專(zhuān)利名稱(chēng)：具有抑制β－內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及編碼的DNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段多肽及編碼該多肽的基因，和利用表達(dá)載體制備所述多肽的方法，具體地說(shuō)，涉及一種編碼β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的基因，以及利用表達(dá)載體制備所述多肽的方法，和所述的多肽的藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(青霉素和頭孢菌素)在臨床上用于治療多種細(xì)菌感染疾病，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用以及某種程度上的濫用，耐藥菌在不斷地產(chǎn)生，它們對(duì)許多β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，從而使這類(lèi)藥物對(duì)耐藥菌感染的疾病無(wú)效。微生物來(lái)源的β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑棒酸(Clavulanic acid)及其β-內(nèi)酰胺砜類(lèi)化合物舒巴坦(Sulbactam)和他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)是有效的β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑，且作為“自殺者”與β-內(nèi)酰胺抗生素合并用藥，可達(dá)到抑制β-內(nèi)酰胺酶活力、增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺抗生素療效的目的。然而，無(wú)論是砜類(lèi)還是棒酸類(lèi)抑制劑，對(duì)一些細(xì)菌產(chǎn)生的由染色體介導(dǎo)的I型β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用都很小。
近來(lái)人們從帶棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)中分離到β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白(β-lactamase inhibitory protein，BLIP)的出現(xiàn)(參見(jiàn)Doran JLeta1 J Bacteriol.1990 Sep；172(9)4909-18.)給人們帶來(lái)了很多啟發(fā)，隨后又有BLIP-I(參見(jiàn)Kang SG et al J Biol Chem.2000 Jun 2；275(22)16851-6.)、BLIP-II(參見(jiàn)Park HU，et al Microbiology.1998 Aug；144(Pt 8)2161-7)被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于BLIP類(lèi)蛋白的研究也受到人們的關(guān)注。
目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白方面的報(bào)道，而國(guó)外文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)有三個(gè)具有抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的蛋白，并對(duì)BLIP進(jìn)行了關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)方面的分析研究(參見(jiàn)Strynadka NC，et al Nat Struct Biol.1996Mar；3(3)233-9.)。從國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，目前的研究還是比較大的β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合蛋白，由于其分子量比較大，有165個(gè)氨基酸組成，并不適合開(kāi)發(fā)成為臨床使用的藥物，即使有BLIP表達(dá)的研究(參見(jiàn)Liu HB，et al.JBiotechnol.2004 Mar 18；108(3)207-17.)，主要還是其與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合以及抑制的機(jī)理研究。
另外對(duì)中國(guó)以及美國(guó)專(zhuān)利查詢(xún)均未發(fā)現(xiàn)有β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白方面的內(nèi)容，只有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑即小分子化合物的報(bào)道，未見(jiàn)有適合用于基因工程表達(dá)藥物的專(zhuān)利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種具有抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的多肽及其編碼DNA，以滿(mǎn)足生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的需要。