專利名稱：一類丹參酚酸的醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥中提取的化學(xué)成份經(jīng)藥理試驗(yàn)證明其有醫(yī)學(xué)用途，更具體地說是丹參酚類的醫(yī)學(xué)用途。
背景技術(shù)：
在我國隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的變化，痛風(fēng)的發(fā)病率呈上升趨勢，痛風(fēng)是一代謝性疾病，難以根治。痛風(fēng)反復(fù)發(fā)作可產(chǎn)生尿酸鹽沉積，關(guān)節(jié)畸形和腎結(jié)石，有較高的危害性，因此加強(qiáng)對痛風(fēng)疾病防治藥物的研究有重要意義。
體內(nèi)血尿酸濃度升高是造成痛風(fēng)的最主要原因。尿酸是在黃嘌呤氧化酶作用下由次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化而來。由于人體內(nèi)缺乏尿酸酶，因此尿酸是代謝的終產(chǎn)物。
黃嘌呤氧化酶是治療高尿酸血癥藥物的一個(gè)作用靶點(diǎn)，抑制黃嘌呤氧化酶的活性可以降低血液中尿酸濃度，從而達(dá)到治療痛風(fēng)的目的，別嘌呤醇是唯一在臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑，但是在臨床上發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇具有較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)如肝炎、超敏變態(tài)反應(yīng)等。在一定程度上限制了其安全使用。為此要從天然植物中尋找活性較強(qiáng)的副作用小的黃嘌呤氧化酶抑制劑是科技工作者攻克痛風(fēng)疾病的很好的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是從天然植物中尋找活性較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制劑。
本發(fā)明涉及從中草藥中提取所得的一類丹參酚酸化合物，包括丹參酚酸B及其它的鹽、迷迭香酸、紫草酸以及丹參素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 1M+＝Mg2+/22M+＝NH4++K+丹酚酸B(lithospermate B)C36H28MgO16(樣品17)
迷迭香酸(rosmarinic acid) 紫草酸(lithospermic acid)C18H16O8(樣品15) C27H22O12(樣品16) 丹參素(Danshensu)鈉鹽C9H9O5Na(樣品19) Acteoside(C29H36O15)(樣品XA-1)實(shí)驗(yàn)方法1.通過尿酸生成法測定樣品體外對黃嘌呤氧化酶活性的影響黃嘌呤氧化酶活性測定參考文獻(xiàn)(Li H.et al.New guaianolides and xathine oxidaseinhibitory flavonols from Ajania fruticulosa.Journal of NaturalProducts，621053-1055，1999)的方法進(jìn)行，具體步驟是1mM的黃嘌呤溶液中加入不同濃度的樣品或陽性對照別嘌呤醇，加入0.1mu·ml-1黃嘌呤氧化酶，37℃反應(yīng)5min，在全自動生化分析儀(日立-7600)測定尿酸生成量，以5min的尿酸生成量作為反應(yīng)速度。
2.通過超氧離子生成法測定樣品體外對黃嘌呤氧化酶活性的影響500μM的黃嘌呤溶液中，加入不同濃度的樣品和陽性對照別嘌呤醇，然后加入0.1mu·ml-1黃嘌呤氧化酶，加入500μM的NBT作為顯色劑，在波長560nm每分鐘的吸光度增加量作為反應(yīng)速度。
黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下，可以生成尿酸和超氧離子，所以可以通過測定尿酸和超氧離子的生成來測定黃嘌呤氧化酶的活性以及抑制劑的抑制作用。
通過以上相同的方法，分別測定了15、16、17、19、XA-1號樣品體外對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，具體結(jié)果見下表

二.體內(nèi)對小鼠高尿酸血癥的影響(一).利用尿酸生成的前體物質(zhì)次黃嘌呤為模型藥物，制備小鼠高尿酸血癥模型，觀察樣品對高尿酸血癥的影響，具體方法參照文獻(xiàn)(唐燦，楊奎，高尿酸血癥動物模型初探，實(shí)驗(yàn)動物模型，11(5)292-294，2000)1.實(shí)驗(yàn)方法昆明種雄性小鼠，體重18-22g，隨機(jī)分成5組，即生理鹽水組，樣品高、中、低劑量組和別嘌呤醇組，模型實(shí)驗(yàn)中樣品高、中、低劑量組每天ig給藥1次，連續(xù)三天，樣品高，中，低劑量分別為20、40、60mg·kg-1，別嘌呤醇劑量為2mg·kg-1，對照組給予相同體積生理鹽水，在最后一次給藥后1小時(shí)，所有組均腹腔注射1000mg·kg-1的次黃嘌呤，2hr后眼眶取血，用全自動生化分析儀日立-7600測定血清中尿酸值。
(二).利用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀作為模型藥物，制備小鼠高尿酸模型，觀察樣品對高尿酸血癥的影響。具體方法參照文獻(xiàn)(王海東，葛飛等。金錢草提取物對高尿酸血癥小鼠的影響，中國中藥雜志，27(12)939-944，2002)
1.試驗(yàn)方法昆明種雄性小鼠，體重18-22g，隨機(jī)分成5組，即生理鹽水組，樣品組高、中、低劑量組和別嘌呤醇組，模型實(shí)驗(yàn)中樣品高、中、低劑量組每天ig給藥1次，連續(xù)三大，樣品高，中，低劑量分別為20、40、60mg·kg-1，別嘌呤醇劑量為2mg·kg-1，對照組給予相同體積生理鹽水，在最后一次給藥后1小時(shí)，所有組均腹腔注射氧嗪酸鉀，2hr后眼眶取血，用全自動生化分析儀日立-7600測定血清中尿酸值。
通過以上方法，分別測定了15，16，17，19、XA-1號樣品體內(nèi)對尿酸生成的影響，具體結(jié)果見下表。
15，16，17，19、XA-1號樣品對次黃嘌呤造成的小鼠高尿酸血癥模型的影響

