物歧化酶可抑制的細(xì)胞色素C還原來測量小鼠腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化物陰離子(O2-)[Yanagitani Y.等(1999)Hypertension33335-9]。在1mL含有乙酰細(xì)胞色素C(80μmol/L)的HBSS中培養(yǎng)細(xì)胞(1×106/孔)。通過加入佛波醇肉豆蔻酸鹽醋酸鹽來刺激細(xì)胞1小時以產(chǎn)生過氧化物。向一些對照樣品中加入過氧化物歧化酶(SOD，30mg/L)。測定培養(yǎng)基中過氧化物的釋放量并表示為過氧化物/mg細(xì)胞蛋白，使用消光系數(shù)E550＝21mmol/L-1cm-1。
巨噬細(xì)胞過氧化物含量通過流式細(xì)胞術(shù)使用二氯氫化熒光素-雙醋酸酯(DCFH-DA)來測定細(xì)胞過氧化物含量[Goupy，P.等(2003)Fr.Journal of Agriculturaland Food Chemistry 51(3)615-622]。DCFH-DA是擴(kuò)散入細(xì)胞中的非極性染料。其在細(xì)胞中水解成非熒光衍生物2’，7’-DCFH，其是極性的并圈閉在細(xì)胞中。在氧化應(yīng)力下，DCFH氧化成DCF(2’，7’-二氯熒光素)，其是熒光化合物。用2.5×105mol/L DCFH-DA在37℃培養(yǎng)腹膜巨噬細(xì)胞(2×106)30分鐘。在4℃用PBS洗滌來終止反應(yīng)。用流式細(xì)胞設(shè)備(FACS-SCAN，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)測定細(xì)胞熒光。用氬離子激光器于488nm激發(fā)細(xì)胞后在510至540nm進(jìn)行測量。
血清脂質(zhì)特征使用可購得的試劑盒(Roche Diagnostics，Penzberg，Germany)分析血清樣品的脂質(zhì)特征，包括總膽固醇和甘油三酯[Rosenblat，M.等(2002)Clin.Chem.Lab.Med.409-14]。
血清脂質(zhì)過氧化作用以1∶4將血清稀釋于PBS中。用100mM自由基產(chǎn)生化合物2’，2’-偶氮二2’-脒基丙烷鹽(AAPH)培養(yǎng)血清樣品來測定血清對氧化的敏感度，AAPH是水溶性偶氮化合物，其受熱恒速分解成過氧化氫自由基。測量硫代巴比妥反應(yīng)物(TBARS)和脂質(zhì)過氧化物的形成，并與在相似條件下但是沒有AAPH培養(yǎng)的血清相比較。
PON1活性測量通過測量芳基酯酶活性來測定血清中的PON1活性，使用乙酸苯酯作為底物。在270nm處分光光度測定水解的初速度。試驗混合物包括1.0mM乙酸苯酯和20mM Tris HCl中的0.9mM CaCl2，pH8.0。從總的水解率中減去乙酸苯酯的非酶水解率。反應(yīng)的E270為1,130M-1cm-1。一單位芳基酯酶活性等于1μmol水解的乙酸苯酯/min/ml。純化的酶具有接近2000單位的芳基酯酶活性每mg蛋白質(zhì)。
巨噬細(xì)胞氧化狀態(tài)在負(fù)載DCF的巨噬細(xì)胞中通過流式細(xì)胞術(shù)來測定細(xì)胞氧化應(yīng)力，使用非熒光DCFH-DA向其熒光對應(yīng)物DCF的轉(zhuǎn)化作為指標(biāo)。
巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的LDL的氧化用LDL(100μg蛋白質(zhì)/mL)培養(yǎng)MPM 18小時，在氧化應(yīng)力下(在2μmolCuSO4的存在下)，隨后通過TBARS試驗測定LDL的氧化程度。
巨噬細(xì)胞攝取氧化的LDL用125I標(biāo)記的氧化LDL(10μg蛋白質(zhì)/mL)培養(yǎng)MPM，并測定這些細(xì)胞的脂蛋白結(jié)合和降解。以不是由于游離碘引起的甘油三酯酸(TCA)可溶的、非脂質(zhì)放射性來測量所收集培養(yǎng)基中的脂蛋白細(xì)胞降解。在相同條件下測量細(xì)胞游離系統(tǒng)中的脂蛋白降解，并從總的降解中減去該降解。將剩余的細(xì)胞用冷PBS洗滌三次并溶解于0.1NNaOH中，用于蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)合脂蛋白測定。
統(tǒng)計學(xué)分析使用Student t-檢驗來統(tǒng)計分析結(jié)果。