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的發(fā)明人參考了關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，從中篩選到的24肽，體外作用表明具有抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，該多肽的氨基酸序列如SQ3SQ3FTIHCSVTAAGDYYCVHGANGTSF由于BLIP的分子量較大，有165個(gè)氨基酸，不適合開(kāi)發(fā)成為藥物，因此嘗試在保持BLIP與β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合能力的前提下，通過(guò)隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的篩選來(lái)獲得更短的、抑制β-內(nèi)酰胺酶作用更強(qiáng)的短肽。
根據(jù)BLIP與β-內(nèi)酰胺酶的構(gòu)效關(guān)系，將BLIP中的46～51位氨基酸殘基作為隨機(jī)序列的核心序列，在核心序列的兩側(cè)加上一些隨機(jī)序列，共有9個(gè)NNY(N為A、T、C、和G，而Y為C或T)。在通過(guò)PCR方法將隨機(jī)的單鏈寡核苷酸大量擴(kuò)增為雙鏈，然后經(jīng)過(guò)一系列基因操作將擴(kuò)增后的隨機(jī)雙鏈基因與pGAD424質(zhì)粒載體中的激活域融合，構(gòu)建隨機(jī)核苷酸文庫(kù)(獵物質(zhì)粒文庫(kù))，庫(kù)容量達(dá)到107。
β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的編碼基因，其DNA序列如SQ2SQ1TTCACTATCC ACTGCNNYNN YNNYGCTGCA GGTGACTACT ACNNYNNYNN YNNYNNYNNYGGCACCTCTT TC其中NNY代表隨機(jī)的寡核苷酸，N為A、T、C或G，而Y為C或T優(yōu)選的基因序列如SQ2SQ2TTCACTATCC ACTGCAGTGT CACTGCTGCA GGTGACTACT ACTGTGTTCA TGGCGCTAATGGCACCTCTT TC該段基因共由72個(gè)核苷酸組成，編碼了24個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量是2600道爾頓。
本發(fā)明還涉及上述的DNA克隆及表達(dá)載體。
運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)隨機(jī)核苷酸文庫(kù)進(jìn)行初篩和復(fù)篩，最終得到了一株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分離其中的質(zhì)粒并命名為pYG202。β-半乳糖苷酶的定量測(cè)定表明其與β-內(nèi)酰胺酶在體內(nèi)的相互作用測(cè)得的米勒單位分10.2。
制備抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的方法，包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，優(yōu)選的宿主菌為大腸桿菌。
將短肽與GST蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，通過(guò)親和層析、凝血酶消化等一系列步驟最終獲得的短肽，體外檢測(cè)其與β-內(nèi)酰胺酶的相互作用，結(jié)果表明短肽可以抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性。
篩選新β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，需要純度較高的β-內(nèi)酰胺酶來(lái)驗(yàn)證篩選得到的短肽是否具有抑制作用。因此，首先將β-內(nèi)酰胺酶基因克隆至pLY-5載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pYG201。在pYG201質(zhì)粒中β-內(nèi)酰胺酶基因處于λ噬菌體PL啟動(dòng)子控制下，通過(guò)42℃熱激解除阻遏物(cIts857)的阻遏，高效表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶。外源蛋白高效表達(dá)易形成包含體，通過(guò)對(duì)包含體的溶解、復(fù)性和純化過(guò)程的研究，最終獲得有活性的β-內(nèi)酰胺酶并達(dá)到90％以上的純度。
通過(guò)常規(guī)的PCR方法將隨機(jī)的單鏈寡核苷酸大量擴(kuò)增為雙鏈，再經(jīng)過(guò)一系列常規(guī)的基因操作，將擴(kuò)增后的隨機(jī)雙鏈基因與pGAD424質(zhì)粒載體中的激活域融合，構(gòu)建隨機(jī)核苷酸文庫(kù)，即獵物質(zhì)粒文庫(kù)。通過(guò)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化條件的研究確定了轉(zhuǎn)化的最佳條件，其最佳條件是選擇聚乙二醇4000為促進(jìn)劑和42℃熱激時(shí)間為30min，獲得的轉(zhuǎn)化率為1.4×105cfu/μg DNA。
