專(zhuān)利名稱(chēng)：改進(jìn)的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的疫苗，尤其是病毒疫苗以及制造它們的方法。
針對(duì)入侵病原體的宿主保護(hù)包括細(xì)胞和體液效應(yīng)子并且由非適應(yīng)性(先天)和適應(yīng)性(后天)免疫的協(xié)調(diào)作用產(chǎn)生。后者基于受體介導(dǎo)的特異性免疫識(shí)別，是免疫系統(tǒng)新近的獲得，且只存在于脊椎動(dòng)物之中。在適應(yīng)性免疫發(fā)展之前就進(jìn)化的前者，由分布在整個(gè)生物體中任務(wù)是控制潛在病原體的各種各樣的細(xì)胞和分子組成。
B和T淋巴細(xì)胞是獲得性抗原特異性適應(yīng)性免疫的介導(dǎo)物，包括免疫記憶的發(fā)展，它是產(chǎn)生成功疫苗的主要目標(biāo)?？乖f呈細(xì)胞(APC)是高度特化的細(xì)胞，它們能夠處理抗原并且在細(xì)胞表面呈現(xiàn)它們的經(jīng)過(guò)處理的片段以及淋巴細(xì)胞激活必需的分子。這意味著APC對(duì)于特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)非常重要。
對(duì)于T淋巴細(xì)胞的激活主要的APC是樹(shù)突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，而對(duì)于B細(xì)胞主要的APC是濾泡樹(shù)突細(xì)胞。通常，就刺激靜止幼稚和記憶B和T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答之啟動(dòng)而言，DC是最強(qiáng)的APC。
外周APC(例如DC或朗格漢氏細(xì)胞)天然的任務(wù)是捕獲和處理抗原，因此一旦被激活它們就開(kāi)始表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子，遷移到淋巴器官，分泌細(xì)胞因子并將抗原遞呈到不同的淋巴細(xì)胞群，啟動(dòng)抗原特異性免疫應(yīng)答。它們不僅激活淋巴細(xì)胞，在某些環(huán)境下，它們也使T細(xì)胞對(duì)抗原耐受。
T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別是主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制的。只有在肽結(jié)合于特別的MHC分子時(shí)特定的T淋巴細(xì)胞才識(shí)別抗原。通常，T淋巴細(xì)胞只在自身MHC分子存在下而被刺激，抗原只在肽結(jié)合于自身MHC分子時(shí)而被識(shí)別。就被識(shí)別的抗原而言以及就結(jié)合其肽片段的MHC分子而言，MHC限制定義了T淋巴細(xì)胞的特異性。
就識(shí)別和適當(dāng)?shù)膽?yīng)答而言，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外抗原向免疫系統(tǒng)提出了非常不同的挑戰(zhàn)。將抗原遞呈到T細(xì)胞由兩個(gè)截然不同種類(lèi)的分子I類(lèi)MHC(MHC-I)和II類(lèi)MHC(MHC-II)介導(dǎo)，它們利用截然不同的抗原處理途徑。主要是一個(gè)能夠區(qū)別已經(jīng)進(jìn)化的兩個(gè)主要抗原處理途徑。來(lái)源自細(xì)胞內(nèi)抗原的肽由I類(lèi)MHC分子遞呈到CD8+T細(xì)胞，它們實(shí)際上在所有的細(xì)胞上表達(dá)，而細(xì)胞外抗原來(lái)源的肽由II類(lèi)MHC分子遞呈到CD4+T細(xì)胞。然而，這個(gè)兩分法有某些例外。一些研究顯示由內(nèi)吞微?；蚩扇苄缘鞍踪|(zhì)產(chǎn)生的肽被遞呈在巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞的MHC-I分子上。所以，位于外周、高效捕獲和處理細(xì)胞外抗原并在MHC-I分子上將它們遞呈到T淋巴細(xì)胞的APC(象樹(shù)突細(xì)胞)是體外和體內(nèi)用抗原細(xì)胞外脈沖處理(pulsing)它們的引人注目的靶點(diǎn)。
APC重要并獨(dú)特的作用(包括對(duì)不同類(lèi)型白細(xì)胞的刺激活性)反映了它們作為開(kāi)發(fā)成功疫苗適當(dāng)策略的靶點(diǎn)的中心位置。理論上，可以如此進(jìn)行的一個(gè)路線是增強(qiáng)或刺激它們天然的任務(wù)，抗原的攝取。一旦用疫苗所指向的適當(dāng)抗原脈沖處理(pulse)，APC應(yīng)當(dāng)開(kāi)始處理攝取的抗原，因此一旦被激活，APC就表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子，遷移至淋巴器官，分泌細(xì)胞因子并將抗原遞呈到不同的淋巴細(xì)胞群因此啟動(dòng)免疫應(yīng)答。
激活的T細(xì)胞通常以高度調(diào)節(jié)的方式分泌許多效應(yīng)細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-10和干擾素-γ(IFN-g)。普遍地用ELISpot試驗(yàn)(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn))監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原(例如腫瘤抗原，通常在疫苗中給予的抗原)應(yīng)答的功能檢測(cè)，所述ELISpot試驗(yàn)是在單個(gè)細(xì)胞水平分析細(xì)胞因子的產(chǎn)生的技術(shù)。本發(fā)明中對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞免疫(1型免疫應(yīng)答)，使用ELISpot試驗(yàn)監(jiān)測(cè)成功的抗原特異性T細(xì)胞激活。此外，測(cè)定細(xì)胞因子IL-4，作為通常參與促進(jìn)強(qiáng)體液應(yīng)答的2型應(yīng)答的指示劑。另外，體液免疫應(yīng)答用ELISA測(cè)定(IgG1作為2型應(yīng)答的指示劑，IgG2作為1型應(yīng)答的指示劑)。
先前顯示聚陽(yáng)離子有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)I類(lèi)MHC匹配的肽的攝取，被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)裝載(TRANSloading)”肽或蛋白質(zhì)脈沖處理過(guò)程。此外，已經(jīng)顯示聚陽(yáng)離子在體內(nèi)以及體外能夠?qū)㈦幕虻鞍踪|(zhì)“轉(zhuǎn)裝載(TRANSload)”到抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)。另外，在小鼠模型中，聚-L-精氨酸或聚-L-賴(lài)氨酸和適當(dāng)肽的混合物作為疫苗的共注射保護(hù)動(dòng)物避免腫瘤的生長(zhǎng)。這個(gè)化學(xué)定義的疫苗能夠誘導(dǎo)許許多多的抗原/肽特異性T細(xì)胞。誘導(dǎo)至少部分可歸于聚陽(yáng)離子介導(dǎo)的APC對(duì)肽增加的攝取表明，APC在體內(nèi)用抗原脈沖處理，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)給予抗原的免疫。
與特征在于應(yīng)答高特異性但是相對(duì)緩慢的適應(yīng)性免疫相反，先天免疫是基于微生物組分與宿主在結(jié)構(gòu)上的差異所觸發(fā)的效應(yīng)子機(jī)制。這些機(jī)制能發(fā)動(dòng)(mount)相當(dāng)快的初始應(yīng)答，它們主要導(dǎo)致有害物的中和。先天免疫的反應(yīng)是較低等門(mén)的生物唯一的防御策略并且在脊椎動(dòng)物已經(jīng)保留為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)動(dòng)員前的第一線宿主防御。
在較高等的脊椎動(dòng)物中，先天免疫的效應(yīng)細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞以及還可能是樹(shù)突細(xì)胞，而這個(gè)途徑中體液組分是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和各種不同的結(jié)合蛋白。
先天免疫快速且有效的組成是長(zhǎng)度通常在大約十二至大約一百個(gè)之間的氨基酸殘基之多種多樣的殺微生物(microbicidal)肽的產(chǎn)生。幾百個(gè)不同的抗菌肽由范圍從海綿、昆蟲(chóng)到動(dòng)物和人的多種生物體中分離，這指出了這些分子的廣泛分布?？咕囊部勺鳛榈挚垢?jìng)爭(zhēng)生物的拮抗物質(zhì)而由細(xì)菌產(chǎn)生。
CD4+細(xì)胞的兩個(gè)主要亞型(T輔助1(Th1)和T輔助2(Th2))基于它們分泌的不同細(xì)胞因子譜和它們不同的效應(yīng)子功能，在小鼠和人中已經(jīng)鑒別出來(lái)。Th1細(xì)胞主要參與所謂1型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，它一般特征在于遲發(fā)型超敏反應(yīng)的誘導(dǎo)、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫球蛋白種類(lèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2a/IgG2b和尤其是干擾素-γ的分泌。相反，Th2細(xì)胞參與所謂2型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，它特征在于激活B細(xì)胞誘導(dǎo)體液免疫，導(dǎo)致包括種類(lèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG1和IgE的抗體的產(chǎn)生。2型應(yīng)答特征也在于如下細(xì)胞因子的分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。
