專利名稱：利用凝集素親和性血液透析去除血液中病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療病毒感染的治療方法學領(lǐng)域。
技術(shù)背景已報道，有許多病毒對人類具有致病性，這些病毒中有許多目前既無藥物也 無疫苗。就目前具有治療藥物的病毒而言，抗藥性突變和藥物副作用的發(fā)生常使治 療效果受到限制；這類病毒的例子包括丙型肝炎和人免疫缺陷病毒(HIV)。HIV是獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病AIDS)的病原體。它選擇性地感染免疫 系統(tǒng)的細胞因此損害了受感染個體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。據(jù)估計美國有一百萬以上HIV 感染者，全世界有1300萬以上HIV感染者。HIV感染的臨床典型表現(xiàn)包括長時期 的無癥狀狀態(tài)，之后是T4淋巴細胞喪失使得個體易患機會感染和腫瘤。HIV-1復(fù)制主要發(fā)生在CD4+淋巴細胞內(nèi)，大多數(shù)位于外周淋巴結(jié)和脾等淋巴 器官中。HIV-1也可見于巨噬細胞和巨噬細胞樣細胞中，如中央神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠 質(zhì)細胞(肌-c2wh'3)中(Cohen等人.Immunol Rev 159:31-48， 1997)。HIV-1血漿濃度和HIV-1感染的外周血淋巴細胞的存在，如HIV-1感染者的臨 床狀態(tài)緊密相關(guān)。 (Ferre等人.J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 10 (補充2) : S51 — 56， 1995; O'Brien等人.N Engl J Med 334 (7) : 426 一431， 1996)。循環(huán)性病毒粒子的半壽期是6小時，而外周血內(nèi)感染細胞HIV-1 的半壽期為1. 6日。每日有l(wèi)(T以上的病毒粒子釋放入循環(huán)血液中(Ho等人.J Biol Regul Horaeost Agents 9(3) : 76-77， 1995; Ho等人.Nature 3/3(6510) : 125-120, 1995; Wil等人.Nature 375(0510) 117-122， 1995)。宿主免疫系統(tǒng)保持對HIV 感染的抑制和限制臨床癥狀的能力，與病毒負荷成正比?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒療法、核 苷同類物、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑以及蛋白酶類抑制劑目的是減少病毒負荷從而使 免疫系統(tǒng)可以控制并清除殘余感染(Fauci, Harrisons Principles of Medicine: 1791 — 1856， 1998)。HIV感染由能結(jié)合CD4以及表面趨化因子受體的gpl20所介導(dǎo)。在細胞內(nèi)病毒 粒子脫去包衣，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA。原病毒DNA進入細胞核，整合到宿主 基因組中，并轉(zhuǎn)錄為病毒RNA進而翻譯成病毒蛋白質(zhì)。裝配成熟病毒粒子并通過出 芽從胞體釋放。(Fauci等人Ann Intern Med 124 (7) : 654 — 663， 1996)。 瀕死細胞也可釋放其所有的細胞內(nèi)容物包括完整的病毒顆粒和片段進入血液，因此 HIV感染個體的循環(huán)血液含有完整的病毒顆粒和病毒蛋白質(zhì)(尤其是毒性病毒表面蛋白)。艾滋病的標志是CD4+ T細胞的逐漸喪失，最終使免疫系統(tǒng)不能抵御機會感染。 雖然對HIV引起艾滋病的機制了解尚不完善，但臨床資料提示除受感染T細胞的喪 失之外，大量未受感染的T細胞瀕臨死亡，HIV包膜蛋白似乎與此密切相關(guān)。己證明，HIV的主要包膜糖蛋白gpl20在體外具有強大生物活性。gpl20可導(dǎo) 致CD4+ T細胞凋亡，而且在抗病毒包膜抗體存在gpl20錨定于CD4+細胞時并由補體調(diào)理細胞，指令細胞的清除。其綜合效應(yīng)是未感染的免疫細胞的損毀。此外， HIV包膜蛋白牽涉到同HIV有關(guān)的丙種球蛋白血(丙種血球蛋白？)升高。測得艾 滋病病人體內(nèi)gpl20平均水平為29納克/毫升，高于病毒濃度多個數(shù)量級。目前還不能治愈HIV感染。已經(jīng)批準逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑能用于HIV的 治療。典型的治療方案采用批準的藥品組合使用，稱為HAART (高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒療法highly active antiretrovial therapy)。