將pYG111和隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)共同轉(zhuǎn)化酵母Y153，通過(guò)初篩和復(fù)篩最終得到了一株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分離得到的質(zhì)粒命名為pYG202。β-半乳糖苷酶的定量測(cè)定表明其與β-內(nèi)酰胺酶在酵母體內(nèi)的相互作用測(cè)得的米勒單位為10.2。
所說(shuō)的pYG111質(zhì)粒為含有來(lái)自pBR322質(zhì)粒中所編碼的TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶基因的質(zhì)粒；pYG111質(zhì)?？刹捎梦墨I(xiàn)公開(kāi)的方法進(jìn)行構(gòu)建，在中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志2004年第35卷第1期第16頁(yè)中已經(jīng)有公開(kāi)的報(bào)道；所述的pBR322質(zhì)粒為一常用的大腸桿菌克隆載體質(zhì)粒，可從上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司處購(gòu)得。
將編碼基因克隆到質(zhì)粒pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)中，得到重組質(zhì)粒pYG205。加入適量的IPTG誘導(dǎo)外源基因在宿主中表達(dá)GST-多肽融合蛋白，運(yùn)用Sepharose 4B親和層析介質(zhì)分離純化GST-多肽，然后用凝血酶(thrombin)將多肽從融合蛋白中切下。體外測(cè)定多肽與β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合作用，結(jié)果表明它可以抑制酶的活性。
pGEX-4T-1質(zhì)粒為一常用的大腸桿菌表達(dá)載體質(zhì)粒，將目的蛋白與GST(谷胱肝肽S-轉(zhuǎn)移酶)蛋白融合表達(dá)，可從Amersham Biosciences Ltd.公司購(gòu)得。
本發(fā)明的多肽及編碼該多肽的基因在醫(yī)藥學(xué)中有廣泛的用途，可用于藥物的制備，與β-內(nèi)酰胺抗生素聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明的具有抑制β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及編碼的DNA1.分子量較小，易于克隆與表達(dá)，并可通過(guò)串聯(lián)提高表達(dá)量；2.通過(guò)構(gòu)效關(guān)系證明所編碼的多肽與β-內(nèi)酰胺酶特異性結(jié)合；3.所篩選到的DNA序列顯示體內(nèi)能結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因；4.體外實(shí)驗(yàn)表明該DNA序列所編碼的多肽能特異性地抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性；5.如能與β-內(nèi)酰胺抗生素合用，能通過(guò)抑制耐藥菌的β-內(nèi)酰胺酶的活性來(lái)提高抗生素的功效。


圖1顯示了表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程。
圖2顯示了β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的包含體SDS/PAGE電泳。2號(hào)為表達(dá)的包含體。
圖3顯示了純化β-內(nèi)酰胺酶的洗脫組分。
圖4顯示了純化的β-內(nèi)酰胺酶SDS/PAGE電泳。6號(hào)為純化的酶。
圖5顯示了純化的β-內(nèi)酰胺酶活性的測(cè)定。
圖6顯示了雙鏈隨機(jī)寡核苷酸的構(gòu)建過(guò)程。
圖7顯示了寡核苷酸文庫(kù)質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程。
圖8顯示了酵母雙雜交系統(tǒng)篩選得到的陽(yáng)性子再經(jīng)復(fù)篩在膜上顯示藍(lán)色。
圖9顯示了篩選得到的陽(yáng)性質(zhì)粒pYG202。
圖10顯示了該陽(yáng)性質(zhì)粒編碼的多肽體內(nèi)與β-內(nèi)酰胺酶的作用強(qiáng)度，1號(hào)、2號(hào)為對(duì)照，5號(hào)為陽(yáng)性質(zhì)粒。
圖11顯示了陽(yáng)性質(zhì)粒上的插入片段的測(cè)序結(jié)果，以及相應(yīng)的編碼的氨基酸序列。
圖12顯示了表達(dá)質(zhì)粒pYG205的構(gòu)建過(guò)程。
圖13顯示了表達(dá)陽(yáng)性多肽融合蛋白的洗脫組分。
圖14顯示了純化的融合蛋白SDS/PAGE電泳。1號(hào)為純化得到的樣品。
圖15顯示了切割后的多肽，2號(hào)為得到的樣品。
圖16顯示了多肽體外對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性。
圖17顯示了不同濃度的多肽對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)純化pYG111質(zhì)粒中含有來(lái)自pBR322質(zhì)粒中所編碼的TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶基因，且在克隆該基因時(shí)在其兩側(cè)加上了EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。為使TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶基因大量表達(dá)，用EcoRI和BamHI消化分別質(zhì)粒pYG111和pLY-5，分別回收pYG111上切出的β-內(nèi)酰胺酶基因小片段和pLY-5載體大片段，用T4連接酶連接起來(lái)，得到了β-內(nèi)酰胺酶高表達(dá)質(zhì)粒pYG201，構(gòu)建流程如圖1所示。