在多數(shù)情形下，誘導(dǎo)的應(yīng)答類(lèi)型(1型或2型)對(duì)疫苗的保護(hù)效能有顯著的影響。替代的佐劑趨向于促成特異類(lèi)型的應(yīng)答。然而，佐劑的選擇因?yàn)楣δ艿牟豢深A(yù)測(cè)性以及商業(yè)約束和可用性而復(fù)雜化。
流行性感冒病毒的感染屬于最重要并且頻繁的感染，具有顯著的死亡率，尤其是對(duì)于年長(zhǎng)的人或有免疫系統(tǒng)缺陷的人。目前，市場(chǎng)上有很多的流行性感冒疫苗；然而，不是所有的疫苗接種導(dǎo)致對(duì)流行性感冒感染的保護(hù)性。所以，存在為了擴(kuò)大保護(hù)效能改進(jìn)目前的流行性感冒疫苗的需要。
此外，因?yàn)榇蠖鄶?shù)目前的疫苗幾乎都專(zhuān)門(mén)地引發(fā)2型應(yīng)答，所以提供改進(jìn)疫苗的需要是存在的，所述疫苗顯示了針對(duì)1型的免疫應(yīng)答或除了2型應(yīng)答也允許顯著1型免疫應(yīng)答。此外，已經(jīng)可以利用的疫苗應(yīng)當(dāng)提供為允許誘導(dǎo)1型應(yīng)答的改進(jìn)的形式。
所以，本發(fā)明提供了針對(duì)(病毒)感染的改進(jìn)的疫苗，包含抗原，式R1-XZXZNXZX-R2的肽和含有脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的免疫刺激性脫氧核酸。
根據(jù)本發(fā)明過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，這兩個(gè)類(lèi)型的免疫物(Immunizer)的組合顯示了對(duì)抗原的協(xié)同作用。對(duì)于共同的流行性感冒抗原(尤其是血凝素和神經(jīng)氨酸酶)和肝炎病毒抗原尤其顯示出協(xié)同作用。尤其對(duì)于病毒抗原的協(xié)同作用不是由這些物質(zhì)類(lèi)型已知的特性可誘導(dǎo)的。盡管已知這兩個(gè)物質(zhì)類(lèi)型的每一個(gè)都具有良好的免疫刺激特性(WO02/32451，WO 01/93905和PCT/EP02/05448)，對(duì)病毒病原體，尤其是對(duì)流行性感冒和肝炎病毒抗原的聯(lián)合作用，顯著地優(yōu)于能從這些單個(gè)效能簡(jiǎn)單加和所期盼的作用。
由于本發(fā)明，只是通過(guò)額外地提供根據(jù)本發(fā)明的兩種類(lèi)型免疫物質(zhì)的聯(lián)合可顯著地改進(jìn)已經(jīng)可得的或市售的病毒疫苗，尤其是流行性感冒或甲、乙或丙型肝炎疫苗。
所以本發(fā)明提供了預(yù)防病毒感染的疫苗，包含-抗原，尤其是病毒抗原，-包含序列R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之間的整數(shù)，優(yōu)選地是5，X是帶正電荷的天然和/或非天然的氨基酸殘基，Z是選自L、V、I、F和/或W的氨基酸殘基，R1和R2相互獨(dú)立地選自-H、-NH2、-COCH3、-COH至多達(dá)20個(gè)氨基酸殘基的肽或者肽反應(yīng)基團(tuán)或者帶有或不帶有肽的肽連接子；X-R2可以是所述肽(在下面也稱(chēng)為“肽A”)羧基末端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯以及-具有根據(jù)式(I)結(jié)構(gòu)的免疫刺激性寡聚核酸分子(ODN)， 其中R選自次黃嘌呤和尿嘧啶，任一X是O或S，任一NMP是2’脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥(niǎo)苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥(niǎo)嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥(niǎo)苷-或者N-異戊烯基-脫氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，NUC是2’脫氧核苷，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥(niǎo)苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧肌苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧尿苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥(niǎo)嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥(niǎo)苷-或者N-異戊烯基-脫氧腺苷，a和b是從0至100的整數(shù)，前提是a+b在4至150之間，且B和E是核酸分子5’或3’末端的共有基團(tuán)(在下面稱(chēng)為″I-/U-ODN″)。
當(dāng)然，本疫苗可進(jìn)一步地含有其它的物質(zhì)，例如合適的藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體、緩沖劑或穩(wěn)定物質(zhì)等等。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步地含有額外的佐劑，尤其是Al(OH)3佐劑(Alum)。
Alum如此處所指包括用于人和動(dòng)物醫(yī)藥及研究的所有形式的基于Al3+的佐劑。尤其是，它包括如Rompp，第10版，139/140頁(yè)定義的所有形式的氫氧化鋁，它們的凝膠形式，磷酸鋁等等。
這個(gè)對(duì)于已經(jīng)面市并含有這樣的Al(OH)3佐劑的疫苗是特別優(yōu)選的。在這樣的情況下，根據(jù)本發(fā)明的免疫物的組合可以簡(jiǎn)單地加入到這樣的現(xiàn)有疫苗中。
本抗原優(yōu)選地是病毒抗原。如果顯著的(或?qū)ｉT(mén)的)Th1 1型應(yīng)答應(yīng)當(dāng)是特別必需的，優(yōu)選的T細(xì)胞抗原決定簇(見(jiàn)上面的引言)作為抗原。所述抗原優(yōu)選地是病毒抗原。在實(shí)施例部分，本發(fā)明在原理上證明對(duì)流行性感冒和肝炎病毒抗原特別有效，也就是對(duì)根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的抗原乙型肝炎表面抗原和丙型肝炎抗原有效。
當(dāng)然，依賴(lài)于期望的免疫應(yīng)答，藥物制備也可包含兩個(gè)或多個(gè)抗原?？梢詫?duì)抗原進(jìn)行修飾以進(jìn)一步地增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
源自病毒或細(xì)菌病原體、源自真菌或寄生蟲(chóng)的蛋白質(zhì)或肽，以及腫瘤抗原(癌癥疫苗)或在自身免疫疾病中有假定作用的抗原可以用作抗原(包括衍生化的抗原，象糖基化的、脂質(zhì)化的、糖脂化的或羥基化的抗原)。此外，碳水化合物、脂質(zhì)或糖脂本身可用作抗原。衍生化過(guò)程可包括源自病原體的特定蛋白質(zhì)或肽的純化、病原體的失活以及這樣的蛋白質(zhì)或肽的水解或化學(xué)衍生作用或穩(wěn)定化?；蛘?，病原體本身也可用作抗原?？乖瓋?yōu)選地是肽或蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、糖脂或它們的混合物。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，T細(xì)胞表位被用作抗原?；蛘?，T細(xì)胞表位B細(xì)胞表位的聯(lián)合也是優(yōu)選的。
當(dāng)然根據(jù)本發(fā)明也可能使用不同抗原的混合物。優(yōu)選地，分離自病毒或細(xì)菌病原體或真菌或寄生蟲(chóng)(或它們的重組對(duì)應(yīng)物)的蛋白質(zhì)或肽被用作這樣的抗原(包括衍生化抗原或糖基化或脂質(zhì)化抗原或多糖或脂質(zhì))?？乖牧硪粋€(gè)優(yōu)選來(lái)源是腫瘤抗原。優(yōu)選的病原體選自人類(lèi)免疫缺陷性病毒(HIV)、甲型和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(HCV)或其它的黃病毒，例如日本腦炎病毒(JCV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、EB病毒(EBV)、流行性感冒病毒、人類(lèi)乳突狀病毒(HPV)、輪狀病毒、金黃色葡萄球菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、結(jié)核桿菌、肺炎鏈球菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、瘧疾原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)，等等)、曲霉屬(Aspergillus sp.)或白色念珠菌。
在肽抗原的情況下，肽模型表位(mimotope)/激動(dòng)劑/高級(jí)激動(dòng)劑/拮抗劑，或者在某些位置改變但不影響免疫特性的肽或者非肽模型表位/激動(dòng)劑/高級(jí)激動(dòng)劑/拮抗劑的用途包括在本發(fā)明中。肽抗原也可以在肽抗原羧基或氨基末端含有延長(zhǎng)，以促進(jìn)與聚陽(yáng)離子化合物或免疫刺激性化合物的相互作用。
也可對(duì)抗原進(jìn)行衍生化，以包括增強(qiáng)抗原遞呈和將抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞的分子。
根據(jù)本發(fā)明，所使用的流行性感冒或肝炎抗原通常不受限于特定形式，似乎所述作用根據(jù)本發(fā)明對(duì)于流行性感冒、乙型肝炎或丙型肝炎病原體特異性地進(jìn)一步增強(qiáng)，但是不特異于來(lái)自流行性感冒或HBV病原體的某個(gè)類(lèi)型的抗原。然而，在本疫苗中使用標(biāo)準(zhǔn)流行性感冒或HBV抗原也是優(yōu)選的，即血凝素抗原，神經(jīng)氨酸酶抗原，聯(lián)合抗原或者一個(gè)或多個(gè)這些抗原的組合。
