專利名稱：基因重組抗真菌肽在治療病原真菌感染上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)中利用基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌引起各種感染的藥物應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗生素的大量使用、免疫抑制劑的應(yīng)用、手術(shù)、放射性治療等等造成菌群失調(diào)，使得許多原來(lái)不致病的和正常情況下治病性很弱的病原菌引起疾病，而且發(fā)病率逐年增加，尤以醫(yī)院內(nèi)交叉感染最為明顯。目前引起臨床感染較常見(jiàn)的病原菌主要是革蘭陰性細(xì)菌中的大腸桿菌、綠膿桿菌和克雷伯菌等，革蘭陽(yáng)性細(xì)菌中的葡萄球菌等和真菌如念珠菌等。對(duì)細(xì)菌引起的感染可采用抗生素進(jìn)行治療，雖然耐藥菌的增多給治療造成困難，但尚可采用藥物敏感試驗(yàn)篩選敏感藥物和聯(lián)合用藥予以治療。而真菌引起的感染近年逐漸增多，在臨床致病菌撿出率各地區(qū)有所區(qū)別，一般在10％左右，而在醫(yī)院內(nèi)感染中高達(dá)20％以上。由于真菌細(xì)胞與人體細(xì)胞都屬于真核細(xì)胞，對(duì)真菌有效的抗生素對(duì)人體細(xì)胞也有毒性作用，所以治療時(shí)的副作用較大，造成治療困難。
既然真菌細(xì)胞與人體細(xì)胞都屬于真核細(xì)胞，對(duì)真菌有效的抗生素對(duì)人體細(xì)胞也有毒性作用，所以治療時(shí)的副作用較大。能否開(kāi)發(fā)出僅針對(duì)真菌有作用，而對(duì)人體細(xì)胞無(wú)副作用的抗生素？人體在生物進(jìn)化過(guò)程中，人體演化出多種天然抗菌物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)對(duì)多種病原菌均有殺滅作用，而對(duì)自身無(wú)任何副作用，是我們尋找低毒高效抗真菌藥物的理想源泉。溶菌酶是由Fleming在1922年發(fā)現(xiàn)的。它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4-β-N-溶菌酶或者稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切斷細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，細(xì)菌在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開(kāi)，引起細(xì)菌裂解。人和動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)亦無(wú)肽聚糖，故溶菌酶對(duì)人體細(xì)胞無(wú)毒性作用。近年來(lái)研究，溶菌酶可能作為一種很古老的防御機(jī)制，還活躍于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外防御病毒和真菌的侵襲。
目前，溶菌酶主要從雞蛋清來(lái)制取。然而，雞溶菌酶作為異種蛋白可引起變態(tài)反應(yīng)而無(wú)法用于人類，天然人溶菌酶的價(jià)格過(guò)于昂貴也無(wú)法用于臨床。我公司利用酵母系統(tǒng)表達(dá)人溶菌酶，成本低，生產(chǎn)量大，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)建立的新提取純化的方法，產(chǎn)物純度高達(dá)99.8％以上，同時(shí)具有天然人溶菌酶的殺菌活性。該方法已申請(qǐng)專利(專利申請(qǐng)?zhí)?0110463.2)。在此基礎(chǔ)上我公司牽頭承擔(dān)并完成了國(guó)家十五重大醫(yī)藥課題“一類新生物制藥人溶菌酶抗耐藥菌研究”。在研究人溶菌酶功能的同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)人溶菌酶的一些功能區(qū)的抗菌作用較完整的人溶菌酶更強(qiáng)，具有更好的開(kāi)發(fā)前景。
近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶除殺菌作用外，還發(fā)現(xiàn)有抗真菌、抗病毒、消炎等作用(申請(qǐng)?zhí)?00410021100.9)，針對(duì)這些新發(fā)現(xiàn)的作用，研究發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的水解粘肽N-乙?；邗＆?1，4-糖苷鍵酶切作用以外的其它生物學(xué)活性。