實施例1橄欖油、橄欖油+植物甾醇和橄欖油MultOil在E0小鼠中對抗巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用的抗氧化效果如上所述，氧化應(yīng)力涉及動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理。動脈粥樣硬化與血漿LDL和動脈細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)[Aviram M.(2000)Free.Radic.Res.33S85-97；Aviram M.和FuhrmanB.(1998)Mol.Cell.Biochem.188149-159]。在氧化應(yīng)力下，巨噬細(xì)胞過氧化物含量提高，且巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了反應(yīng)性氧屬，導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成的提高[Plump A.S.等(1992)Cell 71343-353]。
載脂蛋白E缺乏(E0)小鼠廣泛用作動脈粥樣硬化的動物模型，因為它們在食用固體食物(chow diet)時發(fā)展出嚴(yán)重的高血脂癥和動脈粥樣硬化損害。此外，E0小鼠中，加速的動脈粥樣硬化與血漿脂蛋白和動脈細(xì)胞提高的脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)[Hayek T.等(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.2011567-1574；Keidar S.(1998)LifeSci.631-11]。
由血管緊張肽原酶-血管緊張素系統(tǒng)產(chǎn)生的血管收縮劑血管緊張素II(Ang-II)涉及動脈粥樣硬化。Ang-II激活巨噬細(xì)胞NAD(P)H-氧化酶，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用提高[Rajagopalan S等(1996)J.Clin.Invest.971916-1923；Johnston R.B.Jr.(1984)MethodsEnzymol.105365-9]。
本發(fā)明實施例中，分析了橄欖油的三個制劑指定的橄欖油+植物甾醇、橄欖油MultOil和橄欖油對抗巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)力的抗氧化效果。
檢驗以下的油樣品(所有稀釋于水中1/2vol./vol.，儲液)1.橄欖油+植物甾醇2.橄欖油MultOil3.橄欖油通過兩個參數(shù)(i)降低巨噬細(xì)胞過氧化物含量的能力；和(ii)巨噬細(xì)胞釋放過氧化物離子的能力，來分析橄欖油MultOil對抗巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)力的抗氧化效果，與橄欖油+植物甾醇以及橄欖油相比較。
用50μl儲液/ml橄欖油+植物甾醇、橄欖油MultOil和橄欖油培養(yǎng)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞15分鐘，接著進(jìn)一步用血管緊張素II(10-7M)培養(yǎng)1小時來誘導(dǎo)氧化應(yīng)力。對照細(xì)胞僅用血管緊張素II培養(yǎng)。然后使用DCFH試驗分析巨噬細(xì)胞的過氧化物含量和釋放過氧化物離子的能力(圖2A，B)。
1)橄欖油+植物甾醇、橄欖油MultOil和橄欖油對巨噬細(xì)胞過氧化物含量的影響用橄欖油+植物甾醇和橄欖油MultOil兩者而僅沒有橄欖油預(yù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞來降低巨噬細(xì)胞過氧化物含量，與僅用血管緊張素II培養(yǎng)的對照巨噬細(xì)胞相比較。使用DCFH試驗，通過兩個參數(shù)來確定巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物含量第一，DCF發(fā)射的平均熒光強(qiáng)度，第二，熒光發(fā)射陽性細(xì)胞的百分比。
用50μl/ml橄欖油+植物甾醇或橄欖油MultOil預(yù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，和對照細(xì)胞相比較導(dǎo)致巨噬細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度83％和64％的降低，而相同濃度的橄欖油和對照細(xì)胞相比較對巨噬細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度沒有效果(圖2A)。同樣，用50μl/ml橄欖油+植物甾醇或橄欖油MultOil預(yù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，和對照細(xì)胞相比較導(dǎo)致熒光陽性細(xì)胞百分比74％和55％的降低，而相同濃度的橄欖油和對照細(xì)胞相比較對巨噬細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度沒有效果(圖2B)。