優(yōu)選地，分離自流行性感冒病毒、HBV或HCV來(lái)源(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)或它們重組對(duì)應(yīng)物的蛋白質(zhì)或肽被用作這樣的抗原，包括衍生化抗原。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選地進(jìn)一步(或者，在流行性感冒、HCV或HBV的情況下特異性地，而不是肽A)含有聚陽(yáng)離子肽。
根據(jù)本發(fā)明待使用的聚陽(yáng)離子肽或化合物可以是根據(jù)WO97/30721任何顯示特征性作用的聚陽(yáng)離子化合物。優(yōu)選的聚陽(yáng)離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽(yáng)離子、堿性聚氨基酸或它們的混合物。這些聚氨基酸應(yīng)當(dāng)具有至少4個(gè)氨基酸殘基的鏈長(zhǎng)度。尤其優(yōu)選地是含有肽鍵的物質(zhì)，象聚賴(lài)氨酸、聚精氨酸以及在多于8個(gè)，尤其是多于20個(gè)氨基酸殘基的范圍之內(nèi)含有多于20％，尤其是多于50％堿性氨基酸的多肽或者它們的混合物。其它優(yōu)選的聚陽(yáng)離子和它們的藥物組合物在WO 97/30721(例如，聚乙烯亞胺)和WO 99/38528中有描述。優(yōu)選地這些多肽含有20至500個(gè)之間的氨基酸殘基，尤其是30至200個(gè)之間的殘基。
這些聚陽(yáng)離子化合物可化學(xué)或重組產(chǎn)生或者可從天然來(lái)源衍生。
陽(yáng)離子(多聚)肽也可是聚陽(yáng)離子抗細(xì)菌微生物肽。這些(多聚)肽可以是原核或真核來(lái)源的或者化學(xué)或重組產(chǎn)生的。肽還可以屬于天然發(fā)生的抗微生物肽類(lèi)。這樣的宿主防御肽或防御物也是優(yōu)選形式的根據(jù)本發(fā)明的聚陽(yáng)離子聚合體。通常，允許適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的終末產(chǎn)物激活(或下調(diào))，優(yōu)選地由APC介導(dǎo)的(包括樹(shù)突細(xì)胞)的化合物被用作聚陽(yáng)離子聚合體。
此外，神經(jīng)活性化合物，例如(人)生長(zhǎng)激素(如例如WO 01/24822中描述的)也可用作免疫刺激劑(免疫物)。
天然來(lái)源衍生的聚陽(yáng)離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生陽(yáng)離子肽、觸角足(antennapedia)肽、殼聚糖(chitosan)或者甲殼素(chitin)的其它衍生物)或者通過(guò)生化或重組生產(chǎn)從這些肽或蛋白質(zhì)衍生的其它肽。其它優(yōu)選的聚陽(yáng)離子化合物是cathelin或來(lái)自cathelicidin的相關(guān)或衍生物質(zhì)，尤其是小鼠、牛或尤其是人cathelicidin和/或cathelicidin。相關(guān)或衍生的cathelicidin物質(zhì)含有全部或部分帶有至少15-20個(gè)氨基酸殘基的cathelicidin序列。衍生化包括天然氨基酸被不屬于20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的氨基酸替代或修飾。另外，可將更多的陽(yáng)離子殘基引入這樣的cathelicidin分子。這些cathelicidin分子優(yōu)選與根據(jù)本發(fā)明的抗原/疫苗組合物聯(lián)合。然而，令人驚訝地這些cathelin分子作為抗原的佐劑也是有效的，而無(wú)需加入更多的佐劑。所以，這樣的cathelicidin分子可用作有或沒(méi)有更多免疫刺激物質(zhì)的疫苗制劑中的有效佐劑。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選地含有象肽A KLKL5KLK以及象I-/U-ODN寡聚d(IC)13(肽A和寡聚d(IC)13的聯(lián)合也稱(chēng)為IC31)。這兩個(gè)物質(zhì)在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中顯示了特別有利的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明疫苗可進(jìn)一步地(或者，特別在流行性感冒、HCV或HBV的情況下，而不是U-/I-ODN)含有作為免疫調(diào)節(jié)核酸的含有CpG-基序的寡聚脫氧核苷酸。根據(jù)本發(fā)明使用的免疫調(diào)節(jié)核酸是可以合成、原核和真核來(lái)源的。在真核來(lái)源的情況下，DNA基于種系樹(shù)(phylogenetic tree)應(yīng)當(dāng)從較低等發(fā)育種類(lèi)衍生而來(lái)(例如昆蟲(chóng)，但是也可是其它)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性寡聚脫氧核苷酸(ODN)是合成生產(chǎn)的DNA分子或這類(lèi)分子的混合物。也包括如例如美國(guó)專(zhuān)利US 5,723,335和US 5,663,153描述的ODN衍生物或修飾物例如硫代磷酸酯取代的類(lèi)似物(替代磷酸酯的硫代磷酸酯殘基)，以及其它的衍生物和修飾物，優(yōu)選地它們穩(wěn)定免疫刺激組合物但是不改變它們的免疫特性。優(yōu)選的序列基序是含有側(cè)翼為兩個(gè)5’嘌呤和兩個(gè)3’嘧啶的(非甲基化的)CpG二核苷酸的六堿基DNA基序(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。根據(jù)本發(fā)明ODN中含有的CpG基序在微生物DNA中比在更高等的脊椎動(dòng)物DNA中更普遍，并且顯示出甲基化模式的不同。令人驚訝地，刺激小鼠APC的序列對(duì)人類(lèi)細(xì)胞不是非常有效。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選回文或非回文ODN在例如奧地利專(zhuān)利申請(qǐng)A 1973/2000、A 805/2001，EP 0 468 520 A2，WO 96/02555，WO 98/16247，WO 98/18810，WO 98/37919，WO 98/40100，WO 98/52581，WO 98/52962，WO 99/51259和WO 99/56755中有公開(kāi)，此處引用作為參考。ODN/DNA可化學(xué)或重組產(chǎn)生或者從天然來(lái)源衍生。優(yōu)選的天然來(lái)源是昆蟲(chóng)。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗可優(yōu)選地包含聚陽(yáng)離子肽與含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸的組合。在本發(fā)明的過(guò)程中甚至發(fā)現(xiàn)在流行性感冒疫苗組合物中CpG-ODN和聚陽(yáng)離子肽的組合顯示了改進(jìn)的作用，這與肽A和I-/U-ODN組合的作用相當(dāng)，并不是僅僅與肽A和I-/U-ODN聯(lián)合而甚至是替代它們而被使用。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明也可使用不同免疫刺激核酸(I-/U-ODNs，CpG-ODNs，...)和肽A變異物(以及其它刺激物)的混合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明也涉及兩個(gè)都根據(jù)本發(fā)明定義的肽A和I-/U-ODN組合的用途，以改進(jìn)疫苗抗病毒病原體，尤其是流行性感冒病毒、HCV或HBV、HIV、HPV或JEV的保護(hù)效能。特別地，能改進(jìn)疫苗的抗病毒病原體，尤其是流行性感冒病毒、HCV或HBV、HIV、HPV或JEV的抗原特異性1型應(yīng)答，尤其是IgG2抗體應(yīng)答或IFN-γ應(yīng)答，并且在同一時(shí)間能保存(或優(yōu)選地也增加)所述疫苗的2型應(yīng)答，尤其是IgG1抗體應(yīng)答或白細(xì)胞介素4(IL-4)應(yīng)答。
先前顯示(WO 02/13857)天然發(fā)生的cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物具有免疫應(yīng)答刺激活性，所以構(gòu)成了高效1型誘導(dǎo)佐劑(免疫物)?？刮⑸镫牡闹饕獊?lái)源是嗜中性粒細(xì)胞和呼吸、胃腸道和生殖道上皮細(xì)胞的顆粒。通常它們發(fā)現(xiàn)于最常暴露于微生物入侵的解剖學(xué)位點(diǎn)，分泌到內(nèi)部體液或貯存在專(zhuān)門(mén)噬菌細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)顆粒內(nèi)。
在WO 02/32451中，公開(kāi)了能夠很強(qiáng)地增加對(duì)特異性共給予抗原的免疫應(yīng)答并所以構(gòu)成了高效佐劑的1型誘導(dǎo)佐劑(免疫物)，即包含序列R1-XZXZNXZX-R2的肽A。尤其優(yōu)選的肽是KLKLLLLLKLK。除了天然發(fā)生的抗微生物肽外，已經(jīng)生產(chǎn)和研究了合成抗微生物肽。在金黃葡萄糖菌感染的小鼠中顯示合成抗微生物肽KLKLLLLLKLK-NH2具有顯著的化學(xué)治療活性；人嗜中性粒細(xì)胞被激活經(jīng)由細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)。發(fā)現(xiàn)K和L的確切數(shù)目和位置對(duì)于合成肽的抗微生物活性是關(guān)鍵的(Nakajima，Y.(1997)；Cho，J-H.(1999))。
如果例如皮下地、肌內(nèi)注射地、皮內(nèi)地或透皮地給予聯(lián)合藥劑，本發(fā)明尤其有益。然而，其它的應(yīng)用形式，例如非腸道、靜脈、鼻內(nèi)、口腔或局部應(yīng)用，也適合本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明流行性感冒抗原可與佐劑(免疫物)(組合物)混合，或者另外特殊地制成制劑，例如脂質(zhì)體、延遲制劑等等。
