專利名稱：一種可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及藥物傳遞系統(tǒng)，具體涉及一種將小分子化學(xué)藥物、診斷藥物、多肽蛋白藥物以及基因藥物傳遞入腦的新型傳遞系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
血腦屏障(BBB)，是由腦血管內(nèi)皮細胞、基底膜和神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，它限制了物質(zhì)轉(zhuǎn)運入腦。絕大多數(shù)的藥物不能夠或者是無法有效的通過BBB。因此，常規(guī)途徑給藥后要獲得腦部的藥物治療濃度，必須加大給藥劑量，由此引起外周組織藥物的高濃度而對機體造成嚴重的副作用。
目前克服BBB增加藥物腦內(nèi)傳遞的技術(shù)可以分為侵襲性和非侵襲性兩種。侵襲性的給藥方法包括高滲休克、頸動脈注射血管活性物質(zhì)和直接腦室注射給藥。這些方法雖然有效，但易造成腦部感染和BBB的損傷以及外科性損傷。為能夠克服外科手術(shù)所帶來的創(chuàng)傷和危險，非侵襲性給藥途徑的給藥方法更具有臨床價值。其中，采用酯化、化學(xué)傳遞系統(tǒng)和載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運方式增加藥物分子腦內(nèi)攝取的方法，需要將藥物直接進行化學(xué)修飾，因此，對于藥物的分子量和理化性質(zhì)有較高的要求，具有一定的局限性。此外，載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是由內(nèi)皮細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白形成空間結(jié)構(gòu)特異的孔隙而介導(dǎo)轉(zhuǎn)運，由于空間位阻的作用，限制了分子量較大的多肽蛋白類藥物的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運。
另一類非侵襲性給藥途徑的方法是胞吞轉(zhuǎn)運，它利用腦毛細血管內(nèi)皮細胞膜發(fā)生內(nèi)陷，形成有被小窩，胞吞藥物或載體進入內(nèi)皮細胞，進而在胞內(nèi)體中包裝，穿過胞漿后以胞吐的方式介導(dǎo)相應(yīng)的藥物入腦。由于胞吞轉(zhuǎn)運機制能夠介導(dǎo)大分子蛋白質(zhì)甚至更大的載藥微粒系統(tǒng)(脂質(zhì)體或納米粒)轉(zhuǎn)運入腦，克服了上述藥物轉(zhuǎn)運途徑對藥物分子量和空間位阻的限制。同時，將藥物包載入微粒載體系統(tǒng)，無需對藥物進行化學(xué)修飾，因此更適合于多肽蛋白類大分子藥物的腦內(nèi)傳遞。介導(dǎo)藥物胞吞轉(zhuǎn)運的方式包括受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運和吸附介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運。其中，利用受體介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運藥物入腦，在動物實驗中已得到證實，如采用小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)作為靶向頭基，可以介導(dǎo)與其連接的藥物分子或者藥物儲庫(脂質(zhì)體)入腦。但是，其免疫原性和動物種屬選擇性較強，應(yīng)用到人體需采用抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單抗，必須通過基因工程技術(shù)制備人源化的嵌合抗體，制備技術(shù)較為復(fù)雜。而吸附介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運是由陽離子修飾的蛋白如IgG抗體和白蛋白，通過靜電吸附血腦屏障上的陰離子電荷，包括腔面?zhèn)鹊耐僖核岷突?cè)的硫酸肝素，引起胞吞轉(zhuǎn)運使蛋白進入腦內(nèi)。陽離子白蛋白目前被認為是這一類陽離子修飾蛋白中的代表。采用陽離子化的人血清白蛋白可以降低臨床應(yīng)用時的免疫原性，制備方法相對比較簡便，具有較好的應(yīng)用前景。
利用陽離子化白蛋白作為靶向頭基介導(dǎo)藥物的腦內(nèi)傳遞，國外已有報道。如將陽離子化白蛋白通過二硫鍵與β-內(nèi)啡肽直接連接，可以增加藥物的腦內(nèi)傳遞；采用生物素、親和素系統(tǒng)將載體與藥物相連的可行性也已得到證實。但以上研究中靶向頭基直接與藥物連接，載藥量非常有限。為了增加該系統(tǒng)的載藥能力，有研究報道，將陽離子化白蛋白與載藥脂質(zhì)體連接，通過體外試驗證實能夠增加腦毛細血管內(nèi)皮細胞對藥物的攝取，但是以脂質(zhì)體作為藥物儲庫仍存在載藥量低，且膜不穩(wěn)定以及藥物容易泄漏等問題。