2)橄欖油+植物甾醇、橄欖油MultOil和橄欖油對巨噬細(xì)胞過氧化物離子釋放的效果用50μl/ml橄欖油MultOil、橄欖油+植物甾醇或僅用橄欖油預(yù)培養(yǎng)從E0小鼠分離的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞15分鐘，接著用血管緊張素II(10-7M)進(jìn)一步培養(yǎng)1小時來誘導(dǎo)氧化應(yīng)力。對照細(xì)胞僅用血管緊張素II培養(yǎng)。
本發(fā)明研究中分析的全部三個橄欖油制劑在一定程度上都抑制了由血管緊張素II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞過氧化物釋放。然而，橄欖油MultOil和橄欖油+植物甾醇僅用橄欖油顯著有效。用50μl/ml橄欖油MultOil、橄欖油+植物甾醇或僅用橄欖油預(yù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞各自導(dǎo)致巨噬細(xì)胞過氧化物陰離子釋放29％、23％和僅僅9％的降低，和僅用血管緊張素II培養(yǎng)的對照細(xì)胞相比較(圖3)。
富含植物甾醇的橄欖油制劑尤其是橄欖油MultOil呈現(xiàn)出顯著的對抗巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用的抗氧化特性。相反，而僅用橄欖油沒有呈現(xiàn)出任何效果。最重要的是，在降低巨噬細(xì)胞過氧化物含量和巨噬細(xì)胞過氧化物釋放的能力上，橄欖油MultOil比橄欖油+植物甾醇制劑更有效。
這些結(jié)果表明了橄欖油和另外的成分(植物甾醇和二酰甘油)可以結(jié)合并內(nèi)在化于巨噬細(xì)胞中。此外，富含植物甾醇的橄欖油使得本發(fā)明的制劑能夠抑制細(xì)胞氧化系統(tǒng)(如NADPH氧化酶和/或脂肪加氧酶)或能夠激活細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)(如谷胱甘肽或過氧化物歧化酶系統(tǒng))。此外，將DAG加入橄欖油+植物甾醇制劑中(形成橄欖油MultOil)導(dǎo)致另外的對抗巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物作用的抗氧化物效果。因此本發(fā)明者推斷DAG，其參與了多個胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，可以進(jìn)一步影響上述涉及血管緊張素II-介導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)力的細(xì)胞氧化/抗氧化系統(tǒng)，該細(xì)胞氧化應(yīng)力表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用和過氧化物釋放。
實施例2研究了動脈粥樣硬化載脂蛋白E缺失(E0)小鼠模型中MultOil-c和MultOil-f對脂蛋白和巨噬細(xì)胞的動脈粥樣硬化以及對動脈粥樣硬化發(fā)展的影響。載脂蛋白E缺失(apoE0)小鼠8周大。隨機(jī)分配給以下所述的組(每組5只小鼠)。小鼠接受常規(guī)固體食物，此外，如下喂食(通過管飼法)，三天一次I組1.安慰劑組沒有接受任何另外的油。
2.低芥酸菜子油組(對照)用60μl低芥酸菜子油喂養(yǎng)。
3.MultOil-c組用60μl MultOil-c喂養(yǎng)。
II組1.安慰劑組沒有接受任何另外的油。
2.MultOil-f組用60μl MultOil-f喂養(yǎng)。
每只小鼠食用約5mL水/天，和5g固體食物/天用于喂養(yǎng)的油制劑給小鼠喂食的MultOil-c和MultOil-f量基于以下人的推薦植物甾醇劑量是1.5gr植物甾醇/天。基于每個樣品中18.1％植物甾醇，因此人的MultOil-c和MultOil-f劑量為1.5/0.18＝8.33gr/天/人。對于小鼠，應(yīng)該考慮體重(60,000gr人體重/20gr小鼠體重＝3000)，因此小鼠的日劑量為8.33gr/3000＝2.78mg/天/小鼠，其等于2.78/0.93＝2.99mL/天/小鼠。由于在限定的時間段內(nèi)進(jìn)行試驗，所用的劑量是5倍高。因此，每個小鼠服用15mL油/天(60mL/4天/小鼠)。
在試驗階段最后，從所有小鼠中收集血樣用于血清分離和分析。在每個試驗組中，單個分析每只小鼠的血樣。分析血清中以下的參數(shù)1.測定脂質(zhì)，包括總膽固醇和甘油三酯的水平。
2.測定血清氧化狀態(tài)。
3.測定對氧磷酶，以芳基酯酶活性來測量。