根據(jù)本發(fā)明疫苗以流行性感冒疫苗接種領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的有效量給予個(gè)體。抗原量和免疫物量的最優(yōu)化能從已經(jīng)確立的量開(kāi)始并使用可利用的方法。
本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例和圖例更加詳細(xì)地描述，但是本發(fā)明當(dāng)然并不局限于這些。


圖1顯示陽(yáng)離子肽與不同ODN共注射協(xié)同誘導(dǎo)抗市售流行性感冒疫苗的強(qiáng)1型體液應(yīng)答(IgG2b)；圖2顯示KLK/o-d(IC)13強(qiáng)烈地改善市售流行性感冒疫苗的效能；圖3顯示單次注射KLK/o-d(IC)13協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性感冒疫苗的細(xì)胞1型和體液1型及2型應(yīng)答。
圖4顯示單次注射KLK/o-d(IC)13很強(qiáng)地改進(jìn)市售流行性感冒病毒的效能。
圖5顯示用來(lái)自流行性感冒A病毒的ncORF衍生肽聯(lián)合KLK/o-d(IC)13的疫苗接種誘導(dǎo)強(qiáng)產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞和抗病毒攻擊的保護(hù)圖6顯示KLK/O-d(IC)13誘導(dǎo)HCV-肽特異性1型細(xì)胞免疫應(yīng)答圖7顯示陽(yáng)離子肽與不同ODN共注射誘導(dǎo)HBsAg特異性細(xì)胞1型應(yīng)答(IFN-γ的產(chǎn)生)，而HBsAg誘導(dǎo)的2型應(yīng)答(IL-4的產(chǎn)生)不受影響或降低。
圖8a顯示一次注射陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)和低量市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的疫苗特異性細(xì)胞1型免疫應(yīng)答的結(jié)果。
圖8b顯示了一次注射陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)和低量市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的混合1型/2型體液免疫應(yīng)答的結(jié)果。
圖9a顯示一次注射低劑量的陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的結(jié)果。
圖9b顯示一次注射低劑量的陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)和低量市售流行性感冒疫苗(AgrippalS1)的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的混合1型/2型體液免疫應(yīng)答的結(jié)果。
圖10顯示一次注射市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)聯(lián)合于陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷o-d(IC)13(ODN1a)與聯(lián)合于其它佐劑比較的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1陽(yáng)離子肽(pR或KLK)與不同的寡聚脫氧核苷(ODN)(CpI，ntCpI，o-d(IC)13)共注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性感冒疫苗(Fluvirin)的1型體液應(yīng)答(IgG2b)。
小鼠C57BL/6(Harlan/Olac)流行性感冒疫苗 Fluvirin(Evans vaccine)；下列純化的失活流行性感冒病毒表面抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(15μg血凝素)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/007/99RESVIR-17)(15μg血凝素)B/Sichuan/379/99樣株(15μg血凝素)劑量1μg總蛋白/小鼠Al(OH)3Alhydrogel；Biosys，丹麥劑量與抗原1∶1的混合物pR 有平均43個(gè)精氨酸殘基的多聚化程度的聚-L-精氨酸(由MALLS測(cè)定的)；SigmaAldrich Inc
劑量100μg/小鼠KLK KLKLLLLLKLK-COOH由MPS(MultiplePeptide System，USA)合成劑量168μg/小鼠oligo-d(IC)13(＝ODN1a) ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC3′由Purimex Nucleic AcidsTechnology，Gttingen合成劑量5nmol/鼠I-ODN 2 含有脫氧肌苷的硫代磷酸取代的ODNtccatg aci ttc ctg atg ct，由PurimexNucleic Acids Technology，Gttingen合成劑量5nmol/鼠I-ODN 2b含有脫氧肌苷的ODNtcc atg aci ttc ctgatg ct，由Purimex Nucleic AcidsTechnology，Gttingen合成劑量5nmol/鼠制劑5mM Tris/270mM山梨醇，pH 7實(shí)驗(yàn)組(12只小鼠/組)1.幼稚的2.流感(Flu)疫苗3.流感疫苗+pR4.流感疫苗+KLK5.流感疫苗+Al(OH)36.流感疫苗+o-d(IC)137.流感疫苗+I-ODN 28.流感疫苗+I-ODN 2b9.流感疫苗+pR+I-ODN 2
10.流感疫苗+KLK+o-d(IC)1311.流感疫苗+KLK+I-ODN 212.流感疫苗+KLK+I-ODN 2b在第0、28和56天，C57BL/6小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出的化合物總體積100μl/小鼠(50μl/足墊)。在第26、54和82天收集血清，通過(guò)ELISA分析流行性感冒疫苗特異性IgG1和IgG2b抗體。滴度相應(yīng)于得到半數(shù)最大OD405nm血清的那個(gè)稀釋度。
圖1指出陽(yáng)離子肽(pR或KLK)和不同的ODN(I-ODN 2，I-ODN 2b或o-d(IC)13)的聯(lián)合注射以協(xié)同方式誘導(dǎo)了非常強(qiáng)的抗原(流行性感冒疫苗)特異性體液1型應(yīng)答(IgG2b)。流行性感冒疫苗單獨(dú)或與Al(OH)3聯(lián)合、陽(yáng)離子肽(pR，KLK)單獨(dú)或不同的ODN(除I-ODN 2外)單獨(dú)注射后，沒(méi)有特異性IgG2b應(yīng)答可以檢測(cè)的到。加強(qiáng)疫苗接種很強(qiáng)地增加觀察到的應(yīng)答。
流行性感冒疫苗與Al(OH)3、KLK的共注射或聯(lián)合pR/I-ODN 2、KLK/I-ODN 2、KLK/I-ODN 2b或KLK/o-d(IC)13誘導(dǎo)流行性感冒疫苗特異性IgG1的產(chǎn)生(2型應(yīng)答)。
實(shí)施例2聯(lián)合KLK/o-d(IC)13很強(qiáng)地改進(jìn)了市售流行性感冒疫苗(Fluvirin)的效能。
小鼠BALB/c(Harlan/Olac)流行性感冒疫苗 Fluvirin(Evans vaccine)；下列株純化的失活流行性感冒疫苗表面抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(15μg血凝素)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株
(A/Panama/2007/99 RESVIR-17)(15μg血凝素)B/Sichuan/379/99樣株(15μg血凝素)劑量1μg總蛋白/小鼠(＝低劑量/文獻(xiàn)10μg/小鼠)Al(OH)3Alhydrogel；Biosys，Denmark劑量與抗原1∶1的混合物KLK KLKLLLLLKLK-COOH由MPS(MultiplePeptide System，USA)合成劑量168μg/鼠oligo-d(IC)13(＝ODN1a) ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC3′由Purimex Nucleic AcidsTechnology，Gttingen合成劑量5nmol/鼠制劑5mM Tris/270mM山梨醇，pH 7實(shí)驗(yàn)組(12只小鼠/組)1.幼稚的2.流感疫苗3.流感疫苗+Al(OH)34.流感疫苗+KLK+o-d(IC)13在第0、28和56天BALB/c小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出的化合物總體積100μl/小鼠(50μl/足墊)。在第26、54和82天收集血清并使用標(biāo)準(zhǔn)血凝應(yīng)答抑制試驗(yàn)分析中和抗血凝素抗體。簡(jiǎn)要地，病毒表面上血凝素的存在誘導(dǎo)紅細(xì)胞的血凝應(yīng)答，這能被中和抗血凝素抗體抑制。測(cè)定抗不同病毒株(A1＝A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株；A2＝A/Panama/2007/99RESVIR-17；B＝B/Sichuan/379/99樣株)血凝素的抗體的滴度。血清的滴度相應(yīng)于顯示抑制的終點(diǎn)稀釋度。
與流行性感冒疫苗單獨(dú)或和Al(OH)3聯(lián)合的注射相反，流行性感冒疫苗加上KLK和o-d(IC)13的共注射誘導(dǎo)高水平的抗所有三種受試血凝素的中和抗體(圖2)。因?yàn)橐呀?jīng)顯示流行性感冒疫苗的有效性與抗血凝素抗體的血清滴度相關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d(IC)13誘導(dǎo)抗流行性感冒的保護(hù)的很高的潛能。