雖然美國食品藥品監(jiān)管局(FDA) 批準了 16種以上藥物和藥物組合物用于治療HIV感染，但抗藥性突變株的出現(xiàn)以 及不可治療病毒儲庫的存在(例如在記憶T細胞內(nèi))限制了這些藥物的使用。不 幸的是尚無有效的HIV疫苗如預(yù)期地研制成功，其部分原因是HIV基因組的快速突 變，來不及獲得病毒蛋白質(zhì)的免疫原性表位情況。因此，迫切需要新的治療手段。體外治療提供了一種可以用于系統(tǒng)性疾病的治療程式。針對A蛋白的體外血 漿灌流，血漿置換和淋巴置換都已用作HIV感染的免疫調(diào)節(jié)治療手段，但導(dǎo)致了血 小板減少癥(Kiprov 等人 Curr Stud Hematol Blood Transfus 57:184-197， 1990;Mittelman 等人. Semin Hematol 26(2 s卿l 1): 15-18， 1989;snyder等人.Semin Hematol 26(2 Suppl 1) :31-41， 1989; Snyder等 人.Aids 5(10) :1257-1260, 1991)。提議采用這些療法來去除HIV感染期間產(chǎn)生的 免疫復(fù)合物和其他體液介質(zhì)。它們并不能直接去除HIV病毒。體外血漿置換限制病 毒復(fù)制的機制已經(jīng)過初步試驗的測試(Bisaccia等人.J Acquir Immune DeficSyndr 6(4):386-392， 1993; Bisaccia 等人 . Ann Intern Med 113(4) :270-275， 1990)。但是，這些療法沒有一種可以同時去除病毒和病毒蛋白 質(zhì)。己經(jīng)提出利用層析分析技術(shù)去除血制品中的HIV。 1997年，Motomura等提出 用磺化鹽多孔離子交換器來去除體液中的HIV和來自相關(guān)物質(zhì)(美國專利 5667684) 。 Takashima及其同事(美國專利5041079)提供了含有一微酸或微堿性 表面的固體基質(zhì)的離子交換劑用于體外去除患者體液中的HIV。以上兩法與Porath 和Janson的做法相似(美國專利3925152)，他們二人描述了一種分離帶電荷膠 體顆?；旌衔锏姆椒?，例如將混合物通過吸附劑來分離病毒變種，該吸附劑由堿性 含氮基團及酸性羧基團或磺基兩性成份組成的不溶性有機整合物構(gòu)成(美國專利 3925152)。但是這些層析材料無一對病毒具有選擇性，所以將會去除其他許多重 要成份，因此對于體內(nèi)血液凈化并無用處。也有人提出免疫吸收技術(shù)來治療病毒感染。1980年Terman等提出一種血漿 置換儀來進行疾病的體外治療，該血漿置換儀的裝置中含有一種固定在大面積表面 螺旋形膜上的免疫吸附劑來除去病原(美國專利4215688)。該裝置沒有預(yù)想直接 處理血液的方法，而且需要一種具有免疫反應(yīng)性的有毒試劑。1987至1988年， Ambrus和Horvath提出一種血液凈化系統(tǒng)，它基于結(jié)合在非對稱性的毒素能透過 的膜外表面的抗體或抗原捕獲基質(zhì)(美國專利4714556;美國專利4787974)，然而， 未有例子顯示可以去除病原。1991年L叩ukhin等人報告說，當將兔抗HIV蛋白的 血清與瓊脂糖凝膠S印harose4B或二氧化硅偶聯(lián)后，可以用于在體外將注射了 HIV 重組蛋白的兔血中的HIV蛋白除去(Lopukhim等人.Vestn Akad Med Nauk SSSR 11:60-63,1991)。但是此項策略無效，因為它需進行體外血液吸附，并且未提供 一種機制來除去血液中的游離HIV病毒粒子(Lopukhin等人.，1991，同上)美 國專利6528057描述了使用抗體和反義DNA來去除病毒和病毒核酸的方法。凝集素是能選擇性結(jié)合多糖和糖蛋白的蛋白質(zhì)，并且廣泛分布于植物和動物 中。雖然許多凝集素使用時的特異性不夠高，但最近發(fā)現(xiàn)某些凝集素對包膜病毒有 高度選擇性(De Clercq.等人Med Res Rev 20(5) :323-349,2000)。在具有上述 特性的凝集素中有得自雪花(fe7朋""s /^>a"s)的凝集素即雪花凝集素(GNA， feJa/2t/ "s/7_z>a_Zis agglutinin)， 得自黃7jC仙(iVarcj'ssTAs Ase〃Q^7 arcj.ssusO的 凝集素艮卩黃水仙凝集素(歸，臉cj's篇pse油朋r"'s， agglutinin)以及得 自拉丁文名為Wosfoc eJh'/^as79ar咖的藍綠藻的凝集素即cyanovirin (Boyd等人.Antimicrob Agents Chemother 41 (7) : 1521-1530, 1997; Hammar等人.Ann N Y Acad Sci 724 : 166-169 ， 1994 ; Kaku等人.Arch Biochem Biophys 279(2) :298-304, 1990) 。 