專利名稱：利用谷物籽粒大規(guī)模生產(chǎn)超氧化物歧化酶復(fù)合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶復(fù)合酶的方法，特別是一種利用玉米、小麥、水稻、谷子、高粱五種作物種子大規(guī)模制造生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)復(fù)合酶及系列產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于生物體中，60年代才被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，其功能為清除對(duì)生物體有強(qiáng)烈毒性的超氧自由基，過多的自由基被認(rèn)為是使細(xì)胞衰老到死亡的主要原因之一。近年來，發(fā)展了一些制取SOD的方法，并將其用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品和日用化學(xué)品等領(lǐng)域，取得了很好的效果。特別是對(duì)消炎、抗衰老、抗輻射損傷和抑制腫瘤生長(zhǎng)等均有較好作用。
目前，SOD制劑大都是從動(dòng)物血液或組織中提取制備的，這些原材料不易收集，運(yùn)輸，貯存和清洗，易攜帶病原微生物，極不安全，國(guó)務(wù)院于1997年頒布了“血液制品管理?xiàng)l例”進(jìn)行限制，2004年國(guó)家食品藥品管理局又進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)對(duì)血液制品要限制從嚴(yán)，沒有了用血液生產(chǎn)SOD的空間。有的SOD制品是從蔬菜或水果中提取制備的，原料易腐爛變質(zhì)，貯存成本高，都不是制備SOD的理想原材料。谷物易收集、易貯存，可以做到隨取隨用，副產(chǎn)物淀粉和蛋白質(zhì)等，又是有用之物，故谷物籽粒是理想的生產(chǎn)SOD復(fù)合酶的原料。
在SOD制備的加工工藝方面，目前也沒有統(tǒng)一的好方法。有的方法非常復(fù)雜煩瑣，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，要用有機(jī)溶劑，成本高，易著火，不安全，提純過度，不但產(chǎn)量低，而且只剩下單一SOD，這種純的SOD只能用作生化試劑，不能做保健品和藥品，因?yàn)榧僑OD不能將超氧自由基直接轉(zhuǎn)化成水，只能轉(zhuǎn)化成過氧化氫，過氧化氫仍然對(duì)細(xì)胞有毒。有兩種酶可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化成水，即過氧化氫酶(CAT)與過氧化物酶(POD)，此二種酶在生物組織中是與SOD共同存在的，如提取過純，失去了CAT與POD就只能做試劑SOD了。反之，提取過粗，雜蛋白太多，SOD活力太低，也失去了做保健品和藥品的功效。有的工藝要用大量硫酸銨提取，造成環(huán)境污染。有的工藝所用藥劑價(jià)格昂貴，成本太高，甚至有毒等等。都不能生產(chǎn)高活力、安全無毒、低成本的超氧化物歧化酶(SOD)復(fù)合酶，故制取工藝甚為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用谷物籽粒大規(guī)模生產(chǎn)超氧化物歧化酶復(fù)合酶的方法，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)三種酶都能提取出來，酶的活力高，效果好，保質(zhì)期長(zhǎng)；工藝簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，安全無污染，耗能少，成本低，效益高；五種谷物種子均可生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一、液體復(fù)合酶的制備方法，其特征是有如下步驟1、將谷物籽粒進(jìn)行篩選、消毒、清洗，并保證發(fā)芽率要達(dá)到70％以上；2、將消毒后的籽粒在溫水中浸泡一晝夜，使其吸脹，在發(fā)芽槽中保溫發(fā)芽，保溫溫度為24-30℃，芽長(zhǎng)約1-2mm即可；3、將發(fā)芽谷物用膠體磨研磨成粗漿，在磨制過程中加入含60-65mMol的磷酸鹽緩沖液或磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，PH7.6-7.8，緩沖液為玉米重量的1-2倍；4、將粗漿裝入貯罐，加入每克酶活為2000單位以上的纖維素酶，其量為谷物重量的0.2-0.5％，攪勻；5、將粗漿用膠體磨打成細(xì)漿，細(xì)漿裝入貯罐，加入谷物重量1-2％的氯化鈣，攪勻，在10℃以下靜置3-5小時(shí)；