誘導(dǎo)后的細(xì)胞培養(yǎng)液以8000r/min離心10min后收集菌體，沉淀的菌體用蒸餾水洗滌1次，再離心。將得到的菌體(濕重0.25g)用1×PBS洗滌1次后再懸浮，用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，工作15s，間歇5s，共進(jìn)行20次。細(xì)胞破碎液以10000r/min離心15min，此時(shí)由重組蛋白形成的包含體已在沉淀中。將沉淀用洗滌液I和洗滌液II各洗滌一次，10000r/min離心15min，這樣便得到了較純的包含體。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，灰度分析表明其純度達(dá)到了80％。
將上述的包含體溶解液以15000r/min離心20min去除不溶性雜質(zhì)后，再加入包含體溶解液至總體積為30ml，裝入截留分子量為14,000Da的透析袋中，用300ml復(fù)性液透析過(guò)夜。次日將復(fù)性液稀釋5倍后繼續(xù)透析過(guò)夜，再稀釋5倍繼續(xù)透析過(guò)夜，然后換用去離子水透析過(guò)夜。隨后將蛋白溶液用PEG6000濃縮至1/3體積左右，在濃縮過(guò)程中要注意蛋白液體積的變化，不要濃縮過(guò)度以免發(fā)生蛋白沉淀。將濃縮液用pH7.0的0.02mol/L磷酸緩沖液平衡過(guò)夜。次日，將平衡好的蛋白溶液過(guò)Sephadex G-75柱，用pH7.0的0.02mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.2ml/min，以4ml/tube收集洗脫液。檢測(cè)各管收集液的A280值并檢測(cè)各管洗脫液的β-內(nèi)酰胺酶活性。洗脫圖譜見(jiàn)圖3。
收集有酶活的部分，合并后用蒸餾水透析去除鹽，用冷凍干燥機(jī)凍干保存。取少量樣品用水溶解后作SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，灰度分析顯示其蛋白純度在90％以上。
取22mg凍干樣品溶于1ml pH7.0的0.05mol/L的磷酸緩沖液中，測(cè)定該酶液的蛋白含量。在酶反應(yīng)體系中含有100μl氨芐青霉素(100mg/ml)和20μl酶液，最終用緩沖液補(bǔ)足至3ml，25℃下反應(yīng)，在235nm波長(zhǎng)下測(cè)定酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。在對(duì)照中以20μl緩沖液代替酶液，其它一樣。測(cè)定結(jié)果如圖5所示。最后計(jì)算得酶比活為6732U/mg蛋白(圖5)。
實(shí)施例2構(gòu)建寡核苷酸文庫(kù)用PCR方法將單鏈隨機(jī)寡核苷酸擴(kuò)增為雙鏈，它與普通的PCR擴(kuò)增反應(yīng)有所不同，隨機(jī)寡核苷酸片段擴(kuò)增原理見(jiàn)圖6所示。此PCR反應(yīng)中模板為含有9個(gè)NNY的隨機(jī)序列，其包含的信息量非常大。在PCR擴(kuò)增時(shí)要盡量保持寡核苷酸的種類(lèi)數(shù)不變，以確保在構(gòu)建寡核苷酸庫(kù)時(shí)隨機(jī)序列DNA的多樣性。
將PCR酶切產(chǎn)物與適量的相同酶切的pGAD424大片段連接起來(lái)，按上述質(zhì)粒DNA量擴(kuò)大100倍轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞(1000ml培養(yǎng)液)，涂布100個(gè)LB+Amp平皿，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)16h，每個(gè)平皿上長(zhǎng)滿(mǎn)了菌落可達(dá)105個(gè)克隆。收集平皿上所有的轉(zhuǎn)化子，可獲得～107個(gè)克隆作為一個(gè)隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，收集菌落并接入LB+Amp(共40ml)液體培養(yǎng)基中，于37℃下振搖4h，加入甘油，使甘油的終濃度為20％，然有分裝于1.5ml的eppendorf管，-70℃下保存。寡核苷酸文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程如圖7所示。
實(shí)施例3酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選用各100μg的pYG202和pYG111共同轉(zhuǎn)化用1L培養(yǎng)液制備的Y153感受態(tài)細(xì)胞，涂布100個(gè)SD-L-W-H+3-AT(25mM)平板，將長(zhǎng)出較大的菌落挑出，共挑出6000個(gè)點(diǎn)種于SD-L-W-H+3-AT(25mM)平板上。待菌落長(zhǎng)至適當(dāng)大小時(shí)，進(jìn)行篩選和檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的顏色反應(yīng)。經(jīng)過(guò)初篩得到62個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將硝酸纖維濾膜上出現(xiàn)的藍(lán)色菌落在原始平板上找出對(duì)應(yīng)的菌落。