在除去心臟和主動脈之前收集MPM。用局部鼻容器中的乙醚使小鼠麻醉。從所有小鼠中快速取出心臟和整個主動脈來用于主動脈動脈粥樣硬化損害的組織病理學(xué)分析。
實驗方案(No.IL-066-10-2001)得到Animal Care and UseCommittee of the Technion Israel Institute of Technology(Haifa，Israel)的批準(zhǔn)。
圖3顯示了食用MultOil-c證明了血清中甘油三酯水平顯著的和有意義的降低(36％)，和安慰劑相比較(p＜0.001)。
同樣地，圖4顯示了尤其是MultOil-c，還有MultOil-f證明了降低血清中總膽固醇水平的趨勢(p＜0.1)。
圖5顯示了MultOil-c治療導(dǎo)致對AAPH誘導(dǎo)氧化的血清敏感度急劇的和高度顯著的降低63％(p＜0.001)(和安慰劑比較)。MultOil-f證明了相似的趨勢，和安慰劑相比較，降低了脂質(zhì)過氧化物16％。
圖6顯示了令人感興趣的結(jié)果。食用低芥酸菜子油誘導(dǎo)了血清PON1活性水平的顯著降低(p＜0.1)，其對動脈粥樣硬化是不利的[Mackness，B.等Circulation 1072775-9]，食用MultOil-c或MultOil-f保持了PON1活性，和未處理(安慰劑組)小鼠的水平相比較。因此，食用MultOil-c和MultOil-f對于維持有效水平的PON1活性是有益的。
圖7證明了食用MultOil-c導(dǎo)致ox-LDL結(jié)合(16％)和降解(14％)的降低(p＜0.05)，導(dǎo)致MPM維持ox-LDL能力的提高，其和降低的氧化狀態(tài)相關(guān)，更大程度的，MultOil-f展示了相似的效果，也導(dǎo)致ox-LDL結(jié)合(34％)和降解(30％)(p＜0.001)。相反，食用低芥酸菜子油導(dǎo)致ox-LDL結(jié)合和降解的略微提高(p值＜0.05)(各自4％和11％，和安慰劑相比較)。
圖8顯示了食用MultOil-c或MultOil-f顯著降低了E0小鼠巨噬細(xì)胞的氧化狀態(tài)(p＜0.0001)。MultOil-f和安慰劑相比較降低了巨噬細(xì)胞氧化狀態(tài)34％，而MultOil-c和安慰劑相比較降低29％。因此，MultOil-f和MultOil-c在降低巨噬細(xì)胞的氧化狀態(tài)中都是有效的。和這些結(jié)果相一致的，圖9中，本發(fā)明者顯示，相同地，食用MultOil-f或MultOil-c還顯著降低了巨噬細(xì)胞中PMA-誘導(dǎo)的過氧化物陰離子釋放(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.含有食用組合物的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，該膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響，該食用組合物包括溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的二酰甘油(DAG)，主要是1，3-二酰甘油，和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯(PSE)的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述油是天然油和/或食用油，優(yōu)選橄欖油、大豆油、向日葵油、紅花油、低芥酸菜子油、棕櫚油、鱷梨油、芝麻油和魚油，更優(yōu)選橄欖油、低芥酸菜子油或魚油。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中脂肪是任何天然脂肪，優(yōu)選乳脂、無水乳脂、可可脂和豬脂。
4.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中DAG的脂肪酸殘基對應(yīng)于其來源油的脂肪酸殘基，如油酸殘基、棕櫚酸殘基、棕櫚油酸殘基、硬脂酸殘基、亞油酸殘基、亞麻酸殘基和花生酸殘基。
5.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中植物甾醇酯是豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、5-燕麥甾醇的脂肪酸酯及其異構(gòu)體和衍生物。
6.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物還包括營養(yǎng)組合物的常規(guī)配料。
7.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物中二酰甘油與植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯之間的摩爾比為1∶5至5∶1。