6、固液分層后，濾液進(jìn)入飲料壓濾機(jī)，濾布為200-300目，助濾劑為硅藻土，濾液通過連續(xù)管式離心機(jī)離心，收集離心液；7、離心液過超濾膜，收集小于14萬分子量的流出液，在流出液的貯罐中加入流出液重量0.1-0.3％的糖化酶，攪勻，作用2-3小時(shí)，再通過10000分子量的中性超濾膜濃縮，使其達(dá)到所需要的SOD濃度；8、在濃縮液中加入0.1-0.2的VE原粉，再加入0.1-0.2％的山梨酸鉀或海藻糖，攪勻，將濃縮液置-18--22℃冷凍室使SOD進(jìn)一步分離、濃縮、凈化，將冷凍濃縮液移出，化凍后通過離心機(jī)離心；9、將離心液分裝、殺菌即成。
二、利用本發(fā)明提供的超氧化物歧化酶復(fù)合酶生產(chǎn)的產(chǎn)品1、利用液體復(fù)合酶生產(chǎn)片劑、膠囊產(chǎn)品的方法，其特征是將上述超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液，加入液體重量8-10％的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機(jī)內(nèi)調(diào)節(jié)適宜溫度噴制成細(xì)粉，將粉進(jìn)行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
2、利用液體復(fù)合酶生產(chǎn)純化產(chǎn)品的方法，其特征是將上述超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液置超濾機(jī)中，以分子量為10000的膜超濾濃縮至6-7倍即可。此時(shí)小分子量的雜質(zhì)已去， 但保留了CAT與POD兩種酶，為純質(zhì)復(fù)合酶。
3、利用液體復(fù)合酶生產(chǎn)生化試劑的方法，其特征是將上述純質(zhì)復(fù)合酶，先用Sephadex G-75柱層析，進(jìn)行系統(tǒng)分離，可得電泳純之產(chǎn)品，其中過氧化氫酶與過氧化物酶均極少，酶的比活力每毫克可達(dá)4500單位以上(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)為3000單位)，層析只有一個(gè)峰，電泳只有一條帶。
在濃縮液中加入0.1-0.2的VE(均為原粉)，再加入0.1-0.2％的山梨酸鉀或海藻糖，攪勻，待加入的藥劑溶化后，將濃縮液置-20℃冷凍室使SOD進(jìn)一步分離、濃縮、凈化，將冷凍濃縮液移出，置室溫下，化凍后，再在每分鐘10000-15000轉(zhuǎn)的離心機(jī)中離心。將離心液分裝并密封，以鈷60殺菌即可。
4、利用液體復(fù)合酶生產(chǎn)凍干粉的方法，其特征是將上述冷凍前的超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液，分裝入安瓶中，置凍干機(jī)中，在-20℃下凍干即成。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)超氧化物歧化酶，過氧化物酶和過氧化氫酶三種酶都能提取出來，成為復(fù)合酶，產(chǎn)品雜蛋白少，酶的活力高，酶活力可控效果好，保質(zhì)期長(zhǎng)；(2)一條基本工藝路線可以產(chǎn)生系列產(chǎn)品，即口服液、粉劑、片劑、膠囊和凍干粉等復(fù)合酶產(chǎn)品，將工藝延長(zhǎng)還可生產(chǎn)試劑級(jí)超氧化物歧化酶，即純SOD。工藝簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，不用有毒不安全和造成污染的方式提取藥劑，安全無污染，耗能少，成本低，效益高；(3)五種谷物種子，即玉米、小麥、水稻、谷子、高粱均可用此工藝生產(chǎn)。副產(chǎn)物主要是淀粉和纖維素，可生產(chǎn)各種淀粉制品和食用纖維素，其產(chǎn)值不亞于主產(chǎn)品，是一項(xiàng)可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一，加工以玉米籽粒為基本原料生產(chǎn)超氧化物歧化酶復(fù)合酶及產(chǎn)品液體復(fù)合酶1、將風(fēng)干重一噸，發(fā)芽率達(dá)70％以上的玉米籽粒(發(fā)芽率與酶產(chǎn)率成正比)，先進(jìn)行風(fēng)選，再進(jìn)行磁選，置發(fā)芽槽內(nèi)，加50-100ppm的次氯酸鈉水溶液，使淹過玉米，攪勻，約30-60分鐘后，放出次氯酸鈉液，加清水洗兩遍(以PH試紙?jiān)囼?yàn)，無堿性合格，否則再洗)。在放盡水的發(fā)芽槽內(nèi)，加入28℃的溫水，保溫24小時(shí)，使玉米粒充分吸脹，放出剩余水分。