對(duì)溶菌酶非酶活性功能的研究發(fā)現(xiàn)，加熱滅活溶菌酶的酶活性后，或溶菌酶的部分片段同樣具有殺菌作用，有些殺滅活性甚至超過(guò)完整溶菌酶的殺菌活性。如Ibrahim，HR研究表明溶菌酶C端的螺旋-環(huán)狀-螺旋結(jié)構(gòu)(HLH)具有非酶活性的殺菌作用。它可嵌入到細(xì)菌、真菌等的外膜和胞膜中，造成穿孔，由于細(xì)菌、真菌等的內(nèi)部滲透壓作用而裂解死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本公司研發(fā)中心在鑒定基因工程表達(dá)的人溶菌酶生物學(xué)活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因工程表達(dá)的人溶菌酶在體外同樣具有明顯地殺滅真菌的活性，破壞真菌細(xì)胞壁。同時(shí)，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，基于人溶菌酶C端的螺旋-環(huán)狀-螺旋結(jié)構(gòu)(HLH)之間序列的不同多肽和一些改構(gòu)體均有良好的殺滅真菌的活性，特別是人溶菌酶C端的螺旋-環(huán)狀-螺旋結(jié)構(gòu)(HLH)中的部分氨基酸序列與人體內(nèi)其他抗菌多肽構(gòu)成的HLH復(fù)合體，抗菌效果明顯提高，特別是在抗真菌方面，個(gè)別序列多肽的殺滅真菌的活性比人溶菌酶高100-1000倍以上，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
本發(fā)明首先根據(jù)人溶菌酶C端的螺旋-環(huán)狀-螺旋HLH結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)測(cè)定了不同氨基酸序列，然后，通過(guò)多肽合成儀合成了11個(gè)抗真菌肽氨基酸序列，它們是1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR6)RAWVAWRNR7)AWVAWRNR8)WVAWRNR9)VAWRNR10)RAWVAWRN
11)IKISGKWKAQKRFLK用微孔板法(見(jiàn)實(shí)施例1)，鑒定11個(gè)氨基酸序列的多肽對(duì)病原真菌的殺菌活性，不同的基因重組抗真菌肽殺菌活性結(jié)果如下基因重組抗真菌肽 殺真菌的最低劑量1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR 6.25mg/L2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR 6.25mg/L3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR 3.125mg/L4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR 3.125mg/L5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR6.25mg/L6)RAWVAWRNR 50mg/L7)AWVAWRNR50mg/L8)WVAWRNR 200mg/L9)VAWRNR 無(wú)作用10)RAWVAWRN 無(wú)作用11)IKISGKWKAQKRFLK200mg/L結(jié)果證明了基因重組抗真菌肽(1)-(5)具有良好的抗真菌活性和制藥前景。
最后，確定了基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(1)-(5)可以作為制備治療病原真菌感染引起炎癥的抗真菌藥物是1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR；2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR；3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR；4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR；或5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR用基因重組抗真菌肽通過(guò)微孔板法作為制備治療病原真菌感染的藥物進(jìn)行殺真菌鑒定。然后，用基因重組抗真菌肽作為制備治療真菌感染在皮膚黏膜表面感染引起上呼吸道感染、陰道感染、皮膚感染和口腔感染藥物的應(yīng)用；將具有殺真菌作用的基因重組抗真菌肽制成體內(nèi)用注射針劑、口服片劑、霧化吸入噴霧劑和體外用藥滴劑、膏劑或栓劑。
本發(fā)明病原真菌涉及的是指念珠菌、曲霉菌、隱球菌和皮膚癬菌，基因重組抗真菌肽對(duì)真菌敏感的有效抑菌濃度在0.1μg-100μg/ml之間。上呼吸道感染是由念珠菌感染引起的氣管炎、支氣管炎、肺炎、咽炎；皮膚感染是由念珠菌、曲霉菌和皮膚癬菌感染引起的濕疹、過(guò)敏性皮炎、牛皮癬或皮癬；口腔或陰道感染是由念珠菌感染引起的牙齦炎、鵝口瘡、口腔潰瘍或陰道炎；全身深部真菌感染是由念珠菌、曲霉菌、隱珠菌引起的。