另有報道，采用吐溫表面修飾的納米粒能夠增加腦內(nèi)藥物的傳遞，但是由于吐溫是通過物理吸附的方式修飾在納米粒的表面，因此納米粒進入血液后，表面的吐溫極易解離而失去效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠透過血腦屏障，具有腦內(nèi)遞藥特性的藥物傳遞系統(tǒng)。具體涉及一種將小分子化學(xué)藥物、診斷藥物、多肽蛋白藥物以及基因藥物傳遞入腦的新型傳遞系統(tǒng)。
本發(fā)明采用納米粒作為藥物的載體包載藥物，通過納米粒表面的功能性聚乙二醇與陽離子化白蛋白共價連接，制成能夠透過血腦屏障、具有腦內(nèi)遞藥特性的藥物傳遞系統(tǒng)。該傳遞系統(tǒng)可以傳遞小分子化學(xué)藥物、診斷藥物、多肽蛋白藥物以及基因藥物入腦，從而提高中樞預(yù)防、治療和診斷效果，減少外周毒副作用。
本發(fā)明與陽離子化白蛋白結(jié)合的載藥脂質(zhì)體相比較，避免了以脂質(zhì)體作為藥物儲庫存在載藥量低、膜不穩(wěn)定以及藥物容易泄漏等問題。本發(fā)明以陽離子化白蛋白作為藥物載體的腦內(nèi)靶向頭基，與單克隆抗體相比較，制備方法較為方便，免疫原性較低，無須制備人源化嵌合抗體。本發(fā)明與吐溫修飾的納米粒比較，克服了因吐溫物理吸附而引起的修飾不穩(wěn)定。
通常，藥物傳遞系統(tǒng)，是指能夠包載并輸送藥物的復(fù)合體，它可以是通過藥劑學(xué)手段制備的各種微粒、脂質(zhì)體、納米粒等復(fù)合體。本發(fā)明所涉及的藥物傳遞系統(tǒng)，特指以藥劑學(xué)手段制備的納米粒作為藥物載體，表面共價連接陽離子化白蛋白的復(fù)合體。本發(fā)明傳遞系統(tǒng)能夠使包載的藥物透過BBB，以增加其腦內(nèi)的傳遞。
本發(fā)明所述的納米粒可選用下述高分子材料制備聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物。其中，PEG-PLA的聚乙二醇的分子量范圍是1000-20000，優(yōu)選分子量為2000-5000，聚乳酸的分子量范圍是2000-200000，優(yōu)選分子量為10000-100000，所述的PEG-PLA的聚乙二醇部分，可以是聚乙二醇的衍生物，如單甲氧基聚乙二醇；功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物中的功能性聚乙二醇部分，其一端的功能性基團可以是馬來酰亞胺基、巰基、酰肼基、生物素或親和素中的一種，其中，功能性聚乙二醇的分子量范圍可以是1000-20000，優(yōu)選2000-5000，聚乳酸的分子量范圍可以是2000-200000，優(yōu)選10000-100000。
或選用氰基丙烯酸聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物[Poly(PEGCA-co-HDCA)]和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物。其中，Poly(PEGCA-co-HDCA)的聚乙二醇的分子量范圍是1000-20000，優(yōu)選分子量為2000-5000，所述的氰基丙烯酸十六烷基酯單元的數(shù)目可以是1-5個；氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中，功能性聚乙二醇部分，其一端的功能性基團可以是馬來酰亞胺基、巰基、酰肼基、生物素或親和素中的一種，所述氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中，功能性聚乙二醇的分子量范圍可以是1000-20000，優(yōu)選2000-5000，所述共聚物中氰基丙烯酸十六烷基酯單元的數(shù)目可以是1-5個。
本發(fā)明將PEG-PLA和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物按1-1000∶1混合，或?qū)oly(PEGCA-co-HDCA)和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物1-1000∶1混合后，按下述常規(guī)制備方法的一種或幾種制備納米粒，所述方法包括以水相作為連續(xù)相的乳化聚合法、以油相作為連續(xù)相的乳化聚合法、界面聚合法、溶劑沉淀法、溶劑蒸發(fā)法、單體聚合法和水溶性聚合物乳化后交聯(lián)的方法。其中乳化法制備的乳滴可以是單乳也可以是復(fù)乳。