實(shí)施例3單次注射陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13的聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)的細(xì)胞1型和體液1型/2型免疫應(yīng)答材料小鼠BALB/c(Harlan-Winkelmann，德國(guó))流行性感冒疫苗 Agrippal S1(Chiron SpA，Italy；season2002/2003)；來(lái)自下列株失活的純化流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99IVR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99RESVIR-17)B/HongKong/330/2001樣株(B/Shangdong/7/97)總抗原含量45μg(對(duì)于每個(gè)抗原15μg)；批號(hào)4307；失效日期05/2003劑量1μg總蛋白/小鼠Fluad(Chiron SpA，意大利；season2002/2003)；來(lái)自下列株失活的純化流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)
A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99IVR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99RESVIR17)(B/Shangdong/7/97)總抗原量45μg(對(duì)于每個(gè)抗原15μg)；MF59C.1作為佐劑加入批號(hào)3403；失效日期05/2003劑量1μg總蛋白/小鼠oligo-d(IC)13(＝ODN1a) ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC3′由Purimex Nucleic AcidsTechnology，Gttingen合成劑量0.4nmol/鼠KLK KLKLLLLLKLK-COOH由MPS(MultiplePeptide System，USA)合成劑量10nmol/小鼠制劑10mMs Tris/135mM NaCl；pH-7實(shí)驗(yàn)設(shè)置(10只小鼠/組)1.幼稚的2.Agrippal S13.Fluad4.Agrippal S1+KLK+o-d(IC)13在第0天，BALB/c小鼠雙后股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總量100μl疫苗/小鼠(50μl/肌肉)。在第21天收集血清并且用ELI SA分析流行性感冒疫苗特異性IgG1和IgG2a抗體。滴度相應(yīng)于得到半數(shù)最大OD405nm血清的稀釋度。另外，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并且制備單個(gè)細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞的分裝物用磁性分揀試劑盒(CD4 MACS sort，Miltenyi)分開(kāi)為CD4+T細(xì)胞。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal S1抗原特異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中對(duì)未分開(kāi)的脾細(xì)胞或分開(kāi)的CD4+T細(xì)胞聯(lián)合經(jīng)照射的抗原遞呈細(xì)胞(APC；來(lái)源于幼稚小鼠的)進(jìn)行刺激。分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生IFN-γ(作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，IL-4和IL-5(作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)結(jié)果(圖3a)低量流行性感冒疫苗Agrippal S1(未加佐劑的)和Fluad(加了MF59佐劑的)單獨(dú)注射不能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生疫苗(AgrippalS1)特異性的IFN-γ，而Agrippal S1與KLK/o-d(IC)13聯(lián)合注射后，觀察到CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的疫苗(Agrippal S1)特異性IFN-γ。與幼稚小鼠相比，單獨(dú)Agrippal S1僅略微誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，KLK/o-d(IC)13加入到疫苗未顯示進(jìn)一步地增加。然而，F(xiàn)luad是CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4以及未分開(kāi)的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-5有力的誘導(dǎo)劑。在Agrippal S1單獨(dú)注射后僅可檢測(cè)到很低水平的IL-5，但是在與KLK/o-d(IC)13的聯(lián)合就檢測(cè)不到。未分開(kāi)脾細(xì)胞的再刺激之后，得到相似的結(jié)果。
結(jié)果(圖3b)圖3b顯示加佐劑的流行性感冒疫苗Fluad單獨(dú)注射誘導(dǎo)很強(qiáng)的疫苗(Agrippal S1)特異性體液2型應(yīng)答(IgG1)，但僅僅微弱的1型應(yīng)答(IgG2a)。然而，未加佐劑的流行性感冒疫苗與KLK/o-d(IC)13的聯(lián)合注射誘導(dǎo)了非常強(qiáng)的疫苗(Agrippal S1)特異性IgG2a(體液1型免疫應(yīng)答)以及比單獨(dú)Agrippal S1更高水平的IgG1。因?yàn)榭沽餍行愿忻暗谋Ｗo(hù)與疫苗抗原特異性IgG2a抗體的存在相關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d(IC)13作為流行性感冒疫苗有效佐劑的很高的潛能。
實(shí)施例4聯(lián)合KLK/o-d(IC)13一次注射后很強(qiáng)地改善了市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)的效能材料小鼠BALB/c(Harlan-Winkelmann，德國(guó))流行性感冒疫苗 Agrippal S1(Chiron SpA，Italy；season2002/2003)；下列株純化的失活流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99 IVR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99 RESVIR-17)B/HongKong/33 0/2001樣株(B/Shangdong/7/97)總抗原量45μg(對(duì)于每個(gè)抗原15μg)；批號(hào)4307；失效日期05/2003劑量1μg總蛋白/小鼠Fluad(Chiron SpA，意大利；season2002/2003)；下列株純化的失活流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledoni a/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99I VR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99RESVIR 17)(B/Shangdong/7/97)總抗原量45μg(對(duì)于每個(gè)抗原15μg)；MF59C.1作為佐劑的加入批號(hào)3403；失效日期05/2003劑量1μg總蛋白/小鼠
o-d(IC)13(＝ODN1a) ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3′由Purimex Nucleic Acids Technology，Gttingen合成劑量0.5nmol/小鼠KLK KLKLLLLLKLK-COOH由MPS(Multiple PeptideSystem，USA)合成劑量10nmol/小鼠制劑10mM Tris/270mM山梨醇，pH-7實(shí)驗(yàn)設(shè)置(10只小鼠/組)1.幼稚的2.Agrippal S13.Fluad4.Agrippal S1+KLK+o-d(IC)13在第0天，BALB/c小鼠雙后股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總量100μl疫苗/小鼠(50μl/肌肉)。在第21天，收集血清并且使用人類(lèi)血清標(biāo)準(zhǔn)血凝素抑制(HI)試驗(yàn)分析中和抗血凝素抗體。測(cè)定抗來(lái)源于流行性感冒疫苗Aggripal S1和Fluad不同病毒株(見(jiàn)材料)的抗體的滴度。
結(jié)果(圖4)與單獨(dú)Agrippal S1的注射相反，流行性感冒疫苗與低量KLK/o-d(IC)13的共注射很強(qiáng)地誘導(dǎo)了抗兩個(gè)受試流行性感冒A株(A/NewCaledonia/20/99；A/Panama/2007/99)的中和抗體水平的增加。然而，用Fluad的疫苗接種誘導(dǎo)了與Agrippal S1和低量KLK/o-d(IC)13的共注射水平相同的中和抗體。因?yàn)橐呀?jīng)顯示流行性感冒疫苗的有效性與抗血凝素抗體的血清滴度相關(guān)，本結(jié)果指出KLK/o-d(IC)13作為佐劑誘導(dǎo)抗流行性感冒的保護(hù)很高的潛能。
實(shí)施例5用來(lái)自流行性感冒A病毒的ncORF衍生肽聯(lián)合KLK/o-d(IC)13對(duì)小鼠的疫苗接種。在疫苗接種后7天測(cè)量特異性T細(xì)胞應(yīng)答，動(dòng)物隨后用致死劑量小鼠適應(yīng)的流行性感冒A病毒(x31)刺激(challenge)。監(jiān)測(cè)存活15天。
材料小鼠C57B1/6(Harlan-Winkelmann，Germany)肽 p82(GLCTLVAML)來(lái)源于EBV的對(duì)照肽；HLA-A*0201；AA開(kāi)始點(diǎn)280p1574(IASNENMETM)來(lái)源于流行性感冒核蛋白質(zhì)的對(duì)照肽，AA開(kāi)始點(diǎn)365p1569(TMLYNKMEF)來(lái)自片斷1、框架1、ORF1的流感ncORF衍生肽，AA開(kāi)始點(diǎn)569p1600(SSIAAQDAL)來(lái)自片斷3、框架6、ORF2的流感ncORF衍生肽，AA開(kāi)始點(diǎn)83P1664(VTILNLALL)來(lái)自片斷4、框架5、ORF6的流感ncORF衍生肽，AA開(kāi)始點(diǎn)9劑量100μg/肽/小鼠o-d(IC)13ODN5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3′(＝ODN1a) 由Purimex Nucleic Acids Technology，Gttingen合成劑量0.5nmol/鼠