本發(fā)明還涉及用基因重組抗真菌肽作為制備治療上呼吸道感染、陰道感染和皮膚感染的藥物是由1％基因重組抗真菌肽凍干粉和生理鹽水配制成的注射針劑，靜脈注射用藥量為30,000u/ml/20g鼠，每日三次；作為制備治療口腔炎癥的藥物是由0.1％基因重組抗真菌肽凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液80％、25％丙三醇和5/萬(wàn)吐溫80配制成的噴霧劑，用藥量為1500μl/20g鼠，每日六次；作為制備治療體內(nèi)真菌感染用藥的口服片劑是由10％基因重組抗真菌肽凍干粉、50％藥用淀粉、25％藥用糊精、10mM磷酸鹽PH7緩沖液和5％蔗糖配制而成；體內(nèi)霧化吸入基因重組抗真菌肽的濃度為0.025～0.4mg/ml，吸入用藥2～5天；作為制備治療體外用藥的滴劑是由0.5％基因重組抗真菌肽凍干粉、10mM磷酸鹽PH7緩沖液80％、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮和3/萬(wàn)吐溫80配制而成體外用藥膏劑是由0.1％基因重組抗真菌肽凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液85％、20％丙三醇、1％卡波樹(shù)脂和0.3％香精配制而成。
為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，首先，我們通過(guò)微孔板法用基因重組抗真菌肽作為活性組分對(duì)病原真菌進(jìn)行殺菌活性鑒定，其方法是用10mM PH7.2 PB緩沖液將不同真菌分別配成103-104CFU/ml濃度的菌液，100μl定量加到96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)分別加入100μl的200μg～0.1μg不同劑量的基因重組抗真菌肽，37℃作用30分鐘，補(bǔ)加200μl沙保弱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察結(jié)果。計(jì)算可殺死病原真菌的最低有效濃度。
一、基因重組抗真菌肽作為制備治療上呼吸道感染、陰道感染、口腔感染和皮膚感染藥物的應(yīng)用。
下面將分述由白色念球菌感染引起的上呼吸道感染、陰道感染、口腔感染；由皮膚癬菌感染引起的溫疹、過(guò)敏性皮炎、皮癬藥物的配制、用藥及治療效果(一)藥物配制A、將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組抗真菌肽菌株、搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為30℃，在恒溫床上培養(yǎng)36小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。并將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的蛋白濃縮進(jìn)行凍干，測(cè)得蛋白活性后保存。取基囚重組抗真菌肽凍干粉1％，用生理鹽水制成注射針劑，主要用于對(duì)念珠菌引起的病癥。
B、將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含基因重組抗真菌肽凍干粉0.1％、磷酸鹽緩沖液20mM(PH＝7.0)80％、25％丙三醇、5/萬(wàn)吐溫80的噴霧劑。
C、將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含基因重組抗真菌肽凍干粉0.5％、磷酸鹽緩沖液10mM(PH＝7.0)80％、20％丙三醇、6％2-比咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、3/萬(wàn)吐溫80的滴劑。
D、將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含基因重組抗真菌肽凍干粉0.1％、磷酸鹽緩沖液20mM(PH＝7.0)85％、20％丙三醇、卡波樹(shù)脂1％、香精0.3％的膏劑。
E、將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成膠囊劑、片劑、其含基因重組抗真菌肽凍干粉10％、藥用淀粉50％、藥用糊精25％、磷酸鹽緩沖液10mM(PH＝7.0)、蔗糖5％。
(二)對(duì)小鼠的模型試驗(yàn)A、白色念珠菌呼吸道感染所致小鼠口腔炎、氣管炎、肺炎模型的制備選用健康昆明種小鼠20只，雌雄各半，體重為18-22克，分兩組，每組10只，選取一定量的白色念珠菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道致小鼠氣管炎10只、肺炎10只，感染后即刻靜脈注射受試藥30000u/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因重組抗真菌肽對(duì)白色念珠菌呼吸道感染所致小鼠氣管炎、肺炎有明顯療效。結(jié)果如下表