GNA無毒性且其足夠安全，已將其摻入到基因工程大米 和土豆之中(Bell等人.Transgenic Res 10 (1) : 35-42, 2001; Rao等人.Plant J 15(4) :469-477. 1998)。這些凝集素能結(jié)合甘露糖含量高的糖蛋白，例如HIV的表 面蛋白(Chervenak等人.Biochemistry 34(16) :5685—5695， 1995) 。 GNA己用于 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來檢測人血漿中的HIV gpl20(Hinkula等人.J Immunol Methods 175(1):37-46,1994; Mahmood 等人 J Immunol Methods 151(1-2) :9-13， 1992;Sibille等人.Vet Microbiol 45(2-3) :259-267， 1995)以 及血清中的貓免疫缺陷病毒(FIV)包膜蛋白(Sibille等人.Vet Microbiol 45(2-3) :259-267， 1995)。雖然GNA能結(jié)合HIV (1型和2型)、猿免疫缺陷病毒 (SIV )的包膜糖蛋白(Gilljam等人.AIDS Res Hum Retroviruses 9(5) :431-438， 1993 )，并抑制培養(yǎng)基中的病原生長(Amin等人.Apmis 103(10):714-720，1995;Hammer 等人. AIDS Res Hum Retroviruses 11 (1) :87-95, 1995),但是這些體外研究卻未能反映HIV感染血樣品中所見的那種 復(fù)雜的、蛋白質(zhì)性的介質(zhì)。因此，不知道可在體外結(jié)合富含甘露糖的糖蛋白的凝集 素是否能夠結(jié)合HIV感染血樣品中的這類分子。相反，通常認為HIV感染者一般體 內(nèi)存在的高濃度gpl20抗體，可能會封閉富含甘露糖糖蛋白中GNA等凝集素的結(jié)合 位點。
因此，雖然現(xiàn)已知凝集素可以結(jié)合病毒包膜糖蛋白，但是尚沒有開發(fā)利用凝 集素體內(nèi)透析或血漿置換，直接吸附血液中的HIV或其他包膜病毒的技術(shù)。因此， 當前亟需新的治療方法來治療HIV和其他病毒感染。具體說需要開發(fā)新方法來降低 病毒負荷、以提高其他治療和/或免疫應(yīng)答的效能。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種方法，該方法在體外裝置中用能結(jié)合富含甘露糖的糖蛋白或 其片段的病原體的凝集素，從感染的血液或感染的血漿中去除這類病原體。因此， 本發(fā)明提供了一種降低個體病毒負荷的方法，該方法包括以下步驟獲得個體的血 液或血漿;使其通過一種多孔中空纖維膜，該膜的孔外部部分中固定有凝集素分子； 收集通過的血液或血漿并將其回輸給該個體。
將血液通過固定有凝集素的中空纖維的富含甘露糖糖蛋白的病毒顆粒及其片 段結(jié)合于凝集素，從而降低了流出液中的病毒負荷。 一個具體實施方式
中，本發(fā)明采用可結(jié)合l型、2型HIV和SIV許多亞型病毒包膜蛋白的凝集素。本發(fā)明的方法能減少血液中的病毒粒子數(shù)量，并且能快速有效地降低感染血液中可能具有毒性的 病毒表面蛋白水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白此方法能有助于清除其他常見的與HIV-1同時發(fā)生的感染，例如丙型肝炎病毒(HCV) (Fauci等人.，1998，同上)。 于是，發(fā)明的一個目的是提供一種降低感染病毒的個體血液中的病毒負荷的方法。在一個具體實施的例子中，該方法是從感染病毒的個體血液內(nèi)去除此其病毒顆?；蚱涞鞍踪|(zhì)片段或兩者的混合物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使血液體外循環(huán)通過固定有對病毒的富含甘露糖糖蛋白有親和力的凝集素的中空纖維，來降低血液中病毒負荷的方法。本發(fā)明的再一個目的是提供一種中空纖維構(gòu)成的裝置，該中空纖維的外表面與對病毒或其它病原體的富含甘露糖糖蛋白有特異性親和力的固定的凝集素密切相接。


圖1是親和株的縱向剖面示意圖。圖2是在圖1中平面2的水平剖面示意圖。圖3是圖2中一通道的圖示，中空纖維膜結(jié)構(gòu)40由管道部分構(gòu)成，該管道包 括較為密實的超濾膜42和較為多孔的外部部分44，在這外部部分中固定有例如凝 集素的親和分子46。圖4說明從含HIV的生理鹽水中去除gpl20。起始時，將gpl20用磷酸緩沖鹽 溶液配成濃度500納克/毫升(1.6毫升/每次運作)。將gpl20在室溫下通過含有 0, 2毫升GNA瓊脂糖或S印harose 4B (對照)，層析柱的流速為0. 5 — 058毫升/ 分鐘。圖5說明從HIV感染者血漿中去除gpl20免疫復(fù)合物。HIV陽性人血漿的初始 gpl20濃度500納克/毫升(1.6毫升/每次運作)。用10微克/孔的GNA/NPA平板 捕獲，用羊抗人IgG抗體檢測gpl20免疫復(fù)合物。使血漿在含有0. 2毫升GNA瓊脂 糖或?qū)φ誗印harose 4B的Glen Research層析柱中室溫下反復(fù)循環(huán)的流速為0. 5 一058毫升/分鐘。實驗曲線(〇)的理論上的最佳擬合指數(shù)尺2=0.91，對照線(口) 為直線。圖6A和6B顯示GNA瓊脂糖去除原有的HIV。圖6A示意血漿置換的指數(shù)曲線