發(fā)芽槽內(nèi)徐徐通風(fēng)，保溫28℃，保持飽和濕度，使玉米發(fā)芽，防止厭氧發(fā)酵產(chǎn)熱。發(fā)芽長(zhǎng)度約1-2mm即可。將發(fā)芽玉米籽粒送入膠體磨，打粗漿，同時(shí)不斷滴入PH7.8的磷酸鹽或磷酸檸檬酸鹽緩沖液(約為玉米風(fēng)干重的1.5倍左右。粗漿打入貯罐，加入2-3公斤工業(yè)纖維素酶(每克酶活力在2000單位以上)，攪勻，放置2-3小時(shí)。將粗漿在膠體磨中進(jìn)一步打成細(xì)漿后，輸入貯罐，加入8-10公斤氯化鈣(以無水物計(jì))，攪勻。待罐內(nèi)物固液分層后，通過濾布為200目的板框過濾機(jī)過濾，濾餅為副產(chǎn)品淀粉，濾液在飲料壓濾機(jī)中，以生產(chǎn)酶制劑等級(jí)的硅藻土為助濾劑，濾布為300目，壓濾。濾液入貯罐，在濾液中加入1-2公斤市售制酒用糖化酶，攪勻，濾液在管式離心機(jī)中以10000-15000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心。離心液過分子量為14萬的超濾膜，收集流出液，流出液再以10000分子量的超濾機(jī)濃縮。濃縮程度根據(jù)產(chǎn)品需要而定。
2、在該流出液的貯罐中加入流出液重量0.1-0.3％的糖化酶，攪勻，使作用2小時(shí)，再通過10000分子量的中性超濾膜濃縮，使其達(dá)到所需要的SOD濃度。
液體產(chǎn)品(口服液)將液態(tài)SOD濃縮至每毫升為400-600單位，為了長(zhǎng)期保存，在濃縮液中加入濃縮液重量0.8-0.12％的VE和0.1-0.2％的山梨酸鉀(最好是0.1％左右的海藻糖)，加入攪勻后，送入冷凍室冷凍(-20℃)，冷凍后置室溫融化，再以每分鐘10000-15000轉(zhuǎn)離心，分瓶包裝(約250-500毫升)，用鈷60輻射滅菌即成。在-10℃以下可保存1年，不產(chǎn)生沉淀，活力保持在80％以上。
產(chǎn)品1、干粉、片劑或膠囊將上述液體SOD產(chǎn)品(1)不必冷凍，加入以液體產(chǎn)品重量為基數(shù)8-10％的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在不斷攪拌下進(jìn)行噴霧干燥，將SOD干粉打成腸溶片，分瓶包裝，或制成塑料板水泡眼或裝入腸溶膠囊。包裝物用鈷60 100rad輻射殺菌，在10℃以下避光貯存?？杀４?-2年。
2、純化產(chǎn)品可供輸液用等醫(yī)藥產(chǎn)品。將上述超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液置超濾機(jī)中，以分子量為10000的膜超濾濃縮至6-7倍即可。此時(shí)小分子量的雜質(zhì)已去，但保留了CAT與POD兩種酶，為純質(zhì)復(fù)合酶。按輸液要求作進(jìn)一步處理。
3、生化試劑將上述純質(zhì)復(fù)合酶，先用Sephadex G-75柱層析，后用DEAE-32層析，可得電泳純之產(chǎn)品，其中過氧化氫酶與過氧化物酶均極少，酶的比活力每毫克可達(dá)4500單位以上(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)為3000單位)，層析只有一個(gè)峰，電泳只有一條帶。
4、凍干粉將冷凍前的超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液體裝入安瓶，在凍干機(jī)內(nèi)凍干，封口，其他如滅菌保存等，同膠囊或片劑。
各種產(chǎn)品的質(zhì)量(酶活力檢測(cè)近似數(shù)據(jù)液體u/m1，固體u/g)

*植物SOD常規(guī)應(yīng)用方法數(shù)據(jù)說明以上數(shù)據(jù)根據(jù)需要可以做高或低，如濃縮液的SOD活力單位可以做到300，也可做到1000；噴干粉既可做到1000，也可做到5000；凍干粉既可做到4000，也可做到10000。多一道工藝，單位酶活力能提高，但酶的總活力要下降，要注意總體經(jīng)濟(jì)效益。產(chǎn)品酶活的高低與作物的種類、品種和生育期均有關(guān)。要得到好的產(chǎn)品必須采取綜合措施。
五種谷物在制取超氧化物歧化酶復(fù)合酶的工藝基本上是相同的，所用設(shè)備也相同，即一條生產(chǎn)線可以以上述五種谷物為原料生產(chǎn)SOD復(fù)合酶。
其不同點(diǎn)是即(1)酶產(chǎn)率不同，如以每公斤風(fēng)干種子為基數(shù)比較則玉米約為10萬單位；小麥約為6萬單位；水稻約為5.3萬單位；谷子約為4.5萬單位；高粱約為1.5萬單位。(2)盡管五種谷物的副產(chǎn)物主要都是淀粉，但因水稻與谷子有殼，在利用其淀粉時(shí)，還需有一道去殼的工藝。
權(quán)利要求