**P＜0.01 VS生理鹽水組
15，16，17，19、XA-1號樣品對氧嗪酸鉀造成的小鼠高尿酸血癥模型的影響

*P＜0.05，**P＜0.01 VS生理鹽水組


圖1是15號樣品通過尿酸生成法測定黃嘌呤氧化酶的抑制作用。
圖2是15號樣品體外通過超氧離子生成法對黃嘌呤氧化酶的抑制作用。
本發(fā)明與現(xiàn)僅有的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、無任何副作用；2、來源充足，制備方便。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例15號樣品體外對黃嘌呤氧化酶的抑制作用(通過尿酸生成法測定)1mM的黃嘌呤溶液中分別加入35、70、105μg·ml-1的15號樣品或陽性對照別嘌呤醇(2μg·ml-1)，加入0.1mu·ml-1黃嘌呤氧化酶，37℃反應(yīng)5min，在全自動生化分析儀(日立-7600)測定尿酸生成量，以5min的尿酸生成量作為反應(yīng)速度。通過實(shí)驗(yàn)，15號樣品體外有較強(qiáng)的抑制黃嘌呤氧化酶的作用，其半數(shù)抑制劑量(IC50)為42mg·ml-1，屬于競爭性抑制。具體結(jié)果見圖1。
15號樣品體外對黃嘌呤氧化酶的抑制作用(通過超氧離子生成法)500μM的黃嘌呤溶液中，分別加入12、26、38μg·ml-1的15號樣品和陽性對照別嘌呤醇(2μg·ml-1)，然后加入0.1mu·ml-1黃嘌呤氧化酶，加入500μM的NBT作為顯色劑，在波長560nm每分鐘的吸光度增加量作為反應(yīng)速度。
通過實(shí)驗(yàn)，15號樣品體外抑制超氧離子生成的半數(shù)抑制劑量(IC50)為25μg·ml-1，屬于競爭性抑制。具體結(jié)果見圖215號樣品體內(nèi)對次黃嘌呤造成的小鼠高尿酸血癥的影響昆明系小鼠50只，雄性，體重約20克左右，購自二軍大實(shí)驗(yàn)動物中心。到實(shí)驗(yàn)室后將購得小鼠隨機(jī)分為5組，即生理鹽水組，15號樣品組高、中、低劑量組和別嘌呤醇組，模型實(shí)驗(yàn)中15號樣品高、中、低劑量組每天ig給藥1次，連續(xù)三天，15號樣品高，中，低劑量分別為20、40、60mg·kg-1，別嘌呤醇劑量為2mg·kg-1，對照組給予相同體積生理鹽水，5組分別在第3次灌胃前采血，采血時(shí)將毛細(xì)采血管截成長度約為一厘米，取一根于小鼠前眼角處進(jìn)針約50mm待出血后，用500μml的EP管接取約500μml血作為正常對照待測。稱取次黃嘌呤600mg用15ml羧甲基纖維素鈉溶解。在第3次灌胃一小時(shí)前分別腹腔注射次黃嘌呤0.5ml/只，再過45min后眼眶采血。
將采好的血樣2000轉(zhuǎn)/分離心5min，取出血樣吸取血清約100μl上日立全自動生化分析儀(7600)來測定尿酸的生成量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果15號樣品對小鼠血清尿酸水平的影響(x±s，n＝10)

**P＜0.01 VS生理鹽水組
15號樣品體內(nèi)對氧嗪酸鉀造成的小鼠高尿酸血癥的影響昆明種雄性小鼠，體重18-22g，隨機(jī)分成5組，即生理鹽水組，樣品組高、中、低劑量組和別嘌呤醇組，模型實(shí)驗(yàn)中15號樣品高、中、低劑量組每天ig給藥1次，連續(xù)三天，15號樣品高，中，低劑量分別為20、40、60mg·kg-1，別嘌呤醇劑量為2mg·kg-1，對照組給予相同體積生理鹽水，在最后一次給藥后1小時(shí)，所有組均腹腔注射氧嗪酸鉀，2hr后眼眶取血，用全自動生化分析儀日立-7600測定血清中尿酸值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果15號樣品對小鼠血清尿酸水平的影響(x±s，n＝10)

*p＜0.05，**P＜0.01VS生理鹽水組
權(quán)利要求
1.一類結(jié)構(gòu)如下的丹參酚酸的醫(yī)學(xué)用途在制備治療或預(yù)防痛風(fēng)疾病的藥物中應(yīng)用 1M+＝Mg2+/22M+＝NH4++K+丹酚酸B(lithospermate B)C36H28MgO16(樣品17) 迷迭香酸(rosmarinic acid) 紫草酸(lithospermic acid)C18H16O8(樣品15) C27H22O12(樣品16) 丹參素(Danshensu)鈉鹽C9H9O5Na (樣品19) Acteoside(C29H36O15) (樣品XA-1)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類丹參酚酸的醫(yī)學(xué)用途。該類化合物體外通過尿酸生成法測定及超氧離子生成法對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，以及體內(nèi)對高尿酸血癥的影響揭示了該類化合物具有降低血清尿酸值和毒性小的優(yōu)點(diǎn)，可作為治療和預(yù)防痛風(fēng)疾病的藥物。
文檔編號A61P19/06GK1778292SQ200410084620
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者朱大元, 蔣山好, 黃才國, 李醫(yī)明 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所, 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)