圖，這里1 2=0.90 (除22小時的那一點外)。圖6B示意初始去除(病毒)速率的 對數(shù)圖，去除半數(shù)的時間約為0.9小時。使用Masterflex膜式泵，#14硅管(1.1 毫升/分鐘)。血漿樣品初始量為3毫升(每毫升100000拷貝(CPM) BBIER8-03030-0002原有HIV)。
取250微升等分體積的血漿用于RNA分離； Realtime RTPCR和Sybr綠色跟蹤染料；熱循環(huán)溫度95、 60、 72、 83°C (分別為 15、 30、 60秒，6秒讀數(shù))；計算1=20時初始曲線的Ct值。圖7示意從HIV陽性人血液中去除gpl20。在HIV陽性人血漿中的初始gpl20 為100納克/毫升，用10微克/孔的GNA/NPA平板檢測試驗之前用酸/去污劑裂解后 的免疫復(fù)合物。使血液在含0. 6毫升GNA瓊脂糖或?qū)φ誗印harose 4B的Microkros 柱中反復(fù)循環(huán)。37。C采用Masterflex泵(lrpm)和Parmed 6485-16管，流速為 0. 9毫升/分鐘。實驗曲線(□) (t,/2=22分鐘)的理論上的最佳擬合指數(shù)R2 = 0. 91， 對照曲線(〇)為直線。圖8示意從感染血液中去除丙型肝炎病毒。血液在含有0. 6毫升GNA瓊脂糖 或?qū)φ誗印harose 4B的Micrrokros柱中反復(fù)循環(huán)。室溫下流速0. 5毫升/分鐘， 采用Masterflex泵(lrpm)和Pharmed 6485-16管。該曲線理論上的最佳擬合指 數(shù)為R2=0. 85。發(fā)明詳述本文所用術(shù)語"病毒負荷"對于說明書和權(quán)利要求書目的中是指，在諸如 血液或血漿等生物液體中的病毒粒子或其毒性片段的量。因此病毒負荷涉及體 內(nèi)的病毒顆粒數(shù)量。因此病毒負荷可以是多種病毒存在指示物中任意一種的計 量，例如每單位血液或血漿中的病毒拷貝數(shù)，或每單位血液或血槳中的病毒蛋 白或其片段的單位量。本文所用術(shù)語"富含甘露糖糖蛋白"對于說明書和權(quán)利要求書目的中是指， 含有甘露糖一甘露糖連接結(jié)構(gòu)的糖蛋白，其連接形式是a-1->3或ct-1-〉6甘 露糖一甘露糖連接形式。這類凝集素的一些例子包括GNA，NPA， cyanovirin和 伴刀豆蛋白A (ConA)。本發(fā)明涉及在體外裝置中利用凝集素從感染的血液或血漿中去除病原微生物 及其片段的方法。因此，本發(fā)明提供一種減少個體病毒負荷的方法，該方法包括以 下這些步驟獲得個體的血液或血漿；使其通過一種多孔中空的纖維膜，該膜的孔 外部分中固定有凝集素顆粒；收集通過的血液或血漿并將其回輸給該個體。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的方法采用圖l所示裝置的親和柱實施。這種裝置通用類型見在美國專利4714556、 4787974和6528057的專利中所述， 它們的內(nèi)容納如本文供參考。在此裝置中，血液通過中空纖維超濾膜管腔，在 無血液浸潤的膜側(cè)面與形成可接納并固定病毒及其毒性和/或感染性片段工具 的固定的凝集素密切相接。因此，該裝置能保留被凝集素結(jié)合的完整病毒顆粒 和病毒糖蛋白，同時讓其他組分通過管腔。HIV是本發(fā)明所描述的原型病毒，但是本發(fā)明可用于除去任何血源性病毒。 該裝置詳述見圖l一圖3所示，包括中孔纖維超濾膜組成的多重通道，這些通 道形成過濾室。 一個進液口和一個出液口與此過濾室相通。優(yōu)選超滲膜為各向 異性膜，具有朝向血流的緊密或滯留側(cè)面。該膜可方便地用該領(lǐng)域公知的任意 一種聚合物材料，例如，聚砜、聚醚砜、聚酰胺、聚酰亞胺、醋酸纖維素和聚 丙烯酰胺制備。優(yōu)選膜孔徑為200 — 500納米，可讓完整的病毒和病毒顆粒及 片段(例如HIV病毒顆粒直徑為110納米)通過，但不讓大多數(shù)血細胞(紅血 細胞直徑2000納米，淋巴細胞直徑7000—12000納米，巨噬細胞直徑10000 一18000納米)通過。裝置示意1。該裝置的栓體10玻璃內(nèi)壁14構(gòu)成的 處理血液的腔室12。圍繞腔室12的是一任選的外室16，可通過進液口 18進 入外室16，溫度控制液體通過出液口 20流出進行循環(huán)。該裝置包括血液進入 口 32和流出口 34。該裝置同樣提供一個或多個出入口 48和50，連通柱中的 外通道空間。如圖1和圖2所示，腔室12裝有多層超濾(管狀)膜22。