B、白色念珠菌所致小鼠陰道炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的白色念珠菌用涂抹方式感染小鼠陰道致小鼠陰道炎10只，感染后即靜脈注射受試藥30000u/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因重組抗真菌肽對(duì)白色念珠菌感染所致小鼠陰道炎有明顯療效。結(jié)果如下表

C、對(duì)由皮膚癬菌引起的濕疹、過(guò)敏性皮炎、皮癬等皮膚性感染療效如下表


二、基因重組抗真菌肽作為制備治療體內(nèi)真菌感染引起深部真菌感染藥物的應(yīng)用。
采用小鼠腹腔感染敗血癥觀察基因重組抗真菌肽對(duì)小鼠體內(nèi)感染的治療作用。
試驗(yàn)菌株白色念球菌、曲霉菌用于小鼠敗血癥感染試驗(yàn)。方法是挑取一定量的菌苔接種于2ml沙保弱液體培養(yǎng)基中，在35℃培養(yǎng)18小時(shí)候后，取出用滅菌生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4)，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測(cè)定引起小鼠100％死亡的最小菌量(MLD)，用該菌量作為體內(nèi)感染菌量。
基因重組抗真菌肽藥劑靜脈注射對(duì)真菌感染小鼠敗血癥的治療試驗(yàn)，把受試小鼠按體重性別均勻分組，每組10只鼠，然后取出經(jīng)35℃培養(yǎng)18小時(shí)的上述6種菌種的菌液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1MLD，分別注入小鼠腹腔體內(nèi)，每鼠0.5ml，制備小鼠敗血癥模型，再將各受試藥物以1∶0.5劑間距設(shè)5-6個(gè)劑量組，分別于感染后即刻靜脈注射不同濃度的受試藥液，0.5ml/20g鼠重，同時(shí)設(shè)感染對(duì)照組(不給藥)，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7-14天，按Bliss法計(jì)算半數(shù)有效劑量ED50及可信限。
殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明靜脈注射給藥對(duì)細(xì)菌感染具有一定的體內(nèi)療效，其半數(shù)有效劑量ED50分別是白色念球菌4.1mg/kg，曲霉菌為15mg/kg。(附表1-2)三、基因重組抗真菌肽對(duì)真菌132株體外抗菌活性。
本試驗(yàn)中采用的臨床分離菌種有念珠菌屬84株、隱球菌屬7株、毛霉菌屬21株、曲霉菌屬9株、申克孢子絲菌屬4株、皮炎芽生菌2株、毛發(fā)癬菌屬5株，總共132株菌。
試驗(yàn)方法將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當(dāng)稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，倍比稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03-0.001mg/ml；用多點(diǎn)接種儀將稀釋至104CFU/ml的試驗(yàn)菌液接種于各含藥平皿表面，置35℃培養(yǎng)8-10小時(shí)，取出，再分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于35℃培養(yǎng)10小時(shí)取出，觀察結(jié)果，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。分別以累積抑制50％、90％所試菌株的MIC值計(jì)為MIC50、MIC90。所試菌株的MIC值最小值至其最大值計(jì)為MICRange(范圍)。
試驗(yàn)結(jié)果表明基因重組抗真菌肽對(duì)所試真菌均具有抗菌作用。本發(fā)明對(duì)上述132株菌的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)附表4。
以上所有應(yīng)用結(jié)果表明利用本公司生物基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)出的基因重組抗真菌肽，具有殺真菌作用，可以作為制備治療真菌在體內(nèi)深部和淺部感染的藥物。這就為生物工程制約提供了新的研制方向，也為臨床治愈真菌感染提供新的制劑和福音。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本實(shí)施例為用基因重組抗真菌肽微孔板法對(duì)真菌進(jìn)行殺菌活性鑒定方法。