其中，采用乳化/溶劑蒸發(fā)法可以包載水溶性小分子藥物、多肽蛋白類藥物以及基因藥物。將所述藥物首先溶解于內(nèi)水相，將高分子材料溶解于有機溶劑，超聲乳化形成w/o型初乳，再加入外水相乳化形成w/o/w型復(fù)乳，除去有機溶劑后即形成載藥納米粒。對于包載疏水性藥物，可與聚合物一起溶解于有機溶劑中，緩慢滴加入水相，以水相作為連續(xù)相乳化形成o/w型乳滴，除去有機溶劑后即形成載藥納米粒。
由高分子材料形成的納米粒，以疏水的聚乳酸或聚氰基丙烯酸酯作為內(nèi)核包載藥物，以親水的聚乙二醇或其衍生物如單甲氧基聚乙二醇，包裹在外表面，可以減少血漿蛋白吸附，避免單核吞噬系統(tǒng)的吞噬，起到“隱形”作用，顯著延長其血漿半衰期，從而增加其到達腦毛細血管部位的機會，提高腦內(nèi)遞藥的可能性。
納米粒通過其表面功能性聚乙二醇末端的功能性官能團與陽離子白蛋白共價連接。納米粒表面的功能性聚乙二醇，一端是游離的羥基，可以與乳酸或聚氰基丙烯酸酯縮合反應(yīng)，形成功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物或氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物；功能性聚乙二醇可以通過其另一端的功能性基團與陽離子化白蛋白共價結(jié)合。所述功能性基團及連接方式可以是功能性聚乙二醇一端的馬來酰亞胺基團與陽離子化白蛋白或巰基化陽離子化白蛋白上的巰基連接；功能性聚乙二醇一端的酰肼基團通過羧基活化劑如1-乙基-3-二甲氨基丙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)，與陽離子化白蛋白酸性氨基酸殘基的羧基連接；功能性聚乙二醇一端的巰基可以通過3-(2-吡啶基巰基)丙酸-N-琥珀酰亞胺(SPDP)與巰基化陽離子化白蛋白上的巰基連接；功能性聚乙二醇一端可以通過生物素-親和素與陽離子化白蛋白連接。
本發(fā)明納米粒表面共價連接的陽離子化白蛋白可以是陽離子修飾的牛血清白蛋白(CBSA)、陽離子修飾的人血清白蛋白(CHSA)或陽離子修飾的鼠血清白蛋白(CRSA)。
所述陽離子修飾的白蛋白可以通過1，2-乙二氨或1，6-己二氨與白蛋白酸性氨基酸殘基的羧基縮合，形成陽離子白蛋白。
陽離子化白蛋白可以與BBB上的硫酸肝素或唾液酸部分結(jié)合，通過吸附介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運方式轉(zhuǎn)運整個藥物傳遞系統(tǒng)進入腦內(nèi)。本發(fā)明藥物傳遞系統(tǒng)的粒徑范圍為1-1000nm，優(yōu)選粒徑1-200nm，最優(yōu)選粒徑為50nm-150nm，其中，連接在每個納米粒表面的陽離子化白蛋白個數(shù)為5-1000個，優(yōu)選25-100個。
納米粒表面的功能性、非功能性PEG也可由鞘磷脂代替。
包載于納米粒中的藥物可以是小分子化學(xué)藥物、診斷藥物、多肽蛋白藥物以及基因藥物中的一種或者幾種。其中，小分子化學(xué)藥物、診斷藥物或多肽蛋白藥物可以作用于神經(jīng)突觸連接部位，可以是全身麻醉或局部麻醉藥物如阿片受體激動劑或阻斷劑，催眠藥和鎮(zhèn)靜藥，精神病藥物如治療憂郁癥藥物或精神分裂癥藥物，抗癲癇藥或抗驚厥藥，治療亨廷頓舞蹈病或阿爾采默病藥物，神經(jīng)保護劑，如興奮性氨基酸拮抗劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)再生劑，營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)生長因子，治療中樞創(chuàng)傷和卒中的藥物，治療吸毒和緩解成癮性的藥物，抗寄生蟲或微生物感染藥物，免疫抑制劑和抗癌藥物，激素和激素拮抗劑，重金屬和重金屬拮抗劑，核醫(yī)學(xué)診斷試劑，放射治療藥物，神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的激動劑和拮抗劑及其前體及代謝產(chǎn)物，抗組胺藥，止吐藥，肌松弛藥，腦血管擴張和收縮藥，治療偏頭痛藥物，催眠藥，升高和降低血糖藥物，減肥藥或治療哮喘藥物。
基因藥物是包含有治療基因的質(zhì)粒DNA，含有至少100個核苷酸序列或者分子量在30000以上，質(zhì)?；蛘咻d體被納米粒包載，其表面共價連接陽離子白蛋白，將基因藥物傳遞入腦。其中治療基因包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因，用于治療神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)和腦創(chuàng)傷；酪氨酸羥化酶和/或芳香性氨基酸脫羧酶基因，用于治療帕金森??；β-葡萄糖醛酸苷酶基因；氨基己糖苷酶A基因；腫瘤調(diào)亡基因；單純皰疹病毒胸苷激酶基因；或者是編碼表皮生長因子受體基因的反義RNA；編碼獲得性免疫缺陷綜合癥基因的反義RNA。除了治療基因以外，質(zhì)粒DNA還包括在治療基因前后的DNA序列，可以是起動子、增強子，促進治療基因轉(zhuǎn)錄的mRNA蛋白翻譯和穩(wěn)定的DNA序列，能夠使游離基因在被轉(zhuǎn)染的細胞中復(fù)制的DNA序列。