首先利用酶法分離上述初篩獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒DNA，但這里分離得到是兩種質(zhì)粒的混合物，而我們需要的是含有表達(dá)能與β-內(nèi)酰胺酶有相互作用肽的基因。利用大腸桿菌一次只能接受一個(gè)質(zhì)粒的特性，將分離到的質(zhì)粒DNA混合物轉(zhuǎn)化合適的大腸桿菌宿主中，由于陽(yáng)性質(zhì)粒帶有Leu2基因，而pYG111帶有Trp1基因，因此選擇亮氨酸缺陷型的大腸桿菌作為宿主就可以將上述的兩種質(zhì)粒分開(kāi)。E.coli C600的基因型為thi-1thr-1 leu1 lacY1 proA2 supE44，即在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。將混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli C600，涂布含有Thia和Pro的M9基本培養(yǎng)基即可篩選含有陽(yáng)性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)鑒定后，質(zhì)粒分別單獨(dú)轉(zhuǎn)化Y153和再與pYG111共同轉(zhuǎn)化到Y(jié)153中，分別涂布SD-L+W和SD-L-W-H+3-AT(25mmol/L)平板，于30℃下培養(yǎng)一周，用膜影印法檢測(cè)各平板，結(jié)果為單獨(dú)轉(zhuǎn)化的平板上沒(méi)有出現(xiàn)藍(lán)色，而與pYG111共同轉(zhuǎn)化的平板中出現(xiàn)藍(lán)色，結(jié)果見(jiàn)圖8所示，將得到的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pYG202(圖9)。
實(shí)施例4多肽與β-內(nèi)酰胺酶的體內(nèi)相互作用將陽(yáng)性菌株和酵母Y153(作為對(duì)照)接入5ml SD培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)OD600至0.6～1.2，收集菌體后用等體積的Z緩沖液重懸，置于液氮速凍后，在37℃水浴中融解，重復(fù)此過(guò)程3～4次，然后定量測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性，結(jié)果如圖10所示，對(duì)照Y153，Y153(BD/AD)的米勒單位分別為0.2和0.25，這結(jié)果表明沒(méi)有相互作用的菌株是不表達(dá)β-半乳糖苷酶的，而Y153(pYG111/pYG202)測(cè)得的米勒單位為10.2，表明pYG202在酵母體內(nèi)表達(dá)的多肽與β-內(nèi)酰胺酶有相互作用。
實(shí)施例5編碼多肽的DNA序列測(cè)定用EcoRI和ClaI雙酶切pYG202，將酶切得到的小片斷與pBlu2KSM連接起來(lái)，進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序工作由上海申能博彩公司測(cè)定。測(cè)序結(jié)果及編碼的氨基酸序列如圖11。
實(shí)施例6多肽基因的克隆及表達(dá)將通過(guò)酵母雙雜交方法篩選獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒pYG202的插入基因亞克隆到pGEX-4T-1中構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，圖12為pYG205質(zhì)粒的構(gòu)建路線(xiàn)圖。
實(shí)施例7多肽的純化和切割誘導(dǎo)表達(dá)pYG205后將收集的菌體用適當(dāng)體積的1×PBS懸浮，進(jìn)行超聲破碎。細(xì)胞破碎液以14,000rpm離心15min，上清液用0.45μm的濾膜過(guò)濾除去雜物。將過(guò)濾液上Glutathione Sepharose 4B親和層析柱，樣品開(kāi)始過(guò)親和柱的流速為0.4ml/min，待樣品吸附后用層析平衡緩沖液洗GST融合蛋白吸附后的柱子，直至A280小于0.02；然后用2個(gè)床體積的洗脫緩沖液以0.2ml/min的流速將GST融合蛋白洗脫下來(lái)。按每管5ml收集樣品，檢測(cè)各管的A280，得到的吸附(1-12管)和洗脫(13-17管)圖譜見(jiàn)圖13。
用SDS-PAGE電泳檢測(cè)各個(gè)步驟的蛋白，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖14所示。
用Bradford法測(cè)定收集到的GST-短肽融合蛋白總量，結(jié)果共為50mg。由于一個(gè)單位的凝血酶(thrombin)加入含有100μg融合蛋白的PBS溶液中，在22℃下放置16h，大于90％的融合蛋白被消化。所以加入500單位的凝血酶，置于22℃水浴中酶切反應(yīng)16h。將反應(yīng)后的混合液用截留分子量10,000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，收集流出的液體。冷凍干燥后，用少量的去離子水溶解，將其裝入截留分子量為1,000Da的透析袋中，透析脫鹽，再冷凍干燥，最后用分析小分子多肽的SDS-PAGE電泳檢測(cè)分離得到的多肽。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖15所示。檢測(cè)結(jié)果表明用凝血酶可以將短肽從融合蛋白中切下來(lái)。