用10mM PH7.2 PB緩沖液將不同真菌分別配成103-104CFU/ml濃度的菌液，100μl定量加到96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)分別加入100μl的200μg-0.1μg不同劑量的基因重組抗真菌肽，37℃作用30分鐘，補(bǔ)加200μl沙保弱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察結(jié)果。計(jì)算可殺死病原真菌的最低有效濃度。
實(shí)施例2本實(shí)施例是用基因重組抗真菌肽經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠真菌性呼吸道感染治療作用。
模型制備試驗(yàn)前將小鼠放入密封玻璃缸內(nèi)，玻璃缸連接至超聲霧化器(型號(hào)402，上海合力醫(yī)療器械廠生產(chǎn))，內(nèi)裝30ml試驗(yàn)菌液，菌液濃度為107CFU/ml，開(kāi)動(dòng)超聲霧化器，給小鼠霧化吸入20分鐘，間隔10分鐘，再霧化需吸入20分鐘，連續(xù)霧吸入3次。末次霧化吸入后6小時(shí)，分別用無(wú)菌棉簽挑取咽部黏膜涂于無(wú)藥粘脂平皿表板，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察有無(wú)真菌生長(zhǎng)，進(jìn)計(jì)活菌計(jì)數(shù)。真菌培養(yǎng)陽(yáng)性，且活菌數(shù)≥103CFU/ml，表明感染模型成功。提示該感染模型可用于治療試驗(yàn)。
基因重組抗真菌肽霧化吸入對(duì)小鼠真菌性呼吸道治療試驗(yàn)。
取呼吸道感染真菌成功的小鼠，隨機(jī)分組，每組10只鼠，裝入盛有適當(dāng)濃度的受試藥液(連接了超聲霧化器)的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行霧化吸入治療，每次吻合吸入20分鐘，間隔10分鐘，共霧化吸入3次，于霧化吸入藥液后第一天、第二天、第三天、第四天、第五天分別用滅菌棉簽桃取咽喉部黏膜涂于無(wú)藥瓊脂平皿表板。35℃培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)真菌性呼吸道感染對(duì)照組(不給藥)。將給藥組小鼠咽部活菌數(shù)與感染對(duì)照組小鼠咽部活菌數(shù)進(jìn)計(jì)Student t檢驗(yàn)，以評(píng)價(jià)受試藥物經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠真菌性呼吸道感染的治療作用。(附表3)實(shí)施例3本實(shí)施例是基因重組抗真菌肽凍干粉的制備方法。
將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組抗真菌肽菌株，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為30℃，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)36-40小時(shí)，進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)，并將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的蛋白濃縮液進(jìn)行凍干，測(cè)得蛋白活性后保存。
實(shí)施例4用基因重組抗真菌肽作為制備治療上呼吸道、陰道和皮膚感染炎癥的藥物針劑是用1％基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(1)的凍干粉與生理鹽水配制成的注射劑。靜脈注射時(shí)用藥量為30000μ/ml/20g鼠，每日三次。該注射劑也可以選用1％基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(2)、(3)、(4)或(5)來(lái)配制。
實(shí)施例5用基因重組抗真菌肽作為制備治療口腔炎癥的藥物噴霧劑是用0.1％基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(2)的凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液80％、25％丙三醇和5/萬(wàn)吐溫80配制成的噴霧劑。用藥量為1500μl/20g鼠，每日六次。
該噴霧劑也可以選用(1)、(3)、(4)或(5)氨基酸序列的基因重組抗真菌肽來(lái)配制。
實(shí)施例6用基因重組抗真菌肽作為制備治療體內(nèi)真菌感染的藥物口服片劑是用10％基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(3)的凍干粉、50％藥用淀粉、25％藥用糊精、10mM磷酸鹽PH7緩沖液和5％蔗糖配制而成。