這些 膜優(yōu)選內(nèi)徑0.3毫米、外徑0.5毫米。圖3是通道22的代表性剖面圖，顯示 該膜的各向異性性；如圖3所示，中空纖維膜結(jié)構(gòu)40由一種聚合物材料形成 的管狀體組成，該管狀體包括較致密的超濾膜42和相對多孔的外部部分44， 而44中固定有凝集素46。操作此裝置時，將含有凝集素的溶液通過入口 48加 入其中，使凝集素固定在膜外部22處，如圖2所示。未被固定的凝集素可用 鹽水或是其他溶液洗滌從出口 50收集。為了實施本發(fā)明的方法，抽取病人含有病毒顆粒和/或其片段的血液使之 與超濾膜接觸。 一個優(yōu)選實施例中，將血液分離為血漿和細胞組分；使血漿接 觸凝集素，通過凝集素與富含甘露糖的糖蛋白之間的結(jié)合除去病毒顆粒或其片 段；然后將血漿與細胞組份重新合并，輸回病人體內(nèi)?；蛘呤菍⒓毎鹘M份分 開輸回患者體內(nèi)。定期重復(fù)這種治療直至獲得需要的效果，例如每周一次實施 4小時治療。
已開發(fā)了在透析柱中固定酶、鰲合劑和抗體的技術(shù)(Ambrus等人. Science 201 (4358) :837-839, 1978;Ambrus等人.Ann Intern Med 106(4): 531-537， 1987; Kalghatgi 等人.Res Com瞧 Chem Pathol Pharmacol 27(3) :551-561， 1980)所述技術(shù)在本說明書中引用作為參考。這些透析柱可通 過直接連接靜脈灌注病人血液，然后不需要更多操作就可以輸回病人體內(nèi)。也 可利用標準技術(shù)將血液分離為血漿和細胞組分。細胞組份可與血漿合并后回 輸，或可分別回輸細胞組份?？捎脴藴史椒y定柱體流出液的病毒負荷，例如 ELISA法和核酸擴增檢測技術(shù)。原型檢體己用于代謝去除病人血液中過量的苯 丙氨酸(Kalghatgi等人，，1980， supra; Ambrus, 1978,同上)或過量的鋁 (Anthone等人.J Amer soc N印hrol 6: 1271-1277,1995)。用于本發(fā)明方 法在中空纖維上固定蛋白質(zhì)的技術(shù)見美國專利4， 714， 556、4， 787, 974和5， 528， 057中的說明。為了將凝集素固定在超濾膜上，首先要活化超濾膜聚合物，即采用該領(lǐng)域 已知技術(shù)通過化學方法使膜聚合物易于與蛋白質(zhì)結(jié)合。多種不同聚合物都可使 用。例如，為了制備具有反應(yīng)活性的丙烯酸多聚物，可利用碳二亞胺(Valuev 等人.，1998， ^'o鵬ten'a7s， 19:41-3)。 一旦使該多聚物活化后，凝集素可以 直接結(jié)合或通過接頭結(jié)合，這兩種方法都可形成親和基質(zhì)。合適的接頭包括但 不限于親和素、鏈霉親和素、生物素、A蛋白和G蛋白。也可利用偶聯(lián)劑使凝 集素直接結(jié)合此超濾膜多聚物，如雙功能試劑；或是可直接結(jié)合。優(yōu)選例子中， GNA共價偶聯(lián)于瓊脂糖形成一種親和基質(zhì)。以下實施例用以闡明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明范圍。
具體實施方式
實施例一此實施例顯示采用溴化氰制備GNA共價偶聯(lián)瓊脂糖親和基質(zhì)。基本上根據(jù)Cuarecasas等人所述，采用溴化氰(CNBr)活化的瓊脂糖直接偶聯(lián)(Cuatracasas 等人.Proc Natl Acad Sci USA 61 (2) :636-643, 1968)。簡言之，將1毫升 的溶于0. 1M， pH為9. 5NaHC03液濃度為10毫克/毫升的GNA加入至1毫升CNBr 活化的瓊脂糖(Sigma, St. Louis, MO)中使其低溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)完成后， 吸棄未反應(yīng)物質(zhì)，將凝集素偶聯(lián)瓊脂糖用無菌PBS充分洗滌。然后將凝集素一 瓊脂糖親和基質(zhì)冷藏備用。GNA瓊脂糖也可從Vector Lab (Burlingame，美國
加州)購得。 實施例二此實施例顯示利用氰基氫硼化物通過希弗氏堿和還原反應(yīng)劑將GNA共價偶聯(lián)于玻璃珠來制備凝集素親和基質(zhì)。用改進的Hermanson方法制備二氧化硅凝 集素親禾口基質(zhì)(Hermanson. Bioconjugate Techniques:785, 1996)。將GNA 凝集素溶于pH9. 5的0. 1M硼酸鈉溶液緩沖液中，最終蛋白質(zhì)濃度為10毫克/ 毫升，將此液加入到醛化硅玻璃(Bioconnexant， Austin TX)。此反應(yīng)在堿 性pH環(huán)境下最有效但在pH7 —9時反應(yīng)，通常GNA的濃度高于偶聯(lián)位點2 — 4 倍。