本發(fā)明還可通過多聚陽離子蛋白濃縮核苷酸形成粒徑10-30nm結(jié)構(gòu)，再將其包載入納米粒，提高納米粒中包載基因的數(shù)目。
載有藥物的本傳遞系統(tǒng)可以通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射非侵襲性給藥途徑給藥。
載有藥物的本傳遞系統(tǒng)可以分散在藥劑學(xué)上可以接受的各種緩沖溶液環(huán)境中，包括生理鹽水、Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液以及其它的緩沖溶液環(huán)境中。
本發(fā)明傳遞系統(tǒng)，具有以下優(yōu)點(1)與常規(guī)給藥系統(tǒng)和給藥方法相比，能夠提高藥物透過血腦屏障進入腦內(nèi)的量，從而相應(yīng)減少外周組織中分布的藥量；(2)在增強中樞預(yù)防、治療和診斷效果的同時，降低全身性毒副作用；(3)與傳統(tǒng)的劑型相比較，可望減少給藥劑量。


圖1. 37℃條件下，BCECs分別攝取100μg/ml載6-香豆素CBSA-NP和BSA-NP的納米粒數(shù)量-時間曲線。
圖2.BCECs在37℃和4℃條件下，分別攝取10-600μg/mlCBSA-NP和BSA-NP 1h的納米粒數(shù)量-濃度曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明通過以下描述和實施例進行說明，以下描述為非限制性的，并不限制本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。
實施例1制備載有熒光染料6-香豆素的藥物傳遞系統(tǒng)1)將250ml 0.9mol/L乙二氨緩慢加入4ml 50％的牛血清白蛋白(BSA)中，邊加邊攪拌，用鹽酸調(diào)pH至4.75，加入EDAC 360mg，室溫攪拌2h后，加入1.3ml 4mol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4.75)，溶液濃縮至25ml，透析72h后，凍干得到CBSA。所合成的CBSA用SDS-PAGE鑒定分子量，用等電聚焦電泳(IEF)鑒定等電點。IEF結(jié)果顯示CBSA的等電點在8-9之間，SDS-PAGE表明CBSA的分子量于BSA接近，分子量均為66000D左右。
取10μl 10mg/ml S-乙酰-巰基乙酸-N-琥珀酰亞胺(SATA)的二甲基亞砜溶液，加入含CBSA 1mg(1mg/ml)的HEPES溶液(pH 7.4)中，攪拌30min，超濾去除二甲基亞砜。每毫升CBSA溶液加入100μl0.1M羥胺反應(yīng)30min，得到巰基化CBSA。經(jīng)Ellman’s試劑測定CBSA和BSA的巰基化程度均在3-4mol巰基/mol蛋白之間。
制備載有6-香豆素的PEG化納米粒將50μl蒸餾水加入1ml含有24mg單甲氧基聚乙二醇3000-聚乳酸28600(MPEG-PLA)、2.4mg馬來酰亞胺-聚乙二醇3400-聚乳酸23900(maleimide-PEG-PLA)嵌段共聚物和15μg6-香豆素的二氯甲烷中，160W連續(xù)超聲30s制備w/o型初乳。將初乳加入2ml 1％的膽酸鈉溶液中，間斷超聲160W 30次(1s/次)，得到w/o/w型復(fù)乳。將復(fù)乳加入38ml 0.5％的膽酸鈉溶液中，攪拌1min后，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，4℃15000rpm離心45min，去除上清，用0.01mol/L pH7.0HEPES重新混懸。
制備載6-香豆素的CBSA表面共價結(jié)合的納米粒(CBSA-NP)和載6-香豆素BSA表面共價結(jié)合的納米粒(BSA-NP)將巰基化的CBSA按照巰基與納米粒中馬來酰亞胺基的摩爾比1∶1進行反應(yīng)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)液經(jīng)過1.5cm×20cm SepharoseCL-4B凝膠柱分離，得到CBSA-NP，淋洗液為0.01mol/L PBS。BSA-NP的制備和純化方法同CBSA-NP，巰基化的BSA按照巰基與納米粒中馬來酰亞胺基的摩爾比1∶1進行反應(yīng)。載6-香豆素的BSA-NP作為實驗對照組。