該噴霧劑也可以選用(1)、(2)、(4)或(5)氨基酸序列的基因重組抗真菌肽來(lái)配制。
實(shí)施例7用基因重組抗真菌肽作為制備治療體外真菌感染的藥物滴劑是用0.5％基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(4)的凍干粉、10mM磷酸鹽PH7緩沖液80％、25％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮和3/萬(wàn)吐溫80配制而成。
該滴劑也可以選用(1)、(2)、(3)或(5)氨基酸序列的基因重組抗真菌肽來(lái)配制。
實(shí)施例8用基因重組抗真菌肽作為制備治療體外真菌感染的藥物膏劑是用0.1％基因重組抗真菌肽的氨基酸序列(5)的凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液85％、20％丙三醇、1％卡波樹(shù)脂和0.3香精配制而成。
該膏劑也可以選用(1)、(2)、(3)或(4)氨基酸序列的基因重組抗真菌肽來(lái)配制。
實(shí)施例9本實(shí)施例是用基因重組抗真菌肽對(duì)細(xì)菌感染體內(nèi)注射藥劑的治療試驗(yàn)。
把受試小鼠按體重、性別均勻分組每組10只鼠，然后取出經(jīng)35℃培養(yǎng)24小時(shí)的個(gè)同真菌的菌液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1MLD，分別注入小鼠腹腔體內(nèi)，每鼠0.5ml，制備小鼠敗血癥模型，再將各受試藥物以1∶0.5劑間距設(shè)5-6個(gè)劑量組，分別于感染后即刻靜脈注射不同濃度的受試藥液，0.5ml/20g鼠重，同時(shí)設(shè)感染對(duì)照組(不給藥)，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7-14天，按Bliss法計(jì)算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。(見(jiàn)表1、2)
表1基因重組抗真菌肽對(duì)白色念珠菌感染所致小鼠敗血癥的體內(nèi)療效試驗(yàn)結(jié)果感染真菌菌量 劑量濃度動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)死亡率受試藥物 給藥途徑(CFU/ML) (mg/kg) (mg/ml) (只) (只) (％)白色念珠菌 i.v40 1.6 101 10抗真菌肽1.9×10520 0.8 101 1010 0.4 103 305 0.2 106 60感染對(duì)照組(1MLD) ip*— —1010100感染對(duì)照組(1/10MLD) ip — —108 80*ip腹腔感染真菌。
表2抗真菌肽對(duì)黃曲霉菌感染所致小鼠敗血癥的體內(nèi)療效試驗(yàn)結(jié)果感染真菌菌量劑量濃度動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)死亡率受試藥物 給藥途徑(CFU/ML)(mg/kg) (mg/ml) (只) (只) (％)25 1.00 10 44012.50.50 10 660黃曲霉菌 抗真菌肽i.v 6.250.25 10 5502×1053.120.13 10 8801.560.06 10 770感染對(duì)照組 — 10 10 100
表3基因重組抗真菌肽霧化吸入對(duì)小鼠呼吸道感染白色念珠菌的療效試驗(yàn)結(jié)果給藥量 給藥后菌落計(jì)數(shù)(CFU)真菌感染給藥濃度(ul)×給菌量 藥物(mg/ml) 藥次數(shù)第1天 第2天 第3天第4天 第5天(cfu/ml)(次/日)白色念珠菌0.2 100×4242.80±22.88 222.10±18.46150.80±16.08100.20±13.97 70.70±11.602×1040.1 100×4243.20±25.42 221.30±18.12157.70±17.62100.70±15.59 72.30±17.86抗真菌肽0.05 100×4242.90±15.91 228.80±18.70159.50±26.28103.80±17.64 74.80±14.280.025 100×4245.40±14.31 217.20±17.02161.90±11.14105.50±12.41 78.20±20.900.0125100×4246.50±46.60 220.50±12.99167.80±20.67105.90±14.69 80.50±15.71菌對(duì)照 — — 246.60±21.60 240.302±9.12179.30±17.63115.10±19.34 86.70±12.88