KLKKLKLLLLLKLK-COOH由MPS(Multiple Peptide System，USA)合成劑量127nmol/小鼠制劑 270mM山梨醇/10mM Hepes流行性感冒A 病毒 x31，小鼠適應(yīng)的流行性感冒A病毒，rec.病毒，來(lái)源于A/Pr/8/34(seg 1，2，3，5，7，8)和A/Aichi/2/68(seg4，6)實(shí)驗(yàn)設(shè)置(15只小鼠/組)1.p1574+KLK+o-d(IC)132.p1569+KLK+o-d(IC)133.p1600+KLK+o-d(IC)134.p1664+KLK+o-d(IC)135.p1600+p1569+KLK+o-d(IC)13在第0天小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出的化合物總量100μl疫苗/小鼠(50μl/足墊)。在第7天，為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)肽特異性IFN-γ細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激來(lái)自5只小鼠的未分開(kāi)脾細(xì)胞。
剩下的10只小鼠用小鼠適應(yīng)的x31流行性感冒A病毒(5*10E5pfu)進(jìn)行攻擊。監(jiān)測(cè)存活15天。
結(jié)果ELIspot(圖5a)組1和3(肽p1574和p1600)的脾細(xì)胞在用各自的肽再刺激后未顯示任何特異性的斑點(diǎn)。組2和4(p1569和p1664)在再刺激后特異性地釋放IFN-γ。組5用兩個(gè)單獨(dú)的肽(不是混合物，p1600和p1569)進(jìn)行疫苗接種。用兩個(gè)肽的混合或p1569再刺激后，檢測(cè)到特異性的細(xì)胞因子釋放。相反，用p1600單獨(dú)再刺激后，沒(méi)有檢測(cè)到IFN-γ。這與組3(p1600單獨(dú))一致。
結(jié)果攻擊(圖5b)圖5b顯示用致死劑量小鼠適應(yīng)的流行性感冒A病毒x31刺激小鼠的存活率。組1(p1574，報(bào)告的H2-Db保護(hù)抗原決定簇)保護(hù)了30％的所有受刺激小鼠。肽p1569根本不提供保護(hù)(0％)。相反，肽p1600和p1664分別保護(hù)了50％和62％的受刺激動(dòng)物。當(dāng)動(dòng)物用兩個(gè)不同的肽(組5，肽p1600和p1569)進(jìn)行疫苗接種時(shí)一共70％的動(dòng)物受到保護(hù)。
實(shí)施例6用五個(gè)不同HCV衍生肽的聯(lián)合注射、抗微生物肽KLK和合成寡聚核苷酸o-d(IC)13誘導(dǎo)很強(qiáng)的HCV特異性1型細(xì)胞應(yīng)答小鼠HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD.1)肽 肽p83、p84、p87、p89、p1426用于疫苗接種。
p83HCV衍生肽，(KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL)p84HCV衍生肽，(GYKVLVLNPSVAAT)p87HCV衍生肽，(DLMGYIPAV)p89HCV衍生肽，(CINGVCWTV)p1426HCV衍生肽，(HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA)(p1274作為不相關(guān)肽用于再刺激(YMDGTMSQV；HLA-A*0201限制的)所有肽用標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成進(jìn)行合成、HPLC純化并用質(zhì)譜法分析純度。
劑量20μg/肽/小鼠KLK KLKLLLLLKLK-COOH由MPS(MultiplePeptide System，USA)合成劑量10nmol/小鼠oligo-d(IC)13(＝ODN1a) ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC3′由Purimex Nucleic AcidsTechnology，Gttingen合成劑量0.4nmol/鼠制劑10mM Tris/135mM NaCl，pH-7實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組)1.HCV肽2.HCV肽+KLK+o-d(IC)13在第0、14和28天，HHD.1小鼠雙后足墊皮下注射含有上面列出的化合物總量100μl/小鼠(50μl/足墊)。在第35天(最后一次疫苗接種后7天)用磁性分開(kāi)試劑盒(MACS，Miltenyi)從脾細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞懸浮液分離CD4+以及CD8+T細(xì)胞。T細(xì)胞用培養(yǎng)液孵育(背景對(duì)照)或在有用于疫苗接種不同的肽或不相關(guān)肽p1274的存在下用來(lái)自幼稚HHD.1小鼠經(jīng)照射的脾細(xì)胞作為APC進(jìn)行再刺激。過(guò)夜孵育后，用ELIspot試驗(yàn)分析IFN-γ的產(chǎn)生。
圖6顯示KLK/o-d(IC)13和五個(gè)HCV衍生肽共注射后，誘導(dǎo)抗p84、p87、p89、p1426 CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生高量的IFN-γ。此外，可檢測(cè)到抗p87、p89 CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的IFN-γ。
實(shí)施例7陽(yáng)離子肽與不同寡聚脫氧核苷酸(ODN)(CpI，ntCpI，o-d(IC)13)共注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗肝炎B表面抗原的1型細(xì)胞應(yīng)答(IFN-γ)。
小鼠C57BL/6(Harlan-Winkelmann，德國(guó))；對(duì)HBsAg特異性免疫應(yīng)答低應(yīng)答的小鼠抗原乙型肝炎表面抗原(HBsAg)劑量5μg/小鼠Al(OH)3Alhydrogel；Biosys，丹麥劑量與抗原1∶1的混合物pR 有平均43個(gè)精氨酸殘基多聚程度的聚-L-精氨酸(由MALLS測(cè)定)；Sigma Aldrich Inc劑量100μg/小鼠KLK KLKLLLLLKLK-COOH由MPS(Multiple PeptideSystem，USA)合成劑量168μg/小鼠I-ODN 2 (＝CpI 2)含有脫氧肌苷的硫代磷酸替代的ODN5′tcc atg aci ttc ctg atg ct3′由Purimex Nucleic Acids Technology，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠I-ODN 2b(＝CpI 2b)含有脫氧肌苷的ODN5′tcc atg acittc ctg atg ct3′由Purimex Nucleic AcidsTechnology，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠o-d(IC)13(＝ODN1a) ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC3′由Purimex Nucleic Acids Technology，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠制劑5mM Tris/270mM山梨醇，pH 7
實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組/時(shí)間點(diǎn))1.HBsAg2.HBsAg+Alum3.HBsAg+I-ODN 24.HBsAg+I-ODN 2b5.HBsAg+o-d(IC)136.HBsAg+pR7.HBsAg+KLK8.HBsAg+pR+I-ODN 29.HBsAg+pR+I-ODN 2b10.HBsAg+pR+o-d(IC)1311.HBsAg+KLK+I-ODN 212.HBsAg+KLK+I-ODN 2b13.HBsAg+KLK+o-d(IC)13在第0天和第56天，小鼠右側(cè)皮下注射含有上面列出的化合物總體積100μl/小鼠。分別在第一和二次注射后第7天、第21天和第50天，進(jìn)行免疫應(yīng)答的分析。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)五只小鼠的脾細(xì)胞用10μg/ml HBsAg離體(ex vivo)再刺激，為了分析HBsAg特異性IFN-γ(1型免疫應(yīng)答)以及IL-4(2型免疫應(yīng)答)的產(chǎn)生進(jìn)行ELIspot試驗(yàn)。
結(jié)果(圖7)HBsAg單獨(dú)或和Alum聯(lián)合注射并不誘導(dǎo)或僅誘導(dǎo)非常低水平的IFN-γ，而HBsAg聯(lián)合pR/ODN或KLK/ODN注射后，誘導(dǎo)了HBsAg特異性IFN-γ的產(chǎn)生，強(qiáng)化疫苗接種能進(jìn)一步地增加IFN-γ的產(chǎn)生。與HBsAg單獨(dú)注射相比強(qiáng)化之后Alum、pR和KLK共注射以及KLK/ODN聯(lián)合共注射后觀察到略微增加的IL-4的產(chǎn)生。
實(shí)施例8陽(yáng)離子抗微生物肽KLK與合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)和低量市售流行性感冒疫苗(AgrippalS1)聯(lián)合的一次注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的疫苗特異性細(xì)胞1型應(yīng)答。