實(shí)施例8
多肽在體外對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性比較了有無(wú)短肽存在時(shí)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶降解氨芐青霉素的快慢。從圖16中可以看出，加入短肽后曲線(xiàn)的斜率，即氨芐青霉素的降解速率明顯變小，表明短肽對(duì)酶的活性有抑制作用。
接下來(lái)檢測(cè)了短肽濃度對(duì)酶活抑制作用的影響，如圖17所示?？梢钥闯鲭S著短肽濃度的增大其對(duì)酶活的抑制作用也在不斷加大。
序列表<110>上海醫(yī)藥工業(yè)研究院<120>具有抑制β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及編碼的DNA<130>SPI048461<160>3<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(16，17，19，20，22，23，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59)<223>N＝A或T或C或G<222>(18，21，24，45，48，51，54，57，60)<223>Y＝C或T<400>1TTCACTATCC ACTGCNNYNN YNNYGCTGCA GGTGACTACT ACNNYNNYNN YNNYNNYNNY 60GGCACCTCTT TC 72<210>2<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>2TTCACTATCC ACTGCAGTGT CACTGCTGCA GGTGACTACT ACTGTGTTCA TGGCGCTAAT 60GGCACCTCTT TC 72<210>3<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN
<400>3Phe Thr Ile His Cys Ser Val Thr Ala Ala Gly Asp Tyr Tyr Cys Val1 5 10 15His Gly Ala Asn Gly Thr Ser Phe20
權(quán)利要求
1.抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的編碼基因，它的DNA序列如下TTCACTATCC ACTGCNNYNN YNNYGCTGCA GGTGACTACT ACNNYNNYNN YNNYNNYNNYGGCACCTCTT TC其中N代表A、T、C或G中的一種，Y為C或T中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的編碼基因，它的DNA序列如下TTCACTATCC ACTGCAGTGT CACTGCTGCA GGTGACTACT ACTGTGTTCA TGGCGCTAATGGCACCTCTT TC
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA序列編碼的抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的氨基酸序列如下phe Thr Ile His Cys Ser Val Thr Ala Ala Gly Asp Tyr Tyr Cys Val His Gly Ala Asn Gly Thr Ser Phe5 10 15 20
4.一種包括權(quán)利要求1或2的DNA序列的表達(dá)載體。
5.一種包括權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體的宿主菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主菌，其特征在于該宿主菌為大腸桿菌。
7.制備抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的方法，包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌。
9.一種從權(quán)利要求5所述的宿主菌培養(yǎng)物中獲得如權(quán)利要求3所述抑制β-內(nèi)酰胺酶的多肽的方法。
10.權(quán)利要求3所述的多肽在制備治療細(xì)菌感染疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一段能夠抑制β－內(nèi)酰胺酶的多肽，及編碼該多肽的基因，和利用表達(dá)載體制備所述多肽的方法。該段基因共由72個(gè)核苷酸組成，編碼了24個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量是2600道爾頓。利用該基因在大腸桿菌中表達(dá)重組的多肽并且純化，實(shí)驗(yàn)證明它能抑制β－內(nèi)酰胺酶的活性，因此該多肽可以用作與β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素合用藥來(lái)治療細(xì)菌感染。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1778916SQ20041008457
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者朱寶泉, 孫偉, 龔家瑋, 朱春寶, 胡又佳 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院