1.一種利用谷物籽粒大規(guī)模生產(chǎn)超氧化物歧化酶復(fù)合酶的方法，其特征是有如下步驟A、將谷物籽粒進(jìn)行篩選、消毒、清洗，并保證發(fā)芽率要達(dá)到70％以上；B、將消毒后的籽粒在溫水中浸泡一晝夜，使其吸脹，在發(fā)芽槽中保溫發(fā)芽，保溫溫度為24-30℃，芽長(zhǎng)約1-2mm即可；C、將發(fā)芽谷物用膠體磨研磨成粗漿，在磨制過程中加入含60-65mMol的磷酸鹽緩沖液或磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，PH7.6-7.8，緩沖液為谷物籽粒重量的1-2倍；D、將粗漿裝入貯罐，加入每克酶活為2000單位以上的纖維素酶，其量為谷物重量的0.2-0.5％，攪勻；E、將粗漿用膠體磨打成細(xì)漿，細(xì)漿裝入貯罐，加入谷物重量1-2％的氯化鈣，攪勻，在10℃以下靜置3-5小時(shí)；F、固液分層后，濾液進(jìn)入飲料壓濾機(jī)，濾布為200-300目，助濾劑為硅藻土，濾液通過連續(xù)管式離心機(jī)離心，收集離心液；G、離心液過超濾膜，收集小于14萬分子量的流出液，在流出液的貯罐中加入流出液重量0.1-0.3％的糖化酶，攪勻，作用2-3小時(shí)，再通過10000分子量的中性超濾膜濃縮，使其達(dá)到所需要的SOD濃度；H、在濃縮液中加入0.1-0.2的VE原粉，再加入0.1-0.2％的山梨酸鉀或海藻糖，攪勻，將濃縮液置-18--22℃冷凍室使SOD進(jìn)一步分離、濃縮、凈化，將冷凍濃縮液移出，化凍后通過離心機(jī)離心；I、將離心液分裝、殺菌即成。
2.一種利用權(quán)利要求1液體復(fù)合酶生產(chǎn)片劑、膠囊產(chǎn)品的方法，其特征是在超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液中，加入液體重量比例8-10％的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機(jī)內(nèi)調(diào)節(jié)適宜溫度噴制成細(xì)粉，將粉進(jìn)行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
3.一種利用權(quán)利要求1液體復(fù)合酶生產(chǎn)純化產(chǎn)品的方法，其特征是將超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液置超濾機(jī)中，以分子量為10000的膜超濾濃縮至6-7倍即可。
4.一種利用權(quán)利要求1液體復(fù)合酶生產(chǎn)生化試劑的方法，其特征是將純質(zhì)復(fù)合酶，先用Sephadex G-75柱層析，進(jìn)行系統(tǒng)分離，可得電泳純之產(chǎn)品，在濃縮液中加入重量比例0.1-0.2的VE原粉，再加入重量比例0.1-0.2％的山梨酸鉀或海藻糖，攪勻，待加入的藥劑溶化后，將濃縮液置-20℃冷凍室使SOD進(jìn)一步分離、濃縮、凈化，將冷凍濃縮液移出，置室溫下，化凍后，再在每分鐘10000-15000轉(zhuǎn)的離心機(jī)中離心。將離心液分裝并密封，以鈷60殺菌即可。
5.一種利用權(quán)利要求1液體復(fù)合酶生產(chǎn)凍干粉的方法，其特征是將超氧化物歧化酶復(fù)合酶濃縮液，分裝入安瓶中，置凍干機(jī)中，在-20℃下凍干即成。
全文摘要
一種利用谷物籽粒大規(guī)模生產(chǎn)超氧化物歧化酶復(fù)合酶的方法，其特征是將谷物籽粒進(jìn)行篩選、消毒、清洗；將籽粒在溫水中浸泡使其吸脹，在發(fā)芽槽中保溫發(fā)芽；將發(fā)芽谷物研磨成粗漿，加入緩沖液；將粗漿加入纖維素酶并打成細(xì)漿，加入氯化鈣；固液分層后，濾液壓濾，濾液通過離心機(jī)離心，收集離心液；離心液過超濾膜，加入糖化酶，再通過中性超濾膜濃縮，使其達(dá)到所需要的SOD濃度；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是超氧化物歧化酶，過氧化物酶和過氧化氫酶都能提取出來，產(chǎn)品雜蛋白少，酶的活力高，酶活力可控效果好，保質(zhì)期長(zhǎng)；一條基本工藝路線可以產(chǎn)生系列產(chǎn)品，工藝簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，安全無污染，耗能少，成本低，效益高；五種谷物種子均可用此工藝生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/44GK1587395SQ20041005022
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月9日
發(fā)明者陳欣, 陳紅漫, 曹淡君, 陳祖潔, 王成余 申請(qǐng)人:陳欣