8.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物中二酰甘油的含量為至少1wt％。
9.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的含量為至少1wt％。
10.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物中二酰甘油的含量為1至99wt％，優(yōu)選7至48wt％，且所述組合物中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的含量為1至99wt％，優(yōu)選5至50wt％。
11.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，其中所述組合物包括溶解于或分散于橄欖油、低芥酸菜子油和魚油中任一種的15wt％DAG，主要是1，3-DAG，和25wt％總PSE。
12.用于治療和/或預(yù)防心血管病癥及其相關(guān)疾病的根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的膳食營養(yǎng)物或食品補(bǔ)充劑，如冠心病、動脈粥樣硬化和由其它疾病如糖尿病尤其是II型糖尿病誘發(fā)的或呈現(xiàn)的心血管病癥。
13.用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響的口服藥物組合物，包括溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的二酰甘油，主要是1，3-二酰甘油，和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的組合，且任選還包括藥物學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、賦形劑和/或載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其用于治療和/或預(yù)防心血管病癥及其相關(guān)的疾病，如冠心病、動脈粥樣硬化和由其它疾病如糖尿病尤其是II型糖尿病誘發(fā)的或呈現(xiàn)的心血管病癥。
15.根據(jù)權(quán)利要求13和14任一項的藥物組合物，其中所述油是天然油和/或食用油，優(yōu)選橄欖油、大豆油、向日葵油、紅花油、低芥酸菜子油、棕櫚油、芝麻油、鱷梨油和魚油，優(yōu)選橄欖油、低芥酸菜子油或魚油。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其中脂肪是任何天然脂肪，優(yōu)選乳脂、可可脂、無水乳脂和豬脂。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16任一項的藥物組合物，其中DAG的脂肪酸殘基對應(yīng)于其來源油的脂肪酸殘基，如油酸殘基、棕櫚酸殘基、棕櫚油酸殘基、硬脂酸殘基、亞油酸殘基、亞麻酸殘基和花生酸殘基。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至17任一項的藥物組合物，其中植物甾醇酯是豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、5-燕麥甾醇的脂肪酸酯及其異構(gòu)體和衍生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求13至18任一項的藥物組合物，其中所述組合中二酰甘油與植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯之間的摩爾比為1∶5至5∶1。
20.根據(jù)權(quán)利要求13至19任一項的藥物組合物，其中所述組合中二酰甘油的量為至少1wt％。
21.根據(jù)權(quán)利要求13至20任一的藥物組合物，其中所述組合中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的量為至少1wt％。
22.根據(jù)權(quán)利要求13至21任一的藥物組合物，其中所述組合中二酰甘油的量為1至99wt％，優(yōu)選7至48wt％，且所述組合中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的量為1至99wt％，優(yōu)選5至50wt％。
23.用于降低膽固醇和甘油三酯的血液水平和/或降低LDL氧化的藥物組合物，所述組合物基本上由溶解于或分散于橄欖油中的15wt％DAG，主要是1，3-DAG，和25wt％總PSE組成，其中所述組合物的特征在于具有降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響的作用。