粒徑分布通過靜態(tài)光散射儀測定載6-香豆素的CBSA-NP數(shù)均粒徑分布成兩個分布相，平均粒徑分別為123.6nm(97.2％)和346.8nm(2.8％)。
2)大鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞(BCECs)攝取載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP的定量實驗BCECs以30000細胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，3天后進行攝取實驗。吸去培養(yǎng)液，用Hank’s液37℃孵育15min，將載6-香豆素的CBSA-NP和BSA-NP以10-600μg/ml不同濃度加入培養(yǎng)板，分別考察37℃下細胞對不同濃度CBSA-NP和BSA-NP的攝取；考察細胞在4℃和37℃下對相同濃度(100μg/ml)CBSA-NP的攝取。用冰冷的Hank’s液終止攝取，并用冰冷的醋酸-巴比妥鈉緩沖液(pH 3.0)洗去吸附在細胞表面的CBSA-NP和BSA-NP，用400μl 1％的Triton-X100溶解細胞。其中25μl樣品用BCA試劑盒測定總蛋白量，200μl樣品加入500μl甲醇，37℃水浴振蕩提取18h，15000rpm離心10min，吸取上清20μl進行HPLC分析。
結(jié)果BCECs對載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP攝取呈濃度依賴性和溫度依賴性，證實所述兩種納米粒的攝取為主動轉(zhuǎn)運過程。結(jié)果表明，BCECs攝取100μg/ml BSA-NP和CBSA-NP的量隨時間的增加而增加，對于各個時間點CBSA-NP的攝取量均高于BSA-NP。BCECs在37℃條件下對BSA-NP和CBSA-NP攝取的飽和濃度均為300μg/ml，且CBSA-NP的攝取量是BSA-NP的2倍。在4℃條件下，BCECs對BSA-NP和CBSA-NP攝取未呈現(xiàn)飽和，攝取量均較低。
3)載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP的跨體外BBB轉(zhuǎn)運采用大鼠BCECs和星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)作為體外BBB模型進行考察。用Ringer-HEPES液(pH 7.4)平衡BBB模型20min，在培養(yǎng)池的內(nèi)部加入1.0ml 10μg/ml載6-香豆素的BSA-NP或CBSA-NP的Ringer-HEPES液，在外測的培養(yǎng)孔中加入2.3ml Ringer-HEPES液。于15min，30min，45min和60min將培養(yǎng)池轉(zhuǎn)移至另外的含有相同體積Ringer-HEPES液的培養(yǎng)孔中，測定不同時間點培養(yǎng)池外測溶液中的藥物濃度。根據(jù)公式Pec+as＝(dQ/dt)/(A×C0)，計算BSA-NP和CBSA-NP在共培養(yǎng)模型中的表觀滲透系數(shù)(Pec+as)。其中dQ/dt為單位時間藥物轉(zhuǎn)運量(ng/min)，A為轉(zhuǎn)運膜的表面積，此時A為0.9cm2，C0為納米粒的初始濃度(ng/ml)，6-香豆素的濃度采用HPLC測定。
采用只接種星形膠質(zhì)細胞的細胞培養(yǎng)池進行對照實驗，計算BSA-NP和CBSA-NP在星形膠質(zhì)細胞中的表觀滲透系數(shù)(Pas)。根據(jù)公式1/Pec＝1/Pec+as-1/Pas，計算BCECs的表觀滲透系數(shù)Pec，作為體外BBB滲透性的評價指標。
結(jié)果表明CBSA-NP的Pec是BSA-NP的7.58倍。表1是載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP在體外BBB模型中的表觀滲透系數(shù)(Pec+as)、在星形膠質(zhì)細胞單層中的表觀滲透系數(shù)(Pas)以及在BCECs單層中的表觀滲透系數(shù)(Pec)。