材料小鼠BALB/c(Harlan-Winkelmann，德國(guó))流行性感冒疫苗 Agrippal S1(Chiron SpA，意大利；疫苗接種季節(jié)2003/2004)；批號(hào)035105，失效日期06/2004下列株純化的失活流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99IVR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99RESVIR 17)B/Hong Kong/330/2001-樣株(B/Shangdong/7/97)總抗原含量45μg血凝素(每個(gè)病毒株15μg)劑量9μg總蛋白質(zhì)/小鼠(直接從預(yù)填注射器使用的)0.1μg總蛋白質(zhì)/小鼠o-d(IC)13(＝ODN1a) 含有13個(gè)脫氧(-肌苷、-胞嘧啶)基序(ICI CICICI CIC ICI CIC ICI CIC IC)的磷酸二酯替代的ODN；由Transgenomics合成；部分號(hào)I02A03001N。
劑量4nmol/小鼠1.4nmol/小鼠0.4nmol/小鼠
KLK 含有賴(lài)氨酸和亮氨酸的合成陽(yáng)離子聚氨基酸(KLKLLLILKLK-COOH)；由Bachem AG合成批號(hào)0562101劑量100nmol/小鼠35nmol/小鼠10nmol/小鼠制劑由Intercell的藥物開(kāi)發(fā)部制成；10mMTris/135mM NaCl pH 7.5實(shí)驗(yàn)設(shè)置(10小鼠/組)1.幼稚的2.9μg Agrippal S13.0.1μg Agrippal S14.0.1μg Agrippal S1+100nmol KLK+4nmol ODN1a5.0.1μg Agrippal S1+35nmol KLK+1.4nmol ODN1a6.0.1μg Agrippal S1+10nmol KLK+0.4nmol ODN1a在第0天，BALB/c小鼠雙股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總量100μl疫苗/小鼠(50μl/肌肉)。在第21天，收集血清并用ELISA分析流行性感冒疫苗特異性IgG1和IgG2a抗體。滴度相應(yīng)于得到半數(shù)最大OD405nm的血清稀釋度。此外，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并制備單個(gè)細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞的分裝物用磁性分揀試劑盒(CD4和CD8 MACSsort，Miltenyi)分開(kāi)為CD4+和CD8+T細(xì)胞。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal S1抗原特異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激未分開(kāi)的脾細(xì)胞或分開(kāi)的CD4+和CD8+T細(xì)胞聯(lián)合經(jīng)照射的抗原遞呈細(xì)胞(APC；來(lái)源于幼稚小鼠的)。分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生IFN-γ(作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，IL-4和IL-5(作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)
結(jié)果(圖8a)單獨(dú)用9μg和0.1μg Agrippal S1的疫苗接種不能夠誘導(dǎo)CD4+脾細(xì)胞產(chǎn)生疫苗特異性IFN-γ，而Agrippal S1聯(lián)合不同濃度KLK/o-d(IC)13注射后，觀察到CD4+T脾細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的IFN-γ。然而，CD8+脾細(xì)胞不能誘導(dǎo)IFN-γ。與幼稚小鼠相比，單獨(dú)Agrippal S1僅略微誘導(dǎo)了未分開(kāi)的和CD4+脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，KLK/o-d(IC)13加入到疫苗中未顯示進(jìn)一步地增加。然而，KLK/o-d(IC)13共注射后Agrippal S1誘導(dǎo)IL-5被完全消除。
結(jié)果(圖8b)如圖8b闡明地，低量無(wú)佐劑的流行性感冒疫苗與不同濃度KLK/o-d(IC)13的聯(lián)合注射誘導(dǎo)非常強(qiáng)的疫苗(AgrippalS1)特異性IgG2a(體液1型免疫應(yīng)答)和比低量AgrippalS1單獨(dú)更高水平的IgG1。然而，高劑量的AgrippalS1顯示了最高滴度的疫苗特異性IgG1抗體。因?yàn)榭沽餍行愿忻氨Ｗo(hù)與疫苗抗原特異性IgG2a抗體的存在相關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d(IC)13作為流行性感冒疫苗有效佐劑的很高的潛能。
實(shí)施例9陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)聯(lián)合的低劑量一次注射協(xié)同誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗市售流行性疫苗(AgrippalS1)的疫苗特異性細(xì)胞I型免疫應(yīng)答材料小鼠BALB/c(Harlan-Winkelmann，德國(guó))流行性感冒疫苗 Agrippal S1(Chiron SpA，意大利；疫苗接種季節(jié)2003/2004)；批號(hào)035105，失效日期06/2004下列株純化的失活流行性感冒病毒抗原
(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99IVR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99RESVIR 17)B/Hong Kong/330/2001-樣株(B/Shangdong/7/97)總抗原含量45μg血凝素(每個(gè)病毒株15μg)劑量9μg總蛋白質(zhì)/小鼠(直接從預(yù)填注射器使用的)1μg總蛋白質(zhì)/小鼠o-d(IC)13(＝ODN1a) 含有13個(gè)脫氧(-肌苷、-胞嘧啶)基序(ICICIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC)的磷酸二酯替代的ODN；由Transgenomics合成；部分號(hào)I02A03001N。
劑量0.4nmol/小鼠0.2nmol/小鼠0.04nmol/小鼠KLK 含有賴(lài)氨酸和亮氨酸的合成陽(yáng)離子聚氨基酸(KLKLLLILKLK-COOH)；由Bachem AG合成批號(hào)0562101劑量10nmol/小鼠5nmol/小鼠1nmol/小鼠制劑由Intercell的藥物開(kāi)發(fā)部制成；10mMTris/135mM NaCl pH 7.5
實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組)1.幼稚的2.9μg Agrippal S13.1μg Agrippal S14.1μg Agrippal S1+10nmol KLK+0.4nmol ODN1a5.1μg Agrippal S1+5nmol KLK+0.2nmol ODN1a6.1μg Agrippal S1+1nmol KLK+0.04nmol ODN1a在第0天，BALB/c小鼠雙股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總量100μl疫苗/小鼠(50μl/肌肉)。在第21天，收集血清并用ELISA分析流行性感冒疫苗特異性IgG1和IgG2a抗體。梯度相應(yīng)于得到半數(shù)最大OD405nm的血清稀釋度。此外，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并制備單個(gè)細(xì)胞懸浮液。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal S1抗原特異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激脾細(xì)胞。分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生IFN-γ(作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，IL-4和IL-5(作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)結(jié)果(圖9a)單獨(dú)用9μg和1μg Agrippal S1對(duì)小鼠的疫苗接種仍然不能(也見(jiàn)圖8a)誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生疫苗特異性IFN-γ，而Agrippal S1聯(lián)合不同低濃度的KLK/o-d(IC)13注射后，觀察到很強(qiáng)的IFN-γ的產(chǎn)生。與幼稚小鼠相比，Agrippal S1單獨(dú)僅略微誘導(dǎo)了小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，KLK/o-d(IC)13加入到疫苗沒(méi)有作用。KLK/o-d(IC)13共注射后Agrippal S1誘導(dǎo)的IL-5劑量依賴(lài)性地被消除。甚至在很低的劑量，KLK/o-d(IC)13的聯(lián)合誘導(dǎo)很強(qiáng)的細(xì)胞I型免疫應(yīng)答。
結(jié)果(圖9b)低量無(wú)佐劑的流行性感冒疫苗與不同濃度KLK/o-d(IC)13的聯(lián)合注射誘導(dǎo)非常強(qiáng)的疫苗(Agrippal S1)特異性IgG2a(體液1型免疫應(yīng)答)和與低量單獨(dú)Agrippal S1大致同等(comparable)水平的IgGl。然而，單獨(dú)高劑量的AgrippalS1顯示了略微增加的疫苗特異性IgG1抗體滴度以及與Agrippai S1和最低濃度KLK/o-d(IC)13共注射相比相當(dāng)水平的IgG2a抗體。因?yàn)榭沽餍行愿忻暗谋Ｗo(hù)與疫苗抗原特異性IgG2a抗體的存在相關(guān)，得到的結(jié)果指出KLK/o-d(IC)13，甚至在非常低的劑量，作為流行性感冒疫苗有效佐劑的很高的潛能。