24.根據(jù)權(quán)利要求13至23任一項的藥物組合物，用于治療和/或預(yù)防心血管病癥及其相關(guān)的疾病，如冠心病、動脈粥樣硬化和由其它疾病如糖尿病尤其是II型糖尿病誘發(fā)的或呈現(xiàn)的心血管病癥。
25.根據(jù)權(quán)利要求13至24任一項的藥物組合物，用于降低和/或防止以下的任一種情況膽固醇和甘油三酯的血液水平，血清氧化應(yīng)力，巨噬細(xì)胞攝取氧化LDL，巨噬細(xì)胞氧化狀態(tài)，泡沫細(xì)胞形成和由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。
26.溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的DAG，主要是1，3-DAG，和PSE，且任選還包括藥物學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、賦形劑和/或載體的組合在制備口服藥物組合物中的用途，該口服藥物組合物用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中所述組合中二酰甘油與植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯之間的摩爾比為1∶5至5∶1。
28.根據(jù)權(quán)利要求26和27任一項的用途，其中所述組合中二酰甘油的量為至少1wt％。
29.根據(jù)權(quán)利要求26至28任一項的用途，其中所述組合中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的量為至少1wt％。
30.根據(jù)權(quán)利要求26至29任一項的用途，其中所述組合中二酰甘油的量為1至99wt％，優(yōu)選7至48wt％，且所述組合中植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯的量為1至99wt％，優(yōu)選5至50wt％。
31.溶解于或分散于橄欖油中的15wt％DAG，主要是1，3-DAG，和25wt％PSE，且任選還包括藥物學(xué)上可接受的添加劑、稀釋劑、賦形劑和/或載體的組合在制備口服藥物組合物中的用途，該口服藥物組合物用于降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。
32.權(quán)利要求1至12任一項的食品補(bǔ)充劑在制造任一功能食品、功能飲料和膳食補(bǔ)充劑中的用途。
33.治療和/或預(yù)防與高膽固醇和甘油三酯血液水平、高血清氧化應(yīng)力、高巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL、高巨噬細(xì)胞氧化狀態(tài)、高泡沫細(xì)胞形成和高脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力中任一相關(guān)病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的權(quán)利要求1至12的膳食補(bǔ)充劑或權(quán)利要求13至25的組合物給藥于需要的患者。
34.權(quán)利要求33的方法，用于治療和/或預(yù)防心血管病癥及其相關(guān)的疾病，如冠心病、動脈粥樣硬化和由其它疾病如糖尿病尤其是II型糖尿病誘發(fā)的或呈現(xiàn)的心血管病癥。
35.提高健康的方法，包括將治療有效量的權(quán)利要求1至12的膳食營養(yǎng)物或權(quán)利要求13-25的藥物組合物給藥于需要的個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及組合物在制造營養(yǎng)補(bǔ)充劑和口服藥物制劑中的用途，該組合物包括溶解于或分散于食用油和/或食用脂肪中的二酰甘油(DAG)，主要是1，3－二酰甘油，和植物甾醇酯和/或植物甾烷醇酯(PSE)的組合，該營養(yǎng)補(bǔ)充劑和口服藥物制劑能夠降低膽固醇和甘油三酯兩者的血液水平和/或用于降低血清、血清LDL和巨噬細(xì)胞的氧化水平，抑制泡沫細(xì)胞的形成和/或防止由脂質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)力而產(chǎn)生的有害影響。此外，本發(fā)明的組合物及其藥物制劑適用于治療和防止與動脈粥樣硬化相關(guān)的病癥，如心血管病(CVD)、冠心病(CHD)和糖尿病。
文檔編號A61K31/56GK1809284SQ200480009613
公開日2006年7月26日 申請日期2004年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月10日
發(fā)明者D·普拉特, D·佩爾勒德, A·舒爾曼 申請人:酶學(xué)技術(shù)有限公司