表1濃度Pec+asPasPecCBSA-NP與(10μg/ml) (×10-3cm/min) (×10-3cm/min) (×10-3cm/min) BSA-NP Pec的比值CBSA-NP0.97972.43231.6403 7.58BSA-NP 0.17971.05870.2164(n＝3)4)載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP在小鼠腦內(nèi)的分布小鼠尾靜脈注射60mg/kg載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP，于30min前乙醚麻醉，心室灌注生理鹽水20min，4％多聚甲醛灌注30min，斷頭處死，取大腦于視交叉后冠狀切1cm厚的組織塊，用PBS漂洗10次，置于15％和30％的蔗糖溶液脫水24h，包埋，冰凍切片，厚度5μm，PBS漂洗后用1μg/ml DAPI染色10min，PBS漂洗后用磷酸甘油封片，熒光顯微鏡下觀察納米粒在腦組織中的分布和熒光強度。結(jié)果熒光顯微鏡照片結(jié)果顯示，小鼠尾靜脈分別注射60mg/kg載6-香豆素的BSA-NP和CBSA-NP 30min后，在側(cè)腦室脈絡(luò)叢和第三腦室室周區(qū)均有綠色的熒光顆粒分布，CBSA-NP的熒光分布數(shù)目均顯著多于BSA-NP。
實施例2制備載有熒光染料6-香豆素的藥物傳遞系統(tǒng)1)制備CBSA和巰基化CBSA的方法同實施例1制備載有6-香豆素的PEG化納米粒將50μl蒸餾水加入1ml含有24mg單甲氧基聚乙二醇3000-聚乳酸28600(MPEG-PLA)、2.4mg馬來酰亞胺-聚乙二醇3400-聚乳酸23900(maleimide-PEG-PLA)嵌段共聚物和15μg 6-香豆素的二氯甲烷中，60W連續(xù)超聲30s制備w/o型初乳。將初乳加入2ml 1％的膽酸鈉溶液中，間斷超聲60W 30次(1s/次)，得到w/o/w型復(fù)乳。將復(fù)乳加入38ml 0.5％的膽酸鈉溶液中，攪拌1min后，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，4℃15000rpm離心45min，去除上清，用0.01mol/L pH7.0HEPES重新混懸。
制備載6-香豆素的CBSA表面共價結(jié)合的納米粒(CBSA-NP)，制備方法同實施例1。
粒徑分布通過靜態(tài)光散射儀測定載6-香豆素的CBSA-NP數(shù)均粒徑900-1000nm。
實施例3制備載有腦血管擴張藥尼莫地平的藥物傳遞系統(tǒng)1)將250ml 0.9mol/L己二氨緩慢加入到4ml 50％的人血清白蛋白(HSA)中，邊加邊攪拌，用鹽酸調(diào)pH至4.75，加入EDAC 360mg。室溫攪拌2h后，加入1.3ml 4mol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4.75)。溶液濃縮至25ml，透析72h后，凍干得到CHSA。IEF顯示CHSA的等電點在8-9之間，SDS-PAGE表明CHSA的分子量于HSA接近。
取150μl 1mg/ml Traut’s試劑(2-iminothiolane)的硼酸鹽緩沖液(pH 8.0)，加入含CHSA 2mg(2mg/ml)的硼酸鹽緩沖液(pH 8.0)中，攪拌60min，反應(yīng)液過Sephadex G-100凝膠柱更換緩沖鹽為pH7.4 PBS，得到巰基化CHSA。經(jīng)Ellman’s試劑測定CHSA的巰基化程度在3-4mol巰基/mol蛋白之間。
2)采用相分離-透析法制備載尼莫地平的納米粒取0.2g MPEG-PLA、0.01g maleimide-PEG-PLA嵌段共聚物和0.1g尼莫地平溶于6ml DMF中，攪拌下緩慢滴加到14ml水中，所得乳液裝入透析袋中，用3L水分六次透析48h以除去DMF。將透析好的乳液于10000rpm離心10min，未包封的藥物和聚集的載藥聚合物納米粒沉降下來，轉(zhuǎn)移上層膠體液得到載尼莫地平的納米粒。
3)制備載尼莫地平的CHSA表面共價結(jié)合的納米粒(CHSA-NP)將巰基化的CHSA按照巰基與納米粒中馬來酰亞胺基的摩爾比1∶3進行反應(yīng)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)液經(jīng)1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝膠柱分離，得CHSA-NP，淋洗液為0.01mol/L PBS。
所得載尼莫地平的CHSA-NP平均粒徑為51.5±21.6nm。
實施例4制備載有腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)的藥物傳遞系統(tǒng)1)將250ml 0.9mol/L己二氨緩慢加入4ml 50％的鼠血清白蛋白(RSA)中，邊加邊攪拌，用鹽酸調(diào)pH至4.75，加入EDAC 360mg。室溫攪拌2h后，加入1.3ml 4mol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4.75)。溶液濃縮至25ml，透析72h后，凍干得到CRSA。IEF顯示CRSA的等電點在8-9之間，SDS-PAGE表明CRSA的分子量于RSA接近。
CRSA的巰基化方法同實施例2，CRSA的巰基化程度在3-4mol巰基/mol蛋白之間。