實(shí)施例10市售流行性感冒疫苗(Agrippal S1)聯(lián)合于陽(yáng)離子抗微生物肽KLK和合成寡聚脫氧核苷酸o-d(IC)13(ODN1a)的一次注射與聯(lián)合于其它佐劑的比較材料小鼠BALB/c(Harlan-Winkelmann，德國(guó))流行性感冒疫苗 Agrippal S1(Chiron SpA，意大利；疫苗接種季節(jié)2003/2004)；批號(hào)035105，失效日期06/2004Fluad(Chiron SpA，意大利；疫苗接種季節(jié)2003/2004)；批號(hào)4003，失效日期05/2004；MF59C作為佐劑的加入兩個(gè)疫苗含有下列株純化的失活流行性感冒病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)A/NewCaledonia/20/99(H1N1)樣株(A/New Caledonia/20/99 IVR-116)A/Moscow/10/99(H3N2)樣株(A/Panama/2007/99 RESVIR 17)B/Hong Kong/330/2001-樣株(B/Shangdong/7/97)
總抗原含量45μg血凝素(每個(gè)病毒株15μg)劑量9μg總蛋白質(zhì)/小鼠(直接從預(yù)填注射器使用的)1μg總蛋白質(zhì)/小鼠o-d(IC)13(＝ODN1a) 含有13個(gè)脫氧(-肌苷、-胞嘧啶)基序(ICICIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC)的磷酸二酯替代的ODN；由Transgenomics合成；部分號(hào)I02A03001N。
劑量0.4nmol/小鼠KLK 含有賴(lài)氨酸和亮氨酸的合成陽(yáng)離子聚氨基酸(KLKLLLILKLK-COOH)；由Bachem AG合成批號(hào)0562101劑量100nmol/小鼠10nmol/小鼠CPGl668 含有CpG基序(5′-tcc atg acg ttc ctgatgct-3′)的硫代磷酸替代的ODN；由PurimexNucleic Acids Technology，Gttingen合成；批號(hào)020614劑量5nmol/小鼠AlumAl(OH)3[15g/l]；由Chiron Behring，德國(guó)提供劑量與抗原1∶1混合物pR有平均43個(gè)精氨酸殘基多聚程度的聚-L-精氨酸(由MALLS測(cè)定)；由Sigma提供；批號(hào)50K7280；劑量100μg/小鼠IFA 不完全Freud氏佐劑；由Difco實(shí)驗(yàn)室提供；批號(hào)2158430劑量與抗原1∶1混合物
CFA 完全Freud氏佐劑；由Difco實(shí)驗(yàn)室提供；批號(hào)3126639劑量與抗原1∶1混合物制劑Intercell的藥物開(kāi)發(fā)部制成；10mMTris/135mM NaCl pH 7.5實(shí)驗(yàn)設(shè)置(5只小鼠/組)1.幼稚的2.9μg Fluad3.9μg Agrippal S14.1μg Agrippal S15.1μg Agrippal S1+10nmol KLK+0.4nmol ODN1a6.1μg Agrippal S1+5nmol CpG16687.1μg Agrippal S1+100μg pR438.1μg Agrippal S1+100nmol KLK9.1μg AgrippalS1+Alum10.1μg Agrippal S1+CFA11.1μg Agrippal S1+IFA在第0天，BALB/c小鼠雙股骨肌內(nèi)注射含有上面列出的化合物總量100μl疫苗/小鼠(50μl/肌肉)。在第21天，合并每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的脾并制備單個(gè)細(xì)胞懸浮液。為了計(jì)數(shù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Agrippal S1抗原特異性產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目，在96孔ELIspot平板中刺激脾細(xì)胞。分析下面細(xì)胞因子的產(chǎn)生IFN-γ(作為細(xì)胞1型應(yīng)答的指示物)，IL-4和IL-5(作為細(xì)胞2型應(yīng)答的指示物)結(jié)果(圖10)與單獨(dú)用Agrippal S1和Fluad疫苗接種相比低量無(wú)佐劑的流行性感冒疫苗和低劑量KLK/o-d(IC)13的聯(lián)合注射誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的疫苗(Agrippal S1)特異性IFN-γ。只在用CFA疫苗接種后獲得等同量的IFN-γ，與單獨(dú)Agrippal S1相比所有其它實(shí)驗(yàn)組大致顯示小鼠脾細(xì)胞沒(méi)有(pR43、Alum、IFA)或有略微增加的(CpG1668、KLK)IFN-γ的產(chǎn)生。與幼稚小鼠相比，只有Fluad顯著誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-4而所有其它實(shí)驗(yàn)組幾乎顯示同樣低水平的IL-4。疫苗抗原特異性IL-5在用Fluad對(duì)小鼠疫苗接種后可檢測(cè)到非常高的水平，在單獨(dú)Agrippal S1或與KLK聯(lián)合的注射后可檢測(cè)到中等水平。Agrippal S1與pR、Alum或IFA共注射僅顯示略微增加水平的IL-5，而所有其它組顯示IL-5產(chǎn)生的降低。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防病毒感染的疫苗，包含—抗原，—包含序列R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之間的整數(shù)，優(yōu)選地是5，X是帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基，Z是選自L、V、I、F和/或W的氨基酸殘基，R1和R2相互獨(dú)立地選自-H、-NH2、-COCH3、-COH、帶有至多達(dá)20個(gè)氨基酸殘基的肽或肽反應(yīng)基團(tuán)或有或無(wú)肽的肽連接子；X-R2可以是所述肽羧基末端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯(“肽A”)和—具有根據(jù)式(I)的結(jié)構(gòu)之免疫刺激性寡聚脫氧核酸分子(ODN)， R1選自次黃嘌呤和尿嘧啶，任一X是O或S，任一NMP是2’脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥(niǎo)苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥(niǎo)嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥(niǎo)苷-或N-異戊烯基-脫氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，NUC是2’脫氧核苷，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥(niǎo)苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧肌苷-、脫氧胸苷-、2-甲基脫氧尿苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥(niǎo)嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥(niǎo)苷-或N-異戊烯基-脫氧腺苷，a和b是0至100的整數(shù)，前提是a+b在4至150之間，以及B和E是核酸分子5’或3’末端的共有基團(tuán)(″I-/U-ODN″)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有Al(OH)3佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗，特征在于所述抗原是病毒抗原，優(yōu)選地是流行性感冒，尤其是血凝素抗原或神經(jīng)氨酸酶抗原、HCV或HBV、HIV、HPV或JEV抗原、聯(lián)合抗原或一個(gè)或多個(gè)這些抗原的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有聚陽(yáng)離子肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的疫苗，特征在于所述肽A是KLKL5KLK，所述I-/U-ODN是寡聚d(IC)13。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的疫苗，特征在于它進(jìn)一步含有聚陽(yáng)離子肽和含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸。
8.兩個(gè)都如權(quán)利要求1中定義的肽A和I-/U-ODN組合的用途，用以改善針對(duì)病毒感染，尤其是針對(duì)流行性感冒病毒、HBV、HCV、HPV、HIV或JEV感染之疫苗的保護(hù)效能。
9.兩個(gè)都如權(quán)利要求1中定義的肽A和I-/U-ODN組合的用途，用以改善針對(duì)病毒感染，尤其是流行性感冒病毒、HBV、HCV、HIV、HPV或JBV感染之疫苗的抗原特異性1型應(yīng)答，尤其是IgG2抗體應(yīng)答或IFN-γ應(yīng)答，并且同時(shí)保存或優(yōu)選地也增加所述疫苗的2型應(yīng)答，尤其是IgG1抗體應(yīng)答或白細(xì)胞介素4(IL-4)應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)病原體，尤其是病毒病原體感染的改進(jìn)的疫苗，包含抗原、式R
文檔編號(hào)A61K39/29GK1771054SQ200480007042
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者M·比施爾, A·哈貝爾, J·弗里茨, K·普林茨, K·林瑙 申請(qǐng)人:英特塞爾股份公司