在每毫升此反應(yīng)混合物中加入10微升用1M NaOH配制的5M NaCNBH3 (Bioconnexant, Austin TX)交聯(lián)液，使混合物室溫反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束 時，玻璃表面殘余的未反應(yīng)醛基每毫升反應(yīng)液用20微升pH9. 5的3M乙醇胺封 閉。室溫反應(yīng)15分鐘后，棄去反應(yīng)液，用PBS洗滌除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)和試 劑。將親和基質(zhì)冷藏于冰箱內(nèi)備用。實施例三此實施例說明用戊二醛將GNA偶聯(lián)至氨基次乙酰塑料(arninocelite)的 方法。使次乙酰塑料(celite)在5%氨丙基三乙氧基甲硅烷水溶液中反應(yīng)過夜 制備氨基次乙酰塑料(含有硅酸鹽的硅藻土)。用水和乙醇洗滌氨基次乙酰塑 料除去過量試劑，干燥過夜得到白色粉末。將1克粉末懸浮在5毫升5%戊二 醛(Sigma)中反應(yīng)30分鐘。過濾并用水洗滌去除過量戊二醛直至用希弗氏試 劑測不到洗液中的殘留醛為止。將濾餅重懸于5ml含有2 — 3毫克/毫升GNA的 Sigma氫硼化物偶聯(lián)緩沖液中，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)終止后，洗去未反應(yīng)的GNA， 如上所述用乙醇胺酰胺化未反應(yīng)的醛基。最終用無菌PBS洗滌后將材料低溫保 藏備用。實施例四此實施例說明示范性凝集素血漿置換裝置的制備。在小容量過濾栓體 (Glen Research, Silverton， VA)中加入0. 2毫升凝集素樹脂備用，密封并 用5—10柱體積的無菌PBS平衡。該栓立即使用。
實施例五此實施例說明如何制備GNA凝集素親和血液透析裝置。該病毒血液凈化裝置(Hemopurifier)用注射器將無菌PBS緩沖液配制的固定有GNA的瓊脂珠或 次乙酰塑料珠的微粒槳液注入中空纖維透析柱的外隔室。對于多達15毫升的 血液樣品，采用Microdros polyethersulfon中空纖維透析柱，此柱裝有購自 Spectrum Labs， Rancho Dominguez，美國力口州)的Uier部{牛(200 u IDx240 ix 0D，孔徑200 — 500mn， 0.5毫升容積)。將裝有親和樹脂的柱體用5 — 10柱 體積的無菌PBS平衡。實施例六此實施例說明用親和血漿置換裝置從生理鹽水中去除HIV gpl20。將實施 例4所述的血槳置換裝置用5 — 10倍柱體積的無菌PBS平衡。將約1. 5ml含 gpl20 (通常為500納克/毫升)的樣品在室溫下于柱體內(nèi)以0.5 —0.6毫升/分 鐘流速循環(huán)。在不同的時間間隔測試循環(huán)液是否存在gpl20和gpl20免疫復(fù)合 物。用改良的Weiler方法，進行HIV-1的gpl20定量ELISA試驗(Weiler等 人.J Virol Methodes 32 (2-3) :287-301， 1991 )。在Greiner C底盤上制用 GNA/NPA平板，每孔滴加100微升蛋白質(zhì)(PBS溶液配的GNA和NPA各1 — 100 微克/毫升)，37。C培養(yǎng)2小時。然后用PBST (含有O. 01%Tween 20的PBS) 洗滌這些板，用酪蛋白封閉緩沖液封閉1小時。不立即使用的板4。C下可保存 2周。為檢測游離的gpl20，將100微升測試樣品37。C培育1 — 2小時。捕獲gP120 后，用PBS洗滌，加入100微升HRP(辣根過氧化物酶)適當標記的抗gpi20抗 體(用封閉緩沖液配成1: 2500) 。 37。C培育1小時候后，吸棄抗血清，用4x300 微升PBSTA洗滌平板，用穩(wěn)定化的三甲基聯(lián)苯胺(TMB)酶底物(BioFx)液檢 測結(jié)合的辣根過氧化物酶。為了測定免疫復(fù)合物和免疫復(fù)合物的形成，捕獲后， 用PBS洗滌板加入IOO微升親和純化辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體(用 封閉緩沖液配成l: 2500) 。 37。C培育l小時后，吸棄抗血清，用PBSTA洗滌 四次，每次300微升。用三甲基聯(lián)苯胺(BioFx)檢測結(jié)合的辣根過氧化物酶。圖4顯示在15分鐘內(nèi)GNA瓊脂糖從緩沖液中除去gpl20的效率達99%。 因為gpl20是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，它能夠非特異性地結(jié)合多種表面；因