表4基因重組抗真菌肽對(duì)132株病原真菌體外作用比較MIC(μg/ml)真菌名稱50-10025-5012.5-506.25-12.53.125-6.25＜3.125白色念珠菌37株515 17熱帶念珠菌26株1619克柔氏念珠菌11株 56光滑念珠菌10株145隱珠菌7株 1 321毛霉菌21株 1 2810曲霉菌9株 252申克孢子絲菌4株 1 12皮炎牙生菌2株 1 1毛發(fā)癬菌屬5株 12 權(quán)利要求
1.一種抗真菌藥物作為制備治療病原真菌感染引起炎癥的應(yīng)用，其特征在于本抗真菌藥物是具有下列不同氨基酸序列的基因重組抗真菌肽1)DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNR；2)IKISGKWKAQKRFLKGIRAWVAWRNR；3)IKISGKWKAQKRFLKDPQGIRAWVAWRNR；4)RAWVAWRNRDPQGIRAWVAWRNR；或5)RAWVAWRNRGIRAWVAWRNR作為制備治療真菌在皮膚粘膜表面感染引起上呼吸道、陰道、皮膚和口腔炎癥藥物的應(yīng)用；用具有殺真菌的基因重組抗真菌肽制備治療真菌感染引起體內(nèi)炎癥藥物注射針劑、口服片劑或霧化吸入噴霧劑和體外炎癥藥物滴劑、膏劑或栓劑的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于病原真菌中所指的真菌是念珠菌、曲霉菌、隱球菌和皮膚癬菌，基因重組抗真菌肽對(duì)真菌敏感的有效抑菌濃度在0.1μg-100μg/ml之間。
3.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于上呼吸道、口腔和陰道粘膜表面感染的炎癥是指由念珠菌感染引起的氣管炎、支氣管炎、肺炎、咽炎、牙齦炎、鵝口瘡或口腔潰瘍和陰道炎。
4.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于皮膚感染是指由念珠菌、曲霉菌和皮膚癬菌的感染引起的濕疹、過(guò)敏性皮炎、牛皮癬或皮癬。
5.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于治療上呼吸道炎癥、陰道炎癥和皮膚炎癥的藥物是由1％基因重組抗真菌肽凍干粉和生理鹽水配制成的注射針劑，靜脈注射用藥量30,000u/ml/20g鼠重，每日三次，上呼吸道和陰道炎癥的有效治愈率100％，皮膚炎癥的有效治愈率80-100％。
6.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于治療口腔炎癥的藥物是由0.1％基因重組抗真菌肽凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液80％、25％丙三醇和5/萬(wàn)吐溫80配制成的噴霧劑，用藥量1500μL/20g鼠重，每日六次，有效治愈率100％。
7.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于體內(nèi)用藥口服片劑是由10％基因重組抗真菌肽凍干粉、50％藥用淀粉、25％藥用糊精、10mM磷酸鹽PH7緩沖液和5％蔗糖配制成的片劑；體內(nèi)霧化吸入噴霧劑的基因重組抗真菌肽的濃度為0.025-0.4mg/ml，吸入用藥2-5天。
8.按照權(quán)利要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于體外用藥滴劑是由0.5％基因重組抗真菌肽凍干粉、10mM磷酸鹽PH7緩沖液、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮和3/萬(wàn)吐溫80配制而成；膏劑是由0.1％基因重組抗真菌肽凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液85％、20％丙三醇、1％卡波樹(shù)脂和0.3％香精配制而成。
9.按照權(quán)要求1所述基因重組抗真菌肽作為制備治療病原真菌感染藥物的應(yīng)用，其特征在于體外用藥的滴劑是由0.5％基因重組抗真菌肽凍干粉、10mM磷酸鹽PH7緩沖液80％、20％丙三醇、6％ 2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、3/萬(wàn)吐溫80配制而成。
全文摘要
本發(fā)明提供了用酵母菌工業(yè)化生產(chǎn)提取純化的基因重組抗真菌肽，作為制備治療深部和淺部真菌在皮膚粘膜表面感染引起上呼吸道、陰道、皮膚和口腔炎癥藥物的應(yīng)用；并用具有殺真菌作用的基因重組抗真菌肽作為治療各種臨床炎癥體內(nèi)的藥物針劑、片劑、噴霧劑和體外藥物滴劑、膏劑等的配制和用藥方法。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1569220SQ20041002046
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者李元, 李別虎, 薛小平, 黃慶生, 王延竹, 韓文君, 張衛(wèi)華 申請(qǐng)人:大連帝恩生物工程有限公司