2)采用復(fù)乳/溶劑蒸發(fā)法制備載BDNF的納米粒將10％BDNF水溶液300μl加入3ml含有90mg MPEG-PLA、4.5mg和maleimide-PEG-PLA嵌段共聚物的二氯甲烷中，冰水浴中55W連續(xù)超聲30s，得初乳。將初乳加入12ml 2％的聚乙烯醇溶液中，冰水浴中攪拌5min，超聲2min，得到w/o/w復(fù)乳，攪拌過夜，15000rpm離心去上清。用0.01mol/L pH7.0 HEPES重新混懸。
3)制備載BDNF的CRSA共價結(jié)合的納米粒(CRSA-NP)將巰基化的CRSA按照巰基與納米粒中馬來酰亞胺基的摩爾比1∶3進行反應(yīng)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)液經(jīng)1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝膠柱分離，得到CRSA-NP，淋洗液為0.01mol/L PBS。
實施例5制備載有pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的藥物傳遞系統(tǒng)1)CBSA的合成及巰基化同實施例1。
2)采用復(fù)乳/溶劑蒸發(fā)法制備載pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的納米粒將9.2mg pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒PBS溶液1ml加入3ml含有90mg MPEG-PLA、4.5mg和maleimide-PEG-PLA嵌段共聚物的二氯甲烷中，1000rpm攪拌，得初乳。將初乳加入12ml 2％的聚乙烯醇溶液中，室溫攪拌5min，得w/o/w復(fù)乳，攪拌過夜，15000rpm離心去上清。用0.01M pH7.0 HEPES重新混懸。
3)制備載pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的CBSA-NP將巰基化的CBSA按巰基與納米粒中馬來酰亞胺基的摩爾比1∶3進行反應(yīng)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)液經(jīng)1.5cm×20cm Sepharose CL-4B凝膠柱分離，得CBSA-NP，淋洗液為0.01 mol/L PBS。
實施例6制備載有99mTc標記的小鼠抗人Aβ1-40單克隆抗體(99mTc-Aβ1-40MAb)的藥物傳遞系1)CBSA的合成及巰基化同實施例1。
2)采用復(fù)乳/溶劑蒸發(fā)法制備載99mTc-Aβ1-40MAb的CBSA-NP的納米粒將1％99mTc-Aβ1-40MAb水溶液200μl加入2ml含40mg氰基丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物Poly(MPEGCA-co-HDCA)和4mg氰基丙烯酸馬來酰亞胺基聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物Poly(maleimide-PEGCA-co-HDCA)的二氯甲烷中，冰水浴中55W連續(xù)超聲30s，得初乳。將初乳加入12ml 2％的聚乙烯醇溶液中，冰水浴中攪拌5min，超聲2min，得到w/o/w復(fù)乳，攪拌過夜，15000rpm離心去上清。用0.01mol/L pH7.0HEPES重新混懸。
3)制備載99mTc-Aβ1-40MAb的CBSA-NP將巰基化的CBSA按照巰基與納米粒中馬來酰亞胺基的摩爾比1∶3進行反應(yīng)，室溫攪拌過夜。反應(yīng)液經(jīng)過1.5cm×20cm SepharoseCL-4B凝膠柱分離，得到CRSA-NP，淋洗液為0.01mol/L PBS。
權(quán)利要求
1.一種可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于采用納米粒作為藥物的載體包載藥物，所述納米粒通過表面的功能性聚乙二醇與陽離子白蛋白共價連接，制成可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)。
2.按權(quán)利要求1所述的可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的納米粒的制備材料采用聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物；或氰基丙烯酸聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物。