對照柱體中輸入的gpl20也有85%被結(jié)合并不出人意料。 實施例七此實施例說明利用凝集素親和血漿置換裝置從感染血漿內(nèi)去除HIV gpl20。 將實施例4所述的血漿置換裝置用5—10倍柱體積的滅菌PBS平衡。使1.5毫 升含gpl20(通常濃度為500納克/毫升)的血漿樣品室溫下在柱中以0. 5 — 0. 6/ 分鐘的速率循環(huán)。如實施例4在不同的適合時間間隔測試循環(huán)液是否存在gp120 和gpl20免疫復(fù)合物。因為抗gpl20抗體在HIV+血漿中一般含量豐富，預(yù)計從感染血漿中除去 gpl20要比從單純緩沖液中除去難度更高。部分正是由于這些抗體，HIV+血漿 和血液中通常測到的gpl20量很低。為了測定除去的量，必須在感染病人的血 漿中加入gpl20以提供檢測樣品。此樣品經(jīng)ELISA檢測證實，該樣品中加入的 所有g(shù)pl20都與抗gpl20抗體形成復(fù)合物(數(shù)值未公布)。圖5顯示GNA瓊脂糖親和樹脂從HIV感染血漿樣品中有效地去除了免疫復(fù) 合物中的gpl20。該去除法迅速，顯著地半數(shù)去除反應(yīng)時間為20分鐘。部分 gpl20信號(約10X的初始gpl20免疫復(fù)合物)即使7小時后也未被去除，看 來這代表了此試驗中IgG的背景結(jié)合。實施例八此實施例說明利用GNA血漿置換從感染血漿中去除HIV病毒顆粒。取每毫 升含100000拷貝(cpm)病毒的HIV感染血漿樣品(ER8-03030-0002 native HIV， Boston Biomedia, Boston MA)，將其置于0.2毫升GNA瓊脂柱中如實施例4 所述進行循環(huán)。間歇取出250微升等份血漿，用TRI-LS試劑按照廠商說明抽 提病毒的RNA(MRC Corporation)。然后用實時RT PCR和Promega的Access 1 步法試劑組(Madison, WI)，在25微升含有400 nM SK432以及SK461的gag 基因引物、Sybr綠(1: 10000) 、 lxSCA封閉緩沖劑、3mMMgCl2、 400iiMdNTPs 和10微升得自armored脂A標準品(Ambion Austin TX)的未知RNA或HIV-1 RNA 的反應(yīng)體積內(nèi)定量測定HIV的病毒RNA?；旧习凑諒S商說明書在SmartCycler 實時熱循環(huán)儀(C印heid, Sunnyvale, CA)中進行擴增反應(yīng)的時間是RT(48 °C45分鐘)，PCR40輪循環(huán)(94。C/15秒；62°C/30秒；72。C/60秒；83。C/讀數(shù))。 當需要確認擴增時，將用含有0.25微克/毫升溴化乙錠的0.5x TBE緩沖液、pH8. 3配制的IO毫升擴增混合物，取等份進行2% (w/v)瓊脂糖(Sigma，分 子生物等級)凝膠電泳45分鐘，室溫，120VCD。用紫外線轉(zhuǎn)化照明器拍攝凝 膠圖像，然后將圖像用ImageJ數(shù)字化并分析。圖6A、 6B顯示GNA瓊脂糖有效地去除了感染血漿中的HIV病毒粒子。圖 6A是與指數(shù)衰減相擬合的數(shù)據(jù)曲線(R2二0.9)圖。該曲線預(yù)示約10小時內(nèi)基 本上去除的HIV量，圖6B是HIV去除速率的對數(shù)曲線，HIV半數(shù)去除的時間評 估為0.9小時。病毒去除如預(yù)期那樣在GNA遠多于病毒時呈動一級力學方程式。 CPM表示每毫升的HIV拷貝數(shù)。實施例九此實施例說明使用GNA凝集素親和血液透析置從HIV感染血液中除去 gpl20。因為大多數(shù)HIV+血漿樣品gpl20含量低或檢測不到，故通過混合5毫 升0+型新鮮壓積紅細胞與5毫升HIV感染血漿(通常為105cpm)制備HIV感染 血液樣品，并加入足夠量的gpl20IIIB調(diào)節(jié)濃度至100納克/毫升。將實施例5所述的親和血液透析裝置用5 — 10倍圓柱體積的的滅菌PBS平 衡。37。C下，將10毫升含gpl20的感染血樣品在柱中以流速0.9毫升/分鐘的 速率循環(huán)，使用Masterflex滾動泵(rpm)和Parmed6485 —16硅制管道。在 不同時間間隔取循環(huán)液，用酸變性和中和破壞免疫復(fù)合物，檢測游離gpl20的 存在。圖7顯示血樣品在柱中循環(huán)的情況，起始gpl20濃度在4一6小時內(nèi)(顯 著t,/2二22分鐘)從100ng/ml降低到背景水平。而對照柱去除gpl20很慢。實施例十該實施例說明用GNA凝集素親和血液透析從感染血液中除去HCV (丙肝病 毒)的過程。為了顯示GNA凝集素去除病毒的高度特異性，我們對HCV感染血 液進行了凝集素親和血液透析。將實施例4所述的凝集素親和血液透析裝置用 5— 10倍柱體積的滅菌PBS平衡?；旌蟣ral 0型新鮮壓積紅細胞與lmlHCV感染 的血漿，制備HCV感染血樣品。將該感染血樣品室溫下于柱中反復(fù)循環(huán)，速率 為0. 5毫升/分鐘，使用Masterflex滾動泵(lrpm)和Pharmed 6485-16管道。 在不同時間間隔取循環(huán)液測試HCV病毒RNA的存在。按廠商說明書用TRI-LS (MRC公司)試劑分離IO微升血漿中的病毒RNA。