3.按權(quán)利要求2的可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物或氰基丙烯酸聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中的聚乙二醇部分，可以是聚乙二醇的衍生物。
4.按權(quán)利要求2的可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物或氰基丙烯酸聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中的聚乙二醇部分，是單甲氧基聚乙二醇。
5.按權(quán)利要求2的可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物或氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物中的功能性聚乙二醇部分，其一端的功能性基團可以是馬來酰亞胺基、巰基、酰肼基、生物素或親和素中的一種。
6.按權(quán)利要求1的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的陽離子白蛋白是陽離子化牛血清白蛋白、陽離子化人血清白蛋白或陽離子化鼠血清白蛋白中的一種或幾種。
7.按權(quán)利要求1的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的傳遞系統(tǒng)的粒徑為1-1000nm。
8.按權(quán)利要求1的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的傳遞系統(tǒng)的粒徑為1-200nm。
9.按權(quán)利要求1的藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于所述的納米粒包載的藥物可以是小分子化學(xué)藥物或診斷藥物或多肽蛋白藥物或基因藥物或其中的一種或幾種。
10.按權(quán)利要求1的可腦內(nèi)遞藥的藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法，通過下述步驟，(1)制備包載藥物的納米粒，將聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物和功能性聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物混合，或?qū)⑶杌┧峋垡叶减?氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物和氰基丙烯酸功能性聚乙二醇酯-氰基丙烯酸十六烷基酯共聚物混合后，按乳化聚合法、界面聚合法、溶劑沉淀法、溶劑蒸發(fā)法、單體聚合法或乳化交聯(lián)法制備包載藥物的納米粒；(2)將白蛋白進行陽離子化修飾，將乙二氨或己二氨與白蛋白縮合，形成陽離子白蛋白；(3)將載藥納米粒與陽離子白蛋白共價連接。
11.按權(quán)利要求10的藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法，其特征在于所述藥物傳遞系統(tǒng)其中納米粒通過其表面功能性聚乙二醇末端的功能性官能團與陽離子白蛋白共價連接。
12.按權(quán)利要求11的藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法，其中陽離子白蛋白與納米粒表面功能性聚乙二醇末端的功能性官能團共價連接的方式是先將陽離子白蛋白巰基化修飾，再將其巰基與功能性聚乙二醇末端的馬來酰亞胺基連接，或是先將陽離子白蛋白巰基化修飾，再將其巰基與功能性聚乙二醇末端的巰基連接，或是將陽離子白蛋白上酸性氨基酸殘基的羧基與功能性聚乙二醇末端的酰肼基團連接，或是陽離子白蛋白與功能性聚乙二醇末端通過生物素-親和素連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種新型的具有腦內(nèi)遞藥特性的藥物傳遞系統(tǒng)，由納米粒作為藥物的載體，納米粒表面與陽離子化白蛋白進行共價連接而構(gòu)成。本傳遞系統(tǒng)能夠傳遞小分子化學(xué)藥物、診斷藥物、多肽蛋白藥物以及基因藥物通過血腦屏障進入腦內(nèi)，發(fā)揮預(yù)防、治療和診斷作用。藥物裝載于該傳遞系統(tǒng)內(nèi)，能夠提高藥物透過血腦屏障進入腦內(nèi)的量，從而相應(yīng)減少外周組織中分布的藥量，在增強中樞預(yù)防、治療和診斷效果的同時，降低全身性毒副作用，比傳統(tǒng)的劑型給藥劑量減少。
文檔編號A61K9/14GK1582902SQ20041002517
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月15日
發(fā)明者陸偉, 蔣新國 申請人:復(fù)旦大學(xué)