然后HCV用定量RT PCR測定病毒RNA，采用Promeg (Madison, WI)的Impromll 試劑組，在25微升反應(yīng)體積中含有400nMEY80和EY78HCV特異性引物，Sybr 綠(1:10000) ， lxSCA封閉緩沖液，3 mM MgCl2， 400uM dNTPs， Tfl聚合酶 和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶各0. 2單位/微升。 一般用50微升的混合液來溶解從100微 升血槳中分離的RNA，將溶解后的混合物等分為兩個相同樣品。基本上按照廠 商說明書在SmartCycler實時熱循環(huán)儀(C印heid， CA)中進行擴增反應(yīng)時間為 RT(48。C下45分鐘)，PCR 40輪循環(huán)(94 。C/15秒；62。C/30秒；72。C/60秒； 87。C讀數(shù))。通過與擴增反應(yīng)(Ct = 20)最初階段病毒RNA標準品的信號強度 作比較，來估算病毒RNA的量。圖8顯示血液在柱內(nèi)反復(fù)循環(huán)，初始HCV在3小時內(nèi)降低約50% (顯著 1:1/2=3小時)。該曲線與指數(shù)衰減合理地擬合。綜上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然懂得，可對上述方法和組合物作出各種修 改而不背離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。因此，本發(fā)明可采取不背離本發(fā)明構(gòu)思和基 本特征的其他具體形式實施。因此，現(xiàn)有實施例和實施方式均認為是說明性的 而非限制性的，所有的修改都屬于本申請權(quán)利要求所定義的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種減少病毒感染個體血液中病毒顆粒及其凝集素可結(jié)合片段的方法，其 特征在于，該方法包括步驟a) 獲得感染個體的血液；b) 使該血液通過一種多孔中空纖維膜，在該膜的多孔外部部分中固定有凝集 素分子，所述凝集素分子—能結(jié)合富含甘露糖的糖蛋白。c) 收集通過的血液；d) 將通過的血液回輸給該個體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述凝集素選自雪花凝集素(GNA)、黃 水仙凝集素(NPA) 、 cyanovirin和伴刀豆蛋白A。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述凝集素為GNA。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述凝集素分子與病毒包膜蛋白或其片段^口 口 o
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述病毒為HIV-1。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒為HCV。
7. —種降低病毒感染個體血漿中病毒負荷的方法，其特征在于，該方法包括a) 獲得該個體的血漿；b) 使該血液通過一種多孔中空纖維膜，在該膜的多孔外部部分中固定有凝集 素分子，所述凝集素分子能結(jié)合富含甘露糖的糖蛋白。c) 收集通過的血液；d) 將通過的血液回輸給該個體。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中將未結(jié)合的血漿同細胞組份混合后，回輸 給該個體。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述凝集素分子選自GNA、 NPA、伴刀豆蛋 白A禾口 cyanovirin群。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述凝集素分子為GNA。
11. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述凝集素分子能結(jié)合病毒包膜蛋白或其 片段。
12. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒為HIV-1。
13. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒為HCV。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在體外裝置中去除受感染血液或血漿中病原體的方法，該方法利用了能結(jié)合富含甘露糖表面糖蛋白或其片段的病原體的凝集素。因此，本發(fā)明提供一種減少個體病毒負荷的方法，該方法包括以下步驟獲得個體的血液或血漿；使其通過一種多孔中空的纖維膜在膜多孔的外部分中固定有凝集素顆粒；收集通過膜的血液或血漿，將其回輸給該個體。
文檔編號A61M1/34GK101124315SQ200480006996
公開日2008年2月13日 申請日期2004年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日
發(fā)明者R·H·塔利斯 申請人:伊勢龍醫